ISOLASI DAN SELEKSI KAPANG PENGHASIL ASAM SITRAT

Laporan Praktikum Mikroba dan Potensinya
ISOLASI DAN SELEKSI
KAPANG PENGHASIL ASAM SITRAT
oleh
Kelompok 5:
Khairul Anam P051090031
Maisya Zahra Albanna G351090201
Yonatan Banoet G351090151
Zuraidah G351090141
MAYOR MIKROBIOLOGI
SEKOLAH PASCASARJANA
INTITUT PERTANIAN BOGOR
2010
0 PENDAHULUAN
Latar Belakang
Asam sitrat adalah asam organik yang secara alami terdapat pada buah-buahan
seperti jeruk, nenas dan pear. Asam sitrat pertama kali diekstraksi dan dikristalisasi dari buah
jeruk, sehingga asam sitrat hasil ektraksi dari buah-buahan ini dikenal sebagai asam sitrat
alami.
Wehner (1893) pertama kali melaporkan produksi asam sitrat sebagai hasil sampingan
pada fermentasi produksi asam oksalat dengan menggunakan Penicillium glaucum. Tahun
1917, Currie juga melaporkan bahwa Aspergillus niger dapat menghasilkan asam sitrat pada
medium pH rendah dengan kadar gula tinggi. Sejak saat itu asam sitrat diproduksi secara
komersial dengan menggunakan kapang A. niger.
Dewasa ini telah diketahui banyak jenis kapang yang dapat menghasilkan asam sitrat,
seperti A. niger, A. awamori, A. fonsecaeus, A. luchuensis, A. wentii, A. saitoi, A. flavus, A.
clavatus, A. fumaricus, A. phoenicus, Mucor viriformis, Ustulina vulgaris dll. Selain kapang,
beberapa bakteri dan kamir juga dapat memproduksi asam sitrat, diantaranya :
Brevibacterium, Corynebacterium, Arthrobacter dan Candida.
Kapang A. niger merupakan mikroorganisme yang dapat tumbuh dan banyak
digunakan secara komersial dalam produksi asam sitrat, asam glukonat, dan beberapa enzim
seperti pektinase dan amilase (Broekhuijsen et al. 1993; Okada 1985). A. niger mampu
mensintesis asam sitrat dalam medium fermentasi ekstraseluler dengan konsentrasi yang
cukup tinggi, jika dibiakkan dalam media yang kadar garamnya rendah dan mengandung gula
sebagai sumber karbon (Hang et al. 1977; Ji et al. 1992).
Asam sitrat (C6H8O7) banyak digunakan dalam industri terutama industri makanan,
minuman, dan obat-obatan. Kurang lebih 60% dari total produksi asam sitrat digunakan
dalam industri makanan, dan 30% digunakan dalam industri farmasi, sedangkan sisanya
digunakan dalam industri pemacu rasa, pengawet, pencegah rusaknya rasa dan aroma,
sebagai antioksidan, pengatur pH dan sebagai pemberi kesan rasa dingin. Dalam industri
makanan dan kembang gula, asam sitrat digunakan sebgai pemacu rasa, penginversi sukrosa,
penghasil warna gelap dan penghelat ion logam. Dalam industri farmasi asam sitrat
1 digunakan sebgai pelarut dan pembangkit aroma, sedangkan pada industri kosmetik
digunakan sebagai antioksidan (Bizri & Wahem 1994).
Asam sitrat merupakan senyawa antara pada siklus kreb (siklus asam trikarboksilat).
Lintasan reaksi katabolik yang mendahului pembentukan asam sitrat ini diantaranya adalah
lintasan glikolisis dan lintasan Entner-Doudoroff yang menyediakan senyawa antara asam
piruvat yang merupakan senyawa kunci dalam metabolisme sel. Sebagian besar (80%) dari
glukosa diubah menjadi piruvat melalui lintasan glikolisis. Piruvat akan mengalami
dekarboksilasi dan berikatan dengan koenzim-A membentuk asetil-CoA dan selanjutnya
masuk kedalam siklus krebs untuk bergabung dengan oksaloasetat membentuk asam sitrat.
Piruvat juga bisa langsung masuk ke siklus krebs dengan bantuan enzim piruvat karboksilase
yang mengubah piruvat menjadi oksaloasetat.
Pada A. niger, fosfoenol piruvat dapat diubah langsung menjadi oksaloasetat (tanpa
melalui piruvat) oleh enzim fosfoenol piruvat karboksilase. Reaksi tersebut membutuhkan
ATP sebagai sumber energi, Mg2+, atau Mn2+, dan K+, atau NH4+. Judoamidjojo & Darwis
(1992) menyatakan bahwa apabila sumber karbon bukan glukosa, misalnya asam asetat, atau
senyawa alifatik berantai panjang (C9 – C23), maka isositrat liase akan terinduksi sehingga
isositrat diubah menjadi glioksilat, selanjutnya glioksilat diubah menjadi malat oleh sintetase.
Bila glukosa ditambahkan siklus tersebut akan terhambat.
Asam sitrat merupakan metabolik primer, seperti halnya pertumbuhan mikroba secara
umum, pertumbuhan mikroba dalam fermentasi dibatasi oleh ketersediaan beberapa unsur
kelumit (P, Mn, Zn). Peranan ion logam dalam proses ini belum diketahui secara menyeluruh.
Nilai pH optimum sekitar 1,7 – 2,0. Jika pH lebih tinggi (alkalis) menyebabkan pembentukan
asam – asam oksalat dan glukonat dalam jumlah banyak. Karenanya pengendalian kondisi
proses secara cermat merupakan prasyarat untuk mempertahankan keteraturan metabolik dan
mendukung pembentukan asam sitrat yang lebih banyak. Kondisi yang sesuai tersebut
memungkinkan stimulasi glikolisis untuk penyediaan aliran karbon yang tidak terbatas ke
dalam metabolisme antara. Akumulasi sitrat selanjutnya tergantung pada pemasokan
oksaloasetat (Mangunwidjaja & Suryani 1994).
Mangunwidjaja & Suryani (1994) juga menjelaskan bahwa kekurangan mangan akan
menurunkan aktivitas enzim dalam siklus asam trikarboksilat yang diikuti oleh penurunan
anabolisme. Gangguan metabolisme ini menyebabkan perbedaan tingkat ion amonium
intraselluler yang dapat membantu menghilangkan penghambatan enzim fosfofruktose oleh
sitrat. Mangan juga terlibat dalam biokimia permukaan sel dan morfologi hifa. Kebutuhan
2 oksigen yang tinggi memungkinkan reoksidasi sitoplasma NADH tanpa pembentukan ATP
dan melibatkan suatu cabang respirasi alternatif yang berbeda dari rantai respirasi normal.
Proses fermentasi asam sitrat dapat dilakukan dengan sistem terendam, fermentasi
kultur permukaan. Fermentasi kultur terendam dibagi dua yaitu dilakukan pada fermentor
berpengaduk dan pada air lift fermentor. Sedangkan pada fermentasi kultur permukaan dapat
menggunakan media cair maupun media padat. Fermentasi sistem terendam lebih sulit
dilakukan dibandingkan prosedur permukaan, tetapi dapat dilakukan secara curah, proses
curah terumpani, atau sinambung. Fermentasi curah digunakan untuk substrat glukosa, dan
curah terumpani lebih layak diterapkan untuk untuk tetes tebu. Biakan sinambung
mempunyai produktivitas yang lebih tinggi (Mangunwidjaja & Suryani, 1994).
Produksi asam sitrat pada proses fermentasi dipengaruhi oleh beberapa faktor
diantaranya adalah jenis media, pH media, waktu fermentasi, suhu, aerasi, dan
mikroorganisme yang digunakan. Faktor yang paling menentukan adalah media tumbuh
(substrat) dan mikroorganisme yang digunakan (Friedrich et al. 1994).
Pada umumnya hasil samping pertanian dan perkebunan seperti jerami padi, onggok,
bagas, dan kulit kakao masih mengandung lignoselulosa. Limbah ini masih mengandung pati,
protein, lemak, dan senyawa kimia lainnya. Dengan teknologi fermentasi, hasil samping ini
dapat dimanfaatkan lebih lanjut menjadi produk lain yang berguna seperti pangan, pakan
ternak, pelarut organik, asam-asam organik seperti asam sitrat dan lain-lain (Judoamidjojo et
al. 1989).
Tujuan Praktikum
Praktikum ini bertujuan untuk melatih mahasiswa untuk dapat melakukan isolasi
kapang penghasil asam sitrat dari berbagai sumber seperti buah-buahan busuk, dari tanah,
serta menyeleksi isolat-isolat potensial untuk digunakan sebagai isolat penghasil asam sitrat.
3 METODE
Bahan dan Alat
Bahan-bahan yang digunakan adalah sampel buah-buahan busuk (tomat busuk),
sampel tanah, medium agar cawan Prescott (Lampiran 1), medium agar cawan Prescott +
0,1% KH2PO4, larutan garam fisiologis steril (9 ml dalam tabung steril), alkohol 95%, agar
miring PDA, onggok tapioka, dedak, Tween 80, NaOH 0,1 N, indikator Fenolftalein, air
aquades, Asam sitrat anhidrat, larutan Piridin.
Alat-alat yang digunakan adalah Lup inokulasi, pisau/skapel, batang penyebar, pipet 1
ml, inkubator, labu erlemenyer 250 ml, labu ukur 50 ml, tabung reaksi, biuret, gelas piala 100
ml, kertas saring Whatman No. 40,Vortex, Spektrofotometer.
Cara Kerja
Isolasi dari Buah-buahan Busuk dengan Metode Tanam Langsung
Sampel buah-buahan yang telah busuk (Tomat) dipotong-potong dengan ukuran
1x1x1 cm3, kemudian diletakkan potongan tersebut pada medium agar cawan Prescott.
Diinkubasi pada suhu 300C selama 2-5 hari. Mengamati pertumbuhan kapang dan
pembentukan zona asam pada medium. Koloni yang membentuk zona asam dimurnikan pada
medium yang sama. Isolat murni disimpan di dalam agar miring PDA. Kemudian
menentukan genus kapang berdasarkan mikroskopi morfologi struktur konidianya
(menggunakan metode teknik solatif transparan agar struktur konidia tidak rusak).
Isolasi dari Buah-buahan Busuk dengan Metode Sebar
Sampel buah diblender sebanyak 10 g dan dicampur dengan 90 ml larutan garam
fisiologis, diencerkan secara serial (diencerkan 10-3). Pencawanan dengan metode cawan
sebar 0,1 ml dari pengenceran 10-1 sampai 10-3 pada medium agar cawan Prescott. Diinkubasi
pada suhu 300C selama 2-5 hari. Mengamati pertumbuhan kapang dan pembentukan zona
asam pada medium. Koloni yang membentuk zona asam dimurnikan pada medium yang
sama. Isolat murni disimpan di dalam agar miring PDA. Kemudian menentukan genus
kapang berdasarkan mikroskopi morfologi struktur konidianya (menggunakan metode teknik
solatif transparan agar struktur konidia tidak rusak).
4 Seleksi Isolat berdasarkan Nilai Satuan Asam (Acid Unitage/AU)
Medium cawan Prescott yang telah disiapkan ditambahkan 0,1% KH2PO4, kemudian
inokulasikan isolat uji di tengah-tengah medium agar cawan tersebut. Inkubasikan pada suhu
300C selama 3 hari (72 jam). Diukur diameter zona asam dan diameter koloni kapangnya.
Lalu dihitung nilai AU-nya dengan rumus :
Nilai AU =
diameter zona asam
diameter koloni kapang
Isolat-isolat yang memiliki nilai AU relatif besar untuk percobaan selanjutnya disimpan pada
media agar miring PDA.
Fermentasi Padat Produksi Asam Sitrat
Onggok basah (segar) diperas sampai kadar airnya 65%, disiapkan dedak halus
dengan kadar 12%, dan dicampur merata onggok dan dedak dengan perbandingan 5:1.
Kemudian ditambahkan air aquadest sehingga kadar air campuran onggok dedak 65%,
masukkan 30 g campuran tersebut ke dalam erlemenyer 250 ml kemudian sterilkan. Medium
tersebut diinokulasikan dengan 1 ml suspensi konidia (7-8 x 10-5 konidia/ml) dari isolat
terpilih secara merata (isolat terpilih tomat). Inkubasikan pada suhu kamar selama 4 hari
dengan posisi erlemenyer dimiringkan. Diaduk secara merata hasil fermentasi tersebut.
Sebanyak 10 g contoh dimasukkan ke dalam erlemenyer 300 ml. Ditambahkan aquades
sehingga total volumenya 200 ml (20 x pengenceran), diaduk dan dipanaskan sampai
campuran tersebut mendidih. Lalu disaring dengan kertas saring Whatman No. 4 dan
didinginkan pada suhu kamar. Filtrat 10 ml at yang telah ditetesi larutan Phenolphtalein (PP)
sebanyak 1-2 tetes, kemudian dititrasi dengan NaOH 0,1 N. Kemudian dihitung total asam
sebagai asam sitrat monohidrat dengan rumus :
Total asam sitrat monohidrat =
b x c 210 x 20
a x3
Keterangan :
a
= bobot bahan (mg)
b
= volume larutan NaOH yang digunakan (ml)
c
= Normalitas larutan NaOH (0,1N)
210
= bobot molekul asam sitrat monohidrat
20
= pengenceran 20 kali
3
= banyaknya ion H+ yang dilepaskan oleh asam sitrat
5 HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil
Isolasi Mikroba dari Tomat Busuk
Dengan metode tanam langsung dan metode sebar, dari buah tomat yang telah busuk
berhasil diisolasi sebanyak 5 buah koloni kapang dari kapang-kapang yang membentuk zona
bening pada media Presscott, kemudian dimurnikan. Hasil pengamatan secara morfologis,
dapat diketahui ciri-ciri dari masing-masing isolat adalah seperti pada tabel 1.
Tabel 1. Hasil isolasi sampel yang membentuk zona asam
Sampel Tomat
Penampakan Koloni
1
Koloni berwarna putih, terdapat hifa
2
Koloni berwarna merah kecokelatan, terdapat hifa
3
Koloni berwarna putih, terdapat hifa
4
Koloni berwarna putih kekuningan
5
Koloni berwarna putih kecokelatan
Isolat yang telah dimurnikan kemudian diseleksi dengan menggunakan media
Presscott untuk diukur diameter zona bening yang dihasilkan.
Hasil Seleksi Isolat berdasarkan Nilai Satuan Asam (Acid Unitage/AU)
Isolat pada medium Presscott yang digunakan sebagai media seleksi, diinkubasi pada
suhu 30oC selama 72 jam. Setelah 72 jam, dari 5 isolat, diperoleh 4 yang dapat menimbulkan
zona bening, seperti yang terlihat seperti pada gambar 1. Dilakukan pengukuran terhadap
diameter zona bening yang dihasilkan juga diameter dari koloni kapang tersebut. Dengan
perhitungan maka diperoleh nilai Acid Unitage (AU) seperti pada tabel 2.
Tabel 2. Nilai satuan asam (AU) dari isolat-isolat hasil seleksi pada media Presscott
Kode Isolat
A
B
C
D
Diameter
Koloni (cm)
1,2
2,1
2,7
2,3
Nilai AU
Zona asam (cm)
2,5
5
4,5
3,7
6 2,08
2,38
1,66
1,6
b
a
c
d
Gambar 1. Isolat yang menunjukkan pembentukan zona asam sitrat, (a). Isolat A,
(b). Isolat B, (c). Isolat C, (d). Isolat D
Dari hasil seleksi diperoleh bahwa isolat B memiliki nilai AU paling tinggi, yaitu
2,38, sehingga akan digunakan sebagai starter dalam produksi asam sitrat secara fermentasi.
Fermentasi Padat Produksi Asam Sitrat
Isolat yang memiliki nilai AU tertinggi diinokulasikan ke dalam campuran onggok
dan dedak yang kemudian diinkubasi selama 1 minggu pada suhu 30°C. Kapang yang
tumbuh di dalam erlemenyer yang berisi onggok tersebut, miseliumnya berwarna putih
seperti yang terlihat pada gambar 2. Kapang hanya tumbuh pada permukaan , akan tetapi
tidak sampai masuk ke dasar dari media onggok tersebut.
10 gram dari media fermentasi ditimbang dan dilarutkan ke dalam 200 ml aquadest
pada wadah Erlenmeyer yang kemudian dididihkan lalu disaring. Sebanyak 10 ml filtrat
diambil dari media yang telah didinginkan dan disaring untuk dilakukan pengukuran secara
kuantitatif kadar asam sitrat dengan menggunakan prinsip titrimetri, asidimetri dengan
menggunakan NaOH 0,1 N yaitu larutan basa sebagai titran. Dari hasil pengukuran diperoleh
volume NaOH yang digunakan sebanyak 5 tetes atau sebesar 0,2 ml ketika terjadi perubahan
7 warna dari indikator PP dari tidak berwarna menjadi merah muda. Dengan menggunakan
rumus yang terdapat pada metode kerja, maka diperoleh hasil bahwa dalam larutan tersebut
mengandung asam sitrat sebesar 0.28% dimana artinya, dalam 100 g bahan atau substrat
terdapat 0.28 g asam sitrat.
Gambar 2. Hifa yang tumbuh pada medium campuran onggok dan dedak
Pengamatan Mikroskopis
Dalam pengamatan mikroskopis cendawan yang berasal dari buah tomat busuk,
visualisasi bentuk hifa. Diketahui bahwa hifa yang dimiliki olehisolat B tidak sama dengan
yang dimiliki oleh hifa A. niger, seperti terlihat pada gambar 3. Gambar 3. Hasil pengamatan dengan menggunakan mikroskop terhadap isolat B pada
perbesaran 1000 x
8 Pembahasan
Onggok merupakan media yang umum digunakan untuk produksi asam sitrat.
penambahan dedak dimaksudkan sebagai tambahan sumber protein dari substrat. Akan tetapi
kecilnya hasil yang diperoleh dalam pembuatan asam sitrat ini dapat dipengaruhi oleh banyak
hal, seperti kondisi dari substrat. Onggok merupakan limbah dalam pembuatan tepung
tapioka, oleh karena itu di dalam onggok masih terdapat sedikit kandungan karbohidrat. Oleh
kapang hasil isolasi, sisa-sisa amilum yang terdapat pada onggok digunakan untuk
memproduksi asam sitrat, akan tetapi perlu diingat bahwa karbohidrat yang diperoleh juga
digunakan dalam metabolisme primer dalam pembentukan sel dari kapang tersebut. Oleh
sebab itu, asam sitrat yang diperoleh cukup sedikit yaitu 0,28 g tiap 100 g substrat. Selain itu,
ada kemungkinan pH media dan suhu yang tidak sesuai untuk pertumbuhan kapang penghasil
asam sitrat berpengaruh sehingga tidak dapat memproduksi asam sitrat dengan maksimal
(Mangunwidjaja & Suryani, 1994).
Isolat kapangnya sendiri bukan merupakan isolat terbaik yang diperoleh karena meski
secara visual memberikan diameter zona bening yang luas pada media Presscott akan tetapi
hal tersebut masih bersifat kualitatif. Masih perlu dilakukan banyak isolasi dan rekayasa
untuk memperoleh kapang yang benar-benar potensial untuk menghasilkan asam sitrat
(Friedrich et al, 1994).
Pada fermentasi kali ini pun dilakukan fermentasi secara permukaan pada media
padat. Kendala yang ditemui pada fermentasi kali ini adalah tidak meratanya pertumbuhan
kapang pada substrat pada sehingga banyak substrat yang tidak ditumbuhi oleh hifa kapang.
Oleh karena itu, amilum yang terdapat dalam substrat tersebut belum sempat diubah menjadi
asam sitrat.
SIMPULAN
1. Dari hasil praktikum diperoleh 5 isolat kapang yang berasal dari tomat busuk dimana
isolat B memberikan nilai AU terbesar yaitu 2,38.
2. Dari hasil fermentasi, diperoleh bahwa isolat B hanya dapat memproduksi 0,28%
asam sitrat yaitu 0,28 gram tiap 100 gram substrat.
9 DAFTAR PUSTAKA
Bizri NJ dan Wahem AL. 1994. Citric Acid and Antimicrobials Affect Microbiological Stability and
Quality of Tomato Juice. J. of Food Science 59 (1) : 130-134
Broekhuijsen MP, Mattern IE, Contreras, R dan Kinghorn JR. 1993. Secretion of Heterologons
Protein by Aspergillus niger. J.Biotech. 31 : 135-145
Currie. 1917 dalam Rusmana I. 2005. Petunjuk Praktikum Bioteknologi Mikrobia. FMIPA IPB. Bogor
Friedrich J, Cimerman A, dan Steiner W. 1994. Concomitant Biosynthesis of Aspergillus niger
Pectolytic Enzymes and Citric Acid on Sucrosa. J. Enzym and Microbial Technology 16 : 703710
Hang YD, Splittstoessitr DF, Woodams REE, dan Sherman RM. 1977. Citric Acid Fermentation of
Brewery Waste. J. of Food Science. 42 (2) : 383-388
Ji LN, Zhao XR, dan Yang HY. 1992. Effects of Trace Elements on Citric Acid Fermentation by
Aspergillus niger and Treatment of cane Molasses as Raw Material. J. Industriall Microbiology
22(2) : 16-21
Judoamidjojo M, Sa'id EG, dan Hartoto L. 1989. Biokonversi. PAU-BIOTEK. IPB. Bogor
Judoamidjojo M ,Darwis AA dan Sa'id EG. 1992. Teknologi Fermentasi. CV.Rajawali pers. Jakarta
Mangunwidjaja D, Suryani A, 1994. Teknologi Bioproses. Penebar Swadaya. Jakarta
Okada, G. 1985. Purification and Properties of a Cellulase from Aspergillus niger. J. Biochem. 49 (5)
: 1257-1265.
Wehner. 1893 dalam Rusmana I. 2005. Petunjuk Praktikum Bioteknologi Mikrobia. FMIPA IPB.
Bogor
10 LAMPIRAN
Lampiran 1. Komposisi medium Prescott
Komponen
Sukrosa
NH4NO3
K2HPO4. 3H2O
KH2PO4
MgSO4. 7H2O
Jingga metal atau brom cresol green
Agar
Aquades
Berat / Volume
140 g
2,23 g
1g
1g
0,23 g
0,0016 g
17 g
1000 ml
Medium ini disterilisasi pada suhu 121 0C selama 15 menit, kemudian pH diatur sampai 5-5,5
dengan menambahkan 5 ml asam tartarat 10%. Medium akan berwarna jingga bila
menggunakan indikator jingga metal (methyl orange/MO) atau biru bila menggunakan brom
cresol green (BCG). Asam yang dihasilkan akan mengubah warna medium menjadi merah
(MO) atau kuning (BCG).
11