ISOLASI α-AMILASE TERMOSTABIL DARI BAKTERI

1
Prosiding Skripsi Semester Genap 2009/2010
SK
SK-091304
ISOLASI α-AMILASE TERMOSTABIL DARI BAKTERI TERMOFILIK
Bacillus stearothermophilus
Sarah*, Surya Rosa Putra1, Herdayanto Sulistyo Putro1
Jurusan Kimia
Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
Institut Teknologi Sepuluh Nopember
Abstrak
α-Amilase termostabil mempunyai aplikasi komersil dan industri yang dapat dihasilkan dalam jumlah besar dan
aktivitas enzim yang tinggi dengan biaya produksi yang ekonomis. α-Amilase memiliki kemampuan menghidrolisis α-1,4glikosidik dari pati. Tujuan penelitian ini adalah untuk menghasilkan α-amilase dari B. stearothermophilus dan menentukan
aktivitas spesifiknya. Penelitian ini dilakukan beberapa tahap, yaitu penentuan kurva pertumbuhan, produksi α-amilase, dan
pemurnian α-amilase dengan pengendapan ammonium sulfat. Pengujian aktivitas α-amilase dapat dilakukan dengan
mengukur zona bening pada metode pewarnaan iodin dan gula reduksi pada metode DNS, sedangkan kadar protein diuji
dengan menggunakan metode Bradford. Kemampuan B. stearothermophilus dalam menghidrolisis pati ditunjukkan dengan
adanya zona bening setelah ditambahkan iodin dengan diameter inti pusat (dalam) sebesar 3 mm dan diameter luar sebesar 9
mm. Aktivitas spesifik α-amilase sebelum dan setelah pemurnian α-amilase dengan pengendapan ammonium sulfat yang
dihasilkan pada penelitian ini masing –masing sebesar 61,35 dan 85,72 Unit/mg protein.
Kata Kunci : Bacillus stearothermophilus, α-Amilase Termostabil, Termofilik
Abstract
Thermostable α-amilase has application of commercial and industry which can be produced in high quantity and
high activity of enzyme by economical cost production. α-Amilase has the capability to hydrolize of α-1,4-glicosidic from
starch. Purpose of this experiment is to produce α-amilase from B. stearothermophilus and determine its specific activity.
This experiment has several treatment, that is determining of B. stearothermophilus’s growth curve, production of αamylase, and purification of the α-amylase enzyme with precipitation of ammonium sulfate. The examination of α -amylase
activity can be done with measuring halo zone in iodine color method and reducing sugar of DNS method, while the protein
assay was examined using Bradford method. The ability of B. stearothermophilus to hydrolize starch was indicated by halo
zone after addition of iodine solution with 3 mm inner diameter and 9 outer diameter. The specific activity of α-amylase
before and after purification of ammonium sulfate precipitation which producted in this experiments was 61,35 and 85,72
Unit/mg protein.
Keywords : Bacillus stearothermophil, Thermostable α-Amylase, Thermophilic
1. Pendahuluan
Masyarakat Indonesia sudah sejak lama
memanfatkan mikroorganisme untuk menghasilkan
barang bernilai ekonomi, misalnya: fermentasi tempe,
tape,
dan
ragi
untuk
minuman
beralkohol.
Mikroorganisme juga merupakan sumber enzim yang
paling banyak digunakan dibandingkan dengan tanaman
dan hewan. Hampir semua proses dalam sel hidup
membutuhkan enzim untuk mempercepat reaksi karena
enzim merupakan biokatalis reaksi kimia.
Industri enzim telah berkembang pesat dan
menempati posisi penting dalam bidang industri.
Kesadaran masyarakat terhadap masalah lingkungan
yang semakin tinggi serta adanya tekanan dari para ahli
dan pecinta lingkungan menjadikan teknologi enzim
sebagai salah satu alternatif untuk menggantikan
berbagai proses kimiawi dalam bidang industri. Salah
satu enzim yang paling banyak diproduksi dan digunakan
* Corresponding author Phone : +6281231033385
e-mail: [email protected]
1
Alamat sekarang : Jurusan Kimia, Fakultas MIPA,
Institut Teknologi Sepuluh Nopember, Surabaya.
e-mail: [email protected]
[email protected]
Prosiding Kimia FMIPA
adalah amilase. Amilase merupakan enzim yang
menghidrolisa molekul pati untuk menghasilkan produk
bervariasi, salah satunya yaitu dekstrin (Chung, et al.,
1997; Windish dan Mhatre, 1965). Enzim ini memiliki
peranan penting pada aplikasi industri dan bioteknologi
dalam makanan, tekstil, dan industri kertas (Pandey et
al., 2000). α-Amilase termostabil telah mempunyai
aplikasi komersil dalam proses pati, makanan, dan
produksi gula (Leveque, et al., 2000), industri tekstil
(Pedersen, et al., 1999), dan proses deterjen (Hewitt dan
Solomons, 1996; Lin, et al., 1998). Untuk aplikasi
industri diperlukan α-amilase yang dapat diproduksi
dalam jumlah besar dan aktivitas yang tinggi dengan
biaya produksi yang ekonomis. Diharapkan nantinya
Indonesia dapat memenuhi kebutuhan akan enzim dalam
negeri sendiri, sehingga dapat menurunkan biaya
produksi produk-produk olahan pati dengan enzim.
Amilase termofilik disukai untuk aplikasi praktis sejak
hidrolisis pati diketahui untuk mempercepat laju pada
temperatur tinggi dan menghasilkan banyak produk
penting dengan berbagai sifat kimia dan fisika yang
berbeda untuk makanan dan industri (Khire, 1994).
Proses produksi α-amilase yang memiliki sifat
termostabil dapat diperoleh dari mikroorganisme
2
termofilik (Leveque et al., 2000). Keuntungan utama dari
penggunaan mikroorganisme termofilik adalah untuk
memperoleh enzim α-amilase dengan protein yang tahan
panas. Sehingga mikroorganisme ini dapat dimanfaatkan
di dalam bidang industri yang menggunakan suhu tinggi.
Namun kebanyakan α-amilase komersial dihasilkan dari
bakteri Bacillus licheniformis, B. amyloliquefaciens, dan
B. stearothermophilus (Uhling, 1998). Pada penelitian
sebelumnya, protein diperoleh dari enzim α-amilase
digunakan media LB (Luria Bertani) yang mengandung
ion kalsium dengan metode sentrifugasi pada ±10.000
rpm, akan tetapi peralatan (centrifuge) yang dapat
digunakan dengan metode ini sangatlah terbatas. Selain
itu media LB yang digunakan juga relatif mahal,
sehingga pada penelitian ini dilakukan proses pemisahan
protein dari α-amilase termostabil pada 2.000 rpm
dengan menggunakan media yang lebih sederhana yaitu
media NB (Nutrien Broth).
2. Bahan dan Metode
2.1 Pembuatan Media
Media yang digunakan untuk biakan bakteri ada dua
jenis, yaitu NA sebagai media padat (media agar miring)
dan NB sebagai media cair. Media padat dibuat dengan
cara melarutkan NA sebanyak 2,8 g dalam 100 mL
aquades. Larutan dipanaskan sambil diaduk supaya
bubuk NA dapat larut sempurna. Setelah larut, media ini
dimasukkan ke dalam tabung reaksi dan ditutup rapat
(sebagai penutup digunakan kapas berlemak yang
dibungkus kasa). Sedangkan pembuatan media cair
dilakukan dengan cara melarutkan 13 g NB dalam 1 L
aquades.
Setelah larut, media ini dimasukkan ke
erlenmeyer dan ditutup rapat (sebagai penutup digunakan
kapas berlemak yang dibungkus kasa steril). Selanjutnya
masing-masing media tersebut disterilkan dengan
menggunakan autoclave pada 121°C selama 15 menit.
Media cair disimpan di lemari es dan media padat
diinkubasi di dalam incubator sampai padat. Media
produksi α-amilase dibuat dengan metode yang sama
namun dengan penambahan larutan pati sebagai substrat.
2.2 Uji Sterilisasi Bakteri
Media yang digunakan untuk sterilisasi bakteri ada
dua jenis, yaitu NA sebagai media padat (media cawan
petri) dan NB sebagai media cair. Media cair dibuat
dengan cara melarutkan NB sebanyak 1,3 g dalam 100
mL aquades disterilkan dengan menggunakan autoclave
pada 121°C selama 15 menit. Setelah disterilkan, media
didinginkan sampai suhu kamar. Isolat Bacillus
stearothermophilus diambil 1 ose dan dimasukkan dalam
100 mL media cair kemudian diinkubasi dalam shaking
incubator pada 120 rpm dan temperatur 45 °C sampai
keruh. Media padat dibuat dengan cara melarutkan NA
sebanyak 1,4 g dalam 50 mL aquades. Larutan
dipanaskan sambil diaduk supaya bubuk NA dapat larut
sempurna. Setelah larut, media disterilkan dengan
menggunakan autoclave pada 121°C selama 15 menit.
Media padat didiamkan sampai suhu 45°C kemudian
dituang dalam cawan petri dan ditambah 50 µL biomassa
dengan merata. Media cawan petri diinkubasi di dalam
incubator sampai tumbuh bakteri. Jika diperoleh bentuk
kultur yang sama, maka kultur B. stearothermophilus
dapat digunakan untuk perlakuan selanjutnya.
Prosiding Kimia FMIPA
2.3 Regenerasi B. stearothermophilus pada Media
Padat dan Penentuan Kurva Pertumbuhan
Regenerasi pada media padat dilakukan dengan
mengambil 1 ose dari isolat Bacillus stearothermophilus
yang sudah dimurnikan kemudian digoreskan pada media
cawan petri dan hal yang sama dilakukan untuk media
agar miring. Inokulum diinkubasi pada suhu kamar
selama 24 jam. Kultur awal diambil 1 ose dan
dimasukkan dalam 10 mL media cair kemudian
diinkubasi dalam shaking incubator pada 120 rpm dan
temperatur 45°C selama 24 jam. Inokulum selanjutnya
dipindahkan ke dalam 90 mL media cair dan diinkubasi
kembali pada kondisi yang sama dan diukur OD (Optical
Density) tiap 1 jam. Pertumbuhan B. stearothermophilus
diamati menggunakan spektrofotometer pada panjang
gelombang (λ) 600 nm dengan blanko media NB yang
tidak ditumbuhkan bakteri. Data yang didapatkan adalah
OD yang diplotkan terhadap waktu pengecekan jumlah
bakteri. Hal ini dilakukan untuk menentukan fase log dari
B. stearothermophilus sehingga dapat diketahui waktu
optimum untuk produksi enzim α-amilase.
2.4 Produksi Enzim α-Amilase dan Sel Kering
Produksi enzim α-amilase dan sel kering digunakan
media sederhana yaitu media NB tanpa penambahan ion
Ca2+.
Sebelum
menginokulasi
isolat
B.
stearothermophilus, harus dibuat terlebih dahulu starter
dari media produksi yakni media NB yang mengandung
pati 1% (w/v). Starter dibuat dengan mengambil koloni
dari kultur yang telah diremajakan, diambil satu ose
kemudian diinokulasi ke dalam 10 mL media produksi.
Sel bakteri ini diinkubasi dalam shaking incubator 120
rpm pada suhu 45°C selama 7 jam (sesuai dengan fase
log yang diperoleh pada penentuan kurva pertumbuhan).
Inokulum selanjutnya dipindahkan ke dalam 990 mL
media produksi secara aseptik dan diinkubasi kembali
pada kondisi yang sama dan diukur OD tiap 1 jam.
Larutan enzim diperoleh dengan cara memisahkan
supernatan (yang mengandung enzim) dari media
produksi menggunakan sentrifugasi pada kecepatan 2000
rpm selama 20 menit sebanyak 4 kali. Supernatan (yang
mengandung enzim) dipekatkan dengan freeze drying
sampai volume ±10 mL, sedangkan biomassanya
dikeringkan dengan liofilisasi pada suhu -87°C selama
24 jam kemudian ditimbang massanya.
Prosedur pada produksi sel kering dilakukan dengan
prosedur yang sama dengan produksi α-amilase namun
tanpa penambahan pati dan diinkubasi selama 10 jam
(pada awal fase stasioner), di mana pada fase ini sel
bakteri berada dalam jumlah besar. Sel kering diperoleh
setelah dilakukan liofilisasi pada suhu -87°C selama 24
jam dan ditimbang massanya.
2.5 Penentuan Kandungan Protein
2.5.1 Pembuatan Kurva Standar BSA
Kurva standar BSA dibuat dari larutan stok BSA
2000 ppm (di buat dari 100 mg BSA dilarutkan dalam 25
mL aquades dan diaduk perlahan-lahan,kemudian
diencerkan sampai 50 mL). Konsentrasi standar BSA
yang digunakan untuk penentuan konsentrasi protein
adalah 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, dan 800 ppm.
Larutan dengan variasi konsentrasi tersebut diambil dari
larutan stok sebanyak 0,5; 1; 1,5; 2; 2,5 ; 3; 3,5; dan 4
mL kemudian diencerkan dengan aquades sampai 10 mL.
Sampel sebanyak 7 mL yang berisi larutan BSA pada
berbagai konsentrasi direaksikan dengan 3 mL reagen
Bradford dan diinkubasi pada suhu ruang selama 10
3
menit. Setelah itu, sampel diukur absorbansinya pada λ
595 nm dan kurva dibuat antara konsentrasi larutan BSA
(C) terhadap absorbansi (A). Persamaan garis yang
diperoleh dapat digunakan pada perhitungan kandungan
protein enzim α-amilase. Sebagai blanko digunakan
aquabides.
2.5.2 Penentuan Konsentrasi Protein
Kadar protein ditentukan dengan metode Bradford
(1976) dan digunakan BSA (Bovine Serum Albumin)
sebagai protein standar (Snyder dan Desborou, 1978;
Beaumont et al, 1990; Najavi et al., 2005). Enzim diambil
sebanyak 1 mL kemudian diencerkan dengan aquades ke
dalam labu ukur 10 mL. Enzim hasil pengenceran diambil
sebanyak 7 mL dan ditambahkan 3 mL reagen Bradford
lalu divortex kemudian diinkubasi selama 5 menit.
Larutan diukur absorbansinya dengan spectrophotometer
pada λ 595 nm. Data absorbansi yang diperoleh
dikonversikan pada persamaan garis dari kurva standar
BSA yang telah dibuat sehingga diperoleh konsentrasi
kandungan protein enzim α-amilase.
absorbansinya pada λ 540 nm. Sebagai blanko digunakan
buffer fosfat pH 6. Konsentrasi glukosa ditentukan
berdasarkan
absorbansi
larutan
sampel
yang
dikonversikan pada kurva standar.
2.8 Uji Aktivitas α-Amilase
2.8.1 Uji Kualitatif
Kultur yang sudah diremajakan digores
menggunakan ose, dipindahkan ke dalam media NA
yang mengandung pati 1% secara aseptik dan disimpan
pada 45°C selama 24 jam. Setelah itu, larutan KI/I 2
dituangkan ke dalam media hingga merata atau Uji
kualitatif α-amilase dapat juga diperlakukan seperti uji
kemurnian bakteri namun kultur yang digunakan adalah
kultur yang sudah diremajakan, kemudian larutan KI/I 2
dituangkan ke dalam media hingga merata. Aktivitas αamilase ditunjukkan dengan adanya warna halo zone saat
ditambahkan KI/I2, kemudian diukur diameter pada
daerah halo zone. Sebagai kontrol, digunakan media
yang mengandung pati dan tidak ditumbuhi bakteri.
2.8.2 Uji Kuantitatif
2.6 Pemurnian α-Amilase dengan Pengendapan
Ammonium Sulfat
Enzim diendapkan dari Supernatan
dengan
penambahan sejumlah tertentu garam ammonium sulfat
sampai tingkat kejenuhan 40% (lampiran G)
ditambahkan sedikit demi sedikit ke dalam 10 mL
supernatan pada suhu 2-4°C sambil diaduk dengan
pengaduk magnetik. Larutan disimpan di lemari es
selama 24 jam (Tigue et al., 1995; Burhan et al., 2003).
Endapan diperoleh kembali dengan sentrifugasi pada
kecepatan 2000 rpm selama 20 menit sebanyak 4 kali,
kemudian endapannya dilarutkan dengan 4 mL buffer
fosfat pH 6 kemudian dihitung kandungan protein dan
diuji aktivitasnya.
2.7 Pembuatan Kurva Standar Glukosa
2.7.1 Penentuan Panjang Gelombang Maksimum
Penentuan panjang gelombang maksimum (λmaks)
dilakukan dengan menggunakan larutan standar glukosa
dan ditambah dengan reagen DNS kemudian ditentukan
absorbansinya menggunakan spektrofotometer. Dalam
penelitian ini digunakan larutan stok glukosa 2 M (dibuat
dari 36 g glukosa dilarutkan dalam 100 mL aquades)
kemudian diambil sebanyak 1 mL dan ditambahkan 1,5
mL reagen DNS, diinkubasi pada 100°C selama 10 menit
dan kemudian didinginkan pada suhu ruang selama 20
menit. Larutan standar glukosa diukur absorbansinya
pada λ 500-560 nm dengan interval 5 nm sebanyak tiga
kali untuk masing masing panjang gelombang sehingga
diperoleh λmaks yang digunakan untuk pengukuran
selanjutnya. Sebagai blanko digunakan aquabides. Kurva
dibuat antara λ sebagai absis terhadap absorbansi sebagai
ordinat.
2.7.2 Penentuan Kurva Standar Glukosa
Kurva standar glukosa dibuat dari larutan stok
glukosa 2 M. Konsentrasi yang digunakan adalah 0,2;
0,4; 0,6; 0,8; dan 1 M. Larutan dengan variasi
konsentrasi tersebut diambil dari larutan stok sebanyak 1,
2, 3, 4, dan 5 mL, kemudian diencerkan dengan aquades
sampai 10 mL. Sampel sebanyak 1 mL yang berisi
larutan glukosa pada berbagai konsentrasi direaksikan
dengan 1,5 mL reagen DNS, diinkubasi pada 100°C
selama 10 menit dan kemudian didinginkan pada suhu
ruang selama 20 menit. Setelah itu sampel diukur
Prosiding Kimia FMIPA
Aktivitas enzim α-amilase secara kuantitatif
dapat ditentukan dengan menggunakan metode DNS
(Bernfeld,1955) pada pengukuran λ 540 nm (Miller, 1959).
Ke dalam sampel dan kontrol (1 mL) ditambahkan 1,5 mL
reagen DNS. Campuran dihomogenisasi dengan vortex
dan diinkubasi pada 100°C selama 10 menit. Setelah itu,
campuran didinginkan pada suhu ruang selama 20 menit
dan diukur absorbansinya pada panjang gelombang 545
nm. Sampel disiapkan dengan mereaksikan 500 µL enzim
dengan 500 µL substrat pati 1% (w/v) dalam 0,1 M buffer
fosfat pH 6 dan divortex untuk menghomogenkan
larutan, kemudian diinkubasi pada temperatur 40 °C
selama 10 menit. Glukosa sebagai standar, enzim yang
telah diinaktivasi (100°C selama 10 menit) digunakan
sebagai kontrol, dan buffer fosfat pH 6 sebagai blanko.
Aktivitas α-Amilase dinyatakan dalam unit, di mana satu
unit enzim didefinisikan sebagai jumlah enzim yang
dibutuhkan untuk menghasilkan 1,0 µmol gula pereduksi
per menit di bawah kondisi pengujian.
3. Hasil dan Pembahasan
3.1 Sterilisasi Bakteri Bacillus Stearothermophilus
Kultur yang tumbuh untuk sterilisasi isolat B.
stearothermophilus bentuknya sama antara kultur yang
satu dengan kultur yang lain. Hal ini menunjukkan
bahwa isolat B. stearothermophilus tidak terkontaminasi
oleh bakteri lain, sehingga kultur tersebut dapat
digunakan untuk regenerasi pada media padat.
3.2 Penentuan Kurva Pertumbuhan
Pertumbuhan pada bakteri didefinisikan sebagai
pertambahan berat (jumlah) sel karena berat sel relatif
sama dengan siklus sel (Purwoko, 2007). Pertumbuhan
kultur terjadi dalam beberapa tahap, yaitu fase lag, fase
log, fase stasioner, dan fase kematian. Pertumbuhan
bakteri yang ditentukan dengan pengukuran OD dapat
diterjemahkan ke dalam jumlah bakteri (biomassa)
seperti yang pernah dilakukan oleh Kambourova et al.,
(1995). Pengukuran OD dari B. stearothermophilus
menghasilkan kurva pertumbuhan bakteri seperti pada
gambar 3.1.
4
Gambar 3.3 Uji Kualitatif α-Amilase
Gambar 3.1 Grafik Kurva Pertumbuhan
B. stearothermophilus Metode Turbidimetri
Dari data kurva tersebut dapat diketahui bahwa fase
eksponensial (fase logaritmik) B. stearothermophilus
mulai jam ke-2 sampai jam ke-10. Hasil ini sesuai
dengan penelitian sebelumnya yang pernah dilakukan
oleh Xiao et al., (2006), kurva pertumbuhan B.
stearothermophilus pada sampel yang berbeda memiliki
fase log yang sama yakni dari jam ke-2 sampai jam ke10.
3.3 Produksi Enzim α-Amilase dan Sel kering
Produksi α-amilase dilakukan dengan menambahkan
pati 1% (w/v) ke dalam media produksi sebagai substrat
untuk menghasilkan α-amilase. Penambahan pati
bertujuan untuk menginduksi α-amilase sehingga
diharapkan α-amilase yang dihasilkan maksimal karena
pati juga merupakan sebagai makronutrien yang penting
untuk pertumbuhan sel (Brock et al., 1994; Gupta et al.,
2003). Supernatan yang diperoleh dari panen produksi
berjumlah 932 mL dan menjadi 18 mL setelah
dipekatkan dengan freeze drying. Larutan enzim tersebut
dipekatkan dengan freeze drying karena protein tidak
dapat dipekatkan dengan penguapan pada suhu tinggi dan
semua materi biologis hasil freeze drying biasanya stabil
untuk waktu yang lama (Boyer, 1993). Sel kering yang
diperoleh dalam 1 L media NB adalah sebesar 0,29 g dan
sel kering yang diperoleh dalam 1 L media NB yang
mengandung pati 1% adalah sebesar 0,82 g. Kambourova
et al., (1995) melaporkan bahwa B. stearothermophilus
menghasilkan sel kering sebanyak 0,9 g dalam 1 L media
cair yang mengandung pati, sehingga hasil yang didapat
setara dengan yang pernah dilakukan oleh Kambourova
et al., (1995).
3.4 Uji Aktivitas α-Amilase
3.4.1 Uji Kualitatif
Pewarnaan iodin merupakan salah satu metode
untuk mendeteksi aktivitas α-amilase dan berfungsi
sebagai reagen pendeteksi adanya amilase. Zona bening
yang terbentuk memiliki diameter, yaitu diameter inti
pusat (dalam) sebesar 3 mm dan diameter luar sebesar 9
mm. Hasil ini hampir mendekati hasil yang didapat oleh
Arikan (2008) yang menghasilkan 8 mm zona diameter
medium agar pati. Akan tetapi, Fernández et al. (1998)
melaporkan bahwa dalam penelitiannya menghasilkan
0.7 mm diameter inti dan 1.5 mm diameter luar.
Diameter yang didapat lebih besar daripada diameter
yang dihasilkan oleh Fernández et al., (1998). Hal ini
disebabkan strain yang digunakan dalam penelitian ini
berbeda dengan yang digunakan oleh Fernández et al.,
(1998).
Prosiding Kimia FMIPA
a) Media NA (1% pati) tidak ditumbuhi B.
stearothermophilus b) Media NA (1% pati) ditumbuhi
biomassa B. stearothermophilus
3.4.2 Uji Kuantitatif
Penentuan konsentrasi protein dilakukan dengan
metode Bradford. Sedangkan aktivitas α-amilase secara
kuantitatif ditentukan dengan menggunakan metode
DNS. Aktivitas enzim merupakan salah satu parameter
yang harus dikontrol selama pemurnian supaya dapat
diperoleh informasi tentang aktivitas spesifik enzim, di
mana aktivitas spesifik adalah unit enzim per mg
protein. Nilai aktivitas spesifik ini dapat digunakan
sebagai ukuran besarnya kemurnian enzim hasil isolasi.
Tabel 3.1 Pemurnian dan Aktivitas Enzim α-Amilase
Dari tabel 3.1 dapat dilihat bahwa Enzim αamilase yang didapat dari hasil freeze drying (18 mL)
dan pemurnian α-amilase dengan pengendapan
(NH4)2SO4 (40%) (4,8 mL), memiliki aktifitas masingmasing sebesar 5886,0 dan 3139,2 Unit sehingga
diperoleh aktifitas spesifik masing-masing 61,35 dan
85,72 U/mg protein. Tingkat kemurnian yang diperoleh
adalah sebanyak 1,4 kali. Satu unit aktivitas enzim
didefinisikan sebagai jumlah enzim yang dibutuhkan
untuk menghasilkan 1,0 µmol gula pereduksi per menit
di bawah kondisi pengujian. Hasil yang didapat tidak
sebanding dengan yang pernah dilakukan oleh Catherine
et al., (1996) pada penelitiannya yang menghasilkan
aktivitas spesifik α-Amilase sebesar 171,4 U/mg
((NH4)2SO4 40%) dalam pemurnian α-amilase dari B.
flavothermus. Hal ini disebabkan bakteri yang digunakan
dalam penelitian ini spesiesnya berbeda dengan yang
digunakan oleh Catherine et al., (1996).
4. Kesimpulan
Kesimpulan yang diperoleh dari penelitian ini adalah
B. stearothermophilus mempunyai fase log selama 10
jam dan dapat bekerja pada suhu 45°C. Sel kering yang
diperoleh dalam 1 L media NB yang mengandung pati
adalah sebesar 0,82 g. Hasil pengujian aktivitas enzim
menunjukkan bahwa enzim α-amilase dapat dilakukan
dengan mengukur zona bening Diameter zona bening
pada B. stearothermophilus yaitu diameter inti pusat
(dalam) sebesar 3 mm dan diameter luar sebesar 9 mm.
Enzim
α-amilase
yang
diperoleh
dari
B.
stearothermophilus memiliki aktivitas enzim sebelum
dan sesudah pemurnian yaitu sebesar 5886,0 dan 3139,2
unit, sehingga Aktivitas spesifik enzim α-amilase
5
sebelum dan sesudah pemurnian yaitu sebesar 61,35 dan
85,72 U/mg protein.
5. Ucapan Terimakasih
1. Prof. Dr. Surya Rosa Putra, MS atas dukungan,
bimbingan, dan motivasi yang diberikan
2. Herdayanto Sulistyo Putro, S, Si, M, Si atas
dukungan, bimbingan dan motivasi yang diberikan
3. Umi, Abah, dan keluarga atas kasih sayang,
dukungan, dan doanya
4. Dra. Yulfi Zetra, MS selaku dosen wali
stearothermophilus Cells by Entrapment in Various
Matrices, Process Biochemistry, Vol. 30, No. 2, pp.
141-144
Khire, J. M., (1994), Production of Moderately
Halophilic Amylase by Newly Isolated Micrococcus
sp. 4 from a Salt-Pan, Lett. Appl. Microbiol, 19:
210–212
Leveque, E., Janecek, S., Haye, B., dan Belarbi, A.,
(2000), Thermophilic Archaeal Amylolytic Enzymes,
Enzyme dan Microbial Technology, 26: 3–14
Daftar Pustaka
Arikan, B., (2008), Highly Thermostable, Thermophilic,
Alkaline, SDS and Chelator Resistant Amylase from
a Thermophilic Bacillus sp. Isolate A3-15,
Bioresource Technology, 99: 3071-3076
Beaumont, F., Jouvec, H., M., Gagnon, J., Gaillard, J.,
and Pelmont, J., (1990), Purification and Properties
of a Catalase from Potato Tubers (Solanum
tuberosum L), J. Plant Science, 72: 19-26
Bernfeld, P., (1955), Amylases α- and β-Methods,
Enzymology 1: 149-158
Boyer, R.F., (1993), Modern Experimental Biochemistry,
2nd Edition, The Benjamin/Cummings Pub., Co.,
Inc., California, p.42-210
Brock, T. D., Madigan, M. T., Martinko, J. M. (1994),
Biology
of
Microorganisms,
Prentice-Hall
International Inc., London, 7
Burhan, A., Nisa, U., Gokhan, C., Omer, C., Ashabil, A.,
& Osman, G, (2003), Enzymatic Properties of a
Novel Thermophilic, Alkaline and Chelator
Resistant Amylase from an Alkalophilic Bacillus sp.
Isolate ANT-6, Process Biochemistry, 38: 1397–
1403
Catherine, T. K., Declan, J. B., William, M. F., (1997),
Purification and Characterization of the α-Amylase
of Bacillus flavothermus, Enzyme and Microbial
Technology, 20: 340-343
Chung, A. P., Rainey, F., Nobre, M. F., Burghardt, J., da
Costa, M. S., (1997), Meiothermus Cerbereus sp.
Nov., a New Slightly Tthermophilic Species with
High Levels of 3-Hydroxy Fatty Acids, Int. J. Syst.
Bacteriol, 47: 1225–1230
Fernández, P. S., Periago, P. M., Salmerón, M. C.,
Martínez, A., (1998), Predictive Model to Describe
The Combined Effect of pH and NaCl on Apparent
Heat Resistance of Bacillus stearothermophilus,
International Journal of Food Microbiology 44: 21–
30
Gupta, R., Gigras, P., Mohapatra, H., Goswami, V.K.,
Chauhan, B., (2003), Microbial α-Amylases: a
Biotechnological Perspective, Process Biochem.,
38: 1599-1616
Kambourova, M. S., Manolov, R. J., dan Emanuilova, E.
I.,
(1995),
Immobilization
of
Bacillus
Prosiding Kimia FMIPA
Lin, L. L., Chyau, C. C., dan Hsu, W. H., (1998),
Production and Properties of a Raw-StarchDegrading Amylase from Thermophilic and
Alkaliphilic Bacillus sp. TS-23, Biotechnology and
Applied Biochemistry, 28: 61–68
Miller, G. L., (1959), Use of Dinitrosalicylic Acid
Reagent for Determination of Reducing Sugar,
Anal. Chem. 31: 426–428
Najafi, Mohsen F., Kembhavi, A., (2005), One Step
Purification and Characterization of an
Extracellular α-Amylase from Marine Vibrio sp.,
Enzyme and Microbial Technology, 36: 535 -539
Pandey, A., Nigam, P., Soccol, C. R., Soccol, V. T.,
Sing, D., dan Mohan, R., (2000), Advances in
Microbial Amylases, Biotechnology and Applied
Biochemistry, 31: 135–152
Pedersen, S., Hendriksen, H. V., dan Bisgard-Frantzen,
H., (1999), A Process for Textile Warp Sizing Using
Enzymatically
Modified
Starches,
Patent
Application WO 99/35325
Purwoko, T., (2007), Fisiologi Mikroba, PT. Bumi
Aksara, Jakarta
Snyder, J., and Desborou, S., (1978), Rapid Estimation of
Potato Tuber Total Protein with Coomassie
Brilliant Blue G-250, Theo. Appl. Genet., 52: 135139
Tigue, M. A., Kelly, C. T., Doyle, E. M., dan Fogarty,
W. M, (1995), The Alkaline Amylase of the
Alkalophilic Bacillus sp. IMD 370, Enzyme and
Microbial Technology, 17: 570-573
Uhling, H., (1998 ), Industrial Enzymes and Their
Applications, Translated and update by Elfried M.
Linsmaier-bednar, Ph.D. New York
Windish, W. W., Mhatre, N. S., (1965), Microbial
Amylases, In W. U. Wayne (Ed.), Advances in
applied microbiology (Vol. 7, pp. 273-304),
Academic Press, New York
Xiao, D. C., Jin-Ah Yoo, Matthew T. H., (2006), The
Influence of Milk Composition on the Growth of
Bacillus stearothermophilus, Journal of Food
Engineering 77: 96-102