Development of Simple Sequence Repeat Markers for Jatropha spp

Jurnal Littri 17(4), Desember 2011 Hlm. 140 – 149
ISSN 0853-8212
JURNAL LITTRI VOL. 17 NO. 4, DESEMBER 2011 : 140 - 149
PENGEMBANGAN MARKA SIMPLE SEQUENCE REPEAT UNTUK Jatropha spp.
DARMAWAN SAPTADI1, R.R. SRI HARTATI2, ASEP SETIAWAN3, BAMBANG HELIYANTO4, dan SUDARSONO3
1
Jurusan Budidaya Pertanian, Faperta, Universitas Brawijaya,
Jl. Veteran, Malang
2
Pusat Penelitian dan Pengembangan Tanaman Perkebunan,
Jl. Tentara Pelajar 1, Bogor
3
Lab. Biologi Molekuler Tanaman, Departemen Agronomi dan Hortikultura, Faperta, IPB.
Jl. Meranti, Kampus Darmaga, Bogor 16680
4
Balai Penelitian Tanaman Tembakau dan Serat,
Jl. Raya Karangploso km. 4, Malang
email: [email protected]
(Diterima Tgl. 29 - 4 - 2011 - Disetujui Tgl. 28 - 10 - 2011)
ABSTRAK
Pemuliaan tanaman jarak pagar (Jatropha curcas L.) untuk
menghasilkan varietas berdaya hasil dan berkadar minyak tinggi perlu
dilakukan. Penggunaan marka molekuler dapat membantu mempercepat
tercapainya tujuan pemuliaan tanaman jarak pagar. Marka simple sequence
repeat (SSR) merupakan marka ko-dominan yang efektif untuk mendukung program pemuliaan tanaman, tetapi penerapannya pada jarak pagar
masih terbatas. Penelitian yang dilakukan bertujuan untuk : (i) merancang
primer spesifik SSR menggunakan aksesi DNA jarak pagar yang tersedia
di GenBank DNA database dan (ii) mengevaluasi efektivitas pasangan
primer yang dirancang untuk menghasilkan marka SSR yang polimorfik
untuk jarak pagar dan J. multifida. Dua puluh delapan pasang primer
spesifik SSR telah berhasil dirancang menggunakan aksesi DNA asal jarak
pagar yang ada di GenBank DNA database. DNA genomik jarak pagar dan
J. multifida yang diisolasi dapat digunakan sebagai templat untuk
amplifikasi PCR. Dari 28 pasang primer yang dikembangkan, semuanya
mampu menghasilkan marka SSR dari genom jarak pagar dan hanya 19
pasang primer yang menghasilkan marka SSR dari genom J. multifida.
Dari 19 pasangan primer spesifik SSR yang dievaluasi mampu dihasilkan
44 alel dengan ukuran produk amplifikasi berkisar antara 100-360 bp.
Sebanyak 35 alel (79,5%) yang diamati merupakan alel yang polimorfik.
Marka SSR yang didapatkan tidak polimorfik intra-aksesi jarak pagar atau
intra-aksesi J. multifida tetapi polimorfik untuk inter-aksesi kedua spesies.
Karena marka SSR yang dihasilkan bersifat polimorfik untuk aksesi jarak
pagar dengan aksesi J. multifida maka dapat digunakan sebagai marka
untuk mendeteksi hasil persilangan F1 inter-spesies J. curcas x J. multifida.
Kata kunci : Jatropha curcas L., jarak pagar, J. multifida, DNA berulang,
rancangan primer
ABSTRACT
Development of Simple Sequence Repeat Markers for
Jatropha spp.
Breeding of physic nut (Jatropha curcas L.) to obtain new varieties
that are high in yield and oil content needs to be conducted. Molecular
marker could be used to assist breeding of physic nut (J. curcas). Simple
sequence repeat (SSR) marker is a co-dominant marker and theoretically it
could be used to support physic nut breeding program. However, only
limited information has been available regarding molecular analysis of
physic nut. The objectives of this research were: (i) to design SSR specific
primer based on DNA sequences available in the GenBank DNA database
and (ii) to evaluate effectiveness of the primer pairs to produce polymorphic SSR markers for J. curcas and J. multifida. Twenty eight primer pairs
140
were designed and developed using physic nut DNA available in the
GenBank DNA database. Total genomic DNA isolated from J. curcas and
J. multifida could be used as DNA templates for PCR amplification. Of the
28 primer pairs developed in this research yielded SSR marker using J.
curcas genomic DNA, while only 19 out of 28 pairs yielded SSR markers
using J. multifida genomic DNA. As many as 44 alleles with the size of
amplified products ranged from 100-360 bp were identified. Thirty five
alleles (79.5%) out of 44 identified ones were polymorphic. Results of
analysis indicated that identified SSR markers generated using the
designed primers were not polymorphic intra accession of J. curcas nor
intra-accession of J. multifida either. However, the generated SSR markers
were polymorphic for inter-accession of the two Jatropha species. Since
the generated markers were only polymorphic for J. curcas and J.
multifida, they could be used as markers for identifying interspecific F1
hybrids derived from crossing between J. curcas and J. multifida.
Key words: Jatropha curcas L., physic nut, J. multifida, DNA repeat
sequence, primer design
PENDAHULUAN
Jarak pagar (Jatropha curcas L.) adalah tanaman
tahunan multifungsi, berumah dua, dan merupakan anggota
Euphorbiaceae. Pada awalnya jarak pagar digunakan
sebagai tanaman obat. Beberapa tahun terakhir ini jarak
pagar lebih dikenal sebagai tanaman penghasil minyak yang
dapat digunakan untuk biodiesel. Jarak pagar berasal dari
Mexico dan Amerika Tengah yang kemudian menyebar ke
daerah tropis maupun subtropis. Tanaman jarak pagar pada
awalnya ditanam sebagai pagar pengaman atau untuk
keperluan tradisional lainnya ( HELLER, 1996).
Pada beberapa tahun terakhir ini nilai ekonomi jarak
pagar sebagai penghasil biodiesel meningkat pesat
(FAIRLESS, 2007). Hal penting yang harus dilakukan untuk
dapat menggunakan jarak pagar sebagai penghasil biodiesel
adalah pengembangan kultivar yang memiliki hasil biji dan
kadar minyak tinggi serta dapat beradaptasi dengan baik
pada berbagai kondisi lingkungan (DIVAKARA et al., 2010).
DARMAWAN SAPTADI et al.: Pengembangan marka simple sequence repeat untuk Jatropha spp.
Plasma nutfah jarak pagar telah dikoleksi dan dianalisis di Brazil, Indonesia, dan China (OU et al., 2009;
TATIKONDA et al., 2009). Jarak pagar memiliki genom heterosigot dan beberapa penelitian menunjukkan nilai interaksi
genetik dan lingkungan yang cukup besar (MAKKAR et al.,
1997; KAUSHIK et al., 2007) sehingga program pemuliaan
konvensional tidak akan efektif. Strategi pemuliaan berbasis genom sangat penting dilakukan. Sampai saat ini pemetaan genetik jarak pagar belum dilakukan dan informasi
genetik berdasarkan marka molekuler masih sangat sedikit
ketersediaannya.
Marka SSR masih dianggap sebagai marka yang
paling efisien tetapi penggunaannya masih terbatas karena
memakan banyak waktu dan tenaga dalam pengembangannya. Ada dua strategi umum yang digunakan untuk mengakses daerah yang mengandung SSR dan membuat markanya yaitu : (1) penelusuran sekuen yang mengandung SSR
pada database yang telah tersedia atau (2) konstruksi dan
skrining pustaka genom dengan pelacak yang berkaitan
dengan SSR. Cara pertama dinilai sangat hemat, sederhana
dan relatif cepat (RAKOCZY-TROJANOWSKA, 2004). Strategi
ini telah berhasil dikembangkan pada tanaman cabai
(SANWEN et al., 2000) dan buncis (GUERRA-SANZ, 2004).
Marka SSR menarik dikembangkan khususnya pada spesies
yang menunjukkan variasi genetik rendah, pada populasi
inbred dan populasi yang diperoleh dari daerah-daerah
berdekatan sehingga sulit dipilah-pilah dengan pendekatan
lain (RÖDER et al., 1995). Keuntungan SSR secara alami
adalah : (i) multipel alel SSR dapat dideteksi pada lokus
tunggal menggunakan penapisan berbasis PCR, (ii) SSR
biasanya terdistribusi pada seluruh genom, (iii) sifatnya kodominan, (iv) jumlah DNA yang dibutuhkan hanya sedikit,
dan (v) analisis dapat dilakukan secara semi otomatis
(ROBINSON et al., 2004).
Jarak pagar di Indonesia berpotensi besar sebagai
penghasil bahan bakar nabati sehingga perlu dilakukan
penelitian untuk mengoptimalkan keberadaan plasma nutfah tersebut untuk kepentingan pemuliaan tanaman. Sampai
saat ini belum ada penelitian yang memanfaatkan marka
SSR untuk evaluasi keragaman genetik jarak pagar
Indonesia. Penelitian ini dilakukan untuk mengawali
langkah-langkah pemuliaan tanaman pada jarak pagar
dengan basis marka SSR.
Tujuan penelitian ini adalah adalah untuk: (i)
merancang primer spesifik SSR menggunakan aksesi DNA
jarak pagar yang tersedia di GenBank DNA database dan
(ii) mengevaluasi efektivitas pasangan primer yang dirancang untuk menghasilkan marka SSR yang polimorfik
untuk jarak pagar dan J. multifida L. Marka-marka SSR
yang ditemukan pada penelitian ini diharapkan dapat
memberikan sumbangan bagi percepatan kegiatan pemuliaan tanaman jarak pagar untuk mendapatkan varietas
unggul baru.
BAHAN DAN METODE
Analisis molekuler dan penelusuran serta analisis
menggunakan perangkat lunak online dilakukan di
Laboratorium Biologi Molekuler Tanaman (PMB Lab.),
Departemen Agronomi dan Hortikultura, Fakultas
Pertanian, IPB. Penelitian dilakukan dari bulan Mei sampai
dengan November 2008.
Bahan tanaman untuk percobaan berasal dari Kebun
Induk Jarak Pagar (KIJP) Pakuwon, Sukabumi yang terdiri
atas lima aksesi jarak pagar dari berbagai daerah yang
berbeda dan dua individu J. multifida dari Bogor dan
Sukabumi. Aksesi J. multifida digunakan untuk mengevaluasi peluang penggunaan primer yang dievaluasi pada
spesies Jatropha yang masih sekerabat dengan jarak pagar.
Ekstraksi DNA
Ekstraksi DNA pertama kali dilakukan dengan
metode CTAB standar yang dikembangkan oleh DOYLE dan
DOYLE (1990) dan digunakan untuk ekstraksi jarak pagar
oleh BASHA dan SUJATHA (2007). Modifikasi dilakukan
dengan meningkatkan konsentrasi NaCl pada buffer
ekstraksi dari 1,4 M menjadi 3,5 M dan menambahkan
NaCl hingga konsentrasi 2 M pada saat presipitasi
bersamaan dengan penambahan isopropanol sesuai dengan
metode yang dikembangkan oleh PAMIDIMARRI et al.
(2009). Metode modifikasi selengkapnya diuraikan sebagai
berikut. Sebanyak 0,1 g daun muda (daun berwarna
keunguan, sedikit transparan dengan lebar sekitar 2-3 cm)
dari tanaman sampel yang ditumbuhkan di lapangan,
digerus dengan 500 µL buffer ekstraksi (CTAB 2%, 100
mM Tris HCl pH 8, 3,5 M NaCl) dan 1% polyvinylpolypyrolydone (PVP). Ekstrak daun kemudian dipindahkan ke
dalam tabung mikro berukuran 2.000 µL, ditambahkan
1,5% β-merkaptoetanol, dan diinkubasi pada suhu 65oC
selama 90 menit. Setelah inkubasi ditambahkan kloroform :
isoamil alkohol (24:1) dengan volume sebanding dan
digoyang-goyang perlahan selama 10 menit.
Campuran disentrifugasi 8.000 rpm selama 8 menit
pada suhu ruang. Fase cair bagian atas dipindahkan ke
tabung yang baru dan ditambahkan 2M NaCl dengan volume sebanding. Ke dalam campuran tersebut ditambahkan
isopropanol sebanyak 0,6 kali volume akhir dan diinkubasi
pada suhu ruang selama 60 menit. Alkohol 80% sebanyak
2x dari volume akhir ditambahkan pada campuran tersebut
dan diinkubasi selama 10 menit pada suhu ruang. Selanjutnya campuran disentrifugasi 10.000 rpm selama 15 menit
pada suhu ruang. Pelet dicuci dengan alkohol 70% kemudian dikeringkan dan dilarutkan pada 200 µL buffer TE.
141
JURNAL LITTRI VOL. 17 NO. 4, DESEMBER 2011 : 140 - 149
Tabel 1. Aksesi jarak pagar dan kerabatnya yang digunakan untuk
evaluasi primer SSR yang dikembangkan dalam penelitian.
Table 1. Accessions of Jatropha sp. for evaluation of using developed SSR
primers
Genotip
Asal
Umur berbunga (hari)
Genotype
Collection site
Age of flowering (day)
J. curcas IP-M-3
Jawa Timur
>360
J. curcas SP 6-3
Sulawesi Selatan
274
J. curcas HS 49-2
NTT
91
J. curcas IP -1A-2
NTB
99
J. curcas PT 26-2
Lampung
84
J. multifida # 1
Bogor
-
J. multifida # 2
Sukabumi
-
Keterangan : (-) Tidak dilakukan pengamatan umur berbunga karena tidak
ditanam dari awal
Note
: (-) No observation because the accessions were not planted
from seedlings
Total DNA genomik yang didapat dikuantifikasi
menggunakan spektrofotometer UV (Shimadzu UV - 1800)
pada λ 260 nm dan kemurniannya ditentukan dengan
menghitung nisbah absorban pada λ 260 terhadap 280 nm
sesuai dengan prosedur yang dikembangkan oleh
SAMBROOK et al. (1989). Konsentrasi dan kemurnian DNA
juga dicek dengan perbandingan hasil elektroforesis sampel
DNA dengan standar pada gel agarosa 1%.
Rancangan Primer SSR
Penelusuran aksesi DNA jarak pagar yang ada di
GenBank database dilakukan secara online pada situs
http://www.ncbi.nlm.nih.gov. Setiap aksesi DNA jarak
pagar yang diperoleh dari DNA database, dievaluasi ada
tidaknya runutan nukleotida yang merupakan simple sequence repeat (SSR). Selain itu, agar tidak duplikasi, semua
aksesi dianalisis kesamaan runutan nukleotidanya dengan
multiple alignment (HIGGINS et al., 1996) menggunakan
perangkat lunak online ClustalW yang tersedia di situs
http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html. Selanjutnya, dari aksesi DNA yang unik dan positif teridentifikasi
membawa SSR, dirancang primer spesifik yang mengapit
runutan nukleotida SSR-nya. Rancangan primer SSR dilakukan dengan menggunakan perangkat lunak Primer3
(ROZEN and SKALETSKY, 2000) yang tersedia secara online
pada situs http://frodo.wi.mit.edu/. Primer yang berhasil
dirancang digunakan untuk mengamplifikasi sampel DNA
jarak pagar dan J. multifida.
Amplifikasi DNA dan Separasi Hasil Amplifikasi
DNA yang telah diekstraksi diamplifikasi PCR
menggunakan beberapa primer yang berhasil dirancang.
Volume reaksi amplifikasi PCR yang digunakan adalah 25
142
µL, yang masing-masing terdiri atas 1x buffer reaksi, 0.1
µM dNTPs, 1 unit Real Taq DNA Polymerase (Real
Biotech Corporation) dan 20 ng templat DNA. Reaksi
amplifikasi PCR menggunakan GeneAmp PCR System
2400 (Perkin Elmer) dengan denaturasi awal pada 95oC
selama 5 menit, diikuti dengan 35 siklus yang masingmasing terdiri atas tahapan denaturasi pada suhu 94oC
selama 30 detik. Kemudian diikuti dengan penempelan
primer (primer annealing) pada suhu yang sesuai untuk
masing-masing pasangan primer selama 1 menit dan
pemanjangan primer (primer elongation) pada suhu 72oC
selama 1 menit. Pada akhir reaksi ditambahkan satu siklus
final extension pada suhu 72oC selama 5 menit.
DNA hasil amplifikasi dievaluasi dengan dua sistim
elekktroforesis, yaitu elektroforesis gel agarosa (1%) yang
digunakan untuk konfirmasi keberadaan hasil amplifikasi
dan PAGE (polyacrylamide gel electrophoresis) yang
digunakan untuk skoring alel SSR. Hasil elektroforesis gel
agarosa divisualisasi dengan menggunakan pewarnaan
etidium bromida dan difoto di bawah penyinaran UV
menggunakan UV transluminescent. Elektroforesis dengan
gel akrilamid digunakan untuk memperoleh resolusi yang
lebih baik sehinga komposisi alel SSR yang muncul dapat
diidentifikasi. Analisis menggunakan PAGE (40%
akrilamide/bis-akrilamid, 10% amonium persulfat, 5X
buffer TBE, urea dan TEMED) dilakukan dengan
Dedicated Height Sequencer (Cole-Parmer) menggunakan
buffer TBE 1x pada tegangan konstan 1.100 V selama 3
jam. Volume hasil PCR yang dianalisis adalah 1.8 µL
dengan 60 sampel per gel. Hasil PAGE divisualisasi dengan
pewarnaan menggunakan pewarnaan perak (silver
staining). Marka DNA berukuran kelipatan 100 bp (100 bp
ladder) digunakan untuk membantu menentukan ukuran
potongan DNA hasil amplifikasi PCR.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Ekstraksi DNA
Metode ekstraksi DNA yang digunakan pada penelitian ini dimulai dengan mengacu pada metode CTAB
standar (DOYLE dan DOYLE, 1990) yang telah digunakan
untuk jarak pagar (BASHA dan SUJATHA, 2007), yang ternyata sulit dilaksanakan karena tidak berhasil menghilangkan kontaminasi klorofil. Molekul DNA yang berupa
benang-benang putih tidak didapatkan dan muncul endapan
berupa serbuk putih. Selain itu, hasil ekstraksi yang didapat
menggunakan protokol yang digunakan BASHA dan
SUJATHA (2007) sulit dilarutkan dalam buffer TE dan molekul DNA genomik yang didapatkan juga mempunyai
kualitas rendah (Gambar 1A). Sampel DNA juga terlihat
banyak tertinggal pada sumur gel agarosa, yang mengindikasikan tingginya kontaminan protein, polisakarida atau
DARMAWAN SAPTADI et al.: Pengembangan marka simple sequence repeat untuk Jatropha spp.
1
2
3
4
5
6
A
1
2
3
4
5
6
B
Gambar 1. High molecular weight DNA hasil ekstraksi dengan protokol (A) CTAB standar dan (B) Protokol modifikasi. Kolom (1-4) - aksesi J. curcas dan
kolom (5-6) – aksesi J. multifida
Figure 1. High molecular weight DNA extracted using (A) Standard CTAB protocol and (B) Modified protocol. Column (1-4): accessions of J. curcas,
and column (5-6): : accessions of J. multifida
metabolit sekunder pada sampel DNA (DO dan ADAMS,
1991; SHARMA et al., 2002). Jarak pagar dan J. multifida
termasuk dalam famili Euphorbiaceae yang banyak menghasilkan getah sehingga kualitas serta kuantitas DNA yang
kurang bagus dari hasil ekstraksi ini diduga berkaitan
dengan keberadaan kontaminan tersebut. Berdasarkan penelusuran pustaka (PAMIDIMARRI et al., 2009) diperoleh
metode modifikasi untuk ekstraksi DNA tanaman yang
mengandung banyak protein dan polisakarida yaitu dengan
meningkatkan konsentrasi NaCl pada buffer ekstraksi dan
penambahan NaCl konsentrasi tinggi pada saat presipitasi.
Modifikasi dalam prosedur isolasi DNA ini telah diterapkan, yaitu dengan meningkatkan konsentrasi NaCl pada
buffer ekstraksi dari 1,4 M menjadi 3,5 M dan menambahkan NaCl hingga konsentrasi 2 M pada saat presipitasi
bersamaan dengan penambahan isopropanol. Dengan modifikasi di berbagai tahapan isolasi DNA tersebut, terbukti
dapat dihasilkan kualitas dan kuantitas DNA yang baik
(Gambar 1B). Berbagai modifikasi tahapan isolasi DNA
yang digunakan tersebut masih belum sepenuhnya dapat
menghilangkan kontaminan yang terbawa selama proses
ekstraksi DNA. Namun demikian, kualitas DNA yang
didapat sudah memadai untuk keperluan amplifikasi PCR.
Kuantitas DNA yang diperoleh berkisar antara 100-150
ng/µL.
Rancangan Primer SSR
Rancangan primer SSR dimulai dengan penelusuran
di database untuk aksesi DNA jarak pagar, yang tersedia
secara online di situs http://www.ncbi.nlm.nih.gov. Kata
kunci umum yaitu Jatropha curcas digunakan untuk
penelusuran awal.
Dengan kata kunci Jatropha curcas dihasilkan
luaran hasil pencarian sebanyak 157 aksesi, yang merupakan aksesi cDNA dan fragmen DNA genomik asal jarak
pagar serta DNA lain-lain. Keluaran yang diperoleh ternyata masih bersifat umum dan tidak semua merupakan aksesi
DNA asal jarak pagar. Pada tahapan berikutnya, kata kunci
yang digunakan dipersempit, yaitu dengan kata kunci
Jatropha curcas + microsatellite. Dari pencarian tersebut
berhasil didapatkan 39 aksesi DNA. Dari jumlah luaran
pencarian dengan kata kunci Jatropha curcas + microsatellite yang hanya menghasilkan 39 aksesi DNA, mengindikasikan sedikitnya penelitian tentang jarak pagar khususnya yang berkaitan dengan marka SSR. Aksesi DNA
yang diperoleh dari penelusuran selanjutnya dievaluasi dan
yang tidak teridentifikasi mempunyai SSR tidak digunakan
lebih lanjut. Aksesi-aksesi yang memiliki sekuen SSR
digunakan untuk merancang pasangan primer SSR. Beberapa aksesi DNA yang ada terlalu pendek atau posisi SSRnya ada di ujung potongan DNA sehingga tidak dapat digunakan untuk merancang primer.
Aksesi DNA yang didapat dievaluasi kemiripannya
dengan aksesi yang lain yang dilakukan secara online
dengan perangkat lunak ClustalW (HIGGINS et al., 1996).
Beberapa aksesi yang tingkat kemiripan runutan DNA-nya
tinggi hanya dipilih satu sebagai representasi kelompoknya
agar tidak terjadi duplikasi lokus yang diamplifikasi. Pemilihan pasangan primer yang akan dievaluasi juga mempertimbangkan kesesuaian melting point antara pasangan
primer forward dan reverse-nya, yaitu dipilih yang melting
point-nya sama atau paling berdekatan (DIEFFENBACH et al.,
1993). Setelah semua faktor yang diperlukan dijadikan
pertimbangan, 28 pasang primer SSR spesifik telah terpilih
sebagai hasil akhir kegiatan (Tabel 2).
143
JURNAL LITTRI VOL. 17 NO. 4, DESEMBER 2011 : 140 - 149
Tabel 2. Daftar 28 pasang primer spesifik untuk mengamplifikasi SSR yang dirancang menggunakan aksesi DNA jarak pagar dari GenBank DNA Database
Table 2. List of 28 pairs of SSR specific primer designed based on available physic nut DNA accessions in the GenBank DNA database and used for PCR amplification.
No
No
No aksesi
Acc. No
1
EU586348
2
EU586340
3
EU586346
4
EU586347
5
EU586343
6
EU586344
7
EU586345
8
EF612741
9
EF612739
10
EU099518
11
EU099519
12
EU099520
13
EU099521
14
EU099522
15
EU099523
16
EU099524
17
EU099525
18
EU099526
19
EU099527
20
EU099528
21
EU099529
22
EU099530
23
EU099531
24
EU099533
25
AF469003
26
EU586351
27
EU586349
28
EU099534
Sekuen primer
Primer sequence
F
R
F
R
F
R
F
R
F
R
F
R
F
R
F
R
F
R
F
R
F
R
F
R
F
R
F
R
F
R
F
R
F
R
F
R
F
R
F
R
F
R
F
R
F
R
F
R
F
R
F
R
F
R
F
GGGCTGGGATTTTGTCTCTT
GGCATGACCCTTGTGACTCT
GAAAAGGTAAAGCATGGCTGA
TGTTCAGAAATGGATAGGGAAGA
GGTGCTACTGTCGGATGGTT
TGAATCCTGGAATGGGGATA
GAAAAGGTAAAGCATGGCTGA
TGTTCAGAAATGGATAGGGAAGA
CATGAAGTTTGCTGGCAATG
AAAGGTCATCTGGTAAAGCCATA
ATCTTGATGGGTGATGAGACG
TCCACAACCACAACCTTTGA
AAAAATTGAGGATATTACAGCATGAA
GGCAACATGCCTAAAAATCAA
GGCATTTCCTTGCATTTTCA
CTGAGCAAACGGGGAAGTAA
GGCATTTCCTTGCATTTTCA
GAAGGGCAGAGGCTTCACTA
CTCATGAACAACAAGAATTT
CAGATTCTAATGAAGGTACG
TTTTTCTTGAAAGTTTTTGT
TAGTTCGTCTTGAAGCTTAG
AACTGTAACGTTGTGAGTTC
CTGATTTCTGGTCTCAATAG
TAAAATGCCAACTTTTACT
ACATATCGAAGATAGGGAAT
CAAATAGATTCCTCAATCC
GGGACCCAAAGAAACAAT
GTCGGATGACTAGATTGATA
AGAGATATTGGGCTAAAACT
ATTCATGTACCAGTCAAGTC
TGCTAAAACTCTGGTTCTCT
AACTAGAAAGGTTGTTTTTC
TTATGTCTCTTTTCCATGTC
GTATATGTGGTCAAGCATTT
AAAACAGCATAATACGACTC
CTAAAGCCACTTTATCAATC
TAACCGAATAGTTCTTACCA
CAAGCATAGATGTAGAAAAAC
TTATGTCTCTTTTCCATGTC
CTTTATAAGGTCAACTCCAA
CAAGTAAGAAGTGAAGAAAAA
CTAAAATGATTCGAGTTTTC
TGACTTTTTCTGAGTTCTGT
TGCTAAAACTATGGTTCTCT
ATTCATGTACCAGTCAAGTC
ATTGAAGAAGTGGAGTGTG
TCATCTAAAATGCTCTGGT
CATCTTATGAAACTGTCGTT
TACTTACAAAGAAAGCGAGA
TAGAAGTTTTGTGATTAGGT
GACTGCGTACCAATTCAT
CAAAATAAGTCGAAACAAAC
TATAGGCTCTTGCATAAATC
AGAAGAAAGAGGCGACAGGA
R
AAATTCTTGTTGTTCATGAGGATG
Keterangan : F = primer forward, R = primer reverse, Ta = annealing temperature
Note
144
Produk PCR (bp)
Amplified product (bp)
Ta (oC)
Pola ulangan
Repeat pattern
246
55
(GT)12(AG)23
252
54
(TG)6..(TG)4
193
55
(TG)4..(TG)4
252
54
(GT)3..(TG)2.(GT)3
129
54
GT(4)..(GA)5
218
54
(TG)3..(TA)4
193
54
(TG)4..(TG)2..(GT)3..(GT)4
489
55
(TAA)10..(A)8
620
54
(TAA)10..(A)8
137
55
(TA)3(TG)18..(TA)6
104
44
(CA)21
106
44
(CA)10
149
44
(TA)3(C)6..(C)7(A)3(CA)5
122
44
(TC)16
128
44
(GT)11
109
44
(C)6..(C)5(AC)5
104
44
(AC)10
146
44
(CA)18
139
44
(CA)12..(CA)2..(CA)3
145
44
(TA)5(CA)2..(CA)17
113
44
(CTT)4..(CTT)3..(CTT)2
150
44
(CA)13
109
44
(G)3(GT)5(G)5..(G)6
120
45
(GT)15
145
45
(TAA)8
105
44
(GT)5
143
44
(A)6..(A)8..(CA)4
150
54
(GAA)7
DARMAWAN SAPTADI et al.: Pengembangan marka simple sequence repeat untuk Jatropha spp.
Semua aksesi yang digunakan untuk merancang
primer SSR berasal dari DNA genom jarak pagar, yang
terdiri atas 25 aksesi mikrosatelit dengan panjang antara
129-415 bp. Dua aksesi merupakan bagian dari promoter
gen ribosom inactivating protein (489 bp [EF612741] dan
620 bp [EF612739] dan satu aksesi merupakan gen
prekursor kursin dengan panjang 1.802 bp (AF469003).
Berdasarkan runutan nukleotida aksesi DNA yang digunakan, pola ulangan mikrosatelit yang ditemukan adalah
dinukleotida tunggal TG (6 aksesi), CA (5 aksesi), GT (3
aksesi), dan TC (1 aksesi), trinukleotida tunggal CTT, GAA
atau TAA (masing-masing satu aksesi) atau pola ulangan
kombinasi antara dua dinukleotida (GT-AG, TA-TG, TACA), dinukleotida dan mononukleotida (TA-CA-C-A, ACC, GT-G, CA-A) serta trinukleotida dan mono-nukleotida
(TAA-A). Panjang primer hasil rancangan berkisar antara
18-26 bp. Suhu penempelan primer (primer annealing)
bervariasi antara 44, 45, 54, atau 55oC.
Pengujian pasangan primer spesifik SSR yang didapat untuk melakukan amplifikasi PCR menggunakan templat DNA jarak pagar, mengindikasikan bahwa semua
pasangan primer mampu menghasilkan produk amplifikasi.
Ini paling tidak mengindikasikan dua hal, yaitu bahwa kualitas dan kuantitas DNA yang diekstraksi cukup memadai
untuk digunakan sebagai templat dan pasangan primer hasil
rancangan yang dilakukan mampu menghasilkan produk
amplifikasi PCR. Representasi produk PCR yang didapat
dengan menggunakan pasangan primer yang dievaluasi
dalam penelitian ini disajikan pada Gambar 2.
Hasil pemisahan ukuran produk amplifikasi dengan
PAGE menunjukkan bahwa 28 pasangan primer yang dievaluasi menghasilkan produk amplifikasi dengan templat
DNA genomik jarak pagar dan hanya 19 pasangan primer
1
2
3
4
yang menghasilkan produk amplifikasi dengan templat
DNA genomik J. multifida. Jumlah pita DNA hasil amplifikasi PCR yang muncul sebagian besar terdiri atas satu
atau dua pita (Gambar 3).
Hasil running PAGE menunjukkan bahwa dari 19
pasang primer yang digunakan dapat menghasilkan 44 alel
dimana 35 di antaranya (0,8%) merupakan alel polimorfik
dengan ukuran produk amplifikasi berkisar antara 100-360
bp. Polimorfisme hanya terjadi antar alel-alel pada J.
curcas dengan dengan alel-alel J. multifida. Sebaliknya,
antar lima aksesi jarak pagar yang dievaluasi menunjukkan
pola pita yang sama. Kesamaan pola pita DNA hasil
amplifikasi juga diamati untuk kedua aksesi J. multifida
yang diuji. Polimorfisme antara alel-alel yang muncul di
antara aksesi J. curcas dengan yang muncul di antara aksesi
J. multifida dapat berupa perbedaan ukuran pita DNA hasil
amplifikasi atau berupa adanya hasil amplifikasi untuk
aksesi jarak pagar dan tidak ada hasil amplifikasi (null
allele) untuk aksesi J. multifida (Tabel 3; Gambar 3).
Terdapat 17 pasang primer menunjukkan polimorfisme antara aksesi jarak pagar dengan aksesi J. multifida.
Dari 17 pasang primer tersebut, 7 pasang primer menghasilkan produk amplifikasi dengan perbedaan ukuran pita
DNA, sedangkan 10 pasang primer yang lain mampu
menghasilkan produk amplifikasi dari genom jarak pagar
tetapi tidak menghasilkan produk amplifikasi dari genom J.
multifida (Tabel 3; Gambar 3).
Kemunculan dua pita pada aksesi tanaman jarak
pagar (Gambar 3) dapat diartikan bahwa pada genom tanamannya terdapat satu lokus (misalnya lokus EU586347)
dan dalam lokus EU586347 yang dianalisis terdapat dua
alel. Dengan demikian, konstitusi genetik aksesi yang
5
6
7
8
9
Gambar 2. Elektroferogram hasil evaluasi produk amplifikasi PCR dengan menggunakan elektroforesis gel agarosa. Pewarnaan gel agarosa dilakukan
dengan ethidium bromide dan foto gel diambil di bawah pencahayaan sinar UV. Hasil amplifikasi PCR dengan menggunakan templat genom
jarak pagar dan pasangan primer (1) EF612741, (2) EU586345, (3) EF612739, (4) EU586340, (5) EU586343, (6) EU586344, (7) EU586346, (8)
EU586347, dan (9) EU586348
Figure 2. Electropherogram of amplified PCR products fractionated on agarose gel and stained with ethidium bromide for visualization. Photograph was
taken under UV light. Amplified PCR products were obtained using physic nut genome as template and pair of primers (1) EF612741, (2)
EU586345, (3) EF612739, (4) EU586340, (5) EU586343, (6) EU586344, (7) EU586346, (8) EU586347, and (9) EU586348
145
JURNAL LITTRI VOL. 17 NO. 4, DESEMBER 2011 : 140 - 149
M
EU586347
1
2
3
4
M
EU099522
5
6
7
1
2
3
4
EU586344
5
6
EU586340
1
2
3
4
5
7
1
2
3
4
5
6
7
EU586348
6
7
1
2
3
4
5
6
7
Gambar 3. Representasi elektroferogram pemisahan hasil amplifikasi PCR dengan menggunakan poliakrilamid gel elektroforesis (PAGE) untuk lima aksesi
tanaman jarak pagar dan dua aksesi J. multifida dengan menggunakan lima primer spesifik SSR. M: Marka DNA (100 bp ladder), Aksesi
tanaman: (1) J. multifida # 2, (2) J. multifida # 1, (3) J. curcas PT 26-2, (4) IP -1A-2, (5) HS 49-2, (6) SP 6-3, dan (7) IP-M-3.
Figure 3. Representative of amplified PCR products of five Jatropha curcas and two J. multifida accessions using five SSR specific primers, and
fractionated using poly acrylamide gel electrophoresis (PAGE). M: DNA marker (100 bp ladder), (1) J. multifida accession # 2, (2) J. multifida #
1, (3) J. curcas PT 26-2, (4) J. curcas IP -1A-2, (5) J. curcas HS 49-2, (6) J. curcas SP 6-3, and (7) J. curcas IP-M-3.
dianalisis bersifat heterosigot (misalnya dengan pasangan
alel 12), mengingat bahwa SSR adalah marka ko-dominan
(ROBINSON et al., 2004) yang mampu membedakan individu heterosigot (12) dari yang homosigot (11 atau 22).
Sebagai alternatif, kemunculan dua pita pada aksesi tanaman jarak pagar yang diuji juga dapat mengindikasikan
kemungkinan adanya lebih dari satu lokus di dalam genom
tanaman (duplikasi) dan masing-masing lokusnya mempunyai konstitusi alel dalam kondisi homosigot (misalnya
lokus EU586347-1 dengan alel 11 dan lokus EU586347-2
dengan alel 22). Pembuktian terhadap dua kemungkinan ini
dapat dilakukan dengan mengevaluasi segregasi pita DNA
hasil amplifikasi PCR dengan menggunakan primer terpilih
pada populasi tanaman jarak pagar F1.
Jika dua pita yang dihasilkan merupakan alternatif
alel dalam satu lokus yang sama (misal lokus EU586347
dengan pasangan alel 12), maka pada populasi tanaman
jarak pagar F1 diharapkan terjadi segregasi tanaman F1
dengan konstitusi alel pada lokus EU586347 sebagai 11
(homosigot, proporsi 25%), sebagai 12 (heterosigot,
proporsi 50%) dan sebagai 22 (homosigot, proporsi 25%).
Sebaliknya, jika dua pita tersebut merupakan representasi
dari dua lokus (lokus EU586347-1 dan lokus EU586347-2)
146
dan konstitusi alel untuk kedua lokus tersebut homosigot
(lokus EU586347-1 dengan alel 11 dan lokus EU586347-2
dengan alel 22) maka semua individu F1 yang dievaluasi
akan mempunyai produk amplifikasi dengan dua pita yang
sama sebagaimana tetua yang digunakan untuk menghasilkan tanaman F1.
Dari hasil analisis, yang dilakukan terhadap 16 individu F1 hasil persilangan dua tetua yang telah dilakukan,
mengindikasikan bahwa dua pita yang sama yang muncul
pada tetua juga dijumpai pada aksesi jarak pagar F 1 hasil
persilangan antar tetuanya. Di antara 16 individu F1 yang
diuji, tidak diamati adanya segregasi antara kedua pita
DNA hasil amplifikasi. Dengan demikian, kemungkinan
yang ada mengindikasikan bahwa dua pita yang didapatkan
dari hasil amplifikasi PCR menggunakan pasangan primer
spesifik PCR tersebut merupakan dua lokus yang berbeda
(duplikat lokus) dengan alel yang homosigot. Representasi
hasil amplifikasi PCR menggunakan tujuh pasang primer
dan templat empat individu F1 dapat dilihat pada Gambar 4.
Berdasarkan hasil evaluasi, pasangan primer spesifik
SSR yang dirancang dalam penelitian ini tidak polimorfik
untuk sejumlah aksesi tanaman jarak pagar yang dievaluasi.
Deteksi tingkat polimorfisme yang rendah menggunakan
DARMAWAN SAPTADI et al.: Pengembangan marka simple sequence repeat untuk Jatropha spp.
A
1
2
3
4
B
5
6
7
1
2
3
4
C
5
6
7
1
2
3
4
D
5 6
7
1
2
3
4
5
6 7
Gambar 4. Representasi elektroferogram pemisahan hasil amplifikasi PCR dengan menggunakan poliakrilamid gel elektroforesis (PAGE) untuk empat
individu tanaman jarak pagar F1 (A-D), dengan menggunakan pasangan primer (1) EU586345, (2) EU586343, (3) EF612741, (4) EU586347,
(5) EF612739, (6) EU586346, dan (7) EU586340
Figure 4. Representative of amplified PCR products of four F1 intra specific hybrids of Jatropha curcas (A-D) using seven SSR specific primers,
respectively. Amplification of SSR markers were carried out using (1) EU586345, (2) EU586343, (3) EF612741, (4) EU586347, (5) EF612739,
(6) EU586346, and (7) EU586340 - primer pairs
Tabel 3. Konstitusi genetik berdasarkan hasil skoring alel marker SSR yang diamplifikasi dari templat lima aksesi J. curcas dan dua aksesi J. multifida
dengan menggunakan 19 pasangan primer SSR yang dirancang dalam penelitian.
Table 3. Genotype of five Jatropha curcas and two J. multifida accessions based on SSR marker scorings. Amplification of SSR marker was carried out
using 19 primer pairs designed in this research.
Aksesi J. curcas
Aksesi J. multifida
Kode Pasangan Primer
J. curcas accessions
J. multifida accessions
Pairs of primer code
IP-M-3
SP 6-3
HS 49-2
IP-1A-2
PT 26-2
#1
#2
EU586348
13
13
13
13
13
24
24
EU586340
13
13
13
13
13
12
12
EU586346
12
12
12
12
12
12
12
EU586347
13
13
13
13
13
12
12
EU586343
12
12
12
12
12
22
22
EU586344
22
22
22
22
22
11
11
EF612741
12
12
12
12
12
12
12
EU099521
12
12
12
12
12
11
11
EU099522
12
12
12
12
12
-
-
EU099523
11
11
11
11
11
22
22
EU099524
12
12
12
12
12
-
-
EU099526
11
11
11
11
11
-
-
EU099529
11
11
11
11
11
-
-
EU099530
12
12
12
12
12
-
-
EU099531
11
11
11
11
11
22
22
EU099533
14
14
14
14
14
23
23
EU586351
13
13
13
13
13
22
22
EU586349
33
33
33
33
33
12
12
EU099534
12
12
12
12
12
11
11
Keterangan : (-) null alele, pasangan primer SSR yang digunakan tidak menghasilkan produk amplifikasi dengan tempat DNA J. multifida. Individu
dengan konstitusi genetik yang direpresentasikan oleh dua angka yang sama (contoh: 11, 22, atau 33) berarti homosigot untuk masingmasing alel sedangkan jika dua angka yang berbeda (contoh: 12, 13, 14, 23, dan 24) diduga berarti heterosigot
Note
: (-) null alele, the tested SSR primers produce no PCR amplification product using J. multifida DNA template. Individual genotype represented
by the same number (e.g. 11, 22, or 33) was homozygote for the locus and that represented by different number (e.g. 12, 13, 14, 23, and 24)
was each heterozygote.
147
JURNAL LITTRI VOL. 17 NO. 4, DESEMBER 2011 : 140 - 149
pasangan primer yang dikembangkan dapat menjadi
indikator bahwa rendahnya tingkat keragaman genetik
tanaman yang diuji atau tingginya tingkat konservasi bagian
genom yang digunakan untuk merancang primer.
Polimorfisme yang rendah bisa terjadi sebagai akibat
melakukan sampling bagian genom dengan tingkat konservasi runutan DNA yang tinggi. Akibat tingginya tingkat
konservasi bagian genom yang diamplifikasi dengan primer
spesifik SSR, meskipun aksesi yang dievaluasi mempunyai
keragaman genetik yang tinggi maka akan tetap menghasilkan produk amplifikasi yang monomorfis untuk semua
aksesi jarak pagar yang dievaluasi.
Salah satu keuntungan penggunaan marka SSR
adalah sifatnya yang diamplifikasi menggunakan templat
tanaman sekerabat (ROSSETTO et al., 1999). Pasangan
primer yang dirancang dalam penelitian ternyata mampu
menghasilkan produk amplifikasi yang polimorfis untuk
jarak pagar dengan J. multifida. Dengan demikian, pasangan primer tersebut paling tidak akan dapat digunakan untuk
identifikasi hasil persilangan F1 inter-spesies antara J.
curcas x J. multifida (DHILLON et al., 2009). Evaluasi lebih
lanjut pemanfaatan primer spesifik SSR yang telah
dikembangkan untuk menganalisis lebih banyak aksesi J.
curcas, aksesi J. multifida, dan aksesi Jatropha spp. lainnya
masih perlu dilakukan untuk mengetahui efektivitas pemanfaatan primer spesifik SSR yang telah dikembangkan.
KESIMPULAN
DNA jarak pagar dapat terekstraksi dengan baik
menggunakan protokol CTAB yang dimodifikasi yaitu
dengan penambahan konsentrasi NaCl pada buffer ekstraksi
dan pada saat presipitasi. Dua puluh delapan pasang primer
spesifik SSR telah berhasil dirancang menggunakan aksesi
DNA genomik asal jarak pagar yang ditemukan pada basis
data GenBank DNA. DNA genomik asal jarak pagar dan J.
multifida dapat digunakan dengan efektif sebagai templat
untuk amplifikasi PCR. Primer yang dirancang dalam penelitian tidak menghasilkan pita hasil amplifikasi yang polimorfik antar aksesi jarak pagar yang diuji atau antar aksesi
J. multifida. Marker SSR yang dihasilkan bersifat polimorfik untuk aksesi jarak pagar dengan aksesi J. multifida
sehingga dapat digunakan sebagai marka untuk mendeteksi
hasil persilangan F1 inter-spesies J. curcas x J. multifida.
UCAPAN TERIMA KASIH
Terima kasih kami sampaikan kepada Badan
Penelitian dan Pengembangan Pertanian, Kementerian
Pertanian Republik Indonesia yang telah mendanai
sebagian penelitian ini melalui Proyek Kerjasama
148
Kemitraan Penelitian Pertanian dengan Perguruan Tinggi
(KKP3T) dengan judul: Karakterisasi Morfologis dan
Molekuler serta Penerapan Pemuliaan Tanaman untuk
Pengembangan Kultivar Unggul Baru Jarak Pagar
(Jatropha curcas L.) Berdaya Hasil Tinggi, No. kontrak
758/LB.620/I.1/3/2008 yang dikoor-dinasikan oleh Dr. Ir.
Asep Setiawan, M.Sc.
DAFTAR PUSTAKA
BASHA, S.D.
dan M. SUJATHA. 2007. Inter and intrapopulation variability of Jatropha curcas (L.)
characterized by RAPD and ISSR markers and
development of population-specific SCAR markers.
Euphytica. 156:375–386
DHILLON, R.S., M.S. HOODA, M. JATTAN, V. CHAWLA, M.
BHARWAJ, and S.C. GOYAL. 2009. Development and
molecular characterization of interspecifis hybrids of
Jatropha curcas x J. integerrima. Indian Journal of
Biotechnology. 8:384-390
DIVAKARA, B.N., H.D. UPADHYAYA, S.P. WANI, and C.L.
LAXMIPATHI GOWDA 2010. Biology and genetic
improvement of Jatropha curcas L.: A review.
Applied Energy. 87:732-742
DO, N. and R.P. ADAMS. 1991. A simple technique of
removing plants polysaccharides contaminants from
DNA. Biotechniques. 10:162-166
DOYLE, J.J. and J.L. DOYLE. 1990. Isolation of plant DNA
from fresh tissue. Focus. 12:13–15
FAIRLESS, D. 2007. Biofuel: The little shrub that could
maybe. Nature. 449:652-655
GUERRA-SANZ, J.M. 2004. New SSR markers of Phaseolus
vulgaris from sequence databases. Plant Breeding.
123: 87-89
HELLER, J. 1996. Physic nut Jatropha curcas L. Promoting
the conservation and use of under utilized and
neglected crops. International Plant Genetic
Resources Institute. Rome
HIGGINS, D.G., J.D. THOMPSON, and T.J. GIBSON . 1996. Using
CLUSTAL for multiple sequence alignments.
Methods Enzymol. 266:383-402
KAUSHIK, N., K. KUMAR, S. KUMAR, and S. ROY. 2007. Genetic
variability and divergence studies in seed traits and
oil content of Jatropha (Jatropha curcas L.)
accession. Biomass and Bioenergy. 31:497-502.
MAKKAR, H.P.S., K. BECKER, F. SPORER, and M. WINK. 1997.
Studies on nutritive potential and toxic constituents
of different provenances of Jatropha curcas. J.
Agric. Food Chem. 45:3152-3157.
OU, W.J., W.Q. WANG, and K.M. LI. 2009. Molecular genetic
diversity analysis of 120 accessions Jatropha curcas
L. germplasm. Chinese Journal of Tropical Crops.
30:287-292.
PAMIDIMARRI , D.V.N.S., MEENAKSHI, R. SARKAR, G. BORICHA,
and M.P. REDDY. 2009. A simplified method for
DARMAWAN SAPTADI et al.: Pengembangan marka simple sequence repeat untuk Jatropha spp.
extraction of high quality genomic DNA from
Jatropha curcas for genetic diversity and molecular
marker studies. Indian Journal of Biotechnology.
8:187-192.
RAKOCZY-TROJANOWSKA, M. 2004. Characteristics and a
comparison of three classes of microsatellite-based
markers and their application in plants. Cellular &
Molecular Biology Letters 9:221 - 238.
ROBINSON, A.J., C.G. LOVE, J. BATLEY, G. BARKER, and D.
EDWARDS. 2004. Simple sequence repeat marker loci
discovery using SSR primer. Bioinformatics
Application Note. 20(9): 1475-1476.
RÖDER, M.S., J. PLASCHKE, U. KÖNIG, A. BÖRNER, M.
SORRELLS, S.D. TANKSLEY, and M.W. GANAL. 1995.
Abundance, variability, and chromosomal location
of microsatellites in wheat. Mol. Gen. Genet. 246:
327-333.
ROSSETTO, M., M. SHEPHERD, G.M. CORDEIRO, F.C.L. HARRISS,
L.S. LEE, and R.J. HENRY. 1999. Cross species
amplification of microsatellite loci: a valuable tool
for genetic studies in plants. Paper presented to the
Plant and Animal Genome VII Conference, San
Diego, California, USA, 17-21 January 1999.
ROZEN, S.
and H.J. SKALETSKY. 2000. Primer3 on the WWW
for general users and for biologist programmers. In:
Krawetz, S. and S. Misener (eds). Bioinformatics
Methods and Protocols: Methods in Molecular
Biology. Humana Press, Totowa, NJ, pp 365-386.
SAMBROOK, J., E.F. FRITSCH, and T. MANIATIS. 1989.
Molecular cloning: A laboratory manual. Cold
Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring
Harbor, New York, USA
SANWEN, H., Z. BAOXI, D. MILBOURNE, L. CARDLE, Y. GUIMEI,
and G. JIAZHEN. 2000. Development of pepper SSR
markers from
117:163-167.
sequence
databases.
Euphytica.
and P. SINGH. 2002. DNA isolation
from dry and fresh samples of polysaccharides-rich
plants. Plant Mol Biol Rep. 20: 415 a-f.
TATIKONDA, L., W.P. SUHAS, and K. SEETHA. 2009. AFLPbased molecular characterization of an elite
germplasm collection of Jatropha curcas L. a
biofuel plant. Plant Science. 176:505-513.
SHARMA, A.D., P.K. GILL,
149