Bab III.Metode Penelitian 2009nkh1

METODE PENELITIAN
Waktu dan Tempat
Penelitian dilaksanakan pada bulan Februari sampai dengan September
2008 di Bagian Biosistematika dan Ekologi Hewan Departemen Biologi, FMIPA,
IPB.
Bahan
Sampel
Sampel yang digunakan dalam penelitian ini berupa darah sapi perah FH.
Jumlah keseluruhan sampel yang digunakan sebanyak 676 berasal dari 12 lokasi
terdiri dari tujuh lokasi dari pusat pembibitan sapi perah pemerintah dan lima
lokasi dari peternakan sapi perah rakyat (Tabel 2). Sampel dari pusat pembibitan
sapi perah pemerintah meliputi: Balai Besar Inseminasi Buatan (BBIB) Singosari
di Jawa Timur, Balai Inseminasi Buatan (BIB) Lembang di Jawa Barat, Balai
Pembibitan Ternak Unggul (BPTU) Baturraden di Jawa Tengah, Balai Embrio
Transfer (BET) Cipelang di Jawa Barat, dan Balai Pengembangan dan Pembibitan
Ternak Sapi Perah (BPPT-SP) Cikole di Jawa Barat.
Sampel dari peternakan sapi perah FH rakyat meliputi: peternakan Fakultas
Peternakan (FAPET) IPB, Koperasi Peternakan Susu Bandung Utara (KPSBU)
Cilumber, KPSBU Pasar Kemis di Jawa Barat, Ngantang di Jawa Timur,
Boyolali di Jawa Tengah, Lembang di Jawa Barat, dan Pondok Rangon di Jakarta.
Sampel-sampel tersebut diambil pada tahun 2008 kecuali sampel dari BPTU
Baturraden, Peternakan Rakyat Pondok Rangon, BIB Lembang dan Peternakan
Rakyat Lembang, dikoleksi berturut-turut pada tahun 2002, 2004, 2006 dan 2007.
Cara pengambilan sampel. Darah diambil dari vena jugularis dan sebagian
dari vena koksigalis. Sebanyak 1 sampai 2 ml darah diambil menggunakan siring
10 ml berukuran 21 G X 1 ½” dan vaccutainer yang berheparin dan tidak
berheparin. Sampel darah yang diambil berupa darah total (sel darah dan plasma
darah) dan koagulan (sel darah) (Tabel 2).
Tabel 2 Sampel darah yang digunakan dalam penelitian
No. Lokasi
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
Tahun
Koleksi
Jenis
kelamin
Jumlah
sampel
2008
2006
2002
2008
2008
♂
♂
♀
♀
♀
32
30
97
57
88
darah total
darah total
sel darah putih
Koagulan
darah total
2008
2008
2008
2008
2008
2007
2004
♀
♀
♀
♀
♀
♀
♀
17
98
95
49
47
34
32
darah total
darah total
darah total
darah total
darah total
darah total
koleksi sampel dalam
bentuk DNA
Pusat Pembibitan:
BBIB Singosari
BIB Lembang
BPTU Baturraden
BET Cipelang
BPPT-SP Cikole
Peternakan Rakyat:
FAPET IPB
KPSBU Cilumber
KPSBU Pasar Kemis
Boyolali
Ngantang
Lembang
Pondok Rangon
Jumlah Total
Tipe sampel
676
Perlakuan awal sampel darah sebelum ekstraksi. Seluruh sampel
koleksi tahun 2008 ditambah etanol absolut sebanyak dua kali volume darah
kecuali sampel dari BET Cipelang dan FAPET IPB. Etanol absolut ditambahkan
dengan cara berangsur-angsur sambil dikocok, sehingga sel-sel darah terselubungi
oleh alkohol dengan tujuan agar darah tidak membusuk.
← Darah yang diambil dari Peternakan FAPET IPB langsung ditambah Ethylene
Diamine Tetraacetic
Acid (EDTA) dan dimasukkan dalam tabung tanpa
heparin. Hal ini dilakukan karena lokasi pengambilan dekat dengan
laboratorium, sehingga dapat segera dilakukan isolasi DNA. Sebelum
ditambah etanol absolut,
sampel ditambah NaCl 0.2% kemudian
disentrifugasi dengan kecepatan 3 500 rpm selama 10 menit. Setelah
supernatan dibuang, dilakukan penambahan etanol absolut sebanyak dua kali
volume darah (konsentrasi etanol tidak kurang dari 50%) kemudian disimpan
pada suhu ruang (Farajallah et al. 1998).
Sampel darah dari BET berupa gumpalan darah yang telah diambil
serumnya. Serum digunakan untuk analisis penyakit oleh pihak BET. Sampel
berupa gumpalan darah tersebut disimpan dalam kotak es untuk penyimpanan
sementara. Sampel ditambah etanol absolut sebanyak dua kali volume darah.
Penambahan etanol dilakukan agar total konsentrasi etanol tidak kurang dari 50%
untuk penyimpanan sampel dalam waktu yang lama.
Penyimpanan
sampel
permanen.
Volume seluruh
sampel darah
diseragamkan kemudian ditambah etanol absolut sebanyak dua kali volume darah,
sehingga total konsentrasi etanol tidak kurang dari 50% (Smith et al. 1987)
kemudian ditambah 1 mM EDTA. Sampel selanjutnya dikocok agar alkohol
tersebar merata di dalam tabung. Sampel kemudian disimpan pada suhu ruang
(25.°C). Penyimpanan darah semacam ini dapat bertahan dalam jangka waktu
yang lama.
Metode
Ekstraksi DNA
Isolasi molekul DNA total menggunakan DNA isolation Mini Kit for fresh
blood (Geneaid). Ada empat tahapan sebagaimana tertera pada manual kit, yaitu:
lisis, pengikatan, pencucian dan pengendapan DNA. Modifikasi dilakukan pada
tahapan lisis DNA. Sampel yang disimpan dalam etanol dicuci sebanyak dua kali
menggunakan air suling untuk membuang etanol sebelum menggunakan kit.
Sebanyak 200 μl sampel darah diambil dan dipindahkan ke dalam tabung 1.5 ml,
kemudian ditambahkan air suling sebanyak 800 μl, selanjutnya disentrifugasi
5.000 rpm selama 10 menit.
Endapan sel yang diperoleh dilarutkan dalam bufer 1x sodium chloride-TrisEDTA (STE) (0.5 M sodium; 0.2 μM Tris-HCl; 0.02 M EDTA; pH 8.0),
kemudian dilisis dengan proteinase-K dan diinkubasi selama 1 jam pada suhu 56
°C (Farajallah et al. 1998). Selain menggunakan proteinase-K, digunakan juga
Sodium Dodecyl Sulfate 1% (SDS), kemudian diinkubasi suhu 70 °C selama 10
menit. Tahapan selanjutnya mulai dari tahapan kedua sampai akhir mengikuti
petunjuk di manual kit.
Sampel Pool DNA
Metode untuk menentukan genotipe gen ASS dan gen UMPS adalah PCR-RFLP.
Sebanyak 676 sampel dipakai untuk mengidentifikasi genotipe gen ASS dan 483
sampel untuk gen UMPS. Setiap 6 sampai 10 sampel DNA hasil ekstraksi dengan
konsentrasi terukur dimasukkan ke dalam satu tabung 1.5 ml. Masing-masing
sampel diambil 10 μl kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 3 500 rpm
selama 1 menit, selanjutnya diinkubasi pada suhu 37 °C selama satu jam.
Kumpulan DNA dalam tabung 1.5 ml ini disebut dengan sampel pool DNA (Sham
et al. 2002). Jika dalam 1 sampel pool DNA diketahui ada alel mutan maka
anggota sampel pool DNA diperiksa satu persatu.
Amplifikasi Gen
Amplifikasi gen ASS dan gen UMPS menggunakan mesin PCR Thermal
Cycler MP4 (TaKaRa). Primer yang digunakan untuk amplifikasi gen ASS adalah
F:GTG TTC ATT GAG GAC ATC, dan R:CCG TGA GAC ACA TAC TTG
(Dennis et al. 1989) dengan suhu penempelan 61 °C. Amplifikasi gen UMPS
menggunakan primer F: GCA AAT GGC TGA AGA ACA TTC TG, dan R: GCT
TCT AAC TGA ACT CCT CGA GT (Schwenger et al. 2006) dengan suhu
penempelan 60–61 °C. Campuran untuk mengamplifikasi gen ASS dan UMPS
terdiri dari 10-100 ng DNA sapi FH, masing-masing primer sebanyak 1 μM,
dNTP mix 120 μM, MgCl2 100 μM dan Taq polymerase RBC 1 unit beserta
bufernya.
Kondisi PCR untuk amplifikasi gen ASS dalam mesin TaKaRa yaitu
pradenaturasi pada suhu 94 °C selama 5 menit yang dilanjutkan dengan 30 siklus
(denaturasi 94 °C selama 1 menit, penempelan primer (annealing) pada suhu 61
°C selama 1 menit, ekstensi DNA pada suhu 68 °C selama 5 detik) dan diakhiri
dengan pemanjangan akhir DNA pada suhu 72 °C selama 7 menit. Kondisi PCR
untuk amplifikasi gen UMPS dengan kondisi PCR untuk amplifikasi gen ASS
secara keseluruhan hampir sama hanya berbeda pada suhu penempelan. Suhu
penempelan yang digunakan untuk amplifikasi gen UMPS dapat berkisar dari
suhu 60 °C sampai dengan 61 °C.
Pemotongan Produk PCR dengan Enzim Restriksi
Pemotongan gen ASS. Produk PCR dipotong dengan enzim Ava II
(Fermentas) yang mampu mengenali alel normal gen ASS (Patel et al. 2006).
Campuran untuk memotong 2 μl produk PCR yaitu: 3 unit enzim Ava II; 0.4 μl
bufer; 0.3 μl air suling steril. Enzim memotong produk pada suhu 37 °C selama
satu malam (± 18 jam) dalam inkubator.
Pemotongan gen UMPS. Produk PCR tunggal dipotong dengan enzim Ava
I (Fermentas) yang mampu mengenali alel normal gen UMPS (Rahimi et al.
2006). Campuran untuk memotong produk PCR gen UMPS mempunyai volume
yang sama dengan campuran yang digunakan untuk memotong produk gen ASS.
Enzim Ava I memotong produk pada suhu 37°C selama 3 jam hingga satu malam
dalam inkubator.
Visualisasi produk PCR
Visualisasi produk PCR dan hasil restriksi dilakukan menggunakan metode
Polyacrylamide Gel Electrophoresis (PAGE) 6% yang dilanjutkan dengan
pewarnaan perak (Tegelström 1986) yang dimodifikasi oleh Farajallah et al.
(1998). Elektroforesis dijalankan pada tegangan 180 mV selama 30 menit dalam
bufer 1x TBE (0.5 M Tris; 0.65 M asam borat; 0.02 M EDTA).
Analisis Data
Frekuensi alel dihitung dengan menggunakan rumus Nei (1987), yaitu:
xi = (2nii + nij)
2n
xi = frekuensi alel Ai
nii = jumlah individu bergenotipe AiAi
nij = jumlah individu bergenotipe AiAj
n = jumlah total individu
HASIL DAN PEMBAHASAN
Faktor yang Berpengaruh dalam Keberhasilan Amplifikasi
Jumlah sampel darah sapi perah FH yang digunakan untuk identifikasi gen
ASS sebanyak 676. Keberhasilan amplifikasi gen ASS sebesar 97.63% (660
sampel). Jumlah sampel yang tidak teramplifikasi pada gen ASS sebanyak 16
(2.37%). Sampel tersebut berasal dari BPTU Baturraden sebanyak sepuluh
(1.48%) koleksi tahun 2002. Enam sampel (0.89%) lainnya berasal dari
peternakan rakyat Pondok Rangon koleksi tahun 2004. Jumlah sampel yang
digunakan untuk identifikasi gen UMPS sebanyak 483. Sampel yang digunakan
untuk identifikasi gen UMPS telah teramplifikasi seluruhnya (100%).
Isolasi DNA merupakan salah satu langkah awal yang mempengaruhi
keberhasilan amplifikasi DNA. Keberhasilan amplifikasi DNA juga ditentukan
oleh konsentrasi DNA sampel, taq polimerase, deoksiribonukleotida trifosfat
(dNTP), ion Mg, dan primer (Sambrook & Russell 2001). Pada penelitian ini,
kemungkinan ada dua faktor yang menyebabkan 16 sampel DNA tidak
teramplifikasi. Kemungkinan yang pertama adalah sampel DNA sering keluarmasuk dari ruang penyimpanan. Sampel yang sering keluar-masuk dari ruang
penyimpanan dapat menyebabkan kerusakan DNA (Dessauer et al. 1996).
Perubahan suhu yang cukup ekstrim dapat menyebabkan fragmen DNA putus.
Perubahan suhu tersebut ditunjukkan oleh perbedaan suhu ruang penyimpanan
(- 20 °C) dengan suhu di luar ruang penyimpanan (± 25 °C). Menurut Viljoen et
al. (2005) salah satu faktor yang mempengaruhi keberhasilan amplifikasi adalah
kualitas dan keutuhan DNA. Kemungkinan yang kedua adalah kontaminasi
sampel oleh NaCl. Konsentrasi NaCl lebih dari 50 mM dalam sampel dapat
menghambat aktivitas taq polimerase dalam proses pengikatan nukleotida baru
(Innis et al. 1988). Taq polimerase mempunyai kemampuan polimerisasi DNA
yang sangat tinggi, tetapi tidak mempunyai aktivitas eksonuklease dari arah 3’ke
arah 5’. Taq polimerase mempunyai pH paling aktif yaitu 9 dan suhu sekitar 75
°C-80 °C. Jika aktivitas taq polimerase terhambat, maka tidak ada proses
pengikatan nukleotida baru pada utas yang sedang disintesis.