AGRIPLUS, Volume 23 Nomor : 02 Mei 2013, ISSN 0854

IDENTIFIKASI MOLEKULER SIFAT ANTI VIRAL AYAM TOLAKI
MELALUI DETEKSI GEN MX SEBAGAI MARKA GENETIK
Oleh: La Ode Nafiu dan Muhammad Amrullah Pagala1)
ABSTRACT
The objective this reseacrh was detect the Mx gene of Tolaki Chicken as genetic marker.
As a threatment in this research was carried out experiment by using 15 Tolaki chicken from Sub
District Palangga, and Sub District Wolasi of Konawe Selatan Regency. The research was
conducted from September to Nopember 2012. The Method of this research was using DNA
Extraction according to Sambrook, et al (1989). The identified Mx Gene was conducted based on
PCR (Polymerase Chain Reaction) according to Ko et al (2002); Maeda (2005) and Sulandari et
al (2007). The spesifik primer to amplified Mx gene according to Seyama et al (2006) was
Foward NE-F2 (5’CCTTCAGCCTGTTTTTCTCCTTTTAGG AA3’) and Reverse NE-R2/R
(5’CAGAGGAATCTGATTGCTCAGGCGTGTA3). Result showed that all Tolaki Chicken
sample had Mx gene with 299 bp
Keywords : Tolaki Chicken, Mx gene and PCR.
PENDAHULUAN
Pengembangan ayam lokal di
Indonesia sampai saat ini masih belum
ditangani secara serius dan kontinu, upaya
ke arah seleksi yang terarah pada
karakteristik fenotipik tertentu masih sangat
terbatas. Hal ini dapat dilihat masih
tingginya keragaman sifat-sifat yang
dimiliki, baik sifat-sifat tampilan fisik
maupun produktivitasnya (Mansjoer, 2003).
Tingginya keragaman sifat yang dimiliki
ayam lokal merupakan potensi dasar dalam
pembentukan galur ayam lokal asli yang
murni dan unggul, melalui program seleksi
yang berkesinambungan dan karakterisasi
pada sifat-sifat khas yang menonjol.
Ayam Tolaki merupakan salah satu
ayam lokal yang memiliki penampilan yang
khas selain ayam lokal lainnya seperti :
ayam Nunukan, Bangkok, Pelung, Nagrak,
Sentul, Merawang, Merawas, Kedu
hitam/putih, Kokok Balenggek, Tukong,
Kate dan ayam Berugo. Ayam Tolaki
merupakan salah satu dari 31 jenis ayam
lokal
yang
memiliki
karakteristik
penampilan yang khas (Nataamidjaja dan
Dwiyanto, 1994). Ayam Tolaki adalah ayam
lokal asli Sulawesi Tenggara. Sebagaimana
yang dinyatakan Sarwono (2005), bahwa
ayam yang berbadan atletis ini diperkirakan
1
berasal dari Sulawesi Tenggara. Ayam
Tolaki memiliki pola warna bulu yang mirip
dengan ayam hutan merah (Gallus-gallus),
sehingga ada yang menyebutnya sebagai
ayam hutan. Lebih lanjut disebutkan sampai
saat ini ayam Tolaki masih dikelompokkan
sebagai ayam aduan, sementara dengan
postur tubuh ayam Tolaki sebenarnya dapat
diarahkan untuk tujuan produksi telur dan
daging.
Untuk mengetahui peta penyebaran
ayam Tolaki ini, maka salah satu acuan
dasar yang dapat digunakan adalah
mengikuti peta sebaran masyarakat asli suku
Tolaki/Mekongga, karena ayam Tolaki
merupakan salah satu hewan yang
digunakan untuk acara adat dan sebagai
salah satu media pengobatan tradisional
suku Tolaki (Aku dan Pagala, 2010).
Penelitian tentang karakterisasi
ayam Tolaki sampai sejauh ini masih
sampai pada penampilan sifat fenotipiknya
sebagaimana telah dilakukan oleh Nafiu et
al. (2009) yang melaporkan Performans
ayam Tolaki secara fisik memiliki postur
tubuh yang relatif lebih kecil dan bentuk
tubuh yang lebih ramping dibanding ayam
kampung, dengan rata-rata berat Jantan
1.60±0.29 kg kisaran (1.22 - 1.99 kg) dan
betina Rata-rata dengan berat 1.29±0.21 kg,
kisaran (0.97 - 2.04 kg).
Penelitian
)Staf Pengajar Jurusan
Peternakan Volume
Fakultas Peternakan
Universitas
Oleo,
Kendari
AGRIPLUS,
23 Nomor
: 02 MeiHalu
2013,
ISSN
0854-0128
139
140
karakteristik fenotipik ayam Tolaki ini telah
dilaksanakan sampai pada pengamatan pola
warna, seperti warna bulu, shank dan bentuk
jengger bahkan telah dilakukan penelitian
polimorfisme analisis pita protein darah.
Sedangkan penelitian karakterisasi genetik
melalui analisis molekuler (analisis DNA)
termasuk identifikasi molekuler sifat-sifat
ekonomis masih sangat sedikit dilakukan
sehingga dibutuhkan penelitian kearah
analisis molekuler ayam Tolaki untuk
menghasilkan karakterisasi sifat genetik
yang berciri spesifik.
Salah satu sifat ekonomis penting
pada ayam lokal adalah ketahanan terhadap
serangan penyakit viral seperti flu burung
(Avian Influenza) dan tetelo (Newcastle
Disease).
Sifat antiviral ini diketahui
dikontrol oleh gen Mx. Hasil penelitian
Maeda (2005) menunjukan bahwa semua
populasi Ayam Lokal di negara Asean
mempunyai gen Mx+(tahan Flu burung) dan
Mx- (rentan Flu burung), di Indonesia
sendiri frekuensi gen Mx+ lebih besar yakni
63% dan sisanya 37% gen Mx-. Penggunaan
teknik molekuler dengan memilih genotipe
gen kandidat yang resisten terhadap
penyakit tertentu sebagai Marker Assisted
Selection
(MAS)
diharapkan
dapat
mempercepat pembentukan jenis Ayam
Lokal Resisten terhadap beberapa penyakit
yang mematikan seperti AI dan ND.
Berdasarkan Pemikiran tersebut,
maka dibutuhkan suatu penelitian molekuler
yang dapat mengunkap sifat resistensi
penyakit viral pada Ayam Tolaki.
METODE PENELITIAN
Waktu dan Lokasi Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan bulan
September sampai Nopember 2012 Lokasi
pengambilan sampel dilaksanakan di
Kabupaten Konawe Selatan Propinsi
Sulawesi Tenggara. Analisis sampel di
Laboratorium Pemuliaan dan Genetika
Molekuler Departemen Ilmu Produksi dan
Teknologi Peternakan Fakultas peternakan
IPB Bogor.
Materi Penelitian
Sampel yang digunakan dalam
penelitian ini adalah ayam Tolaki yang
diambil dari beberapa daerah di Kabupaten
Konawe
Selatan
Propinsi
Sulawesi
Tenggara sebanyak 15 ekor. Setelah
sebelumnya dilakukan proses seleksi dan
identifikasi fenotipik. Pengambilan sampel
darah dilakukan pada tahap I (pertama)
penelitian, selanjutnya analisis laboratorium
pada tahap II di Laboratorium Departemen
IPTP Fakultas Peternakan IPB. Bahan yang
digunakan adalah bahan kimia untuk
pengambilan sampel darah, ekstraksi DNA,
amplifikasi DNA, gel elektroforesis, dan
Silver Staining antara lain : EDTA, Trs,
HCL pekat, potassium asetat, air bebas ion,
NaCl, NaOH, SDA, natrium asetat, asam
asetat, fenol, etanol absolute, kloroform,
isoamil alkohol, dan proteinase K, agarose,
bromfenolblue, etidium Bromida, marker
DNA leader 100 pb, Tris-Borat-EDTA,
Mgcl2, dNTP, Taq polymerase dan random
primer.
Alat yang digunakan mesin PCR,
elektroforesis, autoclave, vacuum tainer,
pipet mikro, pipet tip,disposable glove,
sentrifuse, vortex,gelas piala, magnetic
stirrer, tabung eppendorf, alat thremocycler,
lampu UV, kamera paraloid.
METODE PENELITIAN
Isolasi DNA Total
Isolasi DNA Total dilakukan
dengan menggunakan metode pemurnian
fenol dan presipitasi dengan etanol menurut
Duryadi
(1993).
Adapun
prosedur
pelaksanaannya adalah sebagai berikut :
4. Darah ayam sebanyak 250 µl yang
sebelumnya telah ditambahkan EDTA
10% dipindahkan kedalam tabung
ependorf 1,5 ml.
5. Ditambahkan digestion buffer (SDS 1%
v/v, 10 mM EDTA, pH 8, 20 mM
NaCl, 50 mM, Tris HCL pH 9)
sebanyak 500 µl dan dikocok.
6. Inkubasi pada suhu 550C selama
semalam atau 16 jam.
Ekstraksi DNA
Ekstraksi DNA pada praktikum ini
menggunakan protokol ekstraksi DNA
metode phenol (Sambrook, et al, 1989).
Sebagai berikut :
AGRIPLUS, Volume 23 Nomor : 02 Mei 2013, ISSN 0854-0128
141
14. 250 µl sampel darah dalam EtOH
dipindahkan ke tabung 1,5 ml
15. Ditambahkan 1000 µl DW/TE dan lisis
buffer 500 µl dikocok pada votex dan
didiamkan selama 5 menit.
16. Sentrifuge pada kecepatan 8000 rpm
selama 5 menit
17. Supernatannya
dibuang
dan
endapannya (pelet) disuspensikan
dengan larutan 40 L SDS 10% dan 10
L Protk 5 mg/ml, dan 1 x STE sampai
400 µl.
18. Dikocok pelan dalam inkubator pada
suhu 55°C selama 2 jam.
19. Supernatan sisa diekstraksi dengan
penambahan 1 x volume 400 µl phenol400
µl
(chloroform-Isoamil
alkohol,24:1) dan 40 µl 5M Nacl.
Dikocok pelan pada suhu ruang selama
1 jam.
20. Sentrifuge pada kecepatan 12000 rpm
selama 5 menit. Bagian bening (DNA)
dipindahkan ke tabung 1,5 ml baru.
21. Ditambahkan 800 µl Etanol absolut dan
40 µl 5 M Nacl.
22. Selanjutnya tabung difreezing selama
(lebih dari) 30 menit/over night.
23. Larutan kemudian disentrifuse pada
12.000 xg selama 5 menit untuk
mempresipitasi Asam Nukleat.
24. Supernatan dibuang dan pelet dibilas
dengan 800 L Etanol 70% (etanol
kemudian dibuang).
25. Diamkan dalam keadaan terbuka dalam
desikator atau ruang terbuka sampai
alkoholnya hilang.
26. Ditambahkan 100 µl.TE 80% atau
Elution Buffer dan DNA kemudian
disimpan dalam freezer sampai akan
digunakan.
Identifikasi dan Amplifikasi gen Mx
Identifikasi genotipe gen Mx
dilakukan berdasarkan metode PCR
(Polymerase Chain Reaction) menurut KO
et a.l. (2002); MAEDA (2005) dan
SULANDARI et al. (2007). Primer spesifik
untuk mengamplifikasi gen Mx berdasarkan
laporan SEYAMA et al., (2006) adalah
primer
Foward
NE-F2
(5’CCTTCAGCCTGTTTTTCTCCTTTTA
GG AA3’) dan primer Reverse NE-R2/R
(5’CAGAGGAATCTGATTGCTCAGGCG
TGTA3).
Untuk amplifikasi fragmen DNA
gen Mx digunakan mesin Polymerase Chain
Reaction (PCR). Komposisi coctail PCR
dalam volume 25μl adalah primer forward
1μl, primer reverse 1μl, DNA template (50
ng) 2 μl, PCR mix 12,5 μl dan pure water
8,5 μl. Kondisi PCR yang digunakan yaitu
pre denaturasi 94oC selama 5 menit,
kemudian denaturasi 940 C selama 60 detik,
annealing pada temperatur 60 0C selama 60
detik dan elongasi pada temperatur 72 0C
selama 60 detik, dengan siklus sebanyak 35
kali, dan final extention 72 0C selama 5
menit. Produk PCR disegregasikan dengan
alat elektroforesis gel agarose 1,2% dalam
buffer TBE 0,5x selama 60 menit dengan
voltage 90 volt konstan, kemudian diwarnai
dengan ethidium bromide dan dilihat
memakai alat Ultra Violet. Dokumentasi
dilakukan
dengan
memotret
hasil
elektroforesis tersebut menggunakan alat gel
document (Gel doc), kemudian disimpan
pada file flash disk.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Ekstraksi DNA Ayam Tolaki
Hasil isolasi dan ekstraksi DNA ayam
Tolaki disajikan pada gambar 1 berikut ini :
B
A
Gambar 1.
Hasil Ekstraksi DNA Ayam
Tolaki
Keterangan :
A = Marker 1 kb
B = Sampel DNA Ayam Tolaki
Berdasarkan tampilan pita-pita DNA
hasil ekstraksi diatas, terlihat bahwa secara
keseluruhan semua sampel (15 sampel)
menunjukkan hasil pita DNA pada ayam
Tolaki yang cukup bersih, meskipun ada
beberapa pita DNA terlihar smear. Pita
AGRIPLUS, Volume 23 Nomor : 02 Mei 2013, ISSN 0854-0128
142
DNA ini terkumpul berdekatan dengan
stocking gel. Hasil ekstraksi DNA pada
ayam Tolaki ini di duga mengandung gen
Mx yang mengindikasikan bahwa ayam
lokal ini tahan terhadap beberapa serangan
penyakit ayam khususnya pada serangan
penyakit viral. Salah satu sifat ekonomis
penting pada ayam lokal adalah ketahanan
terhadap serangan penyakit viral seperti flu
burung (Avian Influenza) dan tetelo
(Newcastle Disease). Sifat antiviral ini
diketahui dikontrol oleh gen Mx.(Maeda,
2005). Dilaporkan pula gen Mx dapat
mengakibatkan resistensi pada vasicular
somatitits virus (VSV) dan avian Influenza.
Penelitian selanjutnya memperjelas posisi
protein Mx ini yang ternyata berada pada
posisi asam amino 631 yang dapat
mengakibatkan
resistensi
untuk
mepertahankan diri terhadap kombinasi
serangan VSV dan AI pada struktur selnya
(Ko et al., 2002).
Amplifikasi PCR pada Ayam Tolaki
Hasil ekstraksi DNA ayam Tolaki
yang
dilanjutkan
dengan
proses
perbanyakan (amplifikasi DNA) dengan
PCR (Polymerisasi Chain Reaction)
ditampilkan pada Gambar di bawah ini.
Gambar 2. Hasil Amplifikasi PCR DNA Ayam Tolaki
Keterangan :
M = Marker 1 kb
TP1 = Sampel Ayam Tolaki Kecamatan
TP2 = Sampel Ayam Tolaki Kecamatan
TP3 = Sampel Ayam Tolaki Kecamatan
TP4 = Sampel Ayam Tolaki Kecamatan
TP5 = Sampel Ayam Tolaki Kecamatan
TP6 = Sampel Ayam Tolaki Kecamatan
TP7 = Sampel Ayam Tolaki Kecamatan
TW1 = Sampel Ayam Tolaki Kecamatan
TW2 = Sampel Ayam Tolaki Kecamatan
TW3 = Sampel Ayam Tolaki Kecamatan
TW4 = Sampel Ayam Tolaki Kecamatan
TW5 = Sampel Ayam Tolaki Kecamatan
Palangga Kandang 1
Palangga Kandang 2
Palangga Kandang 3
Palangga Kandang 4
Palangga Kandang 5
Palangga Kandang 6
Palangga Kandang 7
Wolasi Kandang 1
Wolasi Kandang 2
Wolasi Kandang 3
Wolasi Kandang 4
Wolasi Kandang 5
PCR merupakan suatu teknik
perbanyakan molekul DNA dengan ukuran
tertentu
secara
enzimatik
melalui
mekanisme perubahan suhu (Mullis, et all,
1994). Dalam hal ini, PCR diperlukan untuk
mengamplifikasi fragmen DNA gen Mx
secara invitro menggunakan primer spesifik.
Berdasarkan hasil amplifikasi PCR DNA
ayam Tolaki diperoleh informasi bahwa
semua sampel ayam Tolaki baik dari
Kecamatan Palangga maupun Kecamatan
Wolasi memiliki atau mengandung gen Mx
dengan ukuran pita DNA sebesar 299 bp.
Gen Mx adalah gen yang bertanggungjawab
AGRIPLUS, Volume 23 Nomor : 02 Mei 2013, ISSN 0854-0128
143
terhadap
kemampuan
ayam
dalam
mempertahankan diri (Resisten) terhadap
serangan virus flu burung (avian influenza).
Hasil ini semakin mempertegas hasil
penelitian Maeda (2005) yang mengambil
sampel Ayam kampung atau ayam lokal di
beberapa negara Asia Tenggara dan
menemukan bahwa hampir sebagian besar
mengandung gen Mx, Selanjutnya dikatakan
di Indonesia sendiri frekuensi gen Mx+ lebih
besar yakni 63% resisten dan sisanya 37%
gen Mx- rentan terhadap Avia Influenza
dengan jumlah sampel sebanyak 330 ekor.
Ukuran pita DNA gen Mx pada ayam Tolaki
sebesar 299 bp sejalan dengan hasil
penelitian yang dilaporkan oleh Sironi, et al
(2008) yang menemukan adanya gen Mx
pada ayam jenis white leghorn dan New
Hampshire sebesar 300 bp.
Keberadaan gen Mx dapat digunakan
sebagai marker guna mendeteksi daya tahan
ayam terhadap penyakit viral seperti Avian
Influenza dan Newcastle Disease, hal ini
dikarenakan gen Mx merupakan native
antiviral yang spesifik pada ayam, sehingga
gen Mx ini dapat digunakan sebagai penciri
dalam seleksi molekuler. Pada penelitian
dengan populasi yang lebih besar Sartika,
dkk (2011) melakukan seleksi terhadap
ayam lokal di Indonesia guna menghasilkan
breed ayam lokal Indonesia yang tahan
terhadap serangan virus AI dari 200 sampel
induk ayam dan 40 ayam jantan diperoleh
frekuensi alel resisten Mx++ 65% pada induk
dan 60% pada ayam jantan, sementara
frekuensi alel yang rentan virus Mx- yakni
35% pada induk dan 40% pada jantan.
Gen Mx mampu menghasilkan
protein Mx yang bervariasi pada setiap
spesies ayam. Protein Mx ini bersifat
antiviral yang mampu melawan infeksi
vesicular stomatitis virus (VSV). Adanya
variasi pada asam amino protein Mx pada
posisi 631 sangat menentukan spesifikasi
antiviralnya. Hal ini dapat terjadi karena
adanya mutasi subtitusi yang terjadi antara
serin (AGT) dan asparagin (AAT) pada
posisi 631 tersebut. Mutasi subtitusi ini akan
menentukan terdapatnya gen Mx+ dan gen
Mx- (Watanabe 2003; Ko et al., 2004).
KESIMPULAN
Berdasarkan hasil penelitian ini dapat
diambil beberapa kesimpulan sebagai
berikut :
4. Sampel Ayam Tolaki yang berasal dari
Kecamatan Palangga dan Wolasi
Kabupaten Konawe Selatan terbukti
Mx
yang
memiliki
Gen
bertanggungjawab terhadap serangan
virus Flu Burung (Avian Influenza)
ataupun serangan virus tetelo (Newcastle
Disease).
5. Pita DNA gen Mx yang ditemukan pada
ayam Tolaki berukuran 299 bp.
Keberadaan gen Mx ini dapat digunakan
sebagai penciri dalam seleksi molekuler
guna menghasilkan galur ayam lokal
yang tahan terhadap serangan penyakit
viral pada ayam.
DAFTAR PUSTAKA
Aku, A.S dan Pagala, M.A. 2010. Studi
Sebaran dan Pemetaan Populasi
Ayam Tolaki (Manu ndolaki) di
Kabupaten Kolaka dan Kolaka
Utara dalam rangka pelestarian
plasma nutfah asli Sulawesi
Tenggara.
Laporan
Penelitian.
Lembaga
Penelitian
Unhalu.
Unpublished. Kendari
Ko, J.H., H.K. Jin, A.Asano, A.Takada,
A.Ninomiya, H.Kida, H.Hokiyama,
M.Ohara, M.Tsuzuki, M.Nishibori,
M.Mizutani and T.Watanabe. 2002.
Polymorphisms and the differential
antiviral activity of the chciken Mx
gene.
Genome Research 12
(4):595-601.
Maeda, 2005. Polymorphism of Mx Gene
in Asian Indigenous chicken
population.
Makalah
dipresentasekan
pada
Seminar
Nasional Tentang Unggas Lokal III.
Universitas Diponegoro.25 Agustus
2005.
Mansjoer SS. 2003. Potensi ayam buras di
Indonesia.
Makalah
semiloka
pengkajian pengembangan produksi
bibit ayam Buras dan Itik,
AGRIPLUS, Volume 23 Nomor : 02 Mei 2013, ISSN 0854-0128
144
CisaruaBogor, Tanggal
Desember 2003.
11
-12
Mullis, K.B., F.Ferre and R.A Gibbs. 1994.
The Polymerase Chain Reaction.
Birkhause, Boston.p.512.
Nafiu, LD, Aku, AS, Saili, T, Taufik Y dan
Rusdin, M. 2009. Pelestarian dan
Pengembangan Ayamn
Tolaki
sebagai Plasma Nutfah Asli Sulawei
Tenggara.
Laporan
Penelitian.
Lembaga
Penelitian
Unhalu.
Kendari
Nataamidjaja A.G. dan K. Diwyanto, 1994.
Konservasi Ayam Buras Langka.
Proceeding,
Koleksi
dan
Karakterisasi
Plasma
Nutfah
Pertanian, Bogor.
Sambrook, J., E.F. Fritsch, and T. Maniatis.
1989. Molecular Cloning. A
Laboratory Manual 2nd ed. Cold
Spring Harbor Laboratory Press.
Sartika, T., Sulandari, S.,and, M.S.A Zein.
Selection of Mx gene genotype as
genetic marker for Avian Influenza
resistance in Indonesian native
chicken. BMC Proceedings 2011,
5(Suppl 4):S37.
Sarwono, B. 2005. Ayam Aduan. Penebar
Swadaya. Jakarta. Hal 16-18
Seyama, T., J.H. Ko, M.Ohe, N.Sasaoka, A
Okada, H.Gomi, A.Yoneda, J.Ueda,
M.Nishibori, S.Okamoto, Y.Maeda
and T.Watanabe. 2006. Population
Research of genetic polymorphism
at amino acid position 631 in
chciken Mx protein with differential
antiviral activity. Biochem. Genet.
44:432-443.
Sironi,
L.,
Ramelli.P.,
Williams,
JL.,Mariani, P., 2010. PCR-RFLP
Genotyping Protocol for Chicken
Mx Gene G/A Polymorphism
associated
with
the
S631N
Mutation. Genetics and Molecular
Research 9(2):1104-1108.
Sulandari, S., M.S.A. Zein, D. Astuti And
T.Sartika.
2007.
Unblocking
Indonesian Indigenous Chicken
Genome
to
explore
genetic
resistance to avian influenza virus
infection. Laporan Akhir, Program
Insentif KNRT Tahun Anggaran
2007.
Watanabe, T. 2003. Genomic analysis of
antiviral resistant Mx gene in the
chicken. Lab. Animal Breeding and
Reproduction, Hokkaido University.
International
Sapporo,
Japan.
workshop on Animal Genome
2003 Nop 6;
Analysis, KKR
Sapporo (JP) : Hotel Tokyo.
AGRIPLUS, Volume 23 Nomor : 02 Mei 2013, ISSN 0854-0128