ii. tinjauan pustaka

II. TINJAUAN PUSTAKA
2.1
Ikan Mas (Cyprinus carpio)
Ikan mas merupakan ikan yang mempunyai nilai ekonomis penting,
dagingnya banyak disukai orang, mudah dipelihara, dapat memanfaatkan
makanan buatan, relatif tahan terhadap penyakit, pertumbuhannya relatif cepat
dan mempunyai toleransi yang besar terhadap kisaran suhu dan oksigen telarut,
dan mudah dipijahkan (Hardjamulia & Suseno 1975). Ikan mas mula-mula
didatangkan dari China dan Rusia, kemudian didatangkan juga dari Eropa pada
tahun 1972 dan 1930, Taiwan pada tahun 1970, serta dari Jepang pada tahun 1980
(Bardach 1972). Data statistik mengindikasikan bahwa produksi ikan mas hampir
mendekati batas puncaknya. Bagaimanapun juga, ikan mas merupakan salah satu
komoditas penting (FAO 2010), sehingga perlu ada inovasi untuk memenuhi
permintaan akan ikan mas.
2.2
Hormon Pertumbuhan (Growth Hormone (GH))
GH merupakan polipeptida yang disekresikan oleh bagian anterior dari
kelenjar pituitari yang memacu pertumbuhan tubuh, khususnya dengan
merangsang pelepasan somatomedin, dan mempengaruhi metabolisme protein,
karbohidrat, dan lipid. Menurut Biotechnology Industry Organization (2007), GH
manusia pertama kali ditemukan pada tahun 1920 oleh Evans dan Long.
Kemudian, pada tahun 1979 hormon tersebut disintesis untuk pertama kali. GH
bekerja dengan merangsang sintesis protein dan pemecahan lemak (untuk energi).
Hormon ini merupakan peptida yang besar yang terdiri dari 191 asam amino dan
relatif spesies-spesifik. Sekresi hormon pertumbuhan dikendalikan oleh
hipothalamus. Somatotropin menggambarkan hormon pertumbuhan yang biasa
diproduksi
di
hewan,
sedangkan
somatropin
menggambarkan
hormon
pertumbuhan yang diproduksi oleh teknologi DNA rekombinan (Wikipedia
2009a). Sekresi GH dirangsang oleh growth hormone releasing hormone
(GHRH), ghrelin, protein pakan, kandungan gula darah yang rendah, peningkatan
sekresi androgen, dan arginin, sedangkan yang menghambat antara lain
somatostatin, konsentrasi hormon pertumbuhan dan insulin like growth factor 1
(IGF-1) yang bersirkulasi, kandungan gula darah yang tinggi, glukokortikoid, dan
estradiol ataupun estrogen lainnya. Lokasi tempat produksi hormon-hormon pada
adenohipofisis teleostei ditunjukkan pada Gambar 1. Kandungan GH dalam tubuh
ikan berkisar antara 0,2-111,2 ng/ml plasma darah (Björnsson et al. 1988;
Takahashi et al. 1991; Farbridge et al. 1992; Björnsson et al. 1998; Björnsson et
al. 2000; Einarsdottir et al. 2002; Arnesen et al. 2003; Drennon et al. 2003;
Nordgarden et al. 2005).
Beberapa pengaruh hormon pertumbuhan dalam tubuh antara lain
meningkatkan retensi kalsium, meningkatkan massa otot, merangsang lipolisis,
meningkatkan sintesis protein, merangsang pertumbuhan dari seluruh organ
internal kecuali otak, berperan dalam pemenuhan homeostasi, mengurangi
pengambilan glukosa oleh hati, merangsang glukoneogenesis dalam hati,
berkontribusi dalam pemeliharaan dan fungsi dari islet pankreatik, dan
merangsang sistem imun. Selain pertumbuhan yang lambat, kekurangan hormon
pertumbuhan juga dapat menghambat pematangan seksual.
Gambar 1. Lokasi tempat produksi hormon-hormon pada adenohipofisis teleostei
(Rosenfeld et al. 2007); PRL= prolactin, TSH= thyroid-stimulating
hormone, GH= growth hormone, FSH= follicle-stimulating hormone,
LH= luteinizing hormone, N= neurohypophysts, PI= pars intermidia,
PPD= proximal pars distalis, RPD= rostral pars distalis
4
2.3
Teknologi Protein Rekombinan
DNA rekombinan merupakan hasil dari suatu fragmen DNA yang
mengandung gen yang akan diklon dan diinsersikan pada molekul DNA sirkular
yang disebut vektor (Brown 2003). Vektor tersebut bertindak sebagai wahana
yang membawa gen masuk ke dalam sel tuan rumah yang bisa berupa bakteri
maupun sel jenis lainnya. Dalam sel inang tersebut, vektor melakukan replikasi
dan menghasilkan banyak kopi atau tiruan yang identik, baik vektor itu sendiri
maupun gen yang dibawanya. Ketika sel inang membelah, kopi molekul DNA
rekombinan diwariskan pada progeni dan terjadi replikasi vektor selanjutnya.
Pembelahan sel tersebut akan menghasilkan koloni atau klon sel yang identik.
Kloning dan ekspresi GH rekombinan telah berhasil didapatkan dari beberapa
ikan antara lain ikan rainbow trout (Sekine et al. 1985), ikan tuna (Lin et al.
1995), ikan indian catfish (Anathy et al. 2001), ikan mas (Li et al. 2003), ikan
mas koki (Chan et al. 2003), ikan beronang (Funkenstein et al. 2005), dan ikan
nila merah (Acosta et al. 2007).
Langkah-langkah untuk mendapatkan DNA rekombinan terdiri dari
beberapa tahap yaitu isolasi gen yang akan diinsersikan, preparasi vektor,
pembuatan sel kompeten, ligasi, transformasi, isolasi plasmid ataupun cracking,
dan kloning (Glick & Pasternak 2003). Isolasi gen merupakan langkah awal untuk
mendapatkan DNA rekombinan. Gen tersebut diisolasi dari organisme yang akan
digunakan dengan menggunakan primer yang disusun berdasarkan data dari bank
gen. Jika gen yang akan diisolasi dari suatu spesies tertentu telah diketahui urutan
nukleotidanya, maka primer yang akan digunakan untuk mengisolasi gen target
dapat langsung disusun berdasarkan data tersebut. Akan tetapi, jika data mengenai
gen suatu spesies belum ada, maka primer dapat disusun berdasarkan data
nukleotida dari gen target yang sama tetapi berasal dari beberapa spesies yang
berbeda.
Brown (2003) menyatakan bahwa vektor merupakan molekul DNA sirkular
yang terdapat bebas dalam sel bakteri. Seluruh vektor memiliki paling sedikit 1
rangkaian DNA yang dapat bertindak sebagai asal replikasi sehingga mampu
memperbanyak diri di dalam sel dan tidak tergantung pada kromosom bakteri.
Vektor yang terbaik untuk wahana kloning ialah vektor yang memiliki ukuran
5
kurang dari 10 kb. Akan tetapi, pada keadaan tertentu dapat digunakan plasmid
yang lebih besar untuk kloning.
Salah satu vektor yang biasa digunakan sebagai vektor kloning adalah
pGEM-T Easy (Gambar 2) dan sebagai vektor ekspresi adalah pCold I DNA
(Takara) (Gambar 3). Sebagai vektor kloning, pGEM-T Easy memiliki kelebihan
timin yang menggantung di ujungnya yang terbuka sehingga penempelan gen
insersi tidak memerlukan enzim restriksi, sedangkan pCold I sebagai vektor
ekspresi merangsang ekspresi gen yang diinsersikan dengan memanfaatkan
promotor turunan yang berasal dari gen cspA yang merupakan salah satu gen
cold-shock. Karena vektor ini memanfaatkan promotor turunan dari E. coli, maka
banyak strain E. coli yang dapat dimanfaatkan sebagai host ekspresi. pCold I
mengandung TEE, sekuens His-Tag, dan situs pembelahan Faktor Xa (Takara
2009).
Gambar 2. Peta vektor pGEM-T Easy (Promega 2009)
6
Gambar 3. Peta vektor pCold I (Takara 2009)
2.4
Efek rGH pada Pertumbuhan Ikan
Penggunaan rGH untuk memacu pertumbuhan ikan sudah banyak
dilakukan. Pemberian 0,5% rGH dalam pakan yang diberikan selama 12 minggu
pada juvenil ikan sea bream hitam menunjukkan perbedaan bobot sebesar 41,67%
dari ikan kontrol setelah pemeliharaan selama 18 minggu (Tsai et al. 1997).
Menurut Sekine et al. (1985), pemberian rGH pada ikan rainbow trout dapat
meningkatkan pertumbuhan sebesar 50% dibandingkan dengan ikan rainbow trout
yang tidak diberi perlakuan rGH, sedangkan pada benih ikan beronang, pemberian
rGH sebesar 0,5 µg/g bobot tubuh sebanyak 1 kali per minggu selama 4 minggu
dapat meningkatkan bobot tubuh sebesar 20% dari kontrol (Funkenstein et al.
2005).
Pemberian rGH ikan mas sebesar 0,1 µg/g bobot tubuh yang diproduksi
dalam Pichia pastoris pada benih ikan nila dapat meningkatkan bobot tubuh
sebesar 53,1% dibandingkan dengan kontrol (Li et al. 2003). Pemberian rGH
tersebut dilakukan baik melalui injeksi (Sekine et al. 1985; Tsai et al. 1995;
7
Leedom et al. 2002; Li et al. 2003; Funkenstein et al. 2005), melalui pakan (Tsai
et al. 1997; Xu et al. 2001), ataupun melalui perendaman (Acosta et al. 2007).
2.5
SDS-PAGE
Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)
merupakan metode yang cepat, murah, dan mudah dikerjakan untuk
mengkuantifikasi, membandingkan, dan mengkarakterisasi protein berdasarkan
berat molekul dan pergerakan elektroforetiknya (Bollag et al. 1996; Wikipedia
2009b). Bahan pembuat gelnya yaitu polyacrylamide, merupakan material yang
sama yang digunakan dalam pembuatan lapisan elektroda dan contact lens. PAGE
merupakan gel sintetis, transparan, kuat, dan dapat dibuat untuk berbagai ukuran
pori. Ukuran pori ini dibuat berdasarkan berat protein yang akan dianalisa.
Tabel 1. Rentang resolusi optimal PAGE (Bollag et al. 1996)
Konsentrasi
Akrilamid (% gel)
15
12,5
10
7,5
5
Resolusi
Pemisahan (kDa)
15-45
15-60
18-75
30-120
60-212
SDS merupakan agen pemisah yang biasa digunakan untuk mengubah sifat
protein asli menjadi polipeptida individual. Tanpa SDS, protein berbeda dengan
berat molekul yang sama akan mengalami migrasi yang berbeda sesuai dengan
perbedaan rasio massa, dimana masing-masing protein memiliki nilai isoelektrik
dan berat molekul partikular sesuai dengan struktur primernya (Wikipedia 2009b).
8