TINJAUAN PUSTAKA Crude Palm Oil Crude Palm Oil (CPO) atau minyak sawit mentah rnerupakan minyak hasil olahan dari buah kelapa sawit (Elaeis guinensis JACQ) (Gambar 1). Negara penghasil minyak sawit terbesar di dunia adalah Malaysia, sedangkan Indonesia menempati urutan kedua. Salah satu kekayaan dam dari Indonesia ini pernah mengalami kontroversi pada tahun 80-an. Minyak sawit pernah diisukan sebagai pemicu sakit jantung, yang disebabkan oleh kandungan lemak trans yang dapat menaikkan kadar LDL di dalam darah. Lemak trans ini terbentuk karena minyak terhidrogenasi dan membentuk padatan (Brown & Jacobson 2005). Harga CPO yang dapat tiga kali lebih murah dari minyak kedelai merupakan daya tarik bagi para pelaku industri. Selain itu, rninyak sawit tidak beraroma ketika mengalami hidrogenasi seperti minyak kedelai, dan minyak sawit juga lebih sehat dibandingkan minyak nabati lainnya (Brown & Jacobson 2005). Beberapa manfaat yang dimiliki CPO adalah: (1) dalam industri makanan seperti: minyak goreng, margarine; (2) dalam industri oleokimia seperti: sabun, gliserin, fatty alkohol; (3) sebagai sumber vitamin E dan minyak esensial seperti asam oleat (Brown & Jacobson 2005). Seluruh bagian dari tanaman kelapa sawit dapat diolah dan dirnanfaatkan secara maksimal. Buah sawit selain dapat diolah menjadi CPO yang berasal dari dagingnya, biji dari buah sawit tersebut juga menghasilkan rninyak sawit inti atau yang lebih dikenal dengan palm kernel oil (PKO). Saat pengolahan PKO diperoleh limbah cangkang dari biji kelapa sawit. Cangkang yang dihasilkan masih dapat dimanfaatkan sebagai bahan bakar (arang). Manfaat dari tandan kosong kelapa sawit (TKKS) juga telah banyak diteliti salah satunya sebagai pupuk(http://bbj-j fk.com/products.asp). Proses pengolahan buah sawit hingga terbentuk CPO secara singkat dapat dilihat pada Gambar 2. Tandan buah segar yang diambil dari perkebunan, langsung disterilisasi agar tidak terjadi proses fermentasi oleh mikrorganisme yang dapat merubah komposisi dari buah sawit. Tandan buah segar atau Fresh Fruit Bunch yang telah steril dimasukkan ke dalam alat pembanting untuk mernisahkan buah dari tandannya. Buah yang diperoleh dipres sehingga mengeluarkan minyak yang disebut dengan CPO. Sedangkan bijinya akan dipecah lagi dan mengalami proses lebih lanjut untuk mendapatkan PKO. - * - - x - < Gambar 1 Tanaman, buah, dm minyak kelapa sawit 0 Buah sawit kelapa sawit w Mesin pengepres CPO PKO Gambar 2 Diagram alir pengolahan buah sawit (http://bbj-jfx.com/products.asp) CPO merupakan salah satu contoh simpanan lipid dalam tanaman. Lipid pada turnbuhan berfungsi sebagai pembentuk membran sel, sebagai bahan cadangan energi, dan sebagai sumber energi. Penyimpanan asam lemak sebagai bahan cadangan yang penting dapat ditemukan dalam buah maupun biji-bijian (Estiti 1995). Lipid disintesis oleh e n z h kompleks fatty acids synthetase (FAS). Reaksi pertama dari sintesis lemak adalah pernindahan gugus asetil dan malonil dari Co-A ke ACP (acyl carrier protein). Kemudian malonil mengalami kondensasi melepaskan C02 dan ACP membentuk asetoasetil ACP. Kemudian asetoasetil ACP tereduksi oleh 3-ketoasil ACP reduktase, setelah itu terjadi dehidrasi yang dikatalisis oleh 3-hidroksi ACP dehidrase, dan direduksi kembali oleh enoil reduktase (Gambar 3). Reaksi kondensasi-reduksi-dehidrasi-reduksi tersebut terus berulang hingga panjang rantai karbon sudah cukup (Weete 1980 dalam Sipayung 2003). Reaksi sintesis asam lemak bebas terjadi di kloroplas hingga terbentuk suatu trigliserida (Bruce et al. 2002). Reaksi esterifikasi untuk pembentukkan trigliserida pada tanaman terjadi di sitoplasma. Trigliserida inilah yang kemudian dishpan sebagai butiran lemak (Gambar 4) (Bruce et al. 2002). Energi yang dibutuhkan dalam pembentukkan asam lemak berasal dari reaksi fotosintesis yang menyediakan NADPH dan ATP. Oleh sebab itu reaksi pembentukkan asam lemak lebih cepat terjadi pada siang hari. Sipayung (2003) mengatakan minyak dan lemak pada akar disintesis secara in situ, menggunakan asetil KoA yang berada di dalam proplastid. Sedangkan NADPH yang dibutuhkan berasal dari lintasan pentosa fosfat dan ATP berasal dari glikolisis. P E aseW CoA ACP transaslase CH3- -SCOA "" 7 Y CH3- SACP Asetil CoA karboksilese Malonil COA :ACP 1 3-Ketoas-ACP Pengulangan siklus Untuk memperpanjang Rantai asam lemak C02 CH3-CH2-CH2-C-SACP ACP 0 II End-ACP reduktase 0 I CH3-C-CH2-CSACP (NADH) I NADPH P 3-ketoasil-ACP reduktase CHs-CH=CH-C-SACP NADP+ OH 3-H~droksi-A CP dehrdrase 0 I D(-)CH3-CH-CH2-C-SACP Gambar 3 Sintesis asam lemak pada tanaman (Weete 1980 dalam Sipayung 2003) Gambar 4 Droplet pati dan lipid pada sel daun (Bruce et al. 2002) Droplet lemak dan pati pada daun tersebut akan dihidrolisis pada saat reaksi gelap terjadi. Reaksi pemecahan asam lemak pada tumbuhan hanya terjadi di peroksisom (Gambar 5) berbeda dengan hewan yang dapat melakukan oksidasi asam lemak baik di peroksisom dan di mitokondria (Cooper 2000). Peroksisom tanaman memiliki h g s i yang sangat penting, salah satunya peroksisom yang ada pada biji memugkinkan untuk merubah asam lemak menjadi karbohidrat pada saat dibutuhkan dalam pertumbuhan biji menjadi tanaman. Reaksi pemecahan cadangan asam lemak menjadi karbohidrat pada tanaman itu dinamakan siklus glioksilat (Gambar 6) (Cooper 2000). Sumber lain mengatakan organel tempat menyirnpan lipid pada biji dinamakan dengan oleosom. Jadi cadangan lipid yang ada pada oleosom akan ditransfer ke dalam peroksisom yang ada di biji (glioksisom) mtuk dirubah menjadi surnber energi yang dibutuhkan pertumbuhan kecambah (Bruce et al. 2002). 2m- ZH20 + o2 atau Gambar 5 Oksidasi asam lemak dalam peroksisom (Cooper 2000) Asam lemak C 4 Asetil KoA glukosa KoA-SH oksaloasetat malat 4 isositrat \ AO2 a-ketogutarat Suksinat Suksinil KoA Gambar 6 Siklus glioksilat (Cooper 2000) Gambar 7 Penampang biji tanaman (Bruce et al. 2002) Diasilgliserol Crude palm oil (CPO) memiliki komponen utama berupa triasilgliserol (TAG). Komposisi asam lemak yang terdapat dalam trigliserida dari minyak sawit yaitu miristat, palmitat, oleat, linoleat, dan stearat. Minyak nabati tersebut hanya memilki sedikit kandungan diasilgliserol (DAG) dan monoasilgliserol (MAG). Yasunaga et al. (2001) melaporkan bahwa minyak kaya DAG dapat berfungsi sebagai rninyak kesehatan karena antara lain dapat mengurangi trigliserida dalam serum darah, mencegah akumulasi lemak dalam tubuh untuk memperbaiki rasio kolesterol serum darah (Gambar 8). Dalam pencemaan triasilgliserol, enzim pencernaan akan memecah triasilgliserol menjadi dua buah asam lemak dan monoasilgliserol dengan asam lemak pada posisi karbon nomor 2 dari gliserol. Kemudian molekul MAG tersebut akan diserap ke dalam usus halus. Sel-sel usus halus tersebut memiliki enzim yang dapat menggabungkan kembali asam lemak dari monoasilgliserol menjadi triasilgliserol (www.kao.co.jp). TAG akan beredar di dalam darah dan dapat terakumulasi menjadi lemak tubuh. Sedangkan DAG memiliki proses pencemaan yang berbeda, DAG akan terhidrolisis menjadi MAG dengan posisi asam lemak pada atom karbon nomor satu dari gliserol. Molekul yang baru terbentuk itu sulit untuk disintesis kembali menjasi TAG. Oleh sebab itu kenaikkan konsentrasi TAG di dalam darah setelah asupan DAG lebih rendah dibandingkan kenaikkan konsentrasi TAG setelah asupan TAG (Kondo et al. 2003). Yamamoto et al. (2001) pada penelitiannya menunjukkan kadar serum triasilgliserol pada penderita diabetes menurun setelah mengkonsumsi minyak yang kaya akan DAG. Sebaliknya pada penderita yang tetap mengkosumsi minyak dengan komposisi utama TAG dapat meningkatkan kadar TAG dalam serum. Terakumulasi sebagai lemak tubuh Gambar 8 Proses pencemaan TAG dan DAG dalam tubuh (www-kao-co-jp) Kao Corp. telah memproduksi minyak nabati yang kaya dengan DAG yaitu sekitar 20% TAG, 80% DAG, dan 5% MAG dengan kandungan asam lemak berupa asam oleat, linoleat, dan linolenat. Minyak ini dapat dipanaskan hingga 196 OC (http://www.hc-sc.gc.ca). Shimizu et al. (2004) telah mengamati suhu deteriorasi minyak selama deep-hing dengan membandingkan minyak yang kaya akan DAG dengan minyak komersial dengan carnpuran tokoferol. Hasil penelitiannya menunjukkan tidak terjadi oksidasi minyak yang kaya akan DAG selama proses deep-fiing. Siew (2001) menunjukkan bahwa kehadiran DAG mempengaruhi titik leleh minyak dari berbagai macam jenis minyak. Produk DAG dan MAG dapat diperoleh melalui proses kimiawi maupun enzimatik. DAG dan MAG yang diproduksi secara kimiawi memiliki kelemahan yaitu pemakaian energi yang cukup tinggi, terbentuknya produk samping yang tidak dikehendaki hasil dari reaksi peroksidasi dan polimerisasi yang bersifat toksik bagi kesehatan manusia, selain itu produk yang diperoleh berwarna gelap (Elisabeth et al. 1999). Kekurangan produksi DAG dan MAG melalui proses kimiawi bukan berarti produksi DAG dan MAG secara enzimatik tidak memiliki hambatan yaitu mahalnya lipase komersial yang dibutuhkan dalam proses enzimatik. Beberapa penelitian yang mencoba dalam memproduksi DAG atau pun MAG secara enzimatik dengan fermentasi sendiri telah dilakukan (Arini 2005; Mahmud 2005; August 2000; dan Mappiratu 1999). Kandungan DAG dalam CPO optimum setelah 24 jam reaksi hidrolisis dimulai dan menurun setelah 48 jam inkubasi hal ini dapat terjadi karena pada gliserolisis enzimatik terjadi reaksi simultan antara reaksi hidrolisis untuk pernotongan rantai asil dari TAG dart DAG (Gambar 9). Produksi DAG tidak dipengaruhi oleh rasio mol gliserol dan minyak (Elisabeth et al. 1998). Elisabeth et al. (1999) melaporkan kandungan MAG dan DAG tertinggi pada hasil gliserolisis dari CPO terdapat pada perlakuan suhu 50-40°C dan suhu 50°C. Efek pencernaan minyak DAG pada kenaikkan serum lipid trigliserida postprandial dan kilomikron pada tubuh manusia yang sehat dapat memperkecil kenaikkan bila dibandingkan mengkonsumsi minyak TAG. Efek pencemaan minyak DAG dalam jangka panjang dengan diet terkontrol dapat menurunkan adiposit tubuh dan memperkecil komplikasi diabetes tipe I1 (Takase 2007). Konsumsi emulsi DAG dengan berbagai dosis (10 g, 20 g, 44 g per 60 kg berat badan) juga terbukti dapat menurunkan kadar trigliserida serum postprandial setelah 4 atau 6 jam (Taguchi et al. 2000). Trigliserida Digliserida Monogliserida Gambar 9 Reaksi hidrolisis triasilgliserol oleh lipase (Elisabeth et al. 1998) Besarnya nilai energi yang dihasilkan oleh minyak DAG dibandingkan dengan minyak TAG yang diukur dengan bomb kalorimeter menunjukkan hasil yang tidak begitu jauh, yaitu sebesar 38,9 kJlg (9,30 kcallg) untuk minyak DAG dan 39,6 kJ/g (9,46 kcalig) untuk minyak TAG ( W r r ) . Minyak kaya akan DAG juga tidak mengurangi nilai nutrisi bagi konsurnen yang memakannnya, asam lemak trans yang dinilai jelek juga dapat berkurang dalam minyak yang kaya DAG (Anonimous 2004). Pengujian keamanan minyak kaya akan DAG telah banyak diteliti. DAG telah diuji nil& toksisitas baik secara kualitatif maupun kuantitatif. Hasil yang didapat pada tikus, minyak DAG tidak memiliki efek toksik pada dosis 15 g/kg berat badan, pada manusia nilai yang didapat sebesar 900 gl60 kg berat badan tubuh manusia (www.kao.co.jp). Lipase Lipase atau triasilgliserol asilhidrolase (EC. 3.1.1.3) merupakan enzim dari golongan hidrolase yang menghidrolisis lipid. Enzim ini dapat ditemukan di dam, baik pada mamalia, turnbuhan, dan mikroorganisme. Mikroorganisme dapat menghasilkan lipase baik intraseluler atau ekstraseluler. Lipase mikrobial terbukti lebih baik dalam menghasilkan produk DAG maupun MAG dibandingkan dengan lipase dedak padi (Elisabeth et al. 1998). Interaksi lipase dengan substrat yang tidak larut merniliki dua tahap, adsorpsi enzim ke permukaan minyak-air dan lipolisis (Derewenda et al. 1994). Spesifitas lipase berbeda, lipase Pseudomonas sp. memiliki spesifitas yang tinggi pada asam lemak yang berantai panjang sedangkan lipase lipozyrneIM (Rhizomucor miehei) memiliki spesifitas terhadap jenis asam lemak dengan kisaran panjang rantai atom karbon yang lebih luas (Elisabeth et al. 1998). Kadar air juga dapat mempengaruhi kerja dari lipase dalam kondisi akueus reaksi akan diarahkan ke hidrolisis trigliserida menjadi digliserida, monogliserida, asam lemak bebas, dan gliserol (Colombie et al. 1997). Reaksi kebalikan dapat terjadi yaitu pemindahan gugus asil akan ditransfer ke molekul lain yang terdapat dalam substrat seperti gliserol dan alkohol. Reaksi tersebut terjadi bila kondisi lingkungarn kekurangan air (mikroakueus) (Colombie et al. 1998). Studi kristalografi dari lipase fungi telah dilaporkan oleh Derewenda et a1 (1994). Derewenda et al. (1994) melaporkan kemungkinan dua buah model yang sederhana dari lipase fungi Humicola lanuginose dan Rhizopus delemar. Konformasi tertutup merupakan bentuk yang stabil dalam medium akueous, konformasi tersebut menyebabkan pusat &if dari enzim tidak dapat dimasuki oleh air yang melarutkan substrat. Kristal lipase dari Humicola lanuginosa memiliki konformasi yang tidak teratur terlepas dari kekuatan ionik dari medium, sedangkan Rhizopus delemar membentuk kristal dengan adanya detergent, dua buah molekul yang membentuk unit asimetrik menunjukkan konformasi yang berbeda. Bentuk kristal lipase dapat dilihat pada Gambar 10. Rhizopus oryzae mensintesis dua buah lipase, yang pertama adalah Rhizopus oryzae lipase 34 (ROL34) dan yang kedua adalah Rhizopus oryzae lipase 31 (ROL31). ROL34 adalah lipase dengan bobot molekul 34 kDa sedangkan ROL3 1 memilki bobot molekul 3 1 kDa. ROL mengandung beberapa sekuen nukleotida, seperti: prekursor yang mengandung sinyal sekuen (26 asam amino), prosekuen (79 asam amino), dan bagian lipase yang &if (269 asam amino) (Hama et al, 2006). Proses sintesis ROL yang pertama adalah memotong daerah pre sehingga terbentuk daerah pro, kemudian sekuen lisin-arginin dipotong oleh kexin-like protease sehingga dihasilkan ROL34. Serin protease memotong asam amino ke-123 pada ROL34 sehingga terbentuk lipase yang &if (ROL31). ROL34 adalah lipase yang terletak didinding sel dan mudah dikeluarkan ke medium kultur sedangkan ROL31 terikat kuat pada membran sel (Harna et al. 2006) (Gambar 11). Gambar 10 Model struktur lipase (Derewenda et al. 1994) pre pro I mature 392 a.a. Situs pengenalan 27 197 I b ROL34 1124 , I 392 a.a. a ROL31 Gambar 1 1 Proses pembentukan ROL (Hama et al. 2006) Sisi katalitik dari lipase terdiri atas tiga buah asam amino yaitu serin, asparagin, dan histidin. Reaksi yang dikatalisis oleh enzim lipase pada umurnnya berlangsung dalam lingkungan air, yaitu lingkungan dengan air sebagai pelarut utama. Sebenarnya air yang diperlukan hanya dalam jumlah yang sedikit. Air tersebut berfungsi melapisi molekul enzim sehingga pergantian sisa-sisa air yang lain dengan pelarut organik tidak akan mengganggu aktivitas enzim (Kristanti 2001). Jumlah air minimum yang diperlukan oleh suatu enzim untuk mendapatkan konformasi alaminya (agar dapat menunjukkan aktivitas biologiknya) adalah sekitar 50% dari jumlah air yang diperlukan untuk membentuk monolayer molekul air yang menutup molekul protein. Dalam pelarut hidrofobik dibutuhkan air lebih sedikit dari pada pelarut hidrofilik. Hal ini disebabkan karena air cenderung berpartisi ke dalam molekul enzim dari pada pelarut hidrofobik sehingga walaupun air yang tersedia hanya sedikit (kurang dari 1%) dapat menyebabkan akumulasi sampai 30% dalam molekul enzim. Sebaliknya molekul hidrofilik kemungkinan akan menarik sebagian air yang esensial dari molekul enzim sehingga aktivitas enzim terganggu (Zacks & Klibanov 1988). Untuk dapat mengembalikan aktivitas enzim perlu ditambahkan lebih banyak air untuk menjenuhkan pelarut hidrofobik lebih dahulu (Zacks & Klibanov 1988). Reaksi enzimatis yang dilakukan dalam pelarut organik memiliki beberapa keuntungan, yaitu: 1) senyawa-senyawa organik umunya lebih larut baik dalam pelarut organik (mikroakueus) dari pada dalam lingkungan air; 2) kemungkinan terjadinya reaksi baru yang tidak mungkin terjadi dalam lingkungan akueous; 3) stabilitas enzim meningkat; 4) isolasi produk lebih mudah; 5) kontaminasi mikrobial selama proses dapat ditekan, karena mikroba umumnya tidak aktif pada pelarut organik (Zaks & Klibanov 1988). Sedangkan kerugiannya antara lain: 1) kemungkinan adanya inaktifasi atau denaturasi enzim oleh pelarut organik tertentu ataupun yang tidak sesuai; 2) adanya residu pelarut pada hasil akhir; 3) biaya untuk pelarut organik cukup tinggi dibandingkan pelarut air (Tramper 1985). Isolasi DAG Hasil hidrolisis TAG dapat dipisahkan dengan berbagai metode, diantaranya: destilasi, ekstraksi, kromatografi, kristalisasi, dan pendinginan bertahap. Destilasi Menurut Watanabe et al. (2002) destilasi sering digunakan untuk memurnikan MAG secara industri. Narnun asarn lemak bebas dan MAG tidak dapat sempurna dipisahkan dengan metode ini meskipun DAG dan MAG dapat dipisahkan. Metode ini memerlukan suhu yang tinggi dan tekanan vakurn sekitar lod rnmHg. Proses ini memerlukan energi yang tinggi dan menghasilkan asam lemak yang sangat labil karena suhu yang cukup tinggi dapat menyebabkan perubahan stmktural seperti siklikasi dan isomerisasi cis-trans ikatan ganda pada rantai tak jenuh jarnak (Takao 1986). Ekstraksi Metode ini pemah digunakan dalam memisahkan komponen hasil reaksi etanolisis TAG oleh Irimescu et al. (2002). Prinsip dari metode ekstraksi tersebut adalah memisahkan lipase dari campuran kemudian pelarut campuran reaksi diuapkan. Konsentrat diekstraksi dengan berbagai macam pelarut organik dalam proses pemurniannya. Metode ekstraksi yang relatif baru dalam industri makanan dan farmasi adalah ekstraksi fluida super kritis. Metode ini menggunakan kombinasi suhu dan tekanan di atas titik kritis. Pada kondisi demikian misalnya gas karbon dioksida mempunyai densitas seperti cairan dan mempunyai kapasitas pelarut yang cukup tinggi. Keuntungan metode pemisahan ini yaitu produk yang didapat terhindar dari proses oksidasi atau isomerisasi cis-trans. Karena metode ini didasarkan pada kelarutan asam lemak pada suhu rendah. Tetapi ekstraksi fluida super kritis tidak cukup selektif untuk memperoleh asam lemak 2 0 5 dan 22:6 murni sehingga memerlukan kombinasi dengan metode-metode pemisahan lainnya (Hamilton 1995). Kromatografi teknik pernisahan MAG yang paling banyak K r o m a t ~ gadalah ~ digunakan terutama untuk keperluan analisis seperti kromatografi lapis tipis (Thin Layer Chromatography, TLC), kromatografi cair kinerja tinggi (High Performance Liquid Chromatography, HPLC), dan kromatografi gas (Gas Chromatography, GC). Kromatagrafi kolom merupakan salah satu metode yang paling sering digunakan untuk memurnikan komponen hail pemecahan TAG. Mappiratu (1999) menggunakan metode ini mernisahkan MAG hasil hidrolisis TAG menggunakan lipase dedak padi. Untuk mempercepat dan memperbesar kapasitas kromatografi kolom preparatif, ke dalam kolom diterapkan suatu tekanan alir fase gerak. Menurut Claeson (1992), kromatografi cair preparatif yang menerapkan tekanan alir yang paling sering digunakan adalahJIash chromatography dan medium pressure liquid chromatography (MPLC). Jurnlah contoh pada flash chromatography dapat mencapai 1-200 g sedangkan pada MPLC hanya sampai 50 g. Tekanan yang diterapkan padaflash chromatography adalah 1-2 bar dan pada MPLC 5-20 bar. Kelebihan dari MPLC yaitu resolusi pemisahan yang cukup tinggi, kolom mudah dipak, mempunyai reprodusibilitas yang tinggi dalam hal pemisahan dan packing, support kolom dapat digunakan kembali, tetapi penggunaan pelarut yang cukup tinggi dengan harga yang relatif mahal merupakan kendala dari MPLC. Kristalisasi Minyak yang memiliki kandungan asam lemak jenuh yang tinggi dapat dibekukan dengan pendinginan bertahap sekitar 5 OC. Kristalisasi banyak dilakukan pada asam lemak bebas atau dalam bentuk metil ester dari pada dalam bentuk gliserida. Chen dan Ju (2001) melakukan suatu modifikasi proses kristalisasi untuk mengayakan asam lemak tak jenuh dalam asam lemak minyak biji rami dengan menggunakan suatu pelarut pada suhu rendah. Hasil terbaik tercapai ketika campuran 30 % asetonitril dengan 70 % aseton digunakan sebagai medium pelarut. Kristalisasi asam lemak bebas atau dalam bentuk metil ester sering dilakukan dengan terlebih dahulu mengkomplekskannya dengan urea. Menurut Joseph dan Seaborn (1990), urea akan membentuk kristal dengan senyawa berantai lurus dan bukan senyawa-senyawa berantai cabang atau siklik. Kristal urea murni terdapat dalam bentuk tetragonal yang kompleks dan akan membentuk kristal dengan struktur heksagonal bila membentuk kompleks dengan senyawa-senyawa alifatik berantai lurus. Pendinginan Bertahap Penelitian terbaru dari pemisahan TAG, DAG, dan MAG telah dilakukan oleh Watanabe (2006). Pada penelitiannya asam lemak hasil hidrolisis lipase dipisahkan dengan menggunakan teknik pendinginan pelarut. Secara garis besar pemisahan ini berdasarkan kelarutan bahan dalam pelarut. Sampel hasil hidrolisis dilarutkan ke dalam pelarut dengan perbandingan tertentu kemudian didinginkan. Kristal yang didapat dipisahkan dengan cara disentrifugasi pada suhu -20 OC. Dengan metode pendinginan pelarut perolehan MAG dapat meningkat dari 95,8 % menjadi 98,4 % (Watanabe 2006). Pada penelitian ini digunakan metode pemisahan kromatografi kolom dan pendinginan bertingkat. Hal tersebut dipilih karena kedua buah metode tersebut lebih mudah digunakan dalam produksi DAG skala besar.