ANALISIS SIDIK DNA (DNA Fingerprinting) RFLP

ANALISIS SIDIK DNA (DNA Fingerprinting) RFLP
(Restriction Fragmen Length Polymorphism)
Laurencius Sihotang
I.
II.
Tujuan
 Mempelajari cara teknik RFLP(Restriction Fragmen Length Polymorphism)
 Menganalisis pola pita DNA dengan tehnik RFLP
Kajian Pustaka
RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) adalah sebuah metode
yang digunakan oleh ahli biologi molekuler untuk mengikuti urutan tertentu DNA
seperti yang disampaikan kepada sel-sel lain Sebuah RFLP adalah urutan DNA yang
memiliki pembatasan situs pada setiap ujungnya dengan "target" urutan di antara
keduanya. Dalam analisis RFLP, genomik DNA yang dipotong dengan enzim restriksi
dipisahkan melalui gel elektroforesis. Dasar dari transfer DNA dari gel ke pensupport
yang lebih solid adalah untuk mengawetkan posisi fragmen DNA dan menyebabkan
hibridisasi dapat dilakukan.
Restriction Fragment Length polymorphism (RFLP) merupakan penanda
molekul yang pertama kali ditemukan dan digunakan. Penggunaannya dimungkinkan
semenjak orang menemukan enzim endonuklease restriksi (RE), suatu kelas enzim
yang mampu mengenal dan memotong seurutan pendek basa DNA (biasanya 4-6
urutan basa). Enzim ini dihasilkan oleh bakteri dan dinamakan menurut spesies
bakteri yang menghasilkannya.
Contoh:

EcoR I adalah enzim RE yang dihasilkan dari bakteri Escherichia coli strain R I
(baca: R satu). Pada DNA utas ganda, sekuens GAATTC ini akan berpasangan
dengan sekuens yang sama tetapi berlawanan arah. Enzim EcoRI ini
memotong setiap utas dari utas ganda tersebut pada bagian anatara G dan A.
Sebagai akibatnya, potongan-potongan atau fragmen-fragmen DNA utas
ganda yang dihasilkan akan memliki ujung berutas tunggal. Ujung seperti ini
yang dikenal dengan istilah sticky ends atau cohesive ends.

BamH I diperoleh dari bakteri Bacillus americanus strain H I (H satu). Struktur
enzim restriksi BamHI yang mengikat DNA. Enzim tersebut mengenali double
strand dari DNA dengan sekuens spesifik 5′-GGATCC-3′, yang selanjutnya
memecah ikatan fosfodiester antara dua residu G. Hasilnya adalah berupa
dua fragmen yang ujungnya sticky ends. Pada gambar tersebut warna hijau
dan biru menunjukkan subunit protein dimer yang identik
Deteksi RFLP dilakukan berdasarkan pada adanya kemungkinan untuk
membandingkan profil pita-pita yang di hasilkan setelah di lakukan pemotongan
dengan enzim restriksi terhadap DNA target atau dari individu yang berbeda.
Berbagai mutasi yang terjadi pada suatu organisme mempengaruhi molekul DNA
dengan berbagai cara, menghasilkan fragmen-fragmen dengan panjang yang
berbeda. Aplikasi tekhnik RFLP biasa di gunakan untuk mendeteksi diversitas genetik,
hubungan kekerabatan,sejarah domestikasi,asal dan evolusi suatu spesies, genetik
drift dan seleksi, pemetaan keseluruhan genom, tagging gen, mengisolasi gen-gen
yang berguna dari spesies liar, mengkonstruksi perpustakaan DNA.
Analisis pola restriction fragment dihasilkan ketika DNA dicerna oleh enzim
restriksi. Praktek dalam aplikasi analisis restriction fragment didasari dari fakta
bahwa tidak ada dua orang atau lebih yang kembar identik mempunyai sekuens basa
DNA yang persis. Walaupun perbedaan sekuens DNA diantara dua orang cukup kecil,
tetapi terdapat perubahan panjang
III.
Alat dan Bahan
Alat
Pipet mikro, tabung mikro, tips mikro, alat elektroforesis vertical, transimulator UV,
alat pemasok daya, dan sarung tangan
Bahan
Sampel DNA, kit PCR mix, oligonukleotida primer, deoksinukleotida fosfat, enzim
polymerase
IV.
Cara Kerja
Gel dikeluarkan dari paket dan cabut sisir gel, gel diletakkan kedalam tangki
elektroforesis dengan posisi yang benar. Secara perlahan buffer diisi kedalam tangki
elektroforesis dan isi hasil PCR dari setiap tabung sampel ke dalam sumur gel. Lalu
tabung elektroforesis ditutup dan beri aliran listrik. Setelah itu, mengamati sampel
yang akan bermigrasi dalam gel menuju elektroda merah, kemudian listrik dimatikan
ketika pewarna loading telah mendekati akhir gel dan lepaskan power supply. Tutup
V.
elektroforesis dilepas dan tunggu kira-kira 10 detik. Dengan menggunakan sarung
tangan gel yang ada didalam tangki elektroforesis akan dipindahkan keatas
transiluminator UV lalu mengamati gel tersebut.
Hasil Pengamatan
Formulasi yang diberikan saat RFLP:
MspI
= 2µL
10 x T.Buffer
= 2µL
0,1 % BSA
= 2µL
DNA Template
= 5µL
H2O
= 9 µL
+
Jumlah
= 20µL
Karena kita punya sampel 17,
maka semuanya dikalikan 17.
Catatan :
Diinkubasi 370 C selama 1 jam
BSA : Bovaine Serum Albumin
Setelah selesai di inkubasi, dilakukan elektroforesis dan diperoleh hasil seperti
berikut:
Sumur Gel
No. Sampel DNA
Deteksi DNA
1
Marker
2
1
-
3
3
-
4
4
-
5
5
-
6
7
-
7
8
-
8
9
-
9
10
-
10
11
-
11
12
-
12
13
-
13
14
-
14
15
-
15
Kontrol positif
+
Tabel 6. Hasil Elektroforesis RFLP
Keterangan:
Agarose sebanyak 2 %
Waktu : 20 menit
Daya : 90 volt
DNA yang diambil sebanyak 4,3 μL dan marker sebanyak 1 μL
Gambar 6. DNA Hasil PCR yang di RFLP
*ket: urutan sumur gel adalah nomor 1 dimulai dari bawah ke atas nomor 2 dan
seterusnya
VI.
Pembahasan
Analisis Restriction fragment length polymorphism (RFLP) adalah salah satu
teknik pertama yang secara luas digunakan untuk mendeteksi variasi pada tingkat
sekuen DNA. Deteksi RFLP dilakukan berdasar pada adanya kemungkinan untuk
membandingkan profil pita-pita yang dihasilkan setelah dilakukan pemotongan
dengan enzim restriksi terhadap DNA target/dari individu yang berbeda. Meskipun
gen dalam keadaan normal bersifat stabil, akan tetapi dalam menghadapi perubahan
lingkungan, gen dapat bersifat sensitif atau rentan sehingga dapat menimbulkan
mutasi pada urutan basa nukleotidanya. Berbagai mutasi yang terjadi pada suatu
organisma
mempengaruhi molekul DNA dengan berbagai cara, menghasilkan
fragmen-fragmen dengan panjang yang berbeda. Perbedaan panjang fragmen ini
dapat dilihat setelah dilakukan elektroforesis pada gel, hibridisasi dan visualisasi.
Gen ALAD (asam Amino Levulinat heme) terletak di kromosom 9q34130 pada
urutan nomor 1161148591 bp (base pairs) sampai dengan 116163617 bp. ALAD 1-1,
1-2, dan 2-2, adalah tiga isozym yang berasal dari dua macam aIel yaitu ALAD 1 dan
ALAD2. Keberadaan gen ALAD polimorfik, patogenesis toksisitas Pb telah
mengimplikasikan bahwa secara genetik sangat potensial untuk menyebabkan
terjadinya perbedaan suseptabilitas terhadap Pb. Sintesis heme berasal dari molekul
suksinil-KoA, hasil siklus asam sitrat di mitokondria dan asam amino glisin. Produk
reaksi penggabungan antara suksinil-KoA dan glisinadalah asam α-amino-βketoadipat, yang selanjutnya diderkaboksilasi untuk membentuk α- aminolevulinat
(ALA) melalui enzim ALA sintase. ALA Dehidratase merupakan suatu enzim yang
mengandung seng (Zn) dan peka terhadap inhibisi oleh plumbum(Pb), seperti yang
dapat terjadi pada keracunan plumbum di lingkungan. Penyebab polimorfisme pada
protein enzim ALAD adalah karena adanya transversion
dari G- ke –C pada
nukleotida yang ada dalam region kodon 59 sehingga menyebabkan terjadinya
substitusi asam amino lisin oleh asparagin. Adanya substitusi ini akan menyebabkan
terjadinya perbedaan afinitas Pb terhadap gen polimorfik tersebut.
Setelah melakukan elektroforesis terhadap sampel yang sudaag di uji dengan
RFLP, tidak ada gen yang terdeteksi. Sehingga tidak dapat diamati pada sampel
gtersebut, apakah ada perubahan gen atau tidak. Hal ini mungkin terjadi dimana
kasus seperti di awal, dapat seperti itu karena faktor kesalahan prosedur saat isolasi
genom karena praktikan kurang terbiasa dengan praktikum mikro. Selain itu, hasil
elektroforses saat PCR juga tampak negatif, sehingga jika pada saat RFLP juga negatif
merupakan hal yang wajar. Praktikan ini tidak memungkinkan diulang kembali
karena keterbatasan waktu.
VII.
Kesimpulan
Gen ALAD pada manusia terdapat pada kromosom 9 lengan q, jika terpapar Pb dapat
mengakibatkan polimorfisme. Dari hasil yang diuji, tidak dapat dipastikan apakah ada
yang terkena Pb karena hasil elektroforesis negatif.
Daftar Acuan
 Brown, S.M., Hay, J.G., Ostrer, H. 2009. Essentials of Medical Genomics. Second ed.
John Wiley & Sons, Inc. New Jersey, USA.
 Campbell, A. N. J. B. Reece & L. G. Michell. 2012. Biologi. Edisi 8 jilid 1. terj. Erlangga.
Jakarta
 Cohn Robert m., Roth Karl s. 1996. Biochemistry and Disease. William and Wilkins,
Inc. Maryland
 Jamilah. 2005. Pengaruh pemberian macam deterjen, penambahan enzim dan
ekstrak nanasterhadap hasil isolasi DNA berbagai macam buah. Universitas
Negeri malang. Malang
 McPherson, M.J., Moller, S.G. 2006. PCR. Second ed. Taylor & Francis Group.
Madison Avenue, NY, US.
 Theophilus, B.D.M. 2008. Principles and Medical Applications of the Polymerase
Chain Reaction. In: Molecular Biomethods Handbook Second Edition. Ed:
Walker, J.M., Rapley, R. Humana Press, NJ, USA.