perbandingan karakter fenotip buah melon
advertisement
EKSPRESI GEN MUTAN araA DENGAN PERUBAHAN ASAM AMINO Q269K DARI ISOLAT Geobacillus stearothermophilus TANJUNG API, POSO, INDONESIA SKRIPSI Disusun oleh : Zulfikar Achmad Tanjung 06/193918/BI/07789 FAKULTAS BIOLOGI UNIVERSITAS GADJAH MADA YOGYAKARTA 2011 i EKSPRESI GEN MUTAN araA DENGAN PERUBAHAN ASAM AMINO Q269K DARI ISOLAT Geobacillus stearothermophilus TANJUNG API, POSO, INDONESIA SKRIPSI Untuk memenuhi sebagian persyaratan guna mencapai derajad Sarjana Sains Program Studi Biologi Oleh: Zulfikar Achmad Tanjung 06/193918/BI/07789 Dosen Pembimbing Dr. Niken Satuti Nur Handayani, M.Sc. Budi Saksono, M.Sc. FAKULTAS BIOLOGI UNIVERSITAS GADJAH MADA YOGYAKARTA 2011 ii LEMBAR PENGESAHAN EKSPRESI GEN MUTAN araA DENGAN PERUBAHAN ASAM AMINO Q269K DARI ISOLAT Geobacillus stearothermophilus TANJUNG API, POSO, INDONESIA Skripsi Oleh: Zulfikar Achmad Tanjung 06/193918/BI/07789 Telah dipertahankan di depan Tim Penguji pada tanggal ………………… dan dinyatakan telah memenuhi syarat Yogyakarta, Maret 2011 Universitas Gadjah Mada Fakultas Biologi Tim Penguji Pembimbing I Dekan Dr. Niken Satuti Nur Handayani, M.Sc. Dr. Retno Peni Sancayaningsih, M.Sc. Pembimbing II Budi Saksono, M.Sc. Penguji III Dr. Rarastoeti Pratiwi, M.Sc. iii KATA PENGANTAR Puji syukur kepada Allah Subhanahu wa Ta’ala, atas karunia-Nya, penulis senantiasa diberi kekuatan untuk menyelesaikan penelitian berjudul “Ekspresi Gen Mutan araA dengan Perubahan Asam Amino Q269K dari Isolat Geobacillus stearothermophilus Tanjung Api, Poso, Indonesia” Laporan penelitian ini disusun untuk memenuhi sebagian persyaratan guna mencapai derajad Sarjana Sains Program Studi Biologi, Fakultas Biologi Universitas Gadjah Mada. Penulis berharap penelitian Skripsi ini dapat bermanfaat bagi penulis maupun rekan-rekan Biologi dan pihak terkait dengan bidang kajian. Dalam penyusunan naskah Skripsi ini penulis menyadari banyak mendapat bantuan dari berbagai pihak. Oleh karena itu Penulis mengucapkan terima kasih kepada: 1. Budi Saksono selaku kepala Laboratorium CBRG (Carbohydrate Based Research Group) puslit Bioteknologi LIPI yang telah memberikan izin penelitian di laboratorium. 2. Dr.Niken Satuti Nur Handayani, M.Sc selaku dosen pembimbing dan dosen penguji I yang telah memberikan arahan dan bimbingan dalam pelaksanaan penelitian. 3. Dr. Rarastoeti Pratiwi, M.Sc selaku dosen penguji III 4. Dra. Kistinah Sugihardjo, SU. selaku dosen pengelola skripsi Fakultas Biologi UGM. 5. Bapak, Ibu dan adik tercinta yang senantiasa mendoakan dan mendukung dalam setiap langkah serta kasih sayang yang selama ini diberikan. 6. Anggota Laboratorium CBRG (Mba Ani, Mba Linda Mba Lita, Tegariana) yang telah memberikan suasana yang nyaman dalam melaksanakan penelitian. 7. Ndaru Triutomo dan Keluarga Bp. Sukendar sebagai partner dan tempat bernaung penulis selama penelitian. 8. Cahya sebagai sahabat yang selalu membantu urusan akademik di Yogyakarta. iv 9. Keluargaku, sahabatku, teman-teman Kelompok Studi Kelautan Fakultas Biologi UGM yang telah memberikan kehangatan, kenyamanan, semangat dan pengalaman hebat yang tak terlupakan, JALES VIVA JAYA KSK!! 10. Pihak-pihak lain yang telah menyediakan fasilitas dan telah membantu terlaksananya penelitian ini. Penulis menyadari bahwa tulisan penulis tidak lepas dari kekurangan. Oleh karena itu penulis mengharapkan saran dan kritik demi peningkatan penulisan berikutnya. Semoga laporan ini memberikan manfaat bagi pembaca dan pihak-pihak lain yang memerlukannya. Yogyakarta, Maret 2011 Penulis v DAFTAR ISI SAMPUL DALAM………………………………………………….. i HALAMAN JUDUL............................................................................ ii HALAMAN PENGESAHAN.............................................................. iii KATA PENGANTAR.......................................................................... iv DAFTAR ISI........................................................................................ vi DAFTAR TABEL................................................................................ viii DAFTAR GAMBAR........................................................................... ix DAFTAR LAMPIRAN......................................................................... x INTISARI............................................................................................. xi ABSTRACT…………………………………………………………. xii I. PENDAHULUAN............................................................................ 1 A. Latar Belakang............................................................................. 1 B. Permasalahan............................................................................... 2 C. Tujuan.......................................................................................... 3 D. Manfaat........................................................................................ 3 II. TINJAUAN PUSTAKA DAN HIPOTESIS.................................... 4 A. TINJAUAN PUSTAKA................................................................ 4 1. L-arabinose isomerase………………………………………… 4 2. Geobacillus stearothermophilus………………………………. 6 3. Site-Directed Mutagenesis………………………………………… 7 4. SDS-PAGE…………………………………………………... 9 5. Kromatografi Penukar Ion..……………………………………….. 10 B. Hipotesis......................................................................................... 11 III. BAHAN DAN CARA KERJA........................................................ 12 A. Bahan dan Alat.............................................................................. 12 B. Waktu dan Tempat Penelitian........................................................ 13 vi C. Alur Penelitian............................................................................... 13 D. Cara Kerja..................................................................................... 13 IV. HASIL DAN PEMBAHASAN...................................................... 20 V. SIMPULAN DAN SARAN........................................................... 30 A. Kesimpulan.................................................................................... 30 B. Saran.............................................................................................. 30 DAFTAR PUSTAKA ........................................................................... 31 LAMPIRAN.......................................................................................... 32 vii DAFTAR TABEL Tabel 1. Bioproperti L-AI dari beberapa bakteri ................................................... 5 Tabel 2. Komposisi Reaksi PCR koloni.................................................................. 14 viii DAFTAR GAMBAR Gambar 1. Struktur kristal 3D L-AI dari E. coli ................................................... 5 Gambar 2. Isomerasi L-arabinosa menjadi L-ribulosa .......................................... 6 Gambar 3. Metabolisme Tagatosa pada S. aureus ................................................ 6 Gambar 4. Sel G. stearothermophilus ................................................................... 7 Gambar 5. Skema umum site-directed mutagenesis ............................................. 8 Gambar 6. Posisi mutasi gen araA dari araA local wild type menjadi araA mutan ............................................................................ 20 Gambar 7. Posisi mutasi asam amino L-arabinose isomerase dari GSAI lokal menjadi GSAI mutan ........................................................................... 21 Gambar 8. Hasil PCR koloni gen araA dari 5 koloni ........................................... 22 Gambar 9. Visualisasi total protein pada masing-masing perlakuan medium dan waktu induksi. ...................................................................................... 23 Gambar 10. Data pertumbuhan bakteri pada variasi medium dan variasi waktu induksi. ............................................................................................... 24 Gambar 11. Visualisasi hasil freezing-thawing dari perlakuan medium LB -NaCl. ........................................................................................... 25 Gambar 12.Visualisasi hasil freezing-thawing dari perlakuan medium LCT +YE. ........................................................................................... 26 Gambar 13. Visualisasi hasil produksi enzim GSAI Q269K. ................................. 27 Gambar 14. Grafik konsentrasi protein pada proses purifikasi enzim GSAI Q269K. ............................................................................................... 28 Gambar 15. Visualisasi protein hasil purifikasi enzim GSAI Q269K .................... 28 ix DAFTAR LAMPIRAN Lampiran 1. Komposisi Medium ....................................................................... 35 Lampiran 2. Komposisi Bufer SDS Page .......................................................... 35 Lampiran 3. Komposisi Separated Gel PAGE ................................................... 35 Lampiran 4. Komposisi Concentrating Gel PAGE............................................. 35 Lampiran 5. Peta plasmid pET-21b .................................................................... 36 Lampiran 6. 1 kb DNA ladder marker................................................................ 37 Lampiran 7. Unstained Protein MW marker....................................................... 37 x EKSPRESI GEN MUTAN araA DENGAN PERUBAHAN ASAM AMINO Q269K DARI ISOLAT Geobacillus stearothermophilus TANJUNG API, POSO, INDONESIA Oleh: Zulfikar Achmad Tanjung 06/193918/BI/07789 INTISARI Tagatosa merupakan gula alternatif yang memiliki macam keunggulan dibandingkan sukrosa. Kelebihan tersebut antara lain yaitu untuk mengatasi obesitas, pencegahan karies gigi, peningkatan kualitas kehamilan dan fetus, mengurangi resiko diabetes, hiperglikemia, anemia, dan hemophilia. Enzim L-arabinose isomerase (LAI) mampu mengubah galaktosa menjadi tagatosa. Secara umum produksi tagatosa dengan bahan galaktosa dilakukan pada suhu yang tinggi (>70 oC). Hal ini memberikan keuntungan yaitu laju reaksi yang cepat serta produk konversi yang lebih tinggi. Namun, masalah lain muncul ketika konversi dilakukan pada suhu yang tinggi serta dengan pH alkali terjadi browning pada substrat yang diakibatkan oleh karamelisasi serta produk samping yang menurunkan produk akhir. Rekayasa pada LAI dari Geobacillus stearothermophilus US100 telah berhasil menurunkan pH optimum dari 7.5 menjadi 6.5 dengan mengubah asam amino 269K. Isolat Geobacillus stearothermophilus dari Tanjung Api, Poso, Indonesia juga telah diidentifikasi memiliki gen araA yang mengkode L-AI. Mutasi pada level DNA untuk mengubah asam amino Q269K juga sudah berhasil dilakukan. Oleh karena itu, gen araA mutan perlu diekspresikan dan dipurifikasi menjadi enzim L-AI mutan. Penelitian ini dilakukan untuk mengekspresikan dan memurifikasi enzim L-AI Q269K. Enzim L-AI Q269K dapat diekspresikan dengan baik pada medium Limbah Cair Tahu dengan Yeast Extract dengan waktu induksi 18 jam. Purifikasi Enzim L-AI Q269K dengan peluruh protein 300 mM NaCl dalam 10 mM Tris HCl pH 7.5 menghasilkan Enzim L-AI Q269K murni. Kata kunci: Ekspresi, purifikasi, L-arabinose isomerase, mutasi Q269K, Geobacillus stearothermophilus xi EXPRESSION OF araA MUTANT Q269K FROM Geobacillus stearothermophilus ISOLATED FROM TANJUNG API, POSO, INDONESIA By: Zulfikar Achmad Tanjung 06/193918/BI/07789 ABSTRACT Tagatose is alternative low calorie sweetener. It has a range of advantages over sucrose. The advantages are, among others, to overcome obesity, dental caries prevention, improving the quality of pregnancy and the fetus, reducing the risk of diabetes, hyperglycemia, anemia, and hemophilia. The enzyme L-arabinose isomerase (L-AI) is able to convert galactose into tagatose. In general, the production of galactose with tagatosa as a substrate performed at high temperatures (> 70°C). This provides the advantage of a rapid reaction rate and higher conversion products. However, another problem arises when conversion done at high temperature and alkaline pH occurs with browning on the substrate caused by the caramelization and byproducts that lower the final product. Engineering at the L-AI from Geobacillus stearothermophilus US100 has successfully lowered the pH optimum of 7.5 to 6.5 by changing the amino acid 269K. Geobacillus stearothermophilus isolates from Tanjung Api, Poso, Indonesia also has been identified as having araA gene coding for L-AI. Mutations in the DNA level to change the Q269K amino acid has also been successfully performed. Therefore, araA mutant needs to be expressed and purified the enzyme L-AI mutant. This study aimed to express and optimize the enzyme and followed by it purification. Induction was performed by addition of 1 mM IPTG into the culture. Optimizing the expression of the enzyme was performed with a set of various mediums and various induction time. The mediums were Luria Bertani (LB), LB minus NaCl, Tofu Liquid Waste added Yeast Extract, and Tofu Liquid Waste added NaCl and Yeast Extract. Optimizing the induction time was performed from 4, 6, 12, 16, and 24 hours. The expression was visualized by SDS-PAGE. Purification was performed with freezing-thawing, heat-treatment followed by anion exchange chromatography. Result showed that the best condition for expressing araA mutant Q269K was obtained when medium Tofu Liquid Waste was added by Yeast Extract and has been inducted for 18 hours. SDS-PAGE results showed that pure enzyme was obtained by eluted 300 mM NaCl in Tris HCl pH 7.5. Key words: Expression, purification, L-arabinose isomerase, mutation of Q269K, Geobacillus stearothermophilus xii
