aktivitas bakteri kitinolitik yang diisolasi dari tambak
advertisement
Prosiding Seminar Nasional Kimia, ISBN : 978-602-0951-00-3 Jurusan Kimia FMIPA Universitas Negeri Surabaya, 20 September 2014 AKTIVITAS BAKTERI KITINOLITIK YANG DIISOLASI DARI TAMBAK UDANG DI SITUBONDO CHITINOLYTIC ACTIVITY ISOLATED FROM SHRIMP PONDS IN SITUBONDO Yusak Yulianus Prabowo, Nuniek Herdyastuti Jurusan Kimia FMIPA Universitas Negeri Surabaya Jl. Ketintang Surabaya (60231), Telp. 031-8298761 e-mail: [email protected] Abstrak. Tujuan penelitian ini adalah untuk mengetahui aktivitas bakteri kitinolitik yang diisolasi dari tambak udang di Situbondo. Bakteri kitinolitik berhasil diisolasi dengan menumbuhkan pada media yang mengandung kitin koloidal 1%. Diperoleh 40 isolat dari Situbondo (STB 1 - STB 40) dan 34 isolat menunjukkan aktivitas kitinase. Uji aktivitas kitinase didasarkan pada pelepasan N-asetilglukosamin yang dikomplekskan dengan asam 3,5-dinitrosalisilat. Aktivitas kitinase tertinggi ditunjukkan oleh isolat STB 13 sebesar 0,3152 U/mL. Hasil uji morfologi serta fisiologi diduga bahwa isolat STB 13 merupakan Bacillus licheniformis. Kata kunci: aktivitas kitinase, Bacillus licheniformis, bakteri kitinolitik, kitin koloidal. Abstract. The aim of this research was to determine the activity of chitinolytic bacteria isolated from shrimp ponds in Situbondo. Chitinolytic bacteria were isolated by growing in media containing 1% colloidal chitin. Obtained 40 isolates from Situbondo (STB 1 to STB 40) and 34 isolates yield the chitinase activity. Chitinase activity assay based on release of N-acetyl-glucosamine were complexed with 3,5-dinitrosalicylic acid. The highest chitinase activity were shown by isolates STB 13 were 0,3152 U/mL. Based on morphology and physiology test suspected that isolate STB 13 belonging to Bacillus licheniformis Keyword: chitinase activity, Bacillus licheniformis, chitinolytic bacteria, colloidal chitin. PENDAHULUAN Bakteri kitinolitik adalah bakteri yang dapat menghasilkan enzim kitinase serta dapat mendegradasi kitin menjadi monomernya Nasetil-glukosamin. Bakteri kitinolitik dapat diperoleh dari berbagai sumber seperti rizosfer, phyllosphere, tanah, atau dari lingkungan air seperti laut, danau dan tambak udang. Tidak hanya dari daerah mesofilik, bakteri kitinolitik dapat diisolasi dari daerah ekstrim, seperti dari sumber air panas, lumpur panas dan daerah panas bumi. Sampai saat ini, jumlah dan keanekaragaman bakteri kitinolitik belum banyak diketahui [1] [2]. Eksplorasi habitat bakteri kitinolitik diperlukan untuk mengetahui keberagaman bakteri kitinolitik yang dapat menghasilkan enzim kitinase dengan aktivitas tertinggi. Dalam tambak udang, terdapat proses molting dari udang yang berlangsung secara berkala dan menghasilkan kitin [3]. Kitin dapat degradasi dengan cepat menjadi monomer Nasetil-glukosamin, hal tersebut di duga karena adanya aktivitas dari bakteri kitinolitik. Bakteri kitinolitik dapat diperoleh dengan cara ditumbuhkan pada media yang mengandung kitin. Adanya bakteri kitinolitik dapat dideteksi dengan zona bening di sekitar koloni di media padat yang mengandung kitin [4]. Beberapa bakteri memanfaatkan kitin sebagai sumber karbon dan nitrogen [2]. Bakteri kitinolitik sangat menarik untuk diisolasi karena dapat menghasilkan enzim kitinase yang dapat mendegradasi senyawa kitin yang bersifat ramah lingkungan B - 75 Prosiding Seminar Nasional Kimia, ISBN : 978-602-0951-00-3 Jurusan Kimia FMIPA Universitas Negeri Surabaya, 20 September 2014 (biokompatibel) dan tidak beracun. Bakteri kitinolitik banyak digunakan di berbagai bidang yaitu sebagai biokontrol serangga dan jamur, pengendalian nyamuk dan pengolahan limbah kitin dari industri [5]. Senyawa hasil degradasi kitin atau disebut senyawa turunan kitin juga banyak digunakan di berbagai bidang. Di bidang farmasi monomer kitin Nasetil-glukosamin digunakan sebagai suplemen dan obat-obatan untuk mengontrol kadar gula darah, serta dalam bidang kosmetik N-asetilglukosamin digunakan untuk mengurangi aktivitas dari enzim tirosinase yang memproduksi melanin [2]. di tumbuhkan pada media padat Luria Bertani kemudian diinkubasi selama 24 jam pada suhu ruang untuk mendapatkan kultur campuran. Seleksi Bakteri Penghasil Kitinase dari Tambak Udang Setiap koloni tunggal ditumbuhkan pada media cair yang mengandung kitin koloidal 1% kemudian di shaker pada kecepatan 150 rpm selama 20 jam pada suhu ruang. Kultur dipanen dengan cara disentrifugasi pada kecepatan 4000 rpm selama 15 menit pada suhu 4oC. Supernatan yang diperoleh ditentukan aktivitasnya dengan menggunakan metode kolorimetri. Pembentukan zona bening dapat dideteksi dengan menumbuhkan koloni tunggal pada media padat yang mengandung kitin koloidal 0,3% BAHAN DAN METODE Alat Mikropipet, sentrifus (eppendorf 5810 R), shaker, laminar air flow, UV-Vis (Shimadzu 1800), autoklaf (Hirayama), dan peralatan gelas. Uji Aktivitas Kitinase Aktivitas kitinase ditentukan berdasarkan jumlah N-asetil-glukosamin yang dilepaskan kemudian dikomplekskan dengan reagen asam 3,5-dinitrosalisilat [8]. Sebanyak 2 mL larutan kitin 1% (m/v) yang dilarutkan dalam buffer fosfat 0,2M ditambahkan dengan larutan enzim 0,5 mL, lalu diinkubasi selama 2 jam. Setelah diinkubasi selama 2 jam, kemudian ditempatkan pada air mendidih selama 5 menit lalu didinginkan pada suhu ruang. Suspensi tersebut disentrifugasi pada kecepatan 4000 rpm selama 10 menit. Sebanyak 1 mL supernatan yang diperoleh ditambahkan dengan 2 mL air bebas ion dan 1,5 mL reagen pewarna yang terdiri dari 5,3 M natrium kalium tartrat dan 96mM asam 3,5dinitrosalisilat. Kemudian diinkubasi selama 5 menit pada air mendidih lalu didinginkan pada suhu ruang untuk kemudian dibaca absorbansinya pada panjang gelombang 540 nm. Bahan Yeast extract (difco), bacto tripton (difco), agar, NaCl, cangkang udang, HCl p.a (Sigma), NaOH, Natriumkaliumtartrat, asam 3,5-dinitrosalisilat (sigma), air bebas ion, NaH2PO4, Na2HPO4, N-acetyl-glucosamine (sigma). Prosedur Penelitian Isolasi Kitin dari Cangkang Udang Terdapat dua tahapan untuk isolasi kitin dari cangkang udang meliputi deproteinasi dengan larutan NaOH kemudian demineralisasi dengan menggunakan asam klorida [6] Substrat Kitin Koloidal Kitin koloidal dibuat dari kitin yang dilarutkan dengan HCl pekat dengan menggunakan metode Hsu dan Lockwood [7] HASIL DAN DISKUSI Isolasi Bakteri dari Tambak Udang Pada penelitian ini digunakan sampel air yang diambil dari tambak udang di Situbondo dimana sampel air tersebut memiliki pH 7 Isolasi Bakteri dari Tambak Udang Sampel air dari tambak udang yang diambil secara acak kemudian di campur sampai homogen. Sebanyak 100 µL sampel air B - 76 0,1126 STB 26 0,0782 0,1557 STB 24 STB 22 0,2026 0,1236 STB 21 0,2660 STB 19 STB 20 0,2558 STB 18 0,2949 0,2675 STB 16 0,2253 0,1909 STB 15 0,2527 0,0821 0,1017 0,0618 0,0767 0,1283 0,2167 0,1916 0,2417 0,2010 0,2167 0,2003 0,3000 0,2500 0,2000 0,1500 0,1000 0,0500 0,0000 STB 27 STB 28 STB 29 STB 30 STB 31 STB 32 STB 34 STB 36 STB 37 STB 38 STB 39 STB 40 Aktivitas Kitinase U/mL Gambar 2. Aktivitas Kitinase Isolat STB 14 – STB 26 Isolat Gambar 3. Aktivitas Kitinase Isolat STB 27 – STB 40 0,2926 0,3129 0,3152 Gambar 1 sampai dengan 3 menunjukkan aktivitas 34 isolat bakteri yang di isolasi dari tambak udang Situbondo. Aktivitas kitinase dari 34 isolat berkisar antara 0,0782 U/mL sampai dengan 0,3152 U/mL. Isolat STB 13 menunjukkan nilai aktivitas kitinase yang tertinggi dibandingkan isolat lainnya yaitu sebesar 0,3152 U/mL. Nilai aktivitas kitinase isolat STB 13 tersebut lebih kecil bila dibandingkan dengan aktivitas Psedomonas psedomalei LA21 yang di isolasi dari tambak udang di Lamongan yakni sebesar 0,731 U/mL [10], tetapi lebih besar nilainya bila dibandingkan dengan Stenotrophomonas sp. B2-4 yang di isolasi dari air tanah di Ds, Penajakan Kab. Pasuruan dengan aktivitas 0,1009 0,0876 0,1103 0,1322 0,3051 0,2511 0,3121 0,2667 0,3500 0,3000 0,2500 0,2000 0,1500 0,1000 0,0500 0,0000 Isolat STB 1 STB 2 STB 3 STB 4 STB 5 STB 7 STB 9 STB 10 STB 11 STB 12 STB 13 Aktivitas Kitinase U/mL Uji Aktivitas Kitinase Semua isolat yang diperoleh ditentukan aktivitas kitinasenya dengan menumbuhkan pada media yang mengandung kitin koloidal 1%. Kitin koloidal akan bertindak sebagai induser gen kitinase pada bakteri sehingga gen tersebut dapat terekspresi [9]. Metode konvensional yang menggunakan kitin koloidal sebagai substrat ditemukan sangat efektif untuk menentukan aktivitas kitinase. Aphamocladium album dapat memproduksi 9 jenis kitinase saat ditumbuhkan dalam kitin koloidal, tetapi ketika dalam serbuk kitin hanya menghasilkan 3 jenis kitinase, hal tersebut di duga karena konformasi serta cross-linking pada polisakarida berbeda dengan kitin koloidal dalam media pertumbuhannya [1][2]. Hasil uji aktivitas bakteri kitinolitik yang di isolasi dari tambak udang Situbondo seperti tampak pada Gambar 1 sampai 3. Dari 40 isolat yang berhasil dipisahkan, hanya 34 isolat yang dapat tumbuh dalam media screening. Hal tersebut di duga karena isolat tersebut tidak memiliki aktivitas kitinase atau aktivitas kitinasenya sangat kecil. 0,3500 0,3000 0,2500 0,2000 0,1500 0,1000 0,0500 0,0000 STB 14 Aktivitas Kitinase U/mL dengan suhu 32oC. Diperoleh 40 isolat yang berhasil dipisahkan dari tambak udang tersebut yang diberi nama dengan STB 1 sampai dengan STB 40. STB 17 Prosiding Seminar Nasional Kimia, ISBN : 978-602-0951-00-3 Jurusan Kimia FMIPA Universitas Negeri Surabaya, 20 September 2014 Isolat Gambar 1. Aktivitas Kitinase Isolat STB 1 – STB 13 B - 77 Prosiding Seminar Nasional Kimia, ISBN : 978-602-0951-00-3 Jurusan Kimia FMIPA Universitas Negeri Surabaya, 20 September 2014 4,8.10-3 U/ml [11], dan Enterobacter sp. G-1 yang di isolasi dari perairan di kota Matsue, Jepang dengan aktivitas 0,039 U/mL [12]. Sebagian besar mikroorganisme tanah dan peairan adalah pendegradasi kitin yang unggul dan beberapa mikroorganisme dapat memanfaatkan kitin sebagai sumber karbon dan nitrogen [2]. kitin akan didegradasi sempurna menjadi monomernya N-asetilglukosamin oleh enzim kitinase melalui tahapan yang berurutan yang melibatkan enzim endokitinase, eksokitinase dan N-asetilglukosaminidase. Pertama, hidrolisis terjadi pada ikatan β-1,4 glikosidik yang dilakukan oleh endokitinase menghasilkan oligomer pendek N-asetil-glukosamin. Kemudian eksokitinase akan memotong oligomer kitin hanya dari ujung non reduksi menghasilkan dimmer N-asetil-glukosamin. N-asetilglukosaminidase akan meghidrolisis dimmer N-asetil-glukosamin menghasilkan monomer N-asetil-glukosamin [13]. isolat tersebut berwarna putih, berbentuk bulat, elevasi datar, tepi rata, dengan permukaan lembut (smooth). Hasil uji fisiologi (biokimia) isolat STB 13 seperti tampak pada Tabel 1. Tabel 1. Uji Biokimia Uji biokimia STB 13 Lysine Ornithine H2S Glukosa Manitol Xylosa + ONPG (o-nitro-phenyl+ β-galactopyranoside) Indol Urease Voges-Proskaeur Sitrat TDA (Tryptophan deaminase) Gelatin + Malonat Inositol Sorbitol Rhamnosa Sukrosa Laktosa Arabinosa + Aldonitol Raffinosa Salisin Arginin - Clear Zone Gambar 4. Isolat STB Clear Zone 12 Hasil uji morfologi dan fisiologi yang telah dilakukan kemudian dicocokan dalam daftar Bergey’s manual schematic of determination untuk menduga spesies dari isolat yang telah di uji tersebut. Dapat di duga dari hasil uji morfologi serta fisiologi (biokimia) bahwa isolat STB 13 tergolong ke dalam Bacillus licheniformis Menunjukkan Berdasarkan Gambar 4 bakteri yang menunjukkan aktivitas kitinolitik menghasilkan zona bening (clear zone). Zona bening yang timbul di sekitar koloni dikarenakan enzim kitinase yang dihasilkan dari bakteri kitinolitik tersebut telah mampu mendegradasi substrat kitin yang terdapat pada media agar. Hasil uji morfologi isolat STB 13 menunjukkan bahwa isolat tersebut memiliki bentuk sel batang dan tergolong ke dalam bakteri Gram positif. Pengamatan bentuk koloni terhadap isolat STB 13 diperoleh bahwa KESIMPULAN Isolasi bakteri dari tambak udang di Situbondo telah berhasil dilakukan, diperoleh 40 isolat yang berhasil dipisahkan yang di beri nama dengan STB 1 sampai dengan STB 40. Sebanyak 34 isolat menunjukkan aktivitas kitinolitik. Isolat STB 13 menunjukkan B - 78 Prosiding Seminar Nasional Kimia, ISBN : 978-602-0951-00-3 Jurusan Kimia FMIPA Universitas Negeri Surabaya, 20 September 2014 aktivitas kitinolitik tertinggi dengan aktivitasnya sebesar 0,3152 U/mL. Uji morfologi dan fisiologi (biokimia) yang dilakukan pada isolat STB 13 di duga isolat tersebut merupakan Bacillus licheniformis. DAFTAR PUSTAKA 1. Herdyastuti N, Raharjo TJ, Mudasir, Matsjeh S. 2009. Chitinase and Chitinolytic Microorganism:Isolation, Characterization and Potential. Indo. J. Chem. Vol 9. No 1. 37-47 2. Haliza W dan Suhartono MT. 2012. Karakteristik Kitinase dari Mikrobia. Buletin Teknologi Pascananen Pertanian Vol 8 . No 1. 1-14 3. Muzzarelli RAA. New Aspects of Chitin Chemistry and Enzymology. In Binomium Chitin-Chitinase: Recent Issues. Musumeci S and Paoleti MG (Ed). New York: Nova Science Publishers, Inc. page 2. 4. O’Brien, M. and Colwell, M. M. 1987. A Rapid Test for Chitinase Activity That Uses 4-Methylumbelliferyl-N-Acetyl-DGlucosaminide. Applied and Environmental Microbiology. Vol 53, No. 7. 1718-1720. 5. Patil R.S., Ghormade V dan Deshpande, M.V. 2000. Chitinolytic enzymes: an exploration. Enzyme and Microbial Technology. 26. 473–483. 6. Acosta N, Jimenez C, Borau V and Heras A. 1993. Extraction and Characterization of Chitin from Crustaceans. Biomass and Bioenergy. Vol 5. No 2. 145-153 7. Hsu, S.C. dan Lockwood, J.L. 1975. Powdered Chitin Agar as a Selective Medium for Enumeration of Actinomycetes 8. 9. 10. 11. 12. 13. B - 79 in Water and Soil. American Society for Microbiology. Vol. 29, No. 3. 422-426. Monreal, J., and Reese, E.T. 1969. The Chitinase of Serratia marcescens. Canadian Journal of Microbiology. 15:689-696. Tsujibo H, Kondo N, Tanaka K, Miyamoto K, Bao N, and Imamori Y, 1999, Molecular Analysis of The Gene Encoding a Novel Transglycosylative Enzyme from Alteromonas sp. Strain 0-7 & Its Physiological Role in The Chitinolitic System, J. Bacteriol, Vol 81. 5461-5466. Fauziah and Herdyastuti N. Uji Aktivitas Bakteri Kitinolitik dari Tambak Udang di Lamongan dan Sidoarjo. Unesa Journal Of Chemistry. Vol.2, No. 1. 36-39. Soeka, YS, and Sulistiani. 2011. Seleksi, Karakterisasi, dan Identifikasi Bakteri Penghasil Kitinase yang Diisolasi dari Gunung Bromo Jawa Timur. Jurnal Natur Indonesia. 13(2). 155-161 Mahata, M., Dharma A., Ryanto, I, and Rizal Y. 2008. Characterization of Extracellular Chitinase from Bacterial Isolate 99 and Enterobacter sp. G-1 from Matsue City, Japan. Microbiology Indonesia. Vol. 2, No. 1. 34-38 Nielsen, M.N. dan Sorensen, J. 1999. Chitinolytic activity of Pseudomonas Fluorescens isolates from barley and sugar beet rhizosphere. FEMS Microbiology Ecology. 30. 217-227.
