Efektivitas Metode Transfeksi Dalam Penyisipan

6
PEMBAHASAN
Gen pemendar yang sering digunakan
dalam kajian ilmiah ada beberapa jenis,
diantaranya red fluorescent protein (RFP),
green fluorescent protein (GFP), dan yellow
fluorescent protein (YFP). Pada penelitian ini
dipilih RFP dengan harapan dapat
meningkatkan performa warna merah pada B.
imbellis. Penyisipan fluorescent protein
seperti RFP diharapkan dapat menghasilkan
individu transgenik dengan mutu warna yang
lebih baik seperti yang dilakukan oleh Gong
et al (2003) dalam Parenrengi (2010).
Penggunaan tiga metode transfer gen
yakni mikroinjeksi, elektroporasi, dan
transfeksi telah dilakukan oleh Sun et al.
(2005) pada udang vaname (Litopenaeus
vannamei).
Hasil
penelitian
tersebut
menunjukkan bahwa metode transfeksi
merupakan metode yang paling sesuai
berdasarkan alasan ukuran telur yang relatif
kecil, daya tetas yang tinggi, dan dapat
diaplikasikan dalam jumlah yang banyak.
Telur ikan cupang memiliki karakteristik
yang hampir sama dengan telur udang
vaname, sehingga metode transfeksi dipilih
untuk transgenesis pada ikan cupang alam.
Penelitian pendahuluan dengan menggunakan
metode
transfeksi
dan
elektroporasi
menunjukkan bahwa metode transfeksi lebih
efektif digunakan pada transgenesis ikan
cupang alam dilihat dari hasil PCR.
Konsentrasi DNA plasmid dan reagen
transfeksi merupakan salah satu faktor utama
yang menentukan optimalisasi prosedur
transfeksi (Sakurai et al. 2000 dalam
Calderon 2004). Konsentrasi DNA yang
terlalu tinggi dapat bersifat toksik pada
embrio target (Tseng et al. 2000 dalam
Calderon 2004). Selain itu, rasio reagen dan
DNA plasmid harus dioptimasi sesuai dengan
tipe individu target. Pada penelitian ini, rasio
reagen transfeksi dan DNA yang berbeda
tidak
menunjukkan
perbedaan
yang
signifikan dalam derajat penetasan telur.
Artinya konsentrasi DNA plasmid dan reagen
transfeksi yang digunakan dalam penelitian
ini tidak berdampak buruk bagi individu
target. Hal ini dapat dilihat dari nilai rata-rata
derajat penetasan telur dari perlakuan RFP
1:1, RFP 3:1, dan kelompok kontrol yang
tidak menunjukkan perbedaan signifikan.
Reagen transfeksi memiliki mekanisme
kerja yang unik dalam mengintegrasikan
DNA asing ke organism target dengan risiko
kerusakan fisik yang kecil. Sebelumnya,
beberapa reagen telah dipelajari potensinya
dalam transgenesis, misalnya calcium
phosphate dan DEAE-dextran (Calderon
2004). Meskipun kedua reagen tersebut
memungkinkan terjadinya interaksi antara
DNA dan membran sel, namun sifat kimianya
dapat bersifat toksik bagi sel. Felgner (1987)
mengembangkan
prosedur
transfeksi
menggunakan lipid yang lebih efisien dan
toksisitasnya rendah. Saat ini, reagen
transfeksi yang berbasis lipid ini telah
dikembangkan secara luas. Sun et al. (2005)
dan Sucipto (2009) menyebutkan bahwa
penggunaan reagen transfeksi JetPEI
(Qbiogene) tidak bersifat toksik terhadap
organisme uji. Pada penelitian ini dapat
dilaporkan bahwa reagen yang digunakan,
yaitu X-tremeGENE HP DNA transfection
reagents (Roche) juga tidak bersifat toksik
sehingga berpotensi untuk dikembangkan
dalam transgensis.
Jumlah telur yang menetas pada
kelompok kontrol lebih tinggi dibanding
kelompok perlakuan. Jumlah ikan yang hidup
dari hasil perlakuan yang berbeda tidak
memiliki pola yang jelas. Hal ini
menunjukkan bahwa derajat penetasan telur
bukan semata-mata pengaruh dari perlakuan,
tetapi ada faktor lain selama embriogenesis
maupun setelah ikan menetas. Faktor lain
tersebut diduga disebabkan oleh faktor
lingkungan yang ekstrim dan tidak stabil.
Selain itu dapat pula disebabkan karena
penanganan embrio pascaperlakuan yang
belum tepat. Telur dan larva perlakuan
diduga rentan terhadap fluktuasi suhu dan pH
pada lingkungan. Dugaan lain adalah kualitas
telur yang tidak seragam. Pada umumnya
rata-rata derajat penetasan telur ikan cupang
tanpa perlakuan dapat mencapai 90-100%,
sedangkan pada penelitian ini berkisar antara
70-80%. Oleh karena itu penggunaan telur
dari induk yang sama perlu dilakukan untuk
mendapatkan keseragaman kualitas.
Deteksi keberhasilan transfer gen
dilakukan dengan polymerase chain reaction
(PCR). PCR dilakukan pada fase embrio
akhir dan larva untuk melihat kestabilan
ekspresi gen asing pada setiap fase
perkembangan. Hasil PCR telur dan larva
menunjukkan bahwa pita DNA yang
teramplifikasi sesuai dengan ukuran primer
yang digunakan, yaitu sekitar 0.6 kb. Pada
perlakuan RFP 1:1 ada pita DNA yang
muncul (1A, 4A, dan 6A) dan ada yang tidak
muncul (5A). Penyebab tidak munculnya pita
diduga disebabkan karena proses ekstraksi
yang tidak tepat atau konsentrasi DNA yang
terlalu tinggi sehingga sulit annealing pada
7
saat proses PCR. Perlakuan dengan rasio 3:1
menunjukkan hasil PCR yang positif, baik
pada sampel telur maupun larva. Secara
keseluruhan, hasil PCR pada telur dan larva
dari kedua perlakuan menunjukkan hasil yang
positif.
PCR pada kelompok kontrol non
transgenik dilakukan untuk memastikan
keberhasilan
penyisipan
gen
melalui
transfeksi. PCR pada kontrol seharusnya
menunjukkan hasil yang negatif, akan tetapi
kontrol pun ternyata dapat teramplifikasi
dengan ukuran DNA yang sama. Hasil yang
positif tersebut terjadi pada sampel telur
maupun larva kontrol. Menurut Sambrook &
Russel (2001), munculnya pita DNA pada
kontrol non transgenik diduga disebabkan
oleh kontaminasi larutan PCR atau peralatan
yang digunakan dengan template DNA.
Kontaminasi dapat terjadi saat ekstraksi DNA
maupun saat PCR. Selain itu, positifnya hasil
PCR pada kelompok non transgenik juga
dapat terjadi karena primer PCR yang
digunakan kurang spesifik.
Untuk melihat spesifik atau tidaknya
primer yang digunakan, dilakukan PCR pada
sirip induk B. Imbellis dan pada sirip ikan
mas (Cyprinus carpio). Pembanding pada
konfirmasi PCR ini dapat dilakukan dengan
sampel apa saja asalkan berbeda spesies
dengan organisme uji, dalam hal ini dipilih
genom C. carpio koleksi BPPI Sukamandi.
Konfirmasi PCR menunjukkan bahwa pita
DNA hanya muncul pada kontrol positif dan
sampel sirip B. imbellis.
Dalam hal ini, hasil PCR yang belum
konsisten dapat disebabkan oleh beberapa
faktor. Diduga terdapat kontaminan pada
sampel kontrol non transgenik sehingga pita
DNA muncul dengan ukuran yang sama.
Kondisi PCR yang belum optimal juga dapat
menyebabkan hal tersebut terjadi. Proses
ekstraksi DNA atau pengambilan supernatan
yang kurang tepat juag dapat menjadi
penyebabnya. Kespesifikan primer PCR juga
harus dicobakan terlebih dahulu sebelum
digunakan karena pada penelitian ini primer
PCR tidak dapat mengamplifikasi genom
ikan mas. Untuk mendapatkan hasil yang
spesifik, seharusnya konstruksi plasmid
didesain dari ikan cupang alam sendiri (allfish gene construct) seperti yang dilakukan
oleh Parenrengi (2010) yang menggunakan
all-shrimp gene construct untuk transgenesis
pada
udang
windu.
Hal
tersebut
membutuhkan waktu dan proses yang sangat
panjang sehingga belum mungkin dilakukan
pada penelitian ini.
Secara umum, hasil penyisipan RFP pada
zigot B. imbellis melalui metode transfeksi
memberikan hasil yang positif baik pada
rasio 1:1 maupun 3:1 walaupun tidak
dibuktikan dengan PCR pada seluruh
perlakuan. Namun demikian hasil PCR
terhadap telur yang ditransfeksi mewakili
untuk melihat efektivitas metode ini dalam
teknologi transgenesis ikan hias, khususnya
ikan cupang alam.
Proses embriogenesis pada B. imbellis
belum dipublikasi secara ilmiah. Pada
penelitian ini embriogenesis B. imbellis telah
berhasil diamati. Telur B. imbellis berwarna
putih keruh jika diamati tanpa menggunakan
mikroskop. Di bawah mikroskop akan terlihat
chorion yang bening dengan kuning telur
yang berwarna keruh dan tidak tembus
cahaya. Perkembangan embrio dibagi
menjadi beberapa tahap, tahap pertama
adalah pembelahan atau cleavage dari 2 (dua)
sampai menjadi 64 sel lalu dilanjutkan
dengan tahap kedua, pembelahan 128 sampai
dengan kurang lebih 1000 sel. Tahap ketiga
adalah perisai embrio, keempat gastrula,
kelima segmentasi dan tahap terakhir adalah
tahap embrio dan menetas menjadi larva
(Kimmel et al. 1995 dalam Cindelaras 2005).
Fase pembelahan dimulai sesaat setelah
blastodisk terbentuk dan akan membelah
menjadi dua sampai sekitar 32 sel (Kimmel et
al. 1995 dalam Cindelaras 2005). Pada fase
pembelahan, blastodisk akan membelah
sesuai bidang pembelahan menjadi dua
dengan bentuk yang sama. Pembelahan
pertama pada B. imbellis terjadi dua menit
setelah fertilisasi. Sebagai perbandingan,
pembelahan pertama pada ikan Neon Tetra
terjadi pada waktu 50 menit setelah
pembuahan (Hartono 2002) dan 70 menit
pada ikan Redfin Shark (Sedjati 2002).
Perbedaan ini terutama disebabkan oleh
perbedaan spesies. Setelah melewati fase
pembelahan 128 sampai dengan 1000 sel atau
blastula, pembelahan sudah mulai terlihat
tidak jelas dengan sel yang saling bertumpuk.
Tahap pembelahan sampai dengan 32 sel
berlangsung selama 32 menit.
Setelah
fase
blastula
berakhir,
dilanjutkan dengan fase gastrula dimana
blastomer
akan
melakukan
gerakan
invaginasi dan membentuk rongga yang
dinamakan gastrocoel. Blastomer kemudian
menutupi 50% dari kuning telur yang
menunjukkan berlangsungnya pembentukan
perisai embrio (Gambar 7a). Fase ini
berlangsung pada 404 menit atau lebih
kurang 7 jam setelah terbentuknya blastodisk.