Optimasi produksi enzimatik dan isolasi DAG dari

TINJAUAN PUSTAKA
Crude Palm Oil
Crude Palm Oil (CPO) atau minyak sawit mentah rnerupakan minyak hasil
olahan dari buah kelapa sawit (Elaeis guinensis JACQ) (Gambar 1). Negara
penghasil minyak sawit terbesar di dunia adalah Malaysia, sedangkan Indonesia
menempati urutan kedua. Salah satu kekayaan dam dari Indonesia ini pernah
mengalami kontroversi pada tahun 80-an. Minyak sawit pernah diisukan sebagai
pemicu sakit jantung, yang disebabkan oleh kandungan lemak trans yang dapat
menaikkan kadar LDL di dalam darah. Lemak trans ini terbentuk karena minyak
terhidrogenasi dan membentuk padatan (Brown & Jacobson 2005). Harga CPO
yang dapat tiga kali lebih murah dari minyak kedelai merupakan daya tarik bagi
para pelaku industri. Selain itu, rninyak sawit tidak beraroma ketika mengalami
hidrogenasi seperti minyak kedelai, dan minyak sawit juga lebih sehat
dibandingkan minyak nabati lainnya (Brown & Jacobson 2005). Beberapa
manfaat yang dimiliki CPO adalah: (1) dalam industri makanan seperti: minyak
goreng, margarine; (2) dalam industri oleokimia seperti: sabun, gliserin, fatty
alkohol; (3) sebagai sumber vitamin E dan minyak esensial seperti asam oleat
(Brown & Jacobson 2005).
Seluruh bagian dari tanaman kelapa sawit dapat diolah dan dirnanfaatkan
secara maksimal. Buah sawit selain dapat diolah menjadi CPO yang berasal dari
dagingnya, biji dari buah sawit tersebut juga menghasilkan rninyak sawit inti atau
yang lebih dikenal dengan palm kernel oil (PKO). Saat pengolahan PKO
diperoleh limbah cangkang dari biji kelapa sawit. Cangkang yang dihasilkan
masih dapat dimanfaatkan sebagai bahan bakar (arang). Manfaat dari tandan
kosong kelapa sawit (TKKS) juga telah banyak diteliti salah satunya sebagai
pupuk(http://bbj-j fk.com/products.asp).
Proses pengolahan buah sawit hingga terbentuk CPO secara singkat dapat
dilihat pada Gambar 2. Tandan buah segar yang diambil dari perkebunan,
langsung disterilisasi agar tidak terjadi proses fermentasi oleh mikrorganisme
yang dapat merubah komposisi dari buah sawit. Tandan buah segar atau Fresh
Fruit Bunch yang telah steril dimasukkan ke dalam alat pembanting untuk
mernisahkan buah dari tandannya. Buah yang diperoleh dipres sehingga
mengeluarkan minyak yang disebut dengan CPO. Sedangkan bijinya akan dipecah
lagi dan mengalami proses lebih lanjut untuk mendapatkan PKO.
-
* - - x - <
Gambar 1 Tanaman, buah, dm minyak kelapa sawit
0
Buah sawit
kelapa sawit
w
Mesin pengepres
CPO
PKO
Gambar 2 Diagram alir pengolahan buah sawit (http://bbj-jfx.com/products.asp)
CPO merupakan salah satu contoh simpanan lipid dalam tanaman. Lipid
pada turnbuhan berfungsi sebagai pembentuk membran sel, sebagai bahan
cadangan energi, dan sebagai sumber energi. Penyimpanan asam lemak sebagai
bahan cadangan yang penting dapat ditemukan dalam buah maupun biji-bijian
(Estiti 1995). Lipid disintesis oleh e n z h kompleks fatty acids synthetase (FAS).
Reaksi pertama dari sintesis lemak adalah pernindahan gugus asetil dan malonil
dari Co-A ke ACP (acyl carrier protein). Kemudian malonil mengalami
kondensasi melepaskan C02 dan ACP membentuk asetoasetil ACP. Kemudian
asetoasetil ACP tereduksi oleh 3-ketoasil ACP reduktase, setelah itu terjadi
dehidrasi yang dikatalisis oleh 3-hidroksi ACP dehidrase, dan direduksi kembali
oleh enoil reduktase (Gambar 3). Reaksi kondensasi-reduksi-dehidrasi-reduksi
tersebut terus berulang hingga panjang rantai karbon sudah cukup (Weete 1980
dalam Sipayung 2003).
Reaksi sintesis asam lemak bebas terjadi di kloroplas hingga terbentuk
suatu trigliserida (Bruce et al. 2002). Reaksi esterifikasi untuk pembentukkan
trigliserida pada tanaman terjadi di sitoplasma. Trigliserida inilah yang kemudian
dishpan sebagai butiran lemak (Gambar 4) (Bruce et al. 2002).
Energi yang dibutuhkan dalam pembentukkan asam lemak berasal dari
reaksi fotosintesis yang menyediakan NADPH dan ATP. Oleh sebab itu reaksi
pembentukkan asam lemak lebih cepat terjadi pada siang hari. Sipayung (2003)
mengatakan minyak dan lemak pada akar disintesis secara in situ, menggunakan
asetil KoA yang berada di dalam proplastid. Sedangkan NADPH yang dibutuhkan
berasal dari lintasan pentosa fosfat dan ATP berasal dari glikolisis.
P
E
aseW CoA
ACP transaslase
CH3- -SCOA
"" 7
Y
CH3- SACP
Asetil CoA
karboksilese
Malonil COA :ACP
1
3-Ketoas-ACP
Pengulangan siklus
Untuk memperpanjang
Rantai asam lemak
C02
CH3-CH2-CH2-C-SACP
ACP
0
II
End-ACP
reduktase
0
I
CH3-C-CH2-CSACP
(NADH)
I
NADPH
P
3-ketoasil-ACP
reduktase
CHs-CH=CH-C-SACP
NADP+
OH
3-H~droksi-A
CP
dehrdrase
0
I
D(-)CH3-CH-CH2-C-SACP
Gambar 3 Sintesis asam lemak pada tanaman (Weete 1980 dalam Sipayung
2003)
Gambar 4 Droplet pati dan lipid pada sel daun (Bruce et al. 2002)
Droplet lemak dan pati pada daun tersebut akan dihidrolisis pada saat
reaksi gelap terjadi. Reaksi pemecahan asam lemak pada tumbuhan hanya terjadi
di peroksisom (Gambar 5) berbeda dengan hewan yang dapat melakukan oksidasi
asam lemak baik di peroksisom dan di mitokondria (Cooper 2000).
Peroksisom tanaman memiliki h g s i yang sangat penting, salah satunya
peroksisom yang ada pada biji memugkinkan untuk merubah asam lemak
menjadi karbohidrat pada saat dibutuhkan dalam pertumbuhan biji menjadi
tanaman. Reaksi pemecahan cadangan asam lemak menjadi karbohidrat pada
tanaman itu dinamakan siklus glioksilat (Gambar 6) (Cooper 2000). Sumber lain
mengatakan organel tempat menyirnpan lipid pada biji dinamakan dengan
oleosom. Jadi cadangan lipid yang ada pada oleosom akan ditransfer ke dalam
peroksisom yang ada di biji (glioksisom) mtuk dirubah menjadi surnber energi
yang dibutuhkan pertumbuhan kecambah (Bruce et al. 2002).
2m-
ZH20
+ o2
atau
Gambar 5 Oksidasi asam lemak dalam peroksisom (Cooper 2000)
Asam lemak
C
4
Asetil KoA
glukosa
KoA-SH
oksaloasetat
malat 4
isositrat
\
AO2
a-ketogutarat
Suksinat
Suksinil KoA
Gambar 6 Siklus glioksilat (Cooper 2000)
Gambar 7 Penampang biji tanaman (Bruce et al. 2002)
Diasilgliserol
Crude palm oil (CPO) memiliki komponen utama berupa triasilgliserol
(TAG). Komposisi asam lemak yang terdapat dalam trigliserida dari minyak sawit
yaitu miristat, palmitat, oleat, linoleat, dan stearat. Minyak nabati tersebut hanya
memilki sedikit kandungan diasilgliserol (DAG) dan monoasilgliserol (MAG).
Yasunaga et al. (2001) melaporkan bahwa minyak kaya DAG dapat berfungsi
sebagai rninyak kesehatan karena antara lain dapat mengurangi trigliserida dalam
serum darah, mencegah akumulasi lemak dalam tubuh untuk memperbaiki rasio
kolesterol serum darah (Gambar 8).
Dalam pencemaan triasilgliserol, enzim pencernaan akan memecah
triasilgliserol menjadi dua buah asam lemak dan monoasilgliserol dengan asam
lemak pada posisi karbon nomor 2 dari gliserol. Kemudian molekul MAG tersebut
akan diserap ke dalam usus halus. Sel-sel usus halus tersebut memiliki enzim
yang dapat menggabungkan kembali asam lemak dari monoasilgliserol menjadi
triasilgliserol (www.kao.co.jp). TAG akan beredar di dalam darah dan dapat
terakumulasi menjadi lemak tubuh. Sedangkan DAG memiliki proses pencemaan
yang berbeda, DAG akan terhidrolisis menjadi MAG dengan posisi asam lemak
pada atom karbon nomor satu dari gliserol. Molekul yang baru terbentuk itu sulit
untuk disintesis kembali menjasi TAG. Oleh sebab itu kenaikkan konsentrasi
TAG di dalam darah setelah asupan DAG lebih rendah dibandingkan kenaikkan
konsentrasi TAG setelah asupan TAG (Kondo et al. 2003).
Yamamoto et al. (2001) pada penelitiannya menunjukkan kadar serum
triasilgliserol pada penderita diabetes menurun setelah mengkonsumsi minyak
yang kaya akan DAG. Sebaliknya pada penderita yang tetap mengkosumsi
minyak dengan komposisi utama TAG dapat meningkatkan kadar TAG dalam
serum.
Terakumulasi sebagai lemak tubuh
Gambar 8 Proses pencemaan TAG dan DAG dalam tubuh (www-kao-co-jp)
Kao Corp. telah memproduksi minyak nabati yang kaya dengan DAG
yaitu sekitar 20% TAG, 80% DAG, dan 5% MAG dengan kandungan asam lemak
berupa asam oleat, linoleat, dan linolenat. Minyak ini dapat dipanaskan hingga
196 OC (http://www.hc-sc.gc.ca). Shimizu et al. (2004) telah mengamati suhu
deteriorasi minyak selama deep-hing dengan membandingkan minyak yang kaya
akan DAG dengan minyak komersial dengan carnpuran tokoferol. Hasil
penelitiannya menunjukkan tidak terjadi oksidasi minyak yang kaya akan DAG
selama proses deep-fiing. Siew (2001) menunjukkan bahwa kehadiran DAG
mempengaruhi titik leleh minyak dari berbagai macam jenis minyak.
Produk DAG dan MAG dapat diperoleh melalui proses kimiawi maupun
enzimatik. DAG dan MAG yang diproduksi secara kimiawi memiliki kelemahan
yaitu pemakaian energi yang cukup tinggi, terbentuknya produk samping yang
tidak dikehendaki hasil dari reaksi peroksidasi dan polimerisasi yang bersifat
toksik bagi kesehatan manusia, selain itu produk yang diperoleh berwarna gelap
(Elisabeth et al. 1999). Kekurangan produksi DAG dan MAG melalui proses
kimiawi bukan berarti produksi DAG dan MAG secara enzimatik tidak memiliki
hambatan yaitu mahalnya lipase komersial yang dibutuhkan dalam proses
enzimatik. Beberapa penelitian yang mencoba dalam memproduksi DAG atau pun
MAG secara enzimatik dengan fermentasi sendiri telah dilakukan (Arini 2005;
Mahmud 2005; August 2000; dan Mappiratu 1999).
Kandungan DAG dalam CPO optimum setelah 24 jam reaksi hidrolisis
dimulai dan menurun setelah 48 jam inkubasi hal ini dapat terjadi karena pada
gliserolisis enzimatik terjadi reaksi simultan antara reaksi hidrolisis untuk
pernotongan rantai asil dari TAG dart DAG (Gambar 9). Produksi DAG tidak
dipengaruhi oleh rasio mol gliserol dan minyak (Elisabeth et al. 1998). Elisabeth
et al. (1999) melaporkan kandungan MAG dan DAG tertinggi pada hasil
gliserolisis dari CPO terdapat pada perlakuan suhu 50-40°C dan suhu 50°C.
Efek pencernaan minyak DAG pada kenaikkan serum lipid trigliserida
postprandial dan kilomikron pada tubuh manusia yang sehat dapat memperkecil
kenaikkan bila dibandingkan mengkonsumsi minyak TAG. Efek pencemaan
minyak DAG dalam jangka panjang dengan diet terkontrol dapat menurunkan
adiposit tubuh dan memperkecil komplikasi diabetes tipe I1 (Takase 2007).
Konsumsi emulsi DAG dengan berbagai dosis (10 g, 20 g, 44 g per 60 kg berat
badan) juga terbukti dapat menurunkan kadar trigliserida serum postprandial
setelah 4 atau 6 jam (Taguchi et al. 2000).
Trigliserida
Digliserida
Monogliserida
Gambar 9 Reaksi hidrolisis triasilgliserol oleh lipase (Elisabeth et al. 1998)
Besarnya nilai energi yang dihasilkan oleh minyak DAG dibandingkan
dengan minyak TAG yang diukur dengan bomb kalorimeter menunjukkan hasil
yang tidak begitu jauh, yaitu sebesar 38,9 kJlg (9,30 kcallg) untuk minyak DAG
dan 39,6 kJ/g (9,46 kcalig) untuk minyak TAG ( W r r ) .
Minyak kaya
akan DAG juga tidak mengurangi nilai nutrisi bagi konsurnen yang
memakannnya, asam lemak trans yang dinilai jelek juga dapat berkurang dalam
minyak yang kaya DAG (Anonimous 2004).
Pengujian keamanan minyak kaya akan DAG telah banyak diteliti. DAG
telah diuji nil& toksisitas baik secara kualitatif maupun kuantitatif. Hasil yang
didapat pada tikus, minyak DAG tidak memiliki efek toksik pada dosis 15 g/kg
berat badan, pada manusia nilai yang didapat sebesar 900 gl60 kg berat badan
tubuh manusia (www.kao.co.jp).
Lipase
Lipase atau triasilgliserol asilhidrolase (EC. 3.1.1.3) merupakan enzim dari
golongan hidrolase yang menghidrolisis lipid. Enzim ini dapat ditemukan di dam,
baik pada mamalia, turnbuhan, dan mikroorganisme. Mikroorganisme dapat
menghasilkan lipase baik intraseluler atau ekstraseluler. Lipase mikrobial terbukti
lebih baik dalam menghasilkan produk DAG maupun MAG dibandingkan dengan
lipase dedak padi (Elisabeth et al. 1998). Interaksi lipase dengan substrat yang
tidak larut merniliki dua tahap, adsorpsi enzim ke permukaan minyak-air dan
lipolisis (Derewenda et al. 1994).
Spesifitas lipase berbeda,
lipase Pseudomonas sp. memiliki spesifitas
yang tinggi pada asam lemak yang berantai panjang sedangkan lipase lipozyrneIM (Rhizomucor miehei) memiliki spesifitas terhadap jenis asam lemak dengan
kisaran panjang rantai atom karbon yang lebih luas (Elisabeth et al. 1998). Kadar
air juga dapat mempengaruhi kerja dari lipase dalam kondisi akueus reaksi akan
diarahkan ke hidrolisis trigliserida menjadi digliserida, monogliserida, asam
lemak bebas, dan gliserol (Colombie et al. 1997). Reaksi kebalikan dapat terjadi
yaitu pemindahan gugus asil akan ditransfer ke molekul lain yang terdapat dalam
substrat seperti gliserol dan alkohol. Reaksi tersebut terjadi bila kondisi
lingkungarn kekurangan air (mikroakueus) (Colombie et al. 1998).
Studi kristalografi dari lipase fungi telah dilaporkan oleh Derewenda et a1
(1994). Derewenda et al. (1994) melaporkan kemungkinan dua buah model yang
sederhana dari lipase fungi Humicola lanuginose dan Rhizopus delemar.
Konformasi tertutup merupakan bentuk yang stabil dalam medium akueous,
konformasi tersebut menyebabkan pusat &if dari enzim tidak dapat dimasuki
oleh air yang melarutkan substrat. Kristal lipase dari Humicola lanuginosa
memiliki konformasi yang tidak teratur terlepas dari kekuatan ionik dari medium,
sedangkan Rhizopus delemar membentuk kristal dengan adanya detergent, dua
buah molekul yang membentuk unit asimetrik menunjukkan konformasi yang
berbeda. Bentuk kristal lipase dapat dilihat pada Gambar 10.
Rhizopus oryzae mensintesis dua buah lipase, yang pertama adalah
Rhizopus oryzae lipase 34 (ROL34) dan yang kedua adalah Rhizopus oryzae
lipase 31 (ROL31). ROL34 adalah lipase dengan bobot molekul 34 kDa
sedangkan ROL3 1 memilki bobot molekul 3 1 kDa. ROL mengandung beberapa
sekuen nukleotida, seperti: prekursor yang mengandung sinyal sekuen (26 asam
amino), prosekuen (79 asam amino), dan bagian lipase yang &if (269 asam
amino) (Hama et al, 2006). Proses sintesis ROL yang pertama adalah memotong
daerah pre sehingga terbentuk daerah pro, kemudian sekuen lisin-arginin dipotong
oleh kexin-like protease sehingga dihasilkan ROL34. Serin protease memotong
asam amino ke-123 pada ROL34 sehingga terbentuk lipase yang &if (ROL31).
ROL34 adalah lipase yang terletak didinding sel dan mudah dikeluarkan ke
medium kultur sedangkan ROL31 terikat kuat pada membran sel (Harna et al.
2006) (Gambar 11).
Gambar 10 Model struktur lipase (Derewenda et al. 1994)
pre
pro
I
mature
392 a.a.
Situs pengenalan
27
197
I
b
ROL34
1124
,
I
392 a.a.
a
ROL31
Gambar 1 1 Proses pembentukan ROL (Hama et al. 2006)
Sisi katalitik dari lipase terdiri atas tiga buah asam amino yaitu serin,
asparagin, dan histidin. Reaksi yang dikatalisis oleh enzim lipase pada umurnnya
berlangsung dalam lingkungan air, yaitu lingkungan dengan air sebagai pelarut
utama. Sebenarnya air yang diperlukan hanya dalam jumlah yang sedikit. Air
tersebut berfungsi melapisi molekul enzim sehingga pergantian sisa-sisa air yang
lain dengan pelarut organik tidak akan mengganggu aktivitas enzim (Kristanti
2001).
Jumlah air minimum yang diperlukan oleh suatu enzim untuk
mendapatkan konformasi
alaminya (agar dapat menunjukkan
aktivitas
biologiknya) adalah sekitar 50% dari jumlah air yang diperlukan untuk
membentuk monolayer molekul air yang menutup molekul protein. Dalam pelarut
hidrofobik dibutuhkan air lebih sedikit dari pada pelarut hidrofilik. Hal ini
disebabkan karena air cenderung berpartisi ke dalam molekul enzim dari pada
pelarut hidrofobik sehingga walaupun air yang tersedia hanya sedikit (kurang dari
1%) dapat menyebabkan akumulasi sampai 30% dalam molekul enzim.
Sebaliknya molekul hidrofilik kemungkinan akan menarik sebagian air yang
esensial dari molekul enzim sehingga aktivitas enzim terganggu (Zacks &
Klibanov 1988). Untuk dapat mengembalikan aktivitas enzim perlu ditambahkan
lebih banyak air untuk menjenuhkan pelarut hidrofobik lebih dahulu (Zacks &
Klibanov 1988).
Reaksi enzimatis yang dilakukan dalam pelarut organik memiliki beberapa
keuntungan, yaitu: 1) senyawa-senyawa organik umunya lebih larut baik dalam
pelarut organik (mikroakueus) dari pada dalam lingkungan air; 2) kemungkinan
terjadinya reaksi baru yang tidak mungkin terjadi dalam lingkungan akueous; 3)
stabilitas enzim meningkat; 4) isolasi produk lebih mudah; 5) kontaminasi
mikrobial selama proses dapat ditekan, karena mikroba umumnya tidak aktif pada
pelarut organik (Zaks & Klibanov 1988). Sedangkan kerugiannya antara lain: 1)
kemungkinan adanya inaktifasi atau denaturasi enzim oleh pelarut organik tertentu
ataupun yang tidak sesuai; 2) adanya residu pelarut pada hasil akhir; 3) biaya
untuk pelarut organik cukup tinggi dibandingkan pelarut air (Tramper 1985).
Isolasi DAG
Hasil hidrolisis TAG dapat dipisahkan dengan berbagai metode,
diantaranya: destilasi, ekstraksi, kromatografi, kristalisasi, dan pendinginan
bertahap.
Destilasi
Menurut Watanabe et al. (2002) destilasi sering digunakan untuk
memurnikan MAG secara industri. Narnun asarn lemak bebas dan MAG tidak
dapat sempurna dipisahkan dengan metode ini meskipun DAG dan MAG dapat
dipisahkan. Metode ini memerlukan suhu yang tinggi dan tekanan vakurn sekitar
lod rnmHg. Proses ini memerlukan energi yang tinggi dan menghasilkan asam
lemak yang sangat labil karena suhu yang cukup tinggi dapat menyebabkan
perubahan stmktural seperti siklikasi dan isomerisasi cis-trans ikatan ganda pada
rantai tak jenuh jarnak (Takao 1986).
Ekstraksi
Metode ini pemah digunakan dalam memisahkan komponen hasil reaksi
etanolisis TAG oleh Irimescu et al. (2002). Prinsip dari metode ekstraksi tersebut
adalah memisahkan lipase dari campuran kemudian pelarut campuran reaksi
diuapkan. Konsentrat diekstraksi dengan berbagai macam pelarut organik dalam
proses pemurniannya.
Metode ekstraksi yang relatif baru dalam industri makanan dan farmasi
adalah ekstraksi fluida super kritis. Metode ini menggunakan kombinasi suhu dan
tekanan di atas titik kritis. Pada kondisi demikian misalnya gas karbon dioksida
mempunyai densitas seperti cairan dan mempunyai kapasitas pelarut yang cukup
tinggi. Keuntungan metode pemisahan ini yaitu produk yang didapat terhindar
dari proses oksidasi atau isomerisasi cis-trans. Karena metode ini didasarkan pada
kelarutan asam lemak pada suhu rendah. Tetapi ekstraksi fluida super kritis tidak
cukup selektif untuk memperoleh asam lemak 2 0 5 dan 22:6 murni sehingga
memerlukan kombinasi dengan metode-metode pemisahan lainnya (Hamilton
1995).
Kromatografi
teknik pernisahan MAG yang paling banyak
K r o m a t ~ gadalah
~
digunakan terutama untuk keperluan analisis seperti kromatografi lapis tipis (Thin
Layer Chromatography, TLC), kromatografi cair kinerja tinggi (High
Performance Liquid Chromatography, HPLC), dan kromatografi
gas (Gas
Chromatography, GC). Kromatagrafi kolom merupakan salah satu metode yang
paling sering digunakan untuk memurnikan komponen hail pemecahan TAG.
Mappiratu (1999) menggunakan metode ini mernisahkan MAG hasil hidrolisis
TAG menggunakan lipase dedak padi.
Untuk mempercepat dan memperbesar kapasitas kromatografi kolom
preparatif, ke dalam kolom diterapkan suatu tekanan alir fase gerak. Menurut
Claeson (1992), kromatografi cair preparatif yang menerapkan tekanan alir yang
paling sering digunakan adalahJIash chromatography dan medium pressure liquid
chromatography (MPLC). Jurnlah contoh pada flash chromatography dapat
mencapai 1-200 g sedangkan pada MPLC hanya sampai 50 g. Tekanan yang
diterapkan padaflash chromatography adalah 1-2 bar dan pada MPLC 5-20 bar.
Kelebihan dari MPLC yaitu resolusi pemisahan yang cukup tinggi, kolom mudah
dipak, mempunyai reprodusibilitas yang tinggi dalam hal pemisahan dan packing,
support kolom dapat digunakan kembali, tetapi penggunaan pelarut yang cukup
tinggi dengan harga yang relatif mahal merupakan kendala dari MPLC.
Kristalisasi
Minyak yang memiliki kandungan asam lemak jenuh yang tinggi dapat
dibekukan dengan pendinginan bertahap sekitar 5 OC. Kristalisasi banyak
dilakukan pada asam lemak bebas atau dalam bentuk metil ester dari pada dalam
bentuk gliserida. Chen dan Ju (2001) melakukan suatu modifikasi proses
kristalisasi untuk mengayakan asam lemak tak jenuh dalam asam lemak minyak
biji rami dengan menggunakan suatu pelarut pada suhu rendah. Hasil terbaik
tercapai ketika campuran 30 % asetonitril dengan 70 % aseton digunakan sebagai
medium pelarut. Kristalisasi asam lemak bebas atau dalam bentuk metil ester
sering dilakukan dengan terlebih dahulu mengkomplekskannya dengan urea.
Menurut Joseph dan Seaborn (1990), urea akan membentuk kristal dengan
senyawa berantai lurus dan bukan senyawa-senyawa berantai cabang atau siklik.
Kristal urea murni terdapat dalam bentuk tetragonal yang kompleks dan akan
membentuk kristal dengan struktur heksagonal bila membentuk kompleks dengan
senyawa-senyawa alifatik berantai lurus.
Pendinginan Bertahap
Penelitian terbaru dari pemisahan TAG, DAG, dan MAG telah dilakukan
oleh Watanabe (2006). Pada penelitiannya asam lemak hasil hidrolisis lipase
dipisahkan dengan menggunakan teknik pendinginan pelarut. Secara garis besar
pemisahan ini berdasarkan kelarutan bahan dalam pelarut. Sampel hasil hidrolisis
dilarutkan ke dalam pelarut dengan perbandingan tertentu kemudian didinginkan.
Kristal yang didapat dipisahkan dengan cara disentrifugasi pada suhu -20 OC.
Dengan metode pendinginan pelarut perolehan MAG dapat meningkat dari 95,8 %
menjadi 98,4 % (Watanabe 2006).
Pada penelitian ini digunakan metode pemisahan kromatografi kolom dan
pendinginan bertingkat. Hal tersebut dipilih karena kedua buah metode tersebut
lebih mudah digunakan dalam produksi DAG skala besar.