BRM Enny

BAKTERI RESISTEN MERKURI ENDOGENIK HILIR KALIMAS SURABAYA
1
2
2
Enny ZULAIKA* Atik WIDIYANTI , dan Maya SHOVITRI
1
Mahasiswa S3 Program Studi MIPA, Universitas Airlangga, Surabaya
* e-mail : [email protected]
2
Program Studi Biologi, FMIPA ITS, Surabaya
Abstract
The downstream area of The Kalimas, Surabaya is directly connected to the Tanjung Perak Harbor. It was
contaminated by mercury of about 6.38 mg/L. Other side, it is well known that there is bacteria which is resistant to
mercury as it reduces a toxic ion Hg2+ into a volatile and less toxic ion Hg0. In order to develop a mercury
bioremediation agent, this study was aimed to isolate resistant mercury bacteria from water and sediments of the
downstream Mas River, Surabaya. The used medium was 10 mg/L HgCl2 containing nutrient agar. Morphological,
physiological and biochemical characters was observed based on The Bergey’s Manual of Determinative
Bacteriology. Thus this study was successfully isolated and characterized 24 mercury resistant bacteria isolates.
They were mostly tended to fall into genera Bacillus, Azotobacter, Proteus, Staphylococcus, and Corynebacterium.
They were also abviously observed as a metal resistant bacteria and a halotolerant bacteria, while they were able to
grow in a 10 mg/L of Pb, Cd and Cu containing nutrient agar, as well as in a 50 ‰ saline nutrient agar.
Keyword: the downstream area, the Kalimas, mercury resistant bacteria
1. PENDAHULUAN
Merkuri adalah salah satu logam berat yang secara biologis fungsinya belum jelas tetapi dalam
konsentrasi sangat rendah dapat beracun dan berbahaya, meskipun secara alamiah konsentrasi merkuri di
perairan cukup rendah yaitu satu nanogram/L (Boening, 2000). Pencemaran merkuri pernah terjadi di
kawasan teluk Minamata Jepang, dampak yang ditimbulkan adalah gangguan neurologis dan bayi yang
lahir cacat, penyakit aneh tersebut kemudian dinamakan penyakit Minamata (Iswiari, 2008).
Kalimas adalah salah satu bahan baku air minum kota Surabaya, pada tahun 2002 kadar
merkurinya mencapai 0,099 mg/L hampir 100 kali dari kadar yang disyaratkan pemerintah PP. No.82/2001
2
yaitu 0,001 mg/L (Anonim , 2009), pada tahun 2009 kadar merkuri di sedimen Kalimas bagian tengah
adalah 0,105 mg/L (Shovitri & Zulaika, 2010). Hilir Kalimas Surabaya lokasinya berdekatan dengan
Pelabuhan Tanjung Perak yang merupakan salah satu pintu gerbang di Indonesia Timur. Di sekitar lokasi
pelabuhan Tanjung Perak Surabaya terdapat industri galangan kapal seperti di Tambatan Nilam, PT. PAL
Indonesia, PT. Dok dan Perkapalan Surabaya. Kondisi tersebut berpotensi meningkatkan polutan
termasuk merkuri, bahkan pada tahun 2011 kadar tersebut meningkat pada saat dilakukan pengukuran di
sedimen Kalimas bagian hilir yaitu 6,3 mg/L, fenomena tersebut sangat berbahaya dan perlu mendapat
perhatian.
Bakteri adalah mikroorganisme yang dapat hidup di berbagai macam habitat, di udara, air maupun
tanah, baik di lingkungan normal atau ekstrim seperti tercemar merkuri. Bakteri yang dapat diisolasi dari
lingkungan yang tercemar merkuri seringkali resisten terhadap merkuri (BRM), baik merkuri organik
maupun anorganik (De & Ramaiah, 2007). Pada BRM mempunyai mekanisme enzimatis yang dapat
0
mengubah senyawa merkuri menjadi merkuri volatil (Hg ) supaya senyawa merkuri tersebut tidak meracuni
tubuh bakteri tersebut (Madigan & Martinko, 2006). Adanya mekanisme enzimatis tersebut, BRM sangat
berpotensi digunakan sebagai dekontaminan merkuri dan dapat dikembangkan menjadi agensia
bioremediasi pencemaran merkuri atau sebagai agensia pengunduhan logam merkuri dari berbagai
macam limbah industri.
Berdasarkan kenyataan di atas dan kondisi Kalimas yang sudah tercemar merkuri, apakah
kelompok BRM dapat diisolasi dari Kalimas Surabaya terutama di bagian hilir dan bagaimanakah
keanekaragaman genera BRM tersebut
2. METODE PENELITIAN
2.1. Lokasi dan Waktu Penelitian
Lokasi pengambilan sampel air dan sedimen sebagai sumber inokulum BRM adalah Kalimas
°
Surabaya di daerah hilir (di dekat pelabuhan Tanjung Perak) pada koordinat S: 07 11’57,8” dan E:
°
112 44’06,8”. Preparasi sampel BRM dilakukuan di Laboratorium Mikrobiologi dan Bioteknologi, Jurusan
Biologi FMIPA ITS dan beberapa institusi lain yang terkait. Penelitian dilakukan pada bulan Januari 2011
sampai dengan bulan September 2011.
Diseminarkan pada “Seminar Nasional Teori & Aplikasi Teknologi Kelautan”,
Surabaya 15-16 Desember 2011
1
3.2. Pengumpulan Sampel Air dan Sedimen
Sumber inokulum BRM adalah sampel air dan sedimen dari Kalimas Surabaya daerah hilir.
Pengambilan sampel air dan sedimen dilakukan secara terpisah, sampel air langsung dimasukkan ke
dalam botol gelap steril sedangkan sampel sedimen dimasukkan ke wadah steril. Kedua tempat sampel
tersebut ditutup rapat, diberi label lokasi dan tanggal pengambilan, kemudian segera dibawa ke
laboratorium yang selanjutnya digunakan sebagai sumber inokulum BRM.
3.3. Isolasi BRM
Metode isolasi selektif bakteri dari sampel air dan sedimen menggunakan metode pengenceran
bertingkat dan metode sebar (spread plate method) secara aseptis. Satu ml air atau satu gram sedimen
dimasukkan ke tabung reaksi yang berisi 9 ml akuades steril. Tabung reaksi divortex sampai homogen
-1
-1
(pengenceran 10 ), selanjutnya diambil 1 mL larutan dari pengenceran 10 dan dimasukkan ke dalam
tabung reaksi lain yang berisi 9 mL akuades steril, kemudian divortex kembali dan disebut pengenceran
-2
-10
-7
-10
10 dan seterusnya sampai pengenceran 10 . Dari pengenceran 10 - 10 masing-masing diambil 100
µl dengan pipet mikro dan diteteskan di atas media padat NA-HgCl2 10 mg/L (Nutrient Agar yang
mengandung HgCl2 10 mg/L) dengan metode sebar. Inokulum kemudian diratakan dengan segitiga
Drigalsky. Kultur biakan diinkubasikan dalam inkubator pada suhu 37°C dan diamati setelah ± 24 jam,
sampai tumbuh koloni (Harley & Prescot, 2002). Koloni yang tumbuh diasumsikan sebagai isolat BRM.
3. 4. Purifikasi Isolat BRM
Koloni yang tumbuh dipurifikasi sampai diperoleh kultur murni. Satu koloni isolat bakteri diambil
secara aseptis dengan jarum ose dan diinokulasikan ke permukaan media padat NA-HgCl2 10 mg/L
dengan metode 16 goresan dan diinkubasikan dalam inkubator pada suhu 37°C selama ± 24 jam. Satu
koloni yang tumbuh diambil lagi kemudian dipindahkan ke media baru NA-HgCl2 10 mg/L dengan metode
16 goresan. Pemindahan koloni isolat dilakukan berulang-ulang sampai didapatkan kultur murni. Untuk
mengetahui apakah koloni sudah murni, maka dilakukan pengamatan bentuk sel secara mikroskopis. Isolat
yang telah murni merupakan isolat yang diasumsikan hanya terdiri dari satu strain bakteri (Busse, 1996),
jika dalam satu koloni hanya terdiri satu bentuk sel yang sama maka pemurnian telah menghasilkan kultur
murni.
Pengamatan mikroskopik dilakukan dengan metode preparat apus menggunakan pewarnaan
sederhana methylen blue. Satu tetes akuades diletakkan di tengah kaca obyek, kemudian satu ose bakteri
dimasukkan ke tetesan tersebut dan diratakan. Preparat kemudian difiksasi di atas api bunsen sampai
akuades kering selanjutnya diwarnai dengan methylen blue dan ditutup dengan gelas penutup.
Pengamatan sel bakteri dilakukan di bawah mikroskop dengan perbesaran 1000X dengan menggunakan
bantuan minyak imersi (Harley & Prescot, 2002).
3.5. Skrening Isolat BRM yang Sangat Resisten dan Toleran Terhadap HgCl2
Skrening untuk memperoleh isolat BRM yang sangat resisten dan toleran terhadap merkuri
dilakukan pada konsentrasi HgCl2 15, 20 dan 25 mg/L. Metode yang digunakan adalah streak plate pada
media NA-HgCl2 dan cakram difusi HgCl2 pada media Moeller-Hinton (Grove & Young, 1975). Setelah 24
jam masa inkubasi, akan terseleksi isolat BRM yang mempunyai resistensi dan toleransi tinggi terhadap
merkuri yaitu bakteri dapat tumbuh pada perlakuan media NA-HgCl2, tidak membentuk zona atau
mempunyai zona ≤ 1 mm pada media Moeller-Hinton.
3.6. Verifikasi Genera Isolat BRM (Generic assignment)
Isolat hasil skrening di atas, dikarakterisasi berdasarkan habitat, morfologi, fisiologi dan uji
biokimia, kemudian dari karakterisasi tersebut dilakukan verifikasi dengan Profile matcing terhadap
karakter kunci (Generic assignment) untuk menentukan genera isolat BRM pada genera yang diduga mirip.
Verifikasi mengacu pada buku Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology (Holt et al., 1994)
Sebelum melakukan karakterisasi, isolat BRM disub kultur ke dalam media padat NA-HgCl2 10
mg/L sampai diperoleh kultur yang berumur ± 24 jam. Karakterisasi terdiri dari morfologi dan warna koloni
(bentuk, warna dan transparansi), morfologi sel (bentuk, endospora, kapsula dan cysta), sifat pengecatan
Gram dan tahan asam, serta uji fisiologis dan biokimiawi yang meliputi uji motilitas, metabolisme
karbohidrat, aktivitas enzimatis, kebutuhan oksigen dan lain sebagainya. (Harley & Prescott, 2002).
3. HASIL DAN PEMBAHASAN
Pada penelitian ini didapatkan 24 isolat, dari sumber inokulum air sebanyak 11 isolat yang dikode
dengan A1, A2, A3, A4, A5, A6, A7, A8, A9, A10, A11 dan dari sumber inokulum sedimen didapatkan 14
isolat yang dikode dengan S1, S2, S3, S4, S5, S6, S7, S8, S9, S10, S11, S12, S13Hg. Isolat tersebut
dapat dikategorikan sebagai bakteri resisten merkuri (BRM) karena isolasi dilakukan dengan media selektif
Diseminarkan pada “Seminar Nasional Teori & Aplikasi Teknologi Kelautan”,
Surabaya 15-16 Desember 2011
2
NA yang mengandung 10 mg/L HgCl2. Menurut Canstein et al. (2002), isolat yang dapat tumbuh pada
media sintetis mengandung HgCl2 ≥ 5 mg/L, merupakan isolat yang memiliki resistensi tinggi terhadap
merkuri. Sedangkan menurut Gadd (1992), bakteri yang mampu mengakumulasi logam berat dapat
diperoleh melalui isolasi dari sumber inokulum yang diambil dari lingkungan tercemar logam berat.
Sumber inokulum BRM tersebut adalah air dan sedimen Kalimas, dimana sedimen di bagian hilir Kalimas
Surabaya telah tercemar merkuri sebesar 6,3 mg/L.
Setelah dilakukan skrening dengan metode streak plate pada media NA-HgCl, sebanyak tujuh
isolat dapat tumbuh pada media NA-HgCl2 sampai dengan konsentrasi 25 mg/L yaitu isolat A1, A3, A7, A8,
A10, S1, S8 dan S13. Pada skrening menggunakan cakram difusi HgCl2 25 ppm, dari tujuh isolat tersebut
empat isolat tidak membentuk zona jernih dan 3 isolat membentuk zona jernih ≤ 1 mm (Tabel 1)
Tabel 1. Resistensi dan toleransi BRM terhadap HgCl2
Isolat
A1
A2
A3
A4
A5
A6
A7
A8
A9
A10
A11
Tumbuh
10 ppm 25 ppm
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
+ : tumbuh, - tidak tumbuh
Zona (mm)
10 ppm 25 ppm
+
0,25
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
Isolat
S1
S2
S3
S4
S5
S6
S7
S8
S9
S10
S11
S12
S13
Tumbuh
10 ppm 25 ppm
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
Zona (mm)
10 ppm 25 ppm
+
0,25
+
+
+
+
+
+
+
0,5
+
+
+
+
+
+
+ : tidak ada zona
Isolat yang mempunyai resistensi dan daya toleransi tinggi pada HgCl2 25 mg/L merupakan bakteri
yang sangat resisten terhadap merkuri dan merupakan kelompok bakteri yang potensial digunakan
sebagai agensia bioremediasi pencemaran merkuri. Menurut Spain & van Veld (1983) tingkat adaptasi
suatu mikrobia terhadap senyawa xenobiotic berperan penting untuk menentukan kemampuannya
mendegradasi senyawa tersebut di lingkungan. Hal ini juga berkaitan dengan kapasitas metabolik mikrobia
dalam menggunakan senyawa xenobiotic sebagai substrat pertumbuhannya yang sifatnya novel (van der
Meer et al., 1992). Melihat kemampuan isolat di atas tumbuh di medium yang mengandung 25 mg/L HgCl2,
ke tujuh isolat tersebut mempunyai suatu mekanisme untuk mengatasi cekaman merkuri.
Berdasarkan hasil karakterisasi morfologi, fisiologi, dan biokimia yang kemudian dilakukan
verifikasi dengan Profile matcing terhadap karakter kunci untuk menentukan genera (Generic assignment)
yang mengacu pada Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology (Holt et al., 1994), dari tujuh isolat
terkelompokkan menjadi lima genera yaitu Azotobacter, Staphylococcus, Corynebacterium, Proteus, dan
Bacillus (Tabel 2).
Bakteri dapat resisten terhadap merkuri karena pada BRM mempunyai gen resisten merkuri yang
disebut gen mer-operon. Gen mer-operon terdiri dari gen metaloregulator (merR), gen transpor merkuri
(merT, merP, merC), gen merkuri reduktase (merA) dan gen organomerkuri liase (merB) (Nascimento dan
Souza, 2003; Chien et al., 2010). Gen merB akan mengkatalisis pemutusan ikatan Me-Hg menghasilkan
2+
2+
2+
senyawa organik dan ion Hg , ion Hg akan terikat pada merC atau merT. Sedangkan Hg diluar
lingkungan bakteri akan masuk ke periplasma dengan pasangan residu sistein merP. Kemudian merP
2+
2+
mentransfer Hg ke residu sistein merT atau merC. Selanjutnya ion Hg menyeberang membran
sitoplasma melalui proses reaksi pertukaran ligan menuju NADPH yang bergantung pada merkuri
2+
reduktase (gen merA). Merkuri reduktase memberikan 2 elektronnya kepada NADPH sehingga Hg
0
berubah menjadi Hg yang bersifat volatil tanpa menghasilkan energi untuk bakteri tersebut, selanjutnya
0
Hg dikeluarkan dari sel (Brown et al., 2002).
Kesimpulan
Berdasar hasil penelitian dapat disimpulkan, dari 24 isolat BRM hanya 7 isolat yang sangat
resisten terhadap merkuri, ke tujuh isolat tersebut terkelompokkan ke dalam genera Azotobacter, Proteus,
Staphylococcus, Corynebacterium, dan Bacillus. Genera tersebut merupakan genera unggul sebagai
agensia bioremediasi pencemaran merkuri.
Diseminarkan pada “Seminar Nasional Teori & Aplikasi Teknologi Kelautan”,
Surabaya 15-16 Desember 2011
3
A3
+
+
+
+
+
NA
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
A7
+
NA
+
NA
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
A10
+
NA
NA
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
S1
+
NA
+
+
NA
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
S8
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
S13
+
NA
NA
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
Proteus
Bacillus
Azotobacter
Proteus
Kesimpulan :
termasuk Genera
A1
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
Corynebacterim
Karakter
Sel bentuk batang
Sel bentuk kokus
Sel bentuk ovoid
ø sel 1,5 - 2,0
Pewarnaan Gram
Pewarnaan Acid Fast
Endospora
Cysta
Motilitas
Aerob
Anaerob fakultatif
Kemoorganotrof (O/F)
Kemoorganotrof (O)
Katalase
Oksidase
Urease
Amilase
Ornitin dekarboksilase
MR
VP
Indol
Citrat
H2S
Toleran NaCl 5%
Toleran NaCl 10%
Fermentasi glukosa
Fermentasi fruktosa
Fermentasi manosa
Fermentasi manitol
Fermentasi laktosa
Fermentasi galaktosa
Fermentasi sukrosa
Fermentasi xylosa
Fermentasi sorbitol
Yellow Pigment Colony
PbCl2 (10 mg/L)
CdCl2 (10 mg/L)
CuCl2 (10 mg/L)
Staphylococcus
No
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
Azotobacter
Tabel 2. Karakterisasi dan Verifikasi BRM
Keterangan : + menunjukkan reaksi positip; NA : Not Aplicable
Saran
Untuk mengetahui kemampuan genera BRM yang unggul dalam mengakumulasi merkuri
diperlukan suatu penelitian lebih lanjut tentang kemampuan bioakumulator BRM di atas. Disamping itu jalur
degradasinya perlu ditelaah lebih mendalam berkaitan dengan keberadaan enzim merkuri reduktase
2+
0
(merA) yang berperanan dalam mereduksi Hg menjadi Hg .
Pustaka
2
Anonim . (2009): Pencemaran merkuri di Kali Surabaya. http://www.antarafoto. com/peristiwa/
v1269335101/tingkat-pencemaran-merkuri, diunduh tanggal Juli 2009.
Boening, D.W. (2000): Ecological effects, transport and fate of mercury: A General Review,
Chemosphere, vol. 40, pp. 1335-1351.
Brown, N., Shih, Y., Leang, C., Glendinning, K., Hobman, J., Wilson, J. (2002): Mercury transport
and
Resistance. Biometals. International Biometals Symposium.
Diseminarkan pada “Seminar Nasional Teori & Aplikasi Teknologi Kelautan”,
Surabaya 15-16 Desember 2011
4
Busse, H.J., Denner, E.B.M and Lubitz, W. (1996): Classification and identification of bacteria:
current
approaches to an old problem. Overview of methods used in bacterial systematics, Journal of
Biotechnology. 47: 3- 38.
Canstein, H.V., Li, Y., Leonhauser, J., Haase, E., Felske, A., Deckwer, W.D. and Dobler, I.W. (2002):
Spatially oscillating activity and microbial succession of mercury-reducing biofilms in a technicalscale bioremediation system. Appl. Environ. Microbiol, vol. 68,pp. 1938-1946.
Chien, M.F., Narita, M., Lin, K.H., Matsui, Huang, C.C. and Endol, G., (2010): Organomercurials removal
by heterogeneous merB genes harboring bacterial strains, Journal of
Bioscience and
Bioengineering, VoL. xx No. xx: xxx–xxx.
De, J. and Rahmaniah, N. (2007): Characterization of marine bacteria highly resistant to mercury
exhibiting multiple resistances to toxic chemicals, Ecological Indicators, vol.
7,
pp.
511–
520.
Gadd, G.M. (1992). Metals and Microorganisms; A Problem of Definition. FEMS Microbiol. Lett. 100
:
197-204.
Grove, D.J. and Young, F.E. (1975): Epidemiology of Antibiotic and Heavy Metal Resistance in Bacteria:
Resistance Patterns in Staphylococci Isolated from Populations Not Known to be Exposed
to
Heavy Metals, Antimicrobial Agents and Chemotherapy, Vol
7, no 5: 614 -621.
Harley, J.P. and Prescott, L.M. (2002): Laboratory Exercises in Microbiology 4th Edition. The
McGraw−Hill Companies : New York.
Holt, J.G., Krieg, N.R., Sneath, H.A., Staley, J.T. and Wiliam, S.T. (1994): Bergey’s Manual of
th
Determinative Bacteriology 9 Ed, William & Wilkins, Baltimor.
Iswiari (2008): Paradigma Kejadian Penyakit Pajanan Merkuri (Hg), Sequence of Diseases of
Mercury
Poison, Puslitbang Ekologi dan Status Kesehatan.
th
Madigan, M.T. and
Martinko, J.M. (2006): Brock Biology of
Microorganisms 11 ,
Pearson
Education Inc., New Jersey.
Nascimento, A.M.A. and Souza, E. (2003): Operon mer : Bacterial Resistance to Mercury and
Potential
for Bioremediation of Contamined Environments. Journal Genetics and molecular
Research,
2(1): 92-101
Shovitri, M., Zulaika, E. dan Koentjoro, M.P. (2010). Reduction of Toxic Mercuric Ion by Isolated Bacteria
from the Mas River Surabaya. Inovasi Bioproduk dalam Pembangunan Berkelanjutan
van der Meer, J.R., De Vos, W.M., Harayama, S. And Zehnder, A.J.B. (1992): Molecular Mechanism
of Genetic Adaptation to Xenobiotic Compound. Microbiological Reviews 56 (4): 677-694.
Diseminarkan pada “Seminar Nasional Teori & Aplikasi Teknologi Kelautan”,
Surabaya 15-16 Desember 2011
5