Peneraan Antibodi Serum Mencit (Mus musculus)

Media Kedokteran Hewan
Vol. 21, No. 3, September 2005
Peneraan Antibodi Serum Mencit (Mus musculus) Sebelum dan Setelah Imunisasi
dengan Sediaan Antifertilitas Zona Pelusida-3 Kambing
Determination of Antibody in Serum of Mice (Mus musculus) Before and After Immunizations
Using Antifertility Agent Goat Fraction-3 Zona Pellucida
Tjuk Imam Restiadi 1 , Imam Mustofa 1 dan Suwarno 2
1 Laboratorium
Kebidanan Veteriner, 2 Laboratorium Virologi dan Imunologi Fakultas Kedokteran
Hewan Universitas Airlangga
Abstract
The aim of the study was to determine th e changing of optical density of antibody of mice
(Mus musculus) immunized with 40 μg of fraction 3 of goat zona pellucida (gZP3) as an anti fertility
agent. Each of the mice injected three times, once as the first immunization and twice as booster in 14
days interval respectively. The first immunization, gZP3 suspension was diluted with Complete
Freund’s Adjuvant (CFA), meanwhile the booster gZP3 suspension was diluted with Incomplete
Freund’s Adjuvant (IFA) 1:1. Blood samples collection for serum were carried out four times, i.e.
before first immunization, before first booster, before second booster and after second booster. The
measurement of antibody mice in serum using Elisa technique indicated the increasing (p<0.05) of
optical density serum from after the first immunization until before the second booster injection. It
could be concluded that gZP3 was effective as an immuno contraceptive substance.
Key Words : fraction-3 of goat zona pellucida, pregnancy rate, litter size.

Pendahuluan
Zona pelusida mamalia merupakan lapisan
glikoprotein ekstraseluler yang berperan penting
pada interaksi antara sel spermatozoa dengan sel
telur pada saat fertilisasi (Gupta et al., 1997;
Tsubamoto et.al., 1999). Zona pelusida mengandung
tiga jenis glikoprotein yang spesifik secara
biokimiawi atau imunologi yaitu ZP1, ZP2 dan ZP3.
Diantara tiga komponen glikoprotein tersebut, ZP3
yang berperan penting dalam fertilisasi, karena ZP3
berfungsi sebagai reseptor primer pengenalan
terhadap spermatozoa (Tsubamoto et al., 1999).
Sehingga ZP3 merupakan antigen potensial untuk
target imunokontrasepsi (Gupta et al., 1997; McCartney
and Mate, 1999; Sumitro dan Aulani’am, 2001;
Aulani’am et al., 2003).
Penelitian-penelitian menggunakan zona pelusida berbagai spesies untuk imuno-kontrasepsi sampai
saat ini belum sampai pada tahap produksi secara
komersial. Beberapa efek samping masih dijumpai
khususnya terhadap ovarium (Kerr et al., 1998), yai tu
terjadinya gangguan folikulogenesis dan penekanan
terhadap primordial follicle pool (Paterson et al., 1999;
Hasegawa et al., 2002). Perubahan komposisi struktur
fungsional ovarium tersebut dapat menimbulkan
127
perubahan profil hormon estrogen dan progesteron,
sehingga menimbulkan perubahan siklus birahi.
Penelitian yang telah dilakukan sebelumnya
menggunakan ZP3 kambing (goat zona pellucida 3,
gZP3) ternyata tidak mempengaruhi siklus birahi
hewan coba (Mulyati dkk., 2003) dan efektif
mencegah kebuntingan tanpa diikuti efek abortivum
(Mustofa dkk., 2004a). Oleh karena itu perlu
dilakukan penelitian untuk mengetahui perubahan
antibodi dalam serum sebelum dan sesudah
imunisasi dengan gZP3.
Metode Penelitian
Bahan imunokontrasepsi untuk penelitian ini
(Zona Pelusida-3 Kambing, gZP3) diperoleh dari
penelitian sebelumnya (Mustofa dkk., 2003 ; Mustofa
dkk., 2004b). Teknis preparasi gZP3 dilakukan di
Tropical Disease Center (TDC) Universitas Airlangga,
sebagai berikut.
Ovarium kambing diperoleh dari Rumah
Potong Hewan Pegirikan, Surabaya. Oosit dikumpulkan dengan cara aspirasi folikel-folikel berdiameter
2–5 mm pada ovarium. Oosit dibebaskan dari
reruntuhan sel-sel kumulus dengan cara dipindahkan
Tjuk Imam Restiadi dkk.; Peneraan Antibodi Serum Mencit (Mus musculus) Sebelum dan …
tiga kali dari petri ke petri yang berisi media
Phosphate Bufer Saline (PBS). Pemindahan dilakukan
menggunakan pipet mikro dengan pengamatan
menggunakan mikroskop disecting pada pembesaran
40 kali.
Zona pelusida (Zp) dari oosit di bawah
pengamatan mikroskop disecting dipecah secara
manual menggunakan dua jarum tuberkulin untuk
membebaskannya dari ooplasma. Zona pelusida
selanjutnya dihisap satu per satu sambil dihitung
jumlahnya kemudian dikumpulkan pada tabung
Eppendorf 1,5 ml untuk diproses lebih lanjut.
Penentuan masing-masing komponen zo na
pelusida kambing (gZP) berdasarkan massa molekul
relatif (Mr) dilakukan dengan SDS-PAGE (Sodium
Dodecyl Sulphate - Polyacrylamide Gel Electrophoresis)
menggunakan electrophoresis set mini protein gel (BioRad). Pada penelitian ini running gel digunakan
dengan konsentrasi 12 %. Elusi untuk mengisolasi
gZP3 (band urutan ketiga) dilakukan dengan
elektroforesis horisontal. Eluat dikonfirmasi kebenarannya (apakah benar band gZP3 yang telah
diisolasi) dengan cara di-running ulang dalam SDSPAGE.
Mencit (Mus musculus) betina 10 ekor
diimunisasi secara subkutan dengan 40 µg gZP3
dalam larutan Freund’s Adjuvant (FA) dengan dua kali
booster. Imunisasi pertama dengan suspensi gZP3
dilarutkan dalam Complete Freund’s Adjuvant (CFA)
perbandingan 1 : 1, booster dilakukan dua kali
dengan pelarut Incomplete Freund’s Adjuvant (IFA)
perbandingan 1 : 1, dengan interval 14 hari.
Pengambilan contoh darah untuk koleksi serum
dilakukan dari arteri orbitalis sebanyak empat kali,
yaitu sebelum imunisasi, setelah penyuntikan
pertama (sebelum booster pertama), setelah booster
pertama (sebelum booster kedua), dan setelah
imunisasi (setelah booster kedua).
Peneraan antibodi serum dengan teknik Elisa
indirek (Burgess et al., 2000) dilakukan di
Laboratorium Virologi dan Imunologi Fakultas
Kedokteran Hewan Universitas Airlangga. Data nilai
Optical Density antibodi yang diperoleh dianalisis
dengan uji Anova yang dilanjutkan dengan uji Beda
Nyata Terkecil pada taraf kepercayaan 5 %. Uji
statistik dilakukan dengan menggunakan Aplikasi
Statistik SPSS for Windows (Santosa, 2001).
Hasil dan Pembahasan
Sebagaimana diketahui zona pelusida mamalia
merupakan lapisan glikoprotein ekstra seluler yang
memegang peranan penting dalam inisiasi interaksi
antara sel spermatozoa dengan sel telur (Greenhouse
et al., 1999; Harris et al., 1999), untuk selanjutnya
menghasilkan fertilisasi (Gupta et al., 1997 ;
Tsubamoto et.al., 1999). Pengikatan antigen zona
pelusida tersebut dengan antibodinya akan
menghambat fusi gamet dan menimbulkan kegagalan
fertilisasi (Naz et al., 1995 ; Aitken et al. 1996 ; Ndolo et
al., 1996).
Massa molekul relatif (Mr) ZP3 kambing adalah
82 kDa (Mustofa dkk., 2003). Menurut Austyn and
Wood (1994) molekul protein dengan Mr lebih dari 10
kDa efektif sebagai imunogen. Respon imun terjadi
dengan terbentuknya antibodi spesifik terhadap
molekul gZP3.
Menurut Lee dan Chi (1985) suatu bahan efektif
sebagai antifertilitas apabila menimbulkan angka
infertilitas lebih dari 60 %.
Pada penelitian
sebelumnya, imunisasi dengan 20 μg dan 40 μg gZP3
berturut-turut dengan angka infertilitas 80 % dan 100
% (Mustofa dkk., 2004a).
Pada penelitian ini
menggunakan dosis 40 μg gZP3. Titer antibodi serum
sebelum dan sesudah masing-masing penyuntikan
pada proses imunisasi dapat dilihat pada Tabel 1 dan
Gambar 1.
Tabel 1. Nilai Optical Density Serum Me ncit (Mus musculus) Sebel um dan Setelah Penyuntikan dengan Zona
Pelusida 3 (ZP3) Kambing.
Wa kt u
Pen genc eran
20
40
80
160
320
640
Sebelum Imunisasi
0.542 a)
0.494 a)
0.373 a)
0.256 a)
0.171 a)
0.101 a)
Sebelum Booster 1
0.921 b)
0.853 b)
0.643 b)
0.441 b)
0.294 b)
0.175 b)
Sebelum Booster 2
1.355 c)
1.259 c)
0.951 c)
0.652 c)
0.434 c)
0.258 c)
Setelah Imunisasi
1.490 c)
1.351 c)
1.020 c)
0.699 c)
0.466 c)
0.277 c)
Superskrip berbeda pada kolom sama, berbeda bermakna (p<0,05).
128
Media Kedokteran Hewan
Vol. 21, No. 3, September 2005
1.6
1.4
Optical Density
1.2
1.0
Sebelum Imunisasi
0.8
Sebelum Booster I
Sebelum Booster II
0.6
Setelah Imunisasi
0.4
0.2
0.0
20
40
80
160
320
640
Pengenceran (kali)
Gambar 1. Kurva nilai optical density serum mencit (Mus musculus) sebelum dan setelah penyuntikan dengan
zona pelusida 3 (ZP3) kambing.
Pada penelitian ini terdapat kenaikan nyata
(p<0,05) nilai optical density antibodi dalam serum
antara sebelum imunisasi, setelah penyuntikan
pertama (sebelum booster pertama), sampai dengan
setelah booster pertama (sebelum booster kedua). Nilai
optical density antibodi tersebut relatif tetap sama
tinggi (p>0,05) antara setelah booster pertama
(sebelum booster kedua) dan setelah imunisasi (setelah
booster kedua) pada pengenceran 20 sampai dengan
640 kali.
Pada data tersebut tampak serum mencit
sebelum imunisasi ternyata juga menunjukkan
adanya nilai optical density. Hal ini berarti pada
mencit betina kontrol tersebut memiliki antibodi
terhadap zona pelusidanya sendiri (autoimunitas).
Auto antibodi terhadap zona pelusida tersebut dapat
dikenali oleh gZP3, antigen yang dipakai pada uji
Elisa. Data ini menjadi penjelasan data sebelumnya
(Mustofa dkk., 2004a). bahwa imunisasi mencit (Mus
musculus) dengan substansi yang heterolog, yaitu
gZP3 mampu mencegah kebuntingan.
Elisa untuk menera titer antibodi dalam serum
dengan antigen homolog menghasilkan reaksi positif
paling kuat, namun reaksi silang dapat terjadi (Sadler
et al., 2000; Hasegawa et al., 2002; Paterson et al., 2002;
Srivastava et al., 2002). Anti serum terhadap peptida
zona pelusida babi, kelinci dan manusia paling kuat
bereaksi terhadap peptida yang homolog, tetapi
dapat terjadi reaksi silang dengan derajat yang
berbeda-beda dari ketiganya (Hasegawa et al., 2002).
Pembentukan
antibodi
dalam
individu
berdasarkan waktu pemaparannya dapat dibedakan
menjadi dua tahap, yaitu respon imun primer dan
129
respon imun sekunder (Herscowitz, 1993 ; Austyn
and Wood, 1994 ; Goldsby et al., 2000). Penyuntikan
suatu substansi asing ke dalam tubuh hewan akan
menghasilkan antibodi spesifik dalam darah setelah
beberapa waktu, yang disebut periode induktif atau
periode laten. Antibodi dapat dideteksi 5–7 hari
sesudah penyuntikan protein yang larut air. Setelah
timbulnya antibodi pertama dimulailah biosintesis
aktif antibodi sehingga terjadi peningkatan konsentrasi antibodi secara logaritmik, yang mencapai titer
antibodi tertinggi setelah 8–12 hari. Kadar antibodi
setelah imunisasi adalah selisih antara angka sintesis
dengan angka katabolik antibodi. Apabila angka ini
sama, maka kadar antibodi konstan (fase plateau).
Apabila angka katabolik lebih besar daripada angka
sintesis, maka respon imun memasuki fase penurunan (Herscowitz, 1993). Respon imun primer pada
umumnya ditandai oleh keberadaan imunoglobulin
M (IgM) yang lebih dominan daripada imunoglobulin
G (IgG) (Herscowitz, 1993 ; Goldsby et al., 2000).
Pemaparan kedua terhadap imunogen yang
sama menyebabkan penambahan respon imun
menyolok berupa munculnya sel-sel imunokompeten
dan antibodi yang dipercepat. Pada respon sekunder
periode laten lebih pendek, angka sintesis antibodi
lebih cepat, puncak titer antibodi bertahan lebih
lama, daya gabung antibodi lebih tinggi, lebih
banyak terdapat sel memori, dan lebih banyak IgG
(Herscowitz, 1993; Austyn and Wood, 1994; Goldsby
et al., 2000). Pada analisis antigenik ditemukan perbedaan relatif kecil berdasarkan substansi rangkaian
asam amino dan ikatan disulfida diantara IgG, yaitu
subkelas IgG1, IgG2, IgG3 dan IgG4 (Bernier, 1993).
Tjuk Imam Restiadi dkk.; Peneraan Antibodi Serum Mencit (Mus musculus) Sebelum dan …
Menurut Barber and Fayrer-Hosken (2000), pada
hewan yang diimunisasi dengan preparat yang
berasal dari zona pelusida, level IgG dalam sistem
sirkulasi berkorelasi positif dengan infertilitas yang
terjadi. IgG tersebut akan terikat pada glikoprotein
ZP3 (reseptor spermatozoa) selama oosit masih
berada dalam folikel de Graaf. Setelah ovulasi ikatan
antara IgG dengan ZP akan ditambah oleh ikatan
antibodi yang ada dalam oviduk. Ikatan antara IgG
dengan ZP menyebabkan blokade terhadap reseptor
fertilisasi.
Kesimpulan
Imunisasi mencit (Mus musculus) betina dengan
gZP3 menyebabkan terjadinya peningkatan (p<0,05)
titer antibodi sebelum dan sesudah masing-masing
imunisasi pertama, sampai dengan penyuntikan
booster pertama. Nilai optical density antibodi tersebut
relatif tetap tinggi antara booster pertama maupun
booster
kedua.
Dengan demikian, imunisasi
menggunakan gZP3 cukup dilakukan dua kali, yaitu
sekali imunisasi pertama dan sekali booster.
Ucapan Terimakasih
Penelitian ini merupakan bagian dari Penelitian
Hibah Bersaing XI/2 tahun 2004, yang diketuai oleh
penulis kedua. Ucapan terimakasih disampaikan
kepada Ditbinlitabmas Ditjen Dikti, Depdiknas yang
telah membiayai penelitian ini. Ucapan terimakasih
juga disampaikan kepada Saudari Helen, Laboran
Tropical Disease Center yang membantu preparasi
gZP3, dan Bapak Puryoto serta Saudari Widya
Pratitisari, yang telah membantu pelaksanaan
penelitian pada hewan coba.
Daftar Pustaka
Aitken, R.J., M. Paterson, and M. van Duin 1996. The
potential of the zona pellucida as a target for
immunocontraception. Am J Reprod Immunol
35 (3) : 175-80.
Aulani’am, S.B. Sumitro, S. Hardjopranjoto, Sutiyoso
and T.Soendoro. 2003. Bovine Zona Pellucida 3
Deglycosylated (bZP3dG) and The Prospect for
Immunocontraceptive
Vaccione.
Media
Kedokteran Hewan 19(3) :117 – 120.
Austyn, J.N. and K.J. Wood. 1994. Principle of cellular
and molecular immunology. Oxford : Oxford
University Press, Pp 39-46.
Barber, M.R. and R.A. Fayrer-Hosken. 2000. Possible
mechanisms of mammalian immunocontraception. J Reprod Immunol 46: 103–124.
Bernier, G.M. 1993. Antibodi dan imunoglobulin :
Struktur dan fungsi. Dalam : Bellanti, J.A. (Eds)
Immunology III. Terjemahan A.S. Wahab.
Yogyakarta : Gadjah Mada University Press, Hal
86 - 95.
Burgess, G.W. 2000. Teknologi elisa dalam diagnosis
dan penelitian. Penerjemah : Wayan T. Artama.
Gadjah Mada University Press, Yogyakarta Hal.
56-69.
Epifano, O. and J. Dean. 1994. Biology and structure
of the zona pellucida: a target for immunocontraception. Reprod Fertil Dev 6 (3) : 319-30.
Goldsby, R.A., T.J. Kindt and B.A. Osborne. 2000.
Kuby immunology. 4th Ed. New York : W.H.
Freeman and company, Pp 10-15.
Greenhouse S, Castle PE, and Dean J, 1999. Antibodies
to human ZP3 induce reversible contraception in
transgenic mice with humanized zonae pellucidae. Hum Reprod 1999 Mar ; 14(3):593-600.
Gupta, S.K., P. Jethanandani, A. Afzalpurkar, R. Kaul
and R. Santhanam. 1997. Prospects of zona
pellucida glycoproteins as immunogens for contraceptive vaccine. Hum Reprod 3(4): 311-24.
Harris, J.D., C.A. Seid, Fontenot, G.K. and Liu H.F.
1999. Expression and purification of recombinant human zona pellucida proteins. Protein
Expr Purif 1999 Jul;16(2):298-307.
Hasegawa, A., Y. Hamada, M. Shigeta, and K.
Koyama. 2002. Contraceptive potential of
synthetic peptides of zona pellucida protein
(ZPA). J Reprod Immunol 53 : 91-98.
Herscowitz, H.B. 1993. Imunofisiologi : Fungsi sel dan
interaksi seluler dalam pembentukan antibodi.
Dalam : Bellanti, J.A. (Eds) Immunology III.
Terjemahan A.S. Wahab. Yogyakarta : Gadjah
Mada University Press, Hal 127-136.
Kerr, L.E., M. Paterson and R.J. Aitken. 1998.
Molecular basis of sperm – egg interaction and
the prospect for immunocontraception. J Reprod
Immunol. 40 : 103-118.
Lee, E.B. and H.C. Chi. 1985. Female infertility evaluation of natural products. Proceeding from the
UNESCO Regional Workshop. Seoul, Pp 18-22.
McCartney, C.A. and K.E. Mate. 1999. Cloning and
characterisation of a zona pellucida 3 cDNA
from a marsupial, the brushtail possum
Trichosurus vulpecula. Zygote 7 (1) : 1-9.
Mulyati, S., I. Mustofa, dan S. Utama. 2004. Pengaruh
Zona Pelusida Fraksi 3 (ZP3) Kambing Sebagai
Bahan Antifertilitas terhadap Sikus Birahi
Mencit (Mus musculus) Media Kedokteran
Hewan 20 (1) : 22 – 25.
130
Media Kedokteran Hewan
Mustofa, I., L. Mahaputra, F.A. Rantam dan A.
Hinting. 2003. Pembakuan Epitop Reseptor
Fertilisasi pada Zona Pelusida
Kambing
sebagai Bahan dasar Vaksin Kontrasepsi Masa
Depan. Penelitian Hibah Bersaing XI/1.
Mustofa, I., S. Mulyati dan L. Mahaputra. 2004a.
Pengaruh Imunisasi dengan Zona Pelusida - 3
Kambing terhadap Angka Kebuntingan dan
Jumlah Anak pada Mencit (Mus musculus).
Media Kedokteran Hewan 20 (1) : 22 – 25.
Mustofa, I., L. Mahaputra, F.A. Rantam dan T.I.
Restiadi. 2004b. Isolasi Zona Pelusida-3
Kambing dan Identifikasi Karakter Reseptor
Fertilisasi dengan Uji Imunofluoresen. Media
Kedokteran Hewan 20 (3) : 116 - 120.
Naz, R.K., A. Sacco, O. Singh, R. Pal and G.P. Talwar .
1995. Development of contraceptive vaccines for
humans using antigens derived from gametes
(spermatozoa and zona pellucida) and
hormones (human chorionic gonadotrophin):
current status. Hum Reprod 1(1) : 1-18 .
Ndolo, T.M., M. Oguna, C.S. Bambra, B.S. Dunbar
and E.D. Schwoebel. 1996. Immunogenicity of
zona pellucida vaccines. J Reprod Fertil Suppl
50 : 151-8.
Paterson, M, M.R. Wilson, Z.A. Jennings, M. van Duin
and R.J. Aitken. 1999. Design and evaluation of
a ZP3 peptide vaccine in a homologous primate
model. Mol Hum Reprod 5 (4) : 342-52.
131
Vol. 21, No. 3, September 2005
Paterson, M, Z.A. Jennings, M.R. Wilson and R.J.
Aitken. 2002. The contraceptive potential of ZP3
and ZP3 peptides in a primate model. J Reprod
Immunol 53 : 99–107.
Sadler, K., P.H. Bird. L.E. Brown and D.C. Jackson.
2000. The antigenic and immunogenic properties
of synthetic peptide immunocontraceptive
vaccine candidates based on gamete antigens.
Vaccine 18 (2000) 416 - 425
Santosa, S. 2001. Buku pelatihan SPSS satistik
parametrik. Jakarta : PT Elex Media
Komputindo, Hal 56-70.
Srivastava, N.R., P. Santhanam, S. Sheela, S.S.
Mukund, B.S. Thakral, Malik and S.K. Gupta.
2002. Evaluation of the immunocontraceptive
potential
of
Escherichia
coli-expressed
recombinant dog ZP2 and ZP3 in a homologous
animal model. Reproduction123 : 847–857.
Sumitro, S.B. and Aulanni’am. 2001. Zona pellucida 3
(ZP3) has proper biochemical properties to be
considered
as
candidate
antigen
for
immunocontraceptive vaccine. Reprotech 1(1) :
51-53.
Tsubamoto, H., N. Yamasaki, A. Hasegewa and K.
Koyama. 1999. Expression of a recombinant
porcine zona pellucida glycoprotein ZP1 in
mammalian cells. Protein Expr Purif 17(1):8-15.