bab iii bahan dan metode

BAB III
BAHAN DAN METODE
3.1. Tempat dan Waktu
Tempat penelitian analisis DNA dilakukan di Common Laboratory
SEAMEO BIOTROP dan laboratorium Silvikultur Fakultas Kehutanan Institut
Pertanian Bogor. Penelitian ini dilaksanakan pada bukan Februari 2011 sampai
dengan Januari 2012.
3.2. Bahan dan Alat Penelitian
3.2.1. Bahan Penelitian
Bahan tanaman yang digunakan berupa daun sengon yang berasal dari
tegakan yang diambil secara acak di beberapa hutan rakyat di Jawa. Adapun
daerah-daerah pengambilan sampel dapat dilihat pada Tabel 1.
Tabel 1 Lokasi tempat pengambilan sampel daun sengon pada hutan rakyat di
Jawa
Provinsi
Jawa Barat
Kota/ Kabupaten
Cianjur
Sukabumi
Garut
Subang
Kuningan
Tasikmalaya
Jawa Tengah
Wonosobo
Jawa Timur
Kediri
Lumajang
Total
Jumlah Sampel
25
25
25
25
25
25
25
25
25
225
Bahan-bahan yang digunakan pada penelitian ini secara lengkap dapat
dilihat pada Lampiran 1. Adapun secara garis besar bahan-bahan yang digunakan
adalah: Nitrogen cair, buffer ekstrak CTAB (Cetyl Trimethyl Ammonium
Bromide), β─Mercaptoethanol, GenElute Plant Genomic DNA Miniprep Kit dari
SIGMA, Chloroform: Isoamylalcohol, phenol, aquabidest, isopropanol dingin,
etanol 70% dan buffer TE. Pada proses PCR bahan-bahan yang digunakan adalah:
DNA template, Nuclease free water, primer random dan pereaksi PCR (dNTP,
Taq polymerase, Buffer PCR, dan MgCl2). Adapun bahan-bahan yang digunakan
dalam visualisasi DNA yaitu, agarose, aqudest, buffer TAE, loading dye, DNA
marker, Etbr atau SYBR safe gel stain DNA. Alat-alat yang digunakan dalam
penelitian ini dapat dilihat secara lengkap pada Lampiran 2.
3.3. Prosedur Penelitian
Metode analisis DNA dengan RAPD dibagi menjadi tiga tahap yaitu
ekstraksi DNA, proses PCR yang menghasilkan RAPD, skoring dan analisis data.
Secara umum prosedur penelitian dengan metode RAPD dapat dilihat pada
Gambar 1.
Sample (daun)
Ekstraksi DNA
Tidak
Elektroforesis agar 1%, V : 100 Volt
PCR (seleksi primer random)
PCR (seleksi primer)
PCR (primer terbaik)
Tidak
Elektroforesis (Agar 1,5%, V : 100 volt)
Foto
Interpretasi dan Analisis Data
deskriptif
POPGEN
NTSYS
S
Gambar 1 Bagan tahapan penelitian
3.3.1. Ekstraksi DNA
Ekstraksi DNA merupakan metode pemisahan DNA dari bahan-bahan yang
tidak diperlukan. Dalam penelitian ini, ekstraksi DNA Sengon dilakukan dengan
dua metode, yaitu metode CTAB dan GenElute Plant Genomic DNA Miniprep Kit
11
dari SIGMA. Metode CTAB menggunakan larutan buffer CTAB (Tris-HCL 1M,
NaCl 5M, EDTA 0,5 M dan CTAB 10%), dipilih karena lebih murah dan mudah
dilakukan (Rogers and Bendich 1994, diacu dalam Aritonang et al. 2007). Adapun
langkah awal yang dilakukan dari 2 metode ini hampir sama yaitu, sampel daun
Sengon 0,25─0,5 g digerus dengan bantuan nitrogen cair. Hasil gerusan
dimasukkan ke dalam tube 2 ml yang telah diisi 1 ml buffer ekstrak CTAB dan
1% β-mercaptoethanol. Campuran divortex ± 2 menit, kemudian diinkubasi 650C
selama 30 menit (setiap 10 menit campuran dihomogenkan dengan membolakbalikan tabung). Larutan ekstrak DNA dipurifikasi dengan menambahkan 750 µl
Chloroform, lalu campuran divortex dan disentrifugasi pada kecepatan 11.000
rpm selama 10 menit. Proses sentrifugasi dilakukan untuk memisahkan bahanbahan kimia atau fase organik dari fase air berupa supernatan. Dari kedua fase
tersebut yang digunakan untuk tahap selanjutnya adalah fase air yang berisi
benang-benang nukleat. Supernatan dipipet kedalam tube 2 ml yang baru, proses
purifikasi dilakukan sebanyak dua kali, hal ini bertujuan untuk memperoleh DNA
yang memiliki tingkat kemurnian tinggi. DNA diendapkan dengan penambahan 1
ml isopropanol dingin. Kemudian dihomogenkan perlahan sampai terbentuk
benang-benang putih. Campuran diinkubasi pada suhu -20oC selama minimal 30
menit, kemudian pelet di sentrifugasi pada kecepatan 11.000 rpm selama 10
menit. Setelah itu pelet DNA dilarutkan dengan buffer TE.
Selain itu dalam penelitian ini dilakukan juga modifikasi metode ekstraksi
DNA menggunakan buffer CTAB dan menggunakan GenElute Plant Genomic
DNA Miniprep Kit dari SIGMA. Dimana setelah mendapatkan supernatan dari
ektraksi DNA dengan penggunaan buffer CTAB dilakukan load lysate dengan
menambahkan column preparation 700 µl kedalam binding column. Setelah itu
dilakukan first column wash dengan menambahkan wash solution sebanyak 500
µl. Adapun tahap terakhir yaitu tahapan elute DNA dengan menambahkan elution
solution sebanyak 200 µl. Karakteristik pita DNA dapat diamati dengan
melakukan elektroforesis menggunakan gel agarose dengan konsentrasi sebesar
1%. Gel yang telah dieletroforesis direndam di dalam Etbr 1x selama 30 menit.
Gel divisualisasikan di dalam KODAK Gel Logic 200.
12
3.3.2. PCR (Polymerase Chain Reaction)
Proses amplifikasi DNA pada PCR membutuhkan bahan campuran yang
terdiri dari buffer PCR, MgCl2, dNTP yang digunakan sebagai sumber nukleotida
pada proses PCR (gabungan dATP, dGTP, dCTP dan dTTP), Taq DNA
polymerase, DNA hasil isolasi dan Nuclease Free Water (Tabel 2). Sebelum
dilakukan proses amplifikasi PCR harus dilakukan pengenceran DNA tamplate
dengan Nuclease Free Water. Hal ini tergantung dari tebal dan tipisnya DNA
genomik hasil ekstraksi.
Mengacu pada Promega (2003), jumlah DNA yang diperlukan dalam proses
PCR sangat sedikit yaitu sekitar 1 μl atau 10 ng/μl. Untuk mengetahui konsentrasi
DNA hasil ekstraksi dapat ditetapkan dengan melakukan elektroforesis
menggunakan gel agarose. Hasil amplifikasi DNA dengan PCR ditentukan oleh
primer oligonukleotida yang digunakan.
Tabel 2 Komponen bahan untuk reaksi PCR.
No
1
2
3
4
5
6
7
Nama Bahan
1 Sampel Reaksi
DNA target
Primer
PCR buffer
MgCl2
dNTP
Taq DNA polymerase
Nuclease free water
2 µl
1,5 µl
5 µl
2,5 µl
0,5 µl
0,2 µl
13,3 µl
25 µl
Total Volume
Proses PCR dilakukan dengan menggunakan primer hasil seleksi. Adapun
tahapan PCR yang dilakukan dapat dilihat pada Tabel 3.
Tabel 3 Tahapan proses PCR
Tahapan
Pre-denaturation
Denaturation
Annealing
Extension
Final Extension
Suhu
(oC)
95
95
37
72
72
Waktu
(menit)
Jumlah Siklus
2
1
2
2
5
1
35
35
35
1
13
3.3.3. Seleksi Primer
Primer adalah rantai pendek DNA yang dihasilkan secara buatan yang
biasanya terdiri antara 10–25 nukleotida (Finkeldey 2005). Dalam teknik RAPD,
umumnya primer yang digunakan berupa oligonukleotida yang memiliki panjang
sebesar 10-mer yang dipilih secara acak dan minimum memiliki basa G dan C.
Primer yang mempunyai panjang kurang dari 10-mer dapat digunakan tetapi akan
menghasilkan produk amplifikasi yang lebih sedikit dan diperlukan metode
pewarnaan yang lebih sensitif untuk mendeteksinya.
Seleksi primer dimaksudkan untuk mencari primer acak yang menghasilkan
penanda polimorfik, karena tidak semua primer nukleotida dapat menghasilkan
produk amplifikasi (primer positif) dan dari primer positif tidak semuanya
menghasilkan fragmen DNA polimorfik. Pada kegiatan ini dilakukan seleksi
terhadap primer, yaitu golongan OPO, OPY, OPA, OPB, OPC dan OPD yang
diproduksi oleh Operon Technology. Urutan basa primer yang dicobakan dapat
dilihat pada Tabel 4.
Tabel 4 Urutan basa nukleotida 41 primer (Operon Technology) yang dicobakan.
No
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
Primer
OPA-1
OPA-2
OPA-3
OPA-4
OPA-6
OPA-7
OPA-8
OPA-9
OPA-10
OPB-1
OPB-2
OPB-3
OPB-4
OPB-5
OPB-6
OPB-7
OPB-8
OPB-9
OPB-10
OPC-1
Urutan Nukleotida
CAGGCCCTTC
TGCCGAGCTG
AGTCAGCCAC
AATCGGGCTG
GGTCCCTGAC
GAAACGGGTG
GTGACGTAGG
GGGTAACGCC
GTGATCGCAG
GTTTCGCTCC
TGATCCCTGG
CATCCCCCTG
GGACTGGAGT
TGCGCCCTTC
TGCTCTGCCC
GGTGACGCAG
GTCCACACGG
TGGGGGACTC
CTGCTGGGAC
TTCGAGCCAG
No
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
Primer
OPC-2
OPC-3
OPC-4
OPC-5
OPC-6
OPC-7
OPC-8
OPD-1
OPD-2
OPD-3
0PD-4
OPD-5
OPD-6
OPD-7
OPD-8
OPD-9
OPD-10
OPU-5
OPY-5
OPY-3
Urutan Nukleotida
GTGAGGCGTC
GGGGGTCTTT
CCGCATCTAC
GATGACCGCC
GAACGGACTC
GTCCCGACGA
TGGACCGGTG
ACCGCGAAGG
GGACCCAACC
GTCGCCGTCA
TCTGGTGAGG
TGAGCGGACA
ACCTGAACGG
TTGGCACGGG
GTGTGCCCCA
CTCTGGAGAC
GGTCTACACC
TTGGCGGCCT
GGCTGCGACA
ACAGCCTGCT
Dari hasil seleksi primer yang dilakukan hanya diambil 5 primer yaitu OPA2, OPA-3, OPB-10, OPY-5 dan OPU-5. Urutan nukleotida dari masing-masing
14
primer adalah OPA-2 (TGCCGAGCTG), OPA-3 (AGTCAGCCAC), OPB-10
(CTGCTGGGAC), OPY-5 (GGCTGCGACA) dan OPU-5 (TTGGCGGCCT).
Hasil dari proses PCR tersebut dianalisis dengan melakukan proses elektroforesis
menggunakan 1,5% gel agarose dalam larutan buffer TAE 1x dan distaining
dengan menggunakan SYBR safe gel stain DNA.
3.4. Skoring Fragmen RAPD
Hasil PCR yang telah dielektroforesis dilakukan pengambilan foto dan
dianalisis dengan melakukan skoring. Profil pita DNA hasil analisis RAPD
diskoring dengan ada atau tidaknya hasil amplifikasi. Jika terdapat pita maka
genotipe tersebut dinilai 1 dan jika tidak terdapat pita pada genotipe yang lain
dinilai 0. Contoh proses skoring dapat dilihat pada Gambar 2.
Gambar 2 Cara analisis DNA dengan skoring
3.5. Data Analisis
Hasil skoring yang diperoleh bertujuan untuk memperoleh nilai untuk
menghitung keragaman genetik seluruh populasi dan diferensiasi antar populasi
dengan menggunakan program POPGEN 32. Pendugaan hubungan kekerabatan
dilakukan berdasarkan jumlah pita polimorfik yang dimiliki bersama (Nei dan Lei
1979, diacu dalam Yunanto 2006). Analisis pengelompokan berdasarkan metode
UPGMA (Unweighted Pair-Group with Aritmatic Average) dengan software
NTSYS Versi 2.0. Analysis of Molecular Variance (AMOVA) berdasarkan
Program GenAlEx.
Parameter variasi genetik yang diamati dalam penelitian ini adalah sebagai
berikut (Finkeldey 2005):
1. Persentase Lokus Polimorfik (PLP) =
x 100%
Keterangan :
∑ (LP) : jumlah lokus gen polimorfik
∑ (LM) : jumlah lokus gen monomorfik
15
2. Jumlah alel yang diamati (ne) =
3. Jumlah alel yang efektif (na) =
Keterangan : pi = frekuensi genetik tipe ke i
4. Heterozigositas harapan =
Keterangan : pi = frekuensi genetik tipe ke i
5. Diferensiasi genetik (Gst) (Nei 1973) =
Keterangan :
Ht : Keragaman genetik total
Hs : Keragaman genetik populasi
16