II. METODE PENELITIAN 1. Isolasi dan Identifikasi Bakteri Asam

II. METODE PENELITIAN
1. Isolasi dan Identifikasi Bakteri Asam Laktat
/./.
Bahan
Penelitian ini menggunakan ikan Kerapu Macan (Epinephelus fuscoguttatus)
sebanyak 14 ekor, berukuran 500- 800 gram, diperoleh dari perairan laut Situbondo,
Jawa Timur. Penelitian ini dilakukan dari bulan Agustus sampai dengan bulan
Nopember 2010 di Laboratorium Mikrobiologi dan Laboratorium Hama dan Penyakit
Ikan Jurusan Perikanan Fakultas Pertanian Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta.
Media yang digunakan untuk menumbuhkan bakteri asam laktat adalah media
agar MRS (de Mann, Rogosa, Sharpe) dan MRS cair (Merck, Darmstadt, Germany)
dengan pH 5,7 (Bucio et al., 2006). Untuk menentukan koloni yang tumbuh adalah
dari kelompok bakteri asam laktat, maka koloni direisolasi pada medium agar GYP
(Glucose-Yeast Extract-Peptonj+CaCOz dengan komposisi per liter akuades: glukosa
1%, yeast extract 0,5%, trpton 0,5%, agar bakteriologi 1,5% dan CaCO3 0,5%.
1.2. Prosedur
Isolasi Bakteri Asam Laktat
Isolasi bakteri asam laktat (BAL) dilakukan menurut prosedur Bucio et al.
(2006). Saluran pencernaan ikan Kerapu Macan diambil, dibuka, dibuang isinya,
kemudian dinding usus bagian dalam dikerik dengan menggunakan spatula steril.
Cairan mukosa usus ini diambil sebanyak 1 ml dan dihomogenkan di dalam 9 ml
larutan PBS (phosphate buffer saline) pH 7,4, kemudian dilakukan pengenceran 10"1
hingga 10"4 secara berurutan. Dari setiap pengenceran diambil 0,1 ml dan disebarkan
12
pada medium agar MRS, dan diinkubasi pada suhu 30°C selama 24-48 jam. Koloni
yang tumbuh terpisah, berwarna putih dan berukuran 0,1-3 mm pada MRS agar
diinokulasi kembali pada medium GYP+CaCOs. Selanjutnya koloni yang tumbuh
terpisah, berwarna putih dan terdapat zona jernih disekitarnya diisolasi dan disimpan
pada medium MRS agar miring, MRS broth (untuk penyimpanan jangka pendek) dan
di dalam MRS broth + glycerol (untuk penyimpanan jangka panjang pada suhu 20°C).
Identifikasi BAL
Identifikasi isolat bakteri asam laktat berdasarkan karakteristik fenotip, yaitu
morfologi, biokimia dan fisiologi. Pengamatan morfologi (merujuk pada Cappucino
& Sherman, 2001) meliputi bentuk, tepi, elevasi, warna dan ukuran koloni yang
tumbuh terpisah pada medium GYP+CaCOs. Pengamatan morfologi sel mencakup
bentuk, sifat Gram dan motilitas di bawah mikroskop binokuler pada perbesaran lOx
dan 40x. Uji biokimia meliputi uji-uji katalase, oksidase, OF, MR-VP, Simmon
citrate, TSIA dan gelatinase, produksi amoniak (NHa) dan uji fermentasi gula-gula
menurut prosedur Mac Faddin (1983). Pengamatan fisiologi meliputi uji pertumbuhan
pada suhu 15 dan 45 °C, pada pH 4 dan 9, dan pada konsentrasi NaCl 6,5, 10 dan
18% (w/v) dalam medium MRS broth (Ghanbari et a/., 2009). Pertumbuhan bakteri
diamati setelah waktu inkubasi 3-5 hari.
2. Seleksi Bakteri Asam Laktat sebagai Probiotik
2.1. Bahan
Isolat bakteri yang diseleksi sebagai probiotik adalah dua puluh satu isolat
BAL yang telah diisolasi dari ikan Kerapu Macan. Untuk uji antagonisme, bakteri
13
patogen Vibrio alginolyticus yang digunakan berasal dari Balai Besar Pengembangan
Budidaya Air Payau (BBPBAP) Jepara dan medium Zobell 2216E dengan komposisi
polypepton (Oxoid) 5g/l dan yeast extract (Oxoid) lg/1 yang dilarutkan dalam 75%
air laut (Isnansetyo & Triyanto, 2007). Sedangkan untuk uji patogenisitas, ikan
Kerapu Macan yang digunakan berukuran 10-12 cm, dan dilakukan di Balai
Budidaya Air Payau (BBAP) Situbondo, Jawa Timur.
2.2. Prosedur
Uji aktivitas antibakteri
Aktivitas antibakteri dari isolat bakteri yang diduga bakteri asam laktat
terhadap Vibrio alginolyticus diuji dengan metode paper disc diffusion agar pada
double layer agar (Davidson & Parish, 1989). Medium lapis ganda (double layers)
terdiri dari 1,5% agar dan 0,7% agar (Isnansetyo & Kemei, 2003). Sebanyak satu
ose dari masing-masing isolat diinokulasi pada 5 ml medium Zobell 2216E cair dan
diinkubasi selama 24 jam pada suhu 30°C. Kepadatan bakteri dari tiap kultur cair
ditentukan pada absorbansi 0,1. Sebanyak 50 \JL\ dari kultur cair tersebut diteteskan
pada paper disc, kemudian didiamkan selama 15 menit (aseptis) supaya meresap
sempurna. Paperdisc selanjutnya diletakkan di atas taburan patogen V. alginolyticus
pada medium agar Zobell double layer dengan kepadatan 106 sel/ml merujuk kepada
prosedur Buntin et a/., (2008), dan diinkubasi pada suhu 30°C selama 24 jam.
Kepadatan 106 sel/ml ditentukan dari total plate count (TPC) pada medium TSA air
laut. Kemampuan penghambatan pertumbuhan patogen ditandai dengan terbentuknya
zona jernih disekitar paper disc. Sebagai kontrol positif digunakan chloramphenicol,
dan kontrol negatif digunakan MRS broth. Zona hambat dihitung dengan mengukur
14
diameter zona jemih dalam mm disekitar paper disc dengan menggunakan caliper.
Pengujian dilakukan dua kali untuk setiap isolat dan kontrol.
Toleransi terhadap pH
Uji ini dilakukan untuk mengetahui kemampuan isolat BAL untuk tumbuh
pada pH 3, 4, 5 dan 6. Prosedur pengamatan dilakukan menurut Hardiningsih et al.
(2006). Isolat BAL diinokulasi pada medium cair de Mann, Rogosa, Sharpe (MRS
broth, Merck, Darmstadt, Germany) yang telah diatur pH nya sesuai dengan pH uji
dengan penambahan HC1 1% atau NaOH 1%. Setelah diinkubasi selama 48 jam
dilakukan pengukuran OD (Optical Density) dengan Spektrofotometer (APEL AP101 Photoelectronic Colorimeter, Japan) pada panjang gelombang 600 nm. Sebagai
kontrol dan blanko digunakan MRS broth tanpa inokulasi bakteri. Setiap perlakuan
diulang sebanyak dua kali.
Toleransi terhadap bile salt
Uji ini dilakukan untuk mengamati kemampuan isolat BAL untuk tumbuh
pada berbagai konsentrasi garam empedu (bile salt). Pengamatan dilakukan menurut
prosedur yang dilakukan Buntin et al. (2008). Isolat BAL digoreskan pada medium
agar MRS (Merck), masing-masing ditambahkan dengan bile salt (Oxoid) pada
konsentrasi 0,2, 0,3,0,4 dan 0,5%.
Uji Patogenisitas
Uji ini bertujuan untuk mengetahui apakah isolat bakteri asam laktat (BAL)
yang telah diisolasi dari usus ikan Kerapu Macan bersifat patogen atau tidak. Dean
Kerapu Macan yang digunakan berukuran 10-12 cm sebanyak 250 ekor, terlebih
dahulu diadaptasikan dalam bak penampungan selama 3 hari dan diberi pakan pelet
15
banyak 3% dari berat ikan dengan frekuensi pemberian pakan 3-4 kali per hari.
emudian ikan dipindahkan ke dalam 21 buah akuarium yang berukuran 60x40x40
i3 sebanyak 10 ekor ikan per akuarium (untuk 20 isolat BAL dan 1 kontrol).
Penelitian ini dilakukan menurut prosedur Aly et al. (2008a). Isolat BAL
tumbuhkan pada media MRS broth pada suhu 30°C, setelah 48 jam sel bakteri
panen dengan disentrifugasi pada kecepatan 3500 rpm selama 10 menit pada suhu
'C. Pelet dicuci dua kali dengan larutan PBS (pH 7,4), disentrifugasi seperti
ibelumnya. Bakteri disuspensikan dalam larutan PBS dengan menggunakan standar
[cFarlan ekuivalen dengan kepadatan bakteri 107 sel/ml. Kemudian ikan dari tiap
;lompok diinjeksi dengan suspensi tiap-tiap isolat BAL 107 cfit/ml secara injeksi
3ritoneal (IP). Sebagai kontrol, ikan disuntikkan dengan PBS sebanyak 0,1 ml/ikan.
elama masa pengujian, air akuarium diganti sebanyak 50% dan diaerasi, dan ikan
iberi makan pelet sebanyak 3% dari berat ikan dengan frekuensi pemberian pakan 3kali per hari. Ikan dipelihara dan diamati selama 7 hari. Pengamatan dilakukan
srhadap gejala klinis, kualitas air dan mortalitas. Pengamatan gejala klinis meliputi
erakan ikan, reaksi terhadap rangsangan, nafsu makan, pernafasan, posisi ikan dalam
kuarium, perubahan warna, jumlah lendir, adanya gripsis dan lesi eksternal lainnya.
Iji Ko-kultur
Uji ini dilakukan untuk mengamati kemampuan enam isolat BAL (KSBU
Aa, KSBU 5Da, KSBU 9, KSBU 11B, KSBU 12B dan KSBU 12C) dalam
aenghambat pertumbuhan V. alginolyticus. Isolat-isolat tersebut dipilih berdasarkan
ona hambat terluas pada uji antibakteri, toleransi terhadap pH dan bile salts. Uji ini
tilakukan menurut prosedur Vaseeheran dan Ramasamy (2003). Isolat BAL dan V.
16
alginolyticus sebelumnya dikultur secara terpisah di dalam media Tripticase soya
broth (TSB, Oxoid). V. alginolyticus diinokulasi ke dalam TSB dengan konsentrasi
103 cfiilrrA per tabung reaksi, kemudian tiap tabung ditambahkan dengan isolat BAL
dengan konsentrasi 0 (kontrol), 10 , 10 dan 10 c/w/ml. Perlakuan ini dilakukan
dengan dua kali ulangan. Semua tabung ko-kultur tersebut diinkubasi pada suhu 30°C
dan pertumbuhan koloni V. alginolyticus diamati setiap hari selama 5 hari. Jumlah V.
alginolyticus dihitung dengan menyiapkan serial pengenceran lO'-lO7, dan sebanyak
0,1 ml dari tiap pengenceran diinokulasi pada agar Thiosuphate citrate bile salts
sucrose (TCBS, Merck)), kemudian diinkubasi pada suhu 30°C selama 24-48 jam.
3. Analisis Data
Data hasil penelitian ini disajikan dalam bentuk tabel dan gambar, selanjutnya
data diuraikan secara deskriptif dan dibandingkan dengan hasil-hasil penelitian
terdahulu.
17