PROFIL PROTEIN SERUM DARAH MENCIT YANG
advertisement
PENGARUH VAKSINASI KULTUR Klebsiella pneumoniae HASIL INAKTIVASI PEMANASAN DAN IRADIASI SINAR GAMMA TERHADAP KONDISI FISIK SERTA PROFIL PROTEIN SERUM DARAH MENCIT SKRIPSI Diajukan sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Farmasi (S. Far) Disusun Oleh : DIANA RAHMAWATI 105102003323 PROGRAM STUDI FARMASI FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN UNIVERSITAS ISLAM NEGERI SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA 2009 M / 1430 H LEMBAR PERSETUJUAN SKRIPSI NAMA : Diana Rahmawati NIM : 105102003323 JUDUL SKRIPSI : Pengaruh Vaksinasi Kultur Klebsiella pneumnoniae Hasil Inaktivasi Pemanasan dan Iradiasi Sinar Gamma Terhadap Kondisi Fisik dan Profil Protein Serum Darah Mencit Menyetujui, Pembimbing I Pembimbing II Zilhadia, M.Si.Apt. NIP: 105408672 Irawan Sugoro, M.Si. NIP:197610182012001 Mengetahui, Ketua Program Studi Farmasi UIN Syarif Hidayatullah Jakarta Drs. M. Yanis Musdja, M.Sc, Apt. NIP: 1956010619851010001 i Skripsi dengan judul PENGARUH VAKSINASI KULTUR Klebsiella pneumnoniae HASIL INAKTIVASI PEMANASAN DAN IRADIASI SINAR GAMMA TERHADAP KONDISI FISIK DAN PROFIL PROTEIN SERUM DARAH MENCIT Telah disetujui, diperiksa dan dipertahankan di hadapan penguji oleh DIANA RAHMAWATI NIM 105102003323 Pembimbing Zilhadia, M.Si.Apt. NIP: 105408672 Irawan Sugoro, M.Si. NIP: 197610182012001 Penguji Drh. Bhintari M. Biomed S. Hermanto, M. Si Drs. M. Yanis M, M. Sc, Apt Penguji I Penguji II Penguji III Mengetahui, Ketua Program Studi Farmasi UIN Syarif Hidayatullah Jakarta Drs. M. Yanis Musdja, M. Sc, Apt Dekan Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan UIN Syarif Hidayatullah Jakarta Prof. DR. (hc). dr. M.K. Tadjudin, Sp. And Tanggal lulus : 26 Nopember 2009 ii LEMBAR PERNYATAAN DENGAN INI SAYA MENYATAKAN BAHWA SKRIPSI INI BENARBENAR HASIL KARYA SENDIRI YANG BELUM PERNAH DIAJUKAN SEBAGAI SKRIPSI ATAU KARYA ILMIAH PADA PERGURUAN TINGGI ATAU LEMBAGA MANAPUN. Jakarta, Oktober 2009 Diana Rahmawati 105102003323 iii Bismillahirrahmanirrahim.... “Kamu sekali-kali tidak melihat pada ciptaan Tuhan Yang Maha Pemurah sesuatu yang tidak seimbang. Maka lihatlah berulang-ulang, adakah kamu lihat sesuatu yang tidak seimbang” (QS. Al-Mulk: 3) “....Bermimpilah, karena Tuhan akan memeluk mimpi – mimpi itu...... (Arai) Skripsi ini dipersembahkan Teruntuk bapakku tercinta, mama dan adik ku tersayang Terima kasih untuk segala doa, perhatian dan semangat yang telah diberikan. iv KATA PENGANTAR Puji syukur kehadirat Allah SWT atas rahmat dan ridho-Nya, penulis dapat menyelesaikan naskah skripsi yang berjudul “Pengaruh Vaksinasi Kultur Klebsiella pneumnoniae Hasil Inaktivasi Pemanasan dan Iradiasi Sinar Gamma Terhadap Kondisi Fisik dan Profil Protein Serum Darah Mencit” dengan baik. Tidak lupa shalawat serta salam kepada junjungan nabi besar Muhammad SAW, semoga kita akan selalu menjadi pengikutnya hingga akhir zaman. Pada kesempatan kali ini penulis ingin menyampaikan terima kasih kepada banyak pihak yang memberikan bantuan baik berupa moril maupun material. Dengan ini penulis ingin sekali mengucapkan terima kasih kepada : 1. Bapak Prof.DR. dr. M.K Tadjudin, Sp.And, selaku Dekan Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan UIN Syarif Hidayatullah Jakarta. 2. Bapak Drs. M. Yanis Musdja, M.Sc, Apt selaku Ketua Program Studi Farmasi Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta 3. Ibu Zilhadia, M.Si, Apt. dan Bapak Irawan Sugoro, M.Si, selaku pembimbing dan motivator penulis yang sudah banyak sekali memberikan bimbingan dan kontribusinya, semoga Allah membalas jasanya yang tiada terkira. 4. Kedua Orangtuaku tercinta atas kasih sayang, do’a, dukungan moral dan materi serta pengorbanan yang sudah banyak sekali diberikan tanpa pamrih, yang terus memberi semangat buat penulis untuk dapat menyelesaikan skripsi ini. 5. Kepada adik – adik ku tersayang (Abdul Aziz & Taufiqa Hidayati) yang telah memberikan dukungan dan semangat. v 6. Buat sahabat-sahabat terbaik seperjuangan Siti Syahadah, Selvy, Titin, Dini, Retno yang selalu bersedia memberikan semangatnya, teman–teman Marching Band Bulldozer, dan Taekwondo FORSA UIN yang mewarnai duniaku dan semua sahabat-sahabat terbaik yang selalu ada disetiap langkah perjuangan ini. 7. Teman-teman seperjuangan Farmasi khususnya angkatan 2005. Seluruh personil RS. Bhayangkara Selapa POLRI. Semoga persahabatan yang sudah terjalin tidak akan pernah berakhir. 8. Seluruh pihak yang telah membantu penulis dalam menyelesaikan skripsi ini yang tidak bisa disebutkan satu persatu. Semoga keikhlasan dan ketulusannya cukuplah Allah SWT yang membalas dengan sebaik-baiknya balasan. Penulis sadar masih banyak kekurangan dalam penulisan, oleh karena itu kritik dan saran sangat diharapkan untuk perbaikan skripsi ini. Semoga Skripsi ini bermanfaat dan bisa memberikan sumbangsih kemajuan Ilmu Pengetahuan. Jakarta, Oktober 2009 Penulis vi DAFTAR ISI Halaman LEMBAR PERSETUJUAN .......................................................................... i LEMBAR PENGESAHAN............................................................................... ii LEMBAR PERNYATAAN ........................................................................... iii KATA PENGANTAR .................................................................................. v DAFTAR ISI ................................................................................................ vii DAFTAR GAMBAR .................................................................................... ix DAFTAR TABEL .......................................................................................... x DAFTAR LAMPIRAN ................................................................................ xi ABSTRAK...................................................................................................... xii ABSTRACT ................................................................................................... xiii BAB I 1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 PENDAHULUAN Latar belakang .............................................................................. Perumusan Masalah ...................................................................... Hipotesis ...................................................................................... Tujuan Penelitian .......................................................................... Manfaat Penelitian ......................................................................... BAB II 2.1. 2.2 2.3 2.4 TINJAUAN PUSTAKA Bakteri Klebsiella pneumoniae ....................................................... 6 Mastitis........................................................................................... 9 Mencit (Mus musculus) ................................................................... 12 Vaksin ............................................................................................ 14 2.4.1. Vaksin Iradiasi ...................................................................... 16 2.4.2. Vaksin Pemanasan ................................................................ 17 Sistem Imun........................................................................................ 19 2.5.1. Mekanisme Sistem Imun.......................................................... 19 2.5.1. Antigen..................................................................................... 20 2.5.3. Antibodi.................................................................................... 22 2.5.4. Interaksi Antigen dan Antibodi................................................ 25 Imunologi Darah................................................................................ 26 2.6.1. Serum........................................................................................ 29 Protein................................................................................................ 30 2.7.1. Denaturasi Protein.................................................................... 34 2.7.2. Penentuan kuantitas protein dengan metode Lowry................. 35 Elektroforesis...................................................................................... 36 2.8.1. Gel Poliakrilamid...................................................................... 39 2.8.2. SDS-Polyacrylamide Gel Electrophoresis................................ 40 2.5 2.6 2.7 2.8 BAB III 1 4 4 5 5 KERANGKA KONSEP ............................................................... 45 vii BAB IV METODOLOGI PENELITIAN 4.1 Waktu dan Tempat ........................................................................ 46 4.2 Alat dan Bahan .............................................................................. 46 4.2.1 Alat Penelitian ..................................................................... 46 4.2.2 Bahan Penelitian .................................................................. 47 4.3 Tahapan Penelitian ......................................................................... 47 4.4 Prosedur Penelitian............................................................................. 48 4.4.1 Pembuatan Medium TSB .................................................... 48 4.4.2 Pembuatan Medium TSA ..................................................... 48 4.4.3 Inaktivasi K. pneumoniae dengan Pemanasan....................... 49 4.4.4 Iradiasi K. pneumoniae dengan Sinar Gamma ...................... 49 4.4.5 Persiapan Hewan Uji ............................................................ 50 4.4.6 Uji In vivo ........................................................................... 51 4.4.7 Uji Tantang .......................................................................... 51 4.4.8 Pengamatan Persentasi Mortalitas ........................................ 51 4.4.9 Pengambilan Darah .............................................................. 51 4.3.10 Penghitungan Sel Darah Merah ............................................ 52 4.3.11 Penghitungan Sel Darah Putih .............................................. 52 4.3.12 Pengamatan Kondisi Fisik .................................................... 53 4.3.13 Pengukuran Protein Serum Darah Mencit ............................. 53 4.3.14 Karakteristik Profil Protein Bakteri K. pneumoniae .............. 53 4.6 Analisa Data .................................................................................. 55 BAB V HASIL DAN PEMBAHASAN 5.1 Hasil Penelitian .............................................................................. 5.1.1 Persentase Mortalitas. ............................................................ 5.1.2 Kondisi Fisik ......................................................................... 5.1.3 Analisa Sel Darah Merah & Sel Darah Putih .......................... a. Hasil Jumlah Sel Darah Putih ............................................. b. Hasil Jumlah Sel Darah Merah ........................................... 5.1.4 Analisa Kadar Protein Serum ................................................. 5.1.5 Analisa Profil Protein Serum Mencit........................................ 5.2 Pembahasan....................................................................................... 56 56 57 58 58 59 60 61 63 BAB VI KESIMPULAN DAN SARAN 6.1 Kesimpulan ................................................................................... 70 6.2 Saran ............................................................................................. 70 DAFTAR PUSTAKA .................................................................................... 71 viii DAFTAR GAMBAR Gambar Halaman Gambar 1. Bakteri Klebsiella pneumoniae ............................................... 6 Gambar 2. Mencit (Mus musculus) ........................................................... 12 Gambar 3. Mekanisme respon imun terhadap antigen ............................... 26 Gambar 4. Pemisahan protein serum dengan elektroforesis....................... 29 Gamber 5. SDS-Polyacrylamide Gel Electrophoresis ............................... 40 Gambar 6. Prinsip kerja SDS-PAGE ........................................................ 41 Gambar 7. Bagan kerangka konsep ........................................................... 45 Gambar 8. Grafik rata-rata jumlah sel darah putih .................................... 58 Gambar 9. Grafik rata-rata jumlah sel darah merah................................... 59 Gambar 10. Grafik hasil analisa kadar protein serum mencit ...................... 60 Gambar 11. Hasil foto gel poliakrilamid dari serum mencit ........................ 61 Gambar 12. Bagan tahap penelitian............................................................... 75 Gambar 13. Kurva standar Lowry serum darah mencit................................ 76 Gambar 14. Standar marker protein ............................................................ 78 Gambar 15. Kurva standar marker protein .................................................. 79 Gambar 16. Waterbath ............................................................................... 104 Gambar 17. Irradiation gamma chamber ..................................................... 104 Gambar 18. Larutan Staining dan Destaining ............................................. 104 Gambar 19. Bahan-bahan kimia ................................................................. 104 Gambar 20. SDS-PAGE ............................................................................. 105 Gambar 21. Mikropipet .............................................................................. 105 Gambar 22. Spektrofotometer .................................................................... 105 Gambar 23. Tips......................................................................................... 105 Gambar 24. Proses inaktivasi pemanasan ................................................... 106 Gambar 25. Proses inaktivasi iradiasi ......................................................... 106 Gambar 26. Persiapan hewan uji ................................................................ 106 Gambar 27. Injeksi secara Intra Peritoneal.................................................. 106 Gambar 28. Pengumpulan sampel serum darah .......................................... 107 Gambar 29. Loading sample ....................................................................... 107 Gambar 30. Preparasi alat SDS PAGE........................................................ 107 Gambar 31. Proses staining gel................................................................... 107 Gambar 32. Kondisi mencit normal ............................................................ 108 Gambar 33. Perbedaan limpa kontrol negatif dan normal............................ 108 Gambar 34. Perbedaan limpa mencit kontrol negatif dan vaksinasi ............. 108 Gambar 35. Mortalitas mencit setelah infeksi K.pneumonie aktif ................ 108 ix DAFTAR TABEL Tabel Tabel 1. Tabel 2. Tabel 3. Tabel 4. Tabel 5. Tabel 6. Tabel 7. Tabel 8. Tabel 9. Tabel 10. Tabel 11. Tabel 12. Tabel 13. Tabel 14. Tabel 15. Tabel 16. Tabel 17. Tabel 19. Tabel 20. Tabel 21. Tabel 22. Tabel 23. Tabel 24. Tabel 25. Tabel 26. Tabel 27. Tabel 28. Halaman Data bobot molekul immunoglobulin dalam serum ................. 25 Fungsi protein darah dalam tubuh .......................................... 29 Persentase mortalitas mencit ................................................... 56 Kondisi fisik mencit ................................................................ 57 Rata-rata jumlah sel darah putih .............................................. 58 Rata-rata jumlah sel darah merah ............................................ 59 Hasil analisa kadar protein serum (Metode Lowry) ................. 60 Hubungan konsentrasi protein terhadap absorbansi serum darah mencit ................................................................. 76 Hasil rata-rata kadar protein pada kedua jenis perlakuan ......... 77 Hubungan Log BM terhadap Rf pada kurva standar marker .... 80 Konsentrasi akrilamid yang digunakan untuk SDS-PAGE....... 81 Data bobot molekul immunoglobulin dalam serum ................. 81 Hasil analisa bobot molekul protein serum darah mencit kontrol normal & negatif ......................................................... 82 Analisa berat molekul protein serum darah mencit setelah vaksinasi dan uji tantang pemanasan........................................ 84 Analisa berat molekul protein serum darah mencit setelah vaksinasi dan uji tantang iradiasi ................................. 87 Analisa letak pita profil protein serum darah mencit pada vaksin pemanasan .......................................................... 91 Analisa letak pita profil protein serum darah mencit pada vaksin iradiasi ................................................................ 92 Tabel uji Homogenitas protein, SDM, dan SDP ...................... 94 Hasil uji Anova analisa protein, SDM dan SDP....................... 95 Hasil uji Deskriptif profil protein pemanasan .......................... 96 Hasil uji Anova profil protein pemanasan ............................... 96 Hasil uji Deskriptif profil protein iradiasi ................................ 97 Hasil uji Anova profil protein iradiasi ..................................... 98 Hasil uji Duncan profil protein iradiasi ................................... 98 Hasil uji Duncan pada profil protein iradiasi ........................... 100 Hasil uji Anova profil protein pemanasan & iradiasi .............. 101 Hasil uji Duncan pada profil protein pemanasan & iradiasi ..... 102 x DAFTAR LAMPIRAN Lampiran Lampiran 1. Lampiran 2. Lampiran 3. Lampiran 4. Lampiran 5. Lampiran 6. Lampiran 7. Lampitan 8. Lampiran 9. Lampiran 10. Lampiran 11. Lampiran 12. Lampiran 13. Lampiran 14. Lampiran 15. Lampiran 16. Lampiran 17. Lampiran 18. Lampiran 19. Halaman Bagan Tahapan Penelitian ................................................... 70 Kurva Standar Lowry Klebsiella pneumoniae ...................... 71 Hasil Rata- Rata Kadar Protein Dengan Metode Lowry ........ 72 Standar Marker ..................................................................... 73 Kurva Standar Marker Protein .............................................. 74 Hubungan Log BM terhadap Rf pada kurva standar .............. 75 Konsentrasi akrilamid pada SDS-PAGE ............................... 76 Data Bobot Molekul Immunoglobulin dalam Serum ............. 76 Hasil Analisa Bobot Molekul Protein Serum Darah Mencit Kontrol Normal & Negatif ................................................... 77 Analisa Bobot Molekul Protein Serum Darah Mencit Setelah Vaksinasi dan Uji Tantang Pemanasan ............................... 79 Analisa Berat Molekul Protein Serum Darah Mencit Setelah Vaksinasi dan Uji Tantang Iradiasi ...................................... 83 Analisa Letak Pita Profil Protein Serum Darah Mencit Pada Perlakuan Vaksin Pemanasan ............................................... 88 Analisa Letak Pita Profil Protein Serum Darah Mencit Pada Vaksin Iradiasi ...................................................................... 89 Hasil Statistik Pada Analisa Jumlah Kadar Protein, Sel Darah Merah dan Sel Darah Putih ................................... 90 Hasil Analisa Profil Protein Pada Perlakuan Vaksinasi dan Uji Tantang Pemanasan......................................................... 92 Hasil Analisa Profil Protein Pada Perlakuan Vaksinasi dan Uji Tantang Iradiasi .............................................................. 94 Hasil Analisa Profil Protein Pada Perlakuan Vaksinasi dan Uji Tantang Iradiasi dan Pemanasan...................................... 97 Komposisi larutan Elektroforesis .......................................... 100 Foto-Foto Penelitian ............................................................. 101 xi ABSTRAK Judul : Pengaruh Vaksinasi Kultur Klebsiella pneumnoniae Hasil Inaktivasi Pemanasan dan Iradiasi Sinar Gamma Terhadap Kondisi Fisik serta Profil Protein Serum Darah Mencit Mastitis adalah salah satu penyakit yang disebabkan oleh bakteri koliform. K. pneumoniae adalah bakteri gram negatif yang termasuk famili enterobacteriaceae yang berbentuk batang (basil), merupakan salah satu bakteri koliform penyebab mastitis dan pneumonia. Salah satu cara pencegahan mastitis adalah pemberian vaksin. Teknik nuklir dan pemanasan dapat digunakan untuk memperoleh bahan vaksin. Tujuan penelitian ini untuk memperoleh bahan vaksin dari K.pneumoniae hasil inaktivasi dengan sinar gamma dan pemanasan. Mencit dibagi dalam 4 kelompok, yaitu Kontrol negatif (infeksi kultur aktif K.pneumoniae), Kontrol normal (injeksi larutan NaCl fisiologis), Perlakuan 800 Gy (infeksi K. pneumoniae hasil inaktivasi dengan iradiasi gamma dosis 800 Gy) dan Perlakuan Pemanasan (infeksi K. pneumoniae hasil inaktivasi dengan pemanasan 65 0C selama 30 menit). Mortalitas mencit pada kelompok Kontrol negatif sebesar 100%, sedangkan pada kelompok Perlakuan 800 Gy maupun pemanasan 65 0C selama 30 menit tidak ada mortalitas. K. pneumoniae hasil inaktivasi dengan sinar gamma dosis 800 Gy dan pemanasan yang diinfeksikan ke tubuh mencit tidak mempengaruhi kondisi fisik mencit, jumlah sel darah merah, jumlah sel darah putih pasca vaksinasi dan uji tantang. Secara statistik hasil profil protein terdapat perbedaan bermakna pada kelompok perlakuan (p < 0,05). Hal ini menunjukkan bahwa bakteri hasil inaktivasi dengan iradiasi 800 Gy dan pemanasan dapat digunakan sebagai bahan vaksin. Kata Kunci : K. Pneumoniae, Mastitis, Protein,. SDS-PAGE, Vaksin xii ABSTRACT Title : Vaccination Influence of Klebsiella pneumonia inactivated by heating and gamma irradiation at Physical Condition and Protein profile of Mice Blood Serum Mastitis is one of disease caused by coliform bacteria. Klebsiella pneumoniae is a gram-negative bacteria including enterobacteriaceae family which in form of bar (bacillus), is one of coliform bacteria causing mastitis and pneumonia. Vaccination is a method to prevent mastitis. Nuclear technique appears to be applicable to get vaccine material. The aim of this research is to get the K. pneumonia resulted from gamma ray that has been inactivated. Mice divided into 4 groups, negative control (infected by active cultur of K. pneumoniae), normal control (injection of fisiologis NaCl solution), 800 Gy treatment (infection of inactivated K. pneumoniae by gamma irradiation dose 800 Gy) and 65 0C heat treatment (infection of inactivated K. pneumoniae by 30 minutes heat treatment at 65 0C). Mortality rate on negative control reached 100%, whereas the treatment group and 800 Gy & 65 0C heat treatment there was no mortality. K. pneumoniae inactivation of the gamma ray dose of 800 Gy and 30 minutes heat treatment at 65 0C to the mice did not affect the physical condition of mice, amount of red blood cells, white blood cell of mice after vaccination and challenge tests. Protein profile are significant differences in the treatment group (p <0.05). This indicates that bacterial inactivation by irradiation 800 Gy and heating can be used as a candidate for vaccine and vaccine manufacture. Keywords: K. Pneumoniae, Mastitis, Protein,. SDS-PAGE, Vaccine xiii BAB I PENDAHULUAN 1.1 LATAR BELAKANG Protein hewani merupakan suatu kebutuhan manusia yang sangat penting, salah satunya dapat dipenuhi dengan mengkonsumsi susu. Susu yang paling banyak dikonsumsi masyarakat berasal dari sapi perah. Kendala yang dihadapi para peternak dalam usaha peningkatan produktivitas sapi adalah penyakit radang ambing atau disebut juga mastitis. Mastitis adalah penyakit radang ambing yang merupakan radang infeksi. Biasanya penyakit ini berlangsung secara akut, sub akut maupun kronis. Mastitis ditandai dengan peningkatan jumlah sel di dalam air susu, perubahan fisik maupun susunan air susu dan disertai atau tanpa disertai perubahan patologis dari kelenjarnya sendiri (Subronto, 2003). Di Indonesia kasus mastitis masih banyak terjadi, berdasarkan penelitian terdahulu kejadian mastitis subklinis pada sapi perah di Indonesia sangat tinggi (95-98%) dan menimbulkan banyak kerugian (Sudarwanto, 1999). Kasus terjadi terutama pada peternakan kecil yang kurang memperhatikan kondisi kandang maupun tingkat kebersihannya. Sehingga perlu dilakukan pengendalian ataupun pengobatan yang efektif untuk penyakit ini. Mastitis yang terjadi pada sapi perah dapat menurunkan tingkat produksi hingga 20%. Hal-hal yang menyebabkan kerugian begitu besar ini diantaranya karena produksi susu yang menurun, ongkos perawatan dan pengobatan, banyaknya air susu yang terbuang karena diafkir, serta kenaikan biaya penggantian sapi untuk kelangsungan produksi (Sugoro, 2004). 1 2 Mastitis dapat disebabkan oleh bakteri Streptococcus agalactiae, Str. dysgalactiae, Str. uberis, Str. zooepidemicus, dan Staphylococcus aureus, serta bakteri coliform, seperti Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli, dan berbagai spesies lain yang juga bisa menyebabkan terjadinya mastitis walaupun dalam persentase kecil. Bakteri koliform banyak menginfeksi ambing sapi karena banyak terdapat pada feses, sehingga ketika sapi duduk di lantai atau pada saat pemerahan, bakteri dapat masuk ke ambing melalui lubang atau kanal puting (Gibco, 2000). Dilihat dari faktor penyebabnya yaitu bakteri, memang penggunaan antibiotik sangatlah tepat untuk pengobatan penyakit ini. Namun pemberian antibakteri yang tidak sesuai dengan aturan medis dapat menimbulkan dampak negatif seperti timbulnya residu pada produk ternak dan resistensi bakteri terhadap antibakteri. Residu antibakteri dapat mengganggu kesehatan manusia dan juga mengganggu proses pengolahan produk asal susu. Vaksinasi merupakan salah satu upaya mencegah penyakit serta terjadinya resistensi bakteri dan residu antibakteri. Jika paradigma kesehatan hewan dapat mengutamakan vaksinasi daripada kemoterapi maka secara bertahap residu antibakteri dan resistensi bakteri akan hilang (Soeripto, 2002). Vaksin dapat diperoleh dengan cara konvensional yaitu metode kimia dan pemanasan atau menggunakan iradiasi. Vaksin konvensional yang umum digunakan adalah dengan menginaktivasi sel bakteri melalui pemanasan, penelitian sebelumnya menunjukkan bahwa pemanasan dengan suhu 65 0C selama 30 menit dapat menginaktivasi bakteri K. pneumoniae tanpa perubahan antigen protein (Indriastuti, 2008). 3 Radiovaksin adalah teknik pembuatan vaksin dengan cara iradiasi. Sumber radiasi yang digunakan untuk pembuatan radiovaksin adalah sinar gamma, sinar tersebut digunakan untuk menurunkan infektivitas, virulensi, dan patogenitas agen penyakit, tetapi diharapkan mampu merangsang timbulnya kekebalan pada tubuh terhadap infeksi penyakit (Sugoro, 2007). Dari penelitian sebelumnya telah diketahui bahwa dosis yang diperlukan untuk menginaktivasi sel bakteri K. pneumoniae adalah antara 600 Gy – 1.500 Gy dengan antigen protein yang tidak berubah. Iradiasi mempengaruhi antigen protein dari sel K. pneumoniae pada kisaran berat molekul 35, 36, dan 60 kDa dengan peningkatan intensitas atau konsentrasi (Agustina, 2008). Isolat yang digunakan dalam penelitian ini sebagai bahan vaksin yaitu K. pneumoniae (K3) hasil isolasi dari susu sapi yang terinfeksi mastitis akut yang berasal dari daerah Garut, Jawa Barat. Isolat ini telah diuji menggunakan medium selektif bakteri koliform yaitu Mc Conkey Agar serta diuji patogenitas dan resistensinya terhadap antibiotik. K. pneumoniae merupakan bakteri yang dominan setelah E. coli (Sugoro, 2007). Dalam penelitian ini telah dilakukan pengujian lebih lanjut secara in vivo untuk memperoleh profil protein serum mencit yang telah divaksinasi dengan vaksin yang dibuat menggunakan metode berbeda yaitu pemanasan dan iradiasi. Pita protein immunologlobulin G yang berperan dalam imunisasi diharapkan dapat terlihat pada kisaran berat molekul 150 KDa. Penelitian dilakukan bersamaan dengan pengamatan persentase mortalitas, kondisi fisik, dan gambaran darah hewan uji, sehingga data tersebut akan menunjang pemahaman mengenai kinerja bahan vaksin. Diharapkan data 4 profil protein dapat memberikan informasi mengenai keberadaan protein antibodi yang terbentuk, sehingga dapat menentukan metode pembuatan vaksin yang terbaik serta mengetahui potensi bahan vaksin K. pneumoniae inaktif. 1.2 PERUMUSAN MASALAH 1. Bagaimana pengaruh vaksinasi K. pneumoniae hasil inaktivasi dengan pemanasan dan iradiasi pada mencit mempengaruhi hasil kadar protein serum ? 2. Apakah terdapat perbedaan yang signifikan antara profil protein pada serum mencit yang diinfeksi K. pneumoniae hasil inaktivasi dengan pemanasan dan iradiasi ? 3. Bagaimana pengaruh vaksinasi K. pneumoniae hasil inaktivasi dengan pemanasan dan iradiasi dapat mempengaruhi kondisi fisik mencit ? 1.3 HIPOTESIS 1. Vaksinasi bakteri K. pneumoniae hasil inaktivasi pemanasan dan iradiasi dapat mempengaruhi hasil kadar protein serum. 2. Terdapat perbedaan antara karakterisasi profil protein pada serum mencit yang diinfeksi K. pneumoniae hasil inaktivasi dengan pemanasan dan iradiasi. 3. Infeksi K. pneumoniae hasil inaktivasi pemanasan dan iradiasi bakteri dapat mempengaruhi kondisi fisik mencit. 5 1.4 TUJUAN PENELITIAN 1. Mengetahui hasil kadar protein serum dan karakterisasi profil protein serum mencit yang diinfeksi K. pneumoniae hasil inaktivasi pemanasan dan iradiasi. 2. Mengetahui pengaruh infeksi K. pneumoniae hasil inaktivasi pemanasan dan iradiasi terhadap kondisi fisik mencit. 1.5 MANFAAT PENELITIAN Hasil penelitian ini diharapkan dapat mengetahui perubahan kondisi fisik dan respon imun yang ditimbulkan setelah mencit divaksinasi dengan bakteri K. pneumoniae hasil inaktivasi dengan pemanasan dan iradiasi, mengetahui persentase mortalitas mencit serta memperoleh informasi dari data kadar protein serum serta profil protein serum hasil elektroforesis dengan SDS-PAGE sehingga dapat diketahui metode inaktivasi K. pneumoniae yang paling sesuai dan tepat dalam pembuatan vaksin mastitis. BAB II TINJAUAN PUSTAKA 2.1 BAKTERI Klebsiella pneumoniae Gambar 1. Bakteri Klebsiella pneumoniae (Sugoro, 2004 ). Klasifikasi : Kingdom : Bacteria Filum : Proteobacteria Kelas : Gamma Proteobacteria Ordo : Eubacteriales Famili : Enterobacteriaceae Suku : Escherichiae Genus : Klebsiella Spesies : Klebsiella pneumoniae Klebsiella pneumoniae pertama kali ditemukan oleh Carl Friedlander. Carl Friedlander adalah patologis dan mikrobiologis dari Jerman yang membantu penemuan bakteri penyebab pneumonia pada tahun 1882. Carl Friedlander adalah orang yang pertama kali mengidentifikasi bakteri K. pneumoniae dari paru-paru orang yang meninggal karena pneumonia. Karena 6 7 jasanya, K. pneumoniae sering pula disebut bakteri Friedlander. Bakteri K. pneumoniae tumbuh di bawah kondisi aerob pada suhu 12-43 0C dengan pertumbuhan optimum pada suhu 35-37 0C dan minimum di bawah kondisi anaerob. pH optimum untuk pertumbuhan adalah 7,2. Umumnya, bakteri ini dapat menggunakan sitrat dan glukosa sebagai sumber karbon satu-satunya dan ammonia sebagai sumber nitrogen (Sugoro, 2004). K. pneumoniae adalah bakteri Gram negatif berukuran 0,3-1,5 μm × 0,6-6,0 μm yang berbentuk batang (basil). K. pneumoniae tergolong bakteri yang tidak dapat melakukan pergerakan (non motil). Berdasarkan kebutuhannya akan oksigen, K. pneumoniae merupakan bakteri fakultatif anaerob. K. pneumoniae dapat memfermentasikan laktosa. Pada uji dengan indol, K. pneumoniae akan menunjukkan hasil negatif. K. pneumoniae dapat mereduksi nitrat. K. pneumoniae banyak ditemukan di mulut, kulit, dan saluran usus, namun habitat alami dari K. pneumoniae adalah di tanah. Mastitis dapat dipengaruhi oleh tiga faktor, yaitu ternak itu sendiri, mikroorganisme penyebab mastitis, dan faktor lingkungan. Penyebab utama mastitis disebabkan oleh infeksi bakteri koliform, diantaranya Enterococcus aureus, E. faecium, E. faecalic, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, dan Yersinia enterocolitica. Bakteri ini dapat menginfeksi kelenjar susu akibat adanya kontak antara kelenjar susu dengan feses, dimana feses merupakan sumber bakteri koliform (Sugoro, 2004). Klebsiella pneumoniae merupakan bakteri yang dominan setelah Escherichia coli (Sugoro, 2007). Penyakit mastitis yang disebabkan oleh bakteri koliform, seperti K. pneumoniae, E. coli, dan yang lainnya terjadi pada jangka waktu pendek, 8 < 15% dari binatang yang terinfeksi menunjukkan infeksi kronis. Mastitis yang disebabkan bakteri koliform umum terjadi di alam tetapi banyak hewan yang terinfeksi kurang menunjukkan tanda-tanda sistemik dari penyakit. Gejala klinis yang berhubungan dengan infeksi bakteri koliform adalah hasil dari endotoksin bebas dari dinding sel bakteri gram negatif. Sangat jarang ditemukan akibat jangka panjang dari infeksi bakteri koliform (Ruegg, 2001). K. pneumoniae mampu memproduksi enzim ESBL (Extended Spektrum Beta Lactamase) yang dapat melumpuhkan kerja berbagai jenis antibiotik. Hal ini dapat menyebabkan bakteri kebal dan menjadi sulit dilumpuhkan. Beberapa jenis K. pneumoniae dapat diobati dengan antibiotik, khususnya antibiotik yang mengandung cincin beta-laktam. Contoh antibiotik tersebut adalah ampisilin, karbenisilin, amoksisilin, dll (Sugoro, 2004). Bakteri yang resisten dapat mengancam kehidupan manusia atau hewan karena dapat meningkatkan morbiditas penyakit dan mortalitas akibat kegagalan pengobatan. Selain itu, biaya pengobatan juga meningkat karena harus menggunakan antibakteri dosis tinggi atau lebih dari satu macam antibakteri, atau menggunakan antibakteri baru yang harganya lebih mahal (Soeripto, 2002). K. pneumoniae memiliki dua tipe antigen pada permukaan selnya yang dapat menyebabkan penyakit serta meningkatkan patogenitas K. pneumonia, yaitu lipopolisakarida (antigen O) yang terdapat dalam sembilan varietas dan kapsul polisakarida yang dikelilingi oleh kapsula dengan lebih dari 80 varietas disebut sebagai (antigen K). Kedua jenis antigen ini berperan dalam patogenisitas tersebut (Umeh and Geffen, 2006). 9 2.2 MASTITIS Mastitis berasal dari bahasa Yunani, kata mastitis [(masti’ (te) tis) mastos, breast, -itis, inflamation], adalah pembengkakan atau inflamasi pada jaringan internal kelenjar ambing, atau kelenjar mammae. Istilah tersebut dideskripsikan untuk mengindikasi perubahan karena penyakit pada kelenjar mammae, atau puting, yang dikarakterisasi dengan perubahan bentuk radang ambing, sehingga mengakibatkan perubahan pada produk yang disekresikan atau secara etiologi dapat dikatakan infeksi, perubahan suhu, kimiawi tubuh atau luka (Spangler, 1997). Mastitis adalah peradangan kelenjar ambing yang terjadi pada semua jenis mamalia. Mastitis dapat diklasifikasikan secara klinik sebagai penyakit akut, subklinik atau kronis, tergantung dari keganasan penyakit (Subronto, 2003). Mastitis akut merupakan inflamasi yang terjadi pada seperempat atau keseluruhan puting diikuti dengan gangguan sistemik yang disertai dengan peningkatan suhu tubuh. Tipe mastitis ini mempengaruhi jaringan sekresi, sehingga hasil sekresi hanya sedikit dan mengandung darah (Spangler, 1997). Sedangkan mastitis subklinik biasanya diawali dengan perubahan karakter dari sekresi dan jaringan ambing yang kurang terlihat jelas. Pembengkakan atau iritasi sangat kecil sehingga tidak menunjukkan suatu gejala yang muncul (Wahyuni, 2005). Mastitis kronik berkembang secara pelan-pelan dan tidak menunjukkan gejala klinis. Ketika pembengkakan dan iritasi meningkat, karakter sekresi menjadi abnormal dan jumlahnya berkurang. Ini adalah bentuk paling umum dari mastitis (Ruegg, 2001). 10 Peradangan dapat terjadi pada satu kelenjar atau lebih dan mudah dikenali apabila pada kelenjar susu menampakkan gejala peradangan yang jelas. Kelenjar ambing membengkak, edematus berisi cairan eksudat disertai tanda-tanda peradangan lainnya, seperti suhu meningkat, kemerahan, rasa sakit dan penurunan fungsi. Akan tetapi seringkali sulit untuk mengetahui kapan terjadinya suatu peradangan, sehingga diagnosis terhadap mastitis sering dilakukan melalui pengujian pada produksi susu, misalnya dengan melakukan penghitungan jumlah sel somatik dalam susu (Paryati, 1997). Mastitis terjadi karena masuknya bakteri melalui saluran puting dan berkembang biak di dalam susu yang diproduksi jaringan sehingga menimbulkan radang. Biasanya mastitis disebabkan oleh bakteri seperti Escherichia coli, Streptococcus agalactiae, Staphyococcus dysgaactiae, Streptococcus uberis, Streptococus bovis, Enterococcus faecium, Enterococcus faecium, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca, dan Enterobacter aerogenes (Sugoro, 2004). Klebsiella pneumoniae merupakan bakteri yang dominan setelah Escherichia coli (Sugoro, 2007). Secara spesifik E.coli dan K. pneumonia adalah spesies bakteri koliform yang merupakan bakteri paling umum ditemukan pada infeksi intramammary dan mastitis klinis, infeksi intramammary yang disebabkan oleh K. pneumoniae berkisar antara 21 hari (Hogan, 2002). Mikroorganisme masuk melalui saluran puting dengan berbagai cara. Diantaranya pemerahan, di mana mikroorganisme masuk melalui saluran puting atau hasil perpindahan secara fisik dari ujung puting yang ditekan akibat pergerakan sapi. Selama pemerahan dengan mesin, mikroorganisme 11 mungkin terdorong masuk melalui saluran puting ke dalam puting sisterna (Sugoro, 2004). Proses yaitu infeksi radang ambing terjadi melalui beberapa tahap, adanya kontak dengan mikroorganisme, kemudian dilanjutkan dengan masuknya mikroorganisme tersebut ke dalam kelenjar akibat lubang puting yang terbuka ataupun karena adanya luka. Tahap berikutnya, terjadi respon imun pada induk semang, dengan respon pertahanan pertama ditandai dengan berkumpulnya leukosit-leukosit untuk mengeliminasi mikroorganisme yang telah menempel pada sel-sel ambing. Apabila respon ini gagal, maka mikroorganisme akan mengalami multiplikasi dan sapi dapat memperlihatkan respon yang lain, misalnya demam (Duval, 1997). Pencegahan atau pengendalian penyakit mastitis dapat diakukan dengan vaksinasi. Pemberian vaksin pada prinsipnya dapat mencegah terjadinya infeksi (Syukur, 2000). Vaksin yang mengandung seluruh sel dapat mencegah efek infeksi. Pencegahan dengan vaksinasi akan memberikan dampak yang lebih baik daripada dengan kemoterapi, karena tidak menimbulkan resistensi dan tidak akan meninggalkan residu pada produk ternak (Soeripto, 2002). Pengembangan vaksin bakteri untuk ternak diharapkan dapat memenuhi kriteria yang tidak memberatkan peternak khususnya nilai ekonomi, karena hal ini berkaitan erat dengan nilai jual ternak (Maroney, 2005). Secara teknis vaksin harus memenuhi kriteria dapat memberikan perlindungan semaksimal mungkin terhadap ternak yang divaksin dan 12 terhadap fetus melalui ”maternal immunity”, tidak menimbulkan sakit jika diaplikasikan dan cara pemberiannya mudah serta tidak berulang-ulang agar dapat menghemat waktu, tenaga dan biaya, serta tidak menimbulkan stress berulang pada ternak. Vaksinasi dapat menggunakan vaksin aktif dan inaktif (Soeripto, 2002). 2.3 MENCIT (Mus musculus) Gambar 2. Mencit (Mus musculus) (Sugoro, 2004). Klasifikasi Kingdom : Animalia Filum : Chordata Kelas : Mammalia Ordo : Rodentia Famili : Muridae Suku : Murinae Genus : Mus Spesies : Mus musculus Mencit merupakan hewan percobaan yang dapat sering digunakan dalam penelitian in vivo. Tetapi karena hewan ini paling kecil di antara berbagai jenis hewan percobaan dan karena amat banyak galurnya, sehingga 13 hewan ini disebut mencit. Mencit liar atau mencit rumah adalah hewan semarga dengan mencit laboratorium. Hewan tersebut tersebar di seluruh dunia dan sering ditemukan di dekat atau di dalam gedung dan rumah yang dihuni manusia. Mencit juga banyak ditemukan di daerah lain yang tidak dekat dengan manusia, jika ada makanan dan tempat berlindung. Semua galur mencit laboratorium yang ada pada waktu ini merupakan turunan dari mencit liar sesudah melalui peternakan selektif (Yuwono, 1990). Mencit laboratorium mempunyai berat badan yang hampir sama dengan mencit liar, yaitu 18-20 gram pada umur 4 minggu dan 30-40 gram pada umur 6 minggu atau lebih, tetapi setelah diternakkan secara selektif sejak tahun 1920, sekarang ada berbagai warna dan timbul banyak galur dengan berat badan berbeda-beda. Mencit laboratorium dapat di kandang dalam kotak sebesar kotak sepatu. Kotak dapat dibuat dari berbagai macam bahan, misalnya plastik (polipropilen atau polikarbonat), aluminium, atau baja tahan karat (stainless steel). Kadang-kadang mencit dapat ditempatkan di kandang yang mempunyai dinding dan lantai dari kawat (Yuwono, 1990). Kualitas makanan berpengaruh pada kondisi mencit, di antaranya mata, hidung, gerak dan rambut yang dapat mempengaruhi kemampuan mencit mencapai potensi genetik untuk tumbuh, berbiak, umur, atau reaksi terhadap pengobatan dan lain-lain. Oleh karena itu status makanan hewan yang diberikan dalam percobaan biomedis mempunyai pengaruh nyata pada kualitas hasil percobaan. Persiapan dalam menyediakan makan mencit yang lengkap termasuk memperhatikan kira-kira 50 komponen penting. Persiapan ini meliputi membuat resep dan membuat makanan sehingga mengandung 14 komponen-komponen dengan kadar yang diperlukan dengan mempertimbangkan faktor-faktor lain yang mempunyai pengaruh terhadap kualitas makanan termasuk apakah bahan makanan mudah dicerna, lezat dan mencit berselera untuk makan, cara menyiapkan dan menyimpan makanan serta konsentrasi zat kimia atau bahkan bahan pencemar (Sugoro, 2007). Jumlah eritrosit pada mencit betina umur 3 minggu lebih besar dari pada mencit jantan, tetapi pada umur 8 minggu jumlah eritrosit mencit betina lebih kecil dari pada mencit jantan. Hal ini karena adanya hormon testosteron yang merangsang eritroblast. Jumlah eritrosit mencit jantan umur 3 minggu adalah 6.490 ± 0,339 juta/mL dan pada mencit betina 6.690 ± 0,192 juta/mL. Sedangkan pada umur 8 minggu, jumlah eritrosit mencit jantan 7.072 ± 0,348 juta/mL dan pada mencit betina 6.864 ± 0,478 juta/mL. Jumlah leukosit mencit jantan umur 3 minggu adalah 6.800 ± 1.800 ribu/mL dan mencit betina adalah 7.200 ± 1.700 ribu/mL. Sedangkan pada umur 8 minggu, jumlah leukosit mencit jantan 5.500 ± 1200 ribu/mL dan pada mencit betina 5.900 ± 1500 ribu/ml (Farid , 2005). 2.4 VAKSIN Menurut Farmakope Indonesia (edisi IV). Vaksin adalah sediaan yang mengandung zat antigenik yang mampu menimbulkan kekebalan aktif dan khas pada manusia. Vaksin dibuat dari bacteria, riketsia, atau virus dan dapat berupa suspensi organisme hidup atau inaktif atau fraksi-fraksinya atau toksoid (Ditjen POM, 1995). Empat macam tipe vaksin adalah : (1) vaksin inaktif dari organisme patogen yang dimatikan, (2) vaksin aktif dari 15 organisme yang dilemahkan, (3) vaksin dengan subunit protein hasil rekombinasi, dan (4) vaksin asam nukleat (Tetriana, 2007). Vaksin diperoleh dari suspensi biakan mikroorganisme yang telah dimatikan atau yang hidup tetapi telah diatenuasi (memiliki virulensi yang sudah dilemahkan), sehingga tidak menimbulkan penyakit dan dapat merangsang pembentukan kekebalan atau antibodi bila diinfeksikan (Gibco, 2000). Vaksin merupakan suatu sarana yang dapat mencegah terjadinya penyakit infeksi berat dengan cara membawa sistem imun tubuh ke dalam suatu keadaan siaga. Vaksin memiliki sebagian ciri antigenik organisme patogen atau toksin, tetapi tanpa membawa aktivitas biologis yang merugikan. Beberapa diantaranya dibuat dengan jalan melemahkan organisme patogen, misalnya dengan pemanasan atau dengan reaksi kimia tertentu. Vaksin lain berisi organisme sejenis yang kurang sifat patogennya. Tujuannnya adalah mendapatkan antigen dengan pengaruh buruk sekecil mungkin, tetapi tetap mengandung determinan patogen sehingga antibodi yang terbentuk dapat mengikat patogen (McGilvery, 1996). Ketika vaksin diberikan, maka vaksin menstimulasi reaksi imun, sehingga akan memberikan kekebalan aktif pada penerima vaksin. Vaksin membantu mencegah terjadinya infeksi yang diakibatkan oleh patogen yang sama ataupun patogen yang mirip antigennya. Vaksin digunakan sebagai prophylactical (zat pencegah penyakit) untuk mencegah terjadinya penyakit yang mungkin dialami oleh penerima vaksin. Vaksin dipersiapkan untuk 16 melindungi tubuh dari serangan mikroba lain yang berbahaya, seperti halnya racun (Headon, 1994). Pencegahan penyakit mastitis dengan menggunkan vaksin di Indonesia belum banyak digunakan, karena kurangnya informasi dan harga yang masih relatif mahal. Salah satu produk vaksin yang beredar di pasaran adalah Somato staph dan Lysigen untuk mastitis yang disebabkan oleh bakteri Sthaphylococus aureus, J5 Bacterin dan Mastiguard untuk bakteri koliform, dan Endovac bovi untuk bakteri Gram negatif (Sugoro, 2004). Vaksin-vaksin tersebut ini telah banyak digunakan oleh para peternak di Amerika Serikat, Selandia Baru dan Australia serta dapat menurunkan kejadian mastitis sampai dengan 60% (Sugoro, 2007). Vaksin bekerja melawan bakteri penyebab mastitis, melalui mekanisme antigen-antibodi. Semua formula vaksin mastitis koliform menggunakan antigen dari bakteri Gram negatif untuk menghasilkan imunitas dalam melawan endotoksin (Ruegg, 2001). 2.4.1 Vaksin Iradiasi Organisme dapat dimatikan atau diinaktivasi dengan berbagai macam bahan kimia atau dengan perlakuan fisik. Atenuasi secara normal dicapai dengan membiakkan organisme pada inang yang tidak biasa. Sediaan vaksin yang aman untuk melawan bermacam toksin bakteri dibuat dengan menginaktivasi toksin tersebut sehingga sifat racun dapat hilang, sementara imunogenitasnya masih ada (Headon, 1994). Vaksin iradiasi adalah agen penyakit (antigen) yang telah dilemahkan dengan sinar radiasi (dalam hal ini sinar dari sumber 60 Co), sehingga 17 menurunkan infektivitas, virulensi atau patogenitasnya tetapi masih mampu merangsang tanggap kebal protektif pada hospes (induk semang) yang mengalami infeksi kemudian oleh agen penyakit tersebut. Hal yang penting selain mendapatkan dosis optimum iradiasi selama melakukan pengembangan vaksin adalah optimasi laju dosis. Laju dosis akan mempengaruhi proses kualitas vaksin yang diinaktivasi atau dilemahkan (Tetriana, 2007). Pemanfaatan teknik nuklir radiasi yang dilakukan di bidang peternakan terutama di subbidang kesehatan ternak, yaitu untuk melemahkan patogenisitas penyakit yang disebabkan oleh bakteri, virus dan cacing. Pemanfaatan radiasi telah menghasilkan radiovaksin, reagen diagnostik, dan pengawetan (Sanakkayala, 2005). Radiovaksin adalah teknik pembuatan vaksin dengan cara iradiasi. Sumber radiasi yang digunakan untuk pembuatan radiovaksin adalah sinar gamma yang digunakan untuk menurunkan infektivitas, virulensi, dan patogenitas agen penyakit, tetapi diharapkan mampu merangsang timbulnya kekebalan pada tubuh terhadap infeksi penyakit (Sugoro, 2004). 2.4.2 Vaksin Pemanasan Prinsip yang penting dalam pembuatan vaksin adalah metode inaktivasi harus memusnahkan inefektivitas organisme, tetapi sifat antigeniknya harus tidak berubah. Untuk inaktivasi, organisme memerlukan perlakuan khusus supaya inaktivasi dapat sempurna, kondisi tersebut akan dapat merusak antigen. Vaksin dapat diperoleh dengan cara konvensional, baik secara kimia maupun pemanasan. Vaksin konvensional yang umum 18 digunakan adalah dengan menginaktivasi sel bakteri melalui pemanasan (Suwandi, 1990). Inaktivasi tersebut juga melibatkan perubahan konformasi protein. Protein merupakan suatu enzim yang berfungsi sebagai katalisator. Beberapa jenis protein sangat peka terhadap perubahan lingkungannya. Aktivitas protein ini banyak tergantung pada struktur dan konformasi molekul protein yang tepat. Apabila konformasi molekul protein berubah, misalnya oleh perubahan suhu, maka aktivitas biokimiawinya akan berkurang (Suwandi, 1990). Heat Shock Protein (HSP) merupakan suatu tekanan pada protein di semua sel. Protein ini dibentuk ketika sel mengalami berbagai tekanan dari lingkungannya seperti panas, dingin dan kehilangan oksigen. HSP berperan dalam fungsi seluler dasar seperti pelipatan protein, lalu lintas protein, dan translokasi protein pada membran. Peran HSP secara umum adalah sebagi molekul chaperone (protein pengarah protein) (Goldman, 2005). Perubahan konformasi alamiah menjadi suatu konformasi yang tidak menentu merupakan suatu proses yang disebut denaturasi. Proses denaturasi ini biasanya dapat berlangsung secara reversibel atau tidak reversibel. Penggumpalan protein biasnya didahului oleh proses denaturasi yang berlangsung dengan baik pada titik isoelektrik protein tersebut. Protein akan mengalami koagulasi apabila dipanaskan pada suhu 50 0C atau lebih. Selain oleh pH, suhu tinggi dan ion logam berat, denaturasi juga dapat pula terjadi oleh adanya gerakan mekanik, alkohol, aseton, eter dan deterjen (Poedjiadi, 1994). 19 2.5 SISTEM IMUN 2.5.1 Mekanisme Sistem Imun Mekanisme pertahanan tubuh terhadap infeksi bakteri dipengaruhi oleh struktur dan patogenitas bakteri. Pada sebagian besar infeksi, ada keseimbangan antara kemampuan sistem pertahanan tubuh untuk melawan infeksi dengan kemampuan mikroorganisme untuk menghindar dari sistem pertahanan tubuh. Namun demikian, manifestasi penyakit infeksi dapat terjadi bila respon imun pejamu terhadap infeksi tidak adekuat atau tidak tepat (innappropriate) (Baratawidjaja, 2004). Respon imun sangat bergantung pada kemampuan sistem imun untuk mengenali molekul asing (antigen) yang terdapat pada patogen potensial dan kemudian membangkitkan reaksi yang tepat untuk menyingkirkan sumber antigen yang bersangkutan (Kresno, 2003). Bila sistem imun terpapar pada zat yang dianggap asing, maka ada dua jenis respon imun yang mungkin terjadi, yaitu respon imun nonspesifik, dan sistem imun spesifik. Respon imun nonspesifik umumnya merupakan imunitas bawaan (innate immunity) dalam arti bahwa respon terhadap zat asing dapat terjadi walaupun tubuh sebelumnya tidak pernah terpapar pada zat tersebut, sedangkan respon imun spesifik merupakan respon didapat (acquired) yang timbul terhadap antigen tertentu, terhadap mana tubuh pernah terpapar sebelumnya (McGilvery, 1996). Gambaran umum respon imun terhadap mikroba adalah sebagai berikut : 20 1. Pertahanan terhadap mikroba diperantarai oleh mekanisme efektor imunitas bawaan (nonspesfik) maupun imunitas didapat (spesifik). Berbagai jenis mikroba dapat melawan respon imun nonspesifik, dan dalam keadaan demikian proteksi terhadap mikroba tersebut sangat bergantung pada respon imun spesifik, dalam arti bahwa respon imun spesifik meningkatkan fungsi sistem imun nonspesifik 2. Respon imun non-spesifik terhadap mikroba memegang peranan penting dalam menentukan respon imun spesifik yang akan berlangsung 3. Dalam upaya melawan mikroba secara efektif, sistem imun mampu memberikan respon yang spesialistik dan berbeda terhadap berbagai jenis mikroba. Karena berbagai jenis mikroba berbeda satu dengan yang lainnya dalam pola invasi dan kolonisasi dalam pejamu, maka eliminasinya memerlukan sistem efektor yang berbeda-beda. 4. Survival dan patogenitas mikroba sangat dipengaruhi oleh kemampuan mikroba itu untuk menghindar dari sistem imun pejamu 5. Kerusakan jaringan dan penyakit sebagai konsekuensi infeksi pada umumnya disebabkan oleh respon pejamu terhadap mikroba bersangkutan (Kresno, 2003). 2.5.2 Antigen Sistem alamiah tubuh ditunjang oleh suatu tanggapan yang amat spesifik sehingga terciptalah ketahanan tubuh terhadap senyawa asing, setelah perjumpaan awal dengan senyawa tersebut. Senyawa yang dapat menimbulkan tanggapan semacam ini disebut antigen (McGilvery, 1996). Antigen (Ag) merupakan suatu unsur yang dapat bereaksi dengan suatu 21 antibodi. Tidak semua antigen dapat menginduksi produksi antibodi, hal tersebut juga dapat disebut imunogen (Jawetz, 2004). Antigen adalah bahan yang dapat merangsang respon imun atau bahan yang dapat bereaksi dengan antibodi yang sudah ada tanpa memperhatikan kemampuannya untuk merangsang produksi antibodi. Secara fungsional antigen dibagi menjadi imunogen dan hapten (Kresno, 2003). Kompleks yang terdiri atas molekul kecil (disebut hapten) dan molekul besar (disebut karier atau molekul pembawa) dapat berperan sebagai imunogen. Contoh hapten ialah berbagai golongan antibiotik dan obat lainnya dengan berat molekul kecil. Hapten biasanya dikenal oleh sel B, sedangkan molekul pembawa oleh sel T. Molekul pembawa sering digabung dengan hapten dalam usaha memperbaiki imunisasi. Hapten membentuk epitop pada molekul pembawa yang dikenal sistem imun dan merangsang pembentukan antibodi (Baratawidjaja, 2004). Epitop atau determinan antigen adalah bagian dari antigen yang dapat membuat kontak fisik dengan reseptor antibodi, menginduksi pembentukan antibodi, dan dapat diikat dengan spesifik oleh bagian dari antibodi atau oleh reseptor antibodi. Makromolekul dapat memiliki berbagai epitop yang masing-masing merangsang produksi antibodi spesifik yang berbeda. Respon imun dapat terjadi terhadap semua golongan bahan kimia seperti hidrat arang, protein dan asam nukleat (Martoharso, 1981). Antigen poten alamiah terbanyak adalah protein besar dengan berat molekul lebih dari 40.000 dalton dan juga kompleks polisakarida mikrobial. Glikolipid dan lipoprotein dapat juga bersifat imunogenik, tetapi tidak 22 demikian halnya dengan lipid yang dimurnikan. Asam nukleat dapat bertindak sebagai imunogen dalam penyakit autoimun tertentu, tetapi tidak dalam keadaan normal (Baratawidjaja, 2004). 2.5.3 Antibodi Antibodi (Ab) merupakan suatu protein yang diproduksi sebagai hasil interaksi dengan suatu antigen. Protein mempunyai kemampuan untuk berkombinasi dengan antigen yang dirangsang produksinya (Jawetz, 2004). Bila darah dibiarkan membeku akan meninggalkan serum yang mengandung berbagai bahan larut tanpa sel. Bahan larut tersebut mengandung molekul antibodi yang dapat digolongkan dalam protein yang disebut globulin dan sekarang dikenal sebagai immunoglobulin. Dua cirinya yang penting ialah spesifitas dan aktivitas biologik (Kresno, 2003). Molekul antibodi muncul di alam serum darah dan jaringan tertentu spesies vertebrata tertentu sebagai reaksi terhadap injeksi suatu antigen, protein atau makromolekul asing lain kepada spesies tersebut. Tiap protein asing menimbulkan antibodi yang berbeda. Reaksi tubuh yang bersifat sangat spesifik terhadap protein yang diinjeksikan, disebut reaksi imunitas, dan hal ini merupakan dasar semua bidang ilmu imunologi. Molekul antibodi yang dibentuk oleh sel khusus yang dinamakan limfosit dapat bergabung dengan antigen yang menimbulkan pembentukannya, untuk membuat suatu kompleks antigen-antibodi (Lehninger, 1998). Imunitas terhadap penyakit infeksi seringkali dapat terjadi, dengan menginjeksikan sejumlah kecil komponen makromolekul tertentu, yakni, antigen dari mikroorganisme atau virus penyebab penyakit. Antibodi 23 terhadap antigen asing ini lalu dibentuk oleh limfosit sel inang. Kalau mikroorganisme yang diberikan antigen ini kebetulan dapat mencapai darah atau limfa hewan yang diimunisasi setelah beberapa waktu kemudian, maka antibodi akan dibentuk oleh hewan tersebut, antibodi yang dibentuk oleh hewan menetralkan atau menginaktifkan mikroorganisme atau virus penyerang dengan cara bergabung dengan komponen antigenik. Reaksi imun diberikan hanya oleh vertebrata (Lehninger, 1998). Immunoglobulin (Ig) dibentuk oleh sel plasma yang berasal dari proliferasi sel B yang terjadi secara spesifik akan mengikat antigen baru lainnya yang sejenis. Bila serum protein tersebut dipisahkan dengan cara elektroforesis, maka immunoglobulin ditemukan terbanyak dalam fraksi globulin gama, meskipun ada beberapa immunoglobulin yang ditemukan dalam fraksi globulin alfa dan beta. Semua juga molekul imunoglobulin mempunyai 4 rantai polipeptida dasar yang terdiri atas 2 rantai berat (heavy chain) dan 2 rantai ringan (light chain) yang identik serta dihubungkan satu sama lain oleh ikatan disulfida (Baratawidjaja, 2004). Antibodi (atau immunoglobulin) adalah protein yang disintesis oleh hewan sebagai respon terhadap substansi asing. Antibodi ini disekresi oleh sel plasma yaitu sel yang diturunkan oleh sel limfosit B (sel B). Protein yang dapat larut ini merupakan elemen pengenalan pada respon kekebalan humoral. Tiap antibodi mempunyai afinitas spesifik terhadap materi asing yang memicu sintesis antibodi itu. Suatu makromolekul asing yang mampu memicu pembentukan antibodi disebut antigen (atau imunogen). Protein polisakarida dan asam nukleat pada umumnya merupakan antigen yang 24 efektif. Afinitas spesifik suatu antibodi tidaklah untuk seluruh permukaan antigen makromolekul tetapi untuk situs khusus pada makromolekul yang disebut “determinan antigenic”atau epitop (Stryer, 2002). Sistem imun menggunakan dua sistim elemen pengenalan untuk membedakan dirinya dari zat asing yaitu antibodi terlarut dan reseptor sel T yang mengikat sel. Antibodi memiliki molekul protein berbentuk-Y yang mengandung empat rantai polipeptida. Molekul ini mempunyai sisi pengikat yang bersifat komplementer terhadap bentuk struktur spesifik molekul antigen. Molekul antibodi memiliki dua sisi pengikat, yang membuatnya mampu membentuk kisi-kisi tiga dimensi molekul antibodi dan antigen (Lehninger, 1998). Antibodi merupakan populasi molekul protein (immunoglobulin) yang disintesis oleh binatang sebagai respon terhadap suatu makromolekul asing, yang disebut antigen atau imunogen. Antibodi mempunyai afinitas tinggi terhadap antigen yang menginduksi pembentukannya. Molekul kecil asing (hapten) menimbulkan pembentukan antibodi spesifik bila mereka menempel pada suatu makromolekul. Sintesis antibodi terjadi dengan seleksi dan tidak dengan instruksi. Suatu antigen terikat ke permukaan limfosit yang memang sudah disiapkan untuk pembuatan antibodi spesifik terhadap antigen tersebut. Penggabungan antigen dan reseptor permukaan memicu pembelahan sel dan sintesis sejumlah besar antibodi spesifik. Antibodi yang diarahkan melawan suatu determinan yang spesifik biasanya heterogen, karena merupakan produk dari banyak sel penghasil antibodi. Antibodi yang dihasilkan oleh suatu sel tunggal adalah homogen (Stryer, 2002). 25 Lima kelas antibodi dibuat, Immunoglobulin G (IgG) adalah antibodi utama dalam serum, tetapi IgM adalah kelas immunoglobulin yang pertama muncul setelah pemaparan terhadap suatu antigen. IgA adalah kelas yang paling banyak dalam sekret eksternal dan IgE melindungi terhadap parasit, sedangkan peran IgD belum diketahui. Antibodi terdiri dari rantai pendek dan rantai panjang (Stryer, 2002). Kelas Immunoglobulin Massa (kDa) IgG 150 IgA 180 – 500 IgM 950 IgD 175 IgE 200 Tabel 1. Data Bobot Molekul Immunoglobulin dalam Serum 2.5.4 Interaksi Antara Antigen-Antibodi Antigen adalah bahan yang dapat diikat secara spesifik oleh molekul antibodi atau molekul reseptor pada sel T. Antibodi dapat mengenal hampir setiap molekul biologik sebagai antigen seperti hasil metabolik hidrat arang, lipid, hormon, makromolekul seperti kompleks hidrat arang, fosfolipid, asam nukleat dan protein (McGilvery, 1996). 26 Gambar 3. Mekanisme respon imun terhadap antigen McGilvery, 1996). Antibodi dapat bereaksi dengan antigen spesifik berkat adanya tempat pengikatan (combining site). Suatu antibodi tertentu akan bereaksi dengan antigen yang tertentu pula, dan tidak dengan antigen lain karena tiap antibodi memiliki untaian asam amino tersendiri yang khas pada ujung kedua lengannya. Antibodi sering disebut juga immunoglobulin, atau globulin gama. Istilah ini berasal dari sifat migrasi antibodi yang terbanyak jumlahnya, yakni IgG, pada elektroforesis. Bila serum dielektroforesis, fraksi yang terpisah sebagai globulin gama terutama terdiri atas antibodi ini (McGilvery, 1996). 27 Pengenalan antigen oleh antibodi melibatkan ikatan nonkovalen dan reversibel. Berbagai jenis interaksi nonkovalen dapat berperan pada ikatan antigen seperti faktor elektrostatik, ikatan hidrogen, interaksi hidrofobik dan lainnya. Kekuatan ikatan antara satu antibodi dan epitop disebut afinitas antibodi. Antigen polivalen mempunyai lebih dari satu determinan. Kekuatan ikatan antibodi dengan epitop antigen keseluruhan disebut aviditas (Bratawidjaja, 2004). Antibodi merupakan komponen imunitas didapat yang melindungi tubuh terhadap infeksi mikroorganisme dan produknya yang toksik. Interaksi antara antigen dan antibodi dapat menimbulkan berbagai akibat antara lain presipitasi (bila antigen merupakan bahan larut dalam cairan garam fisiologik), aglutinasi (bila antigen merupakan bahan tidak larut/partikelpartikel kecil), netralisasi (toksin) dan aktivasi komplemen. Kebanyakan reaksi tersebut terjadi oleh adanya interaksi antara antigen multivalen dan antibodi yang sedikitnya memiliki 2 tempat ikatan per molekul (Bratawidjaja, 2004). 2.6 IMUNOLOGI DARAH Semua sel darah dibentuk dalam sumsum tulang. Proses pembentukan disebut hematopoesis. Semua sel darah memiliki fungsi masing-masing. Sel darah merah (eritrosit) memiliki reseptor komplemen yang dapat mengikat kompleks imun. Sel darah merah mengangkut kompleks imun ke hati untuk dilepas ke sel Kupffer yang memakannya. Jadi sel darah merah berperan penting dalam eliminasi kompleks imun dari sirkulasi terutama pada infeksi 28 yang persisten dan beberapa penyakit autoimun, sel darah merah tidak memiliki inti berbeda dengan sel darah putih (leukosit) (Baratawidjaja, 2004). Leukosit adalah sel darah yang mengandung inti, berbentuk bulat dan berupa sel amoebid pleikorfik di dalam jaringan, berdasarkan jenis granula dalam sitoplasma dan bentuk intinya. Sel darah putih dibagi menjadi dua golongan yaitu granulosit (polimorfonuklear) dan agranulosit (mononuclear). Leukosit granulosit mencakup neutrofil dan basofil. Leukosit agranulosit mencakup limfosit dan monosit. Manfaat sesungguhnya dari sel darah putih ialah bahwa kebanyakan ditranspor secara khusus ke daerah yang terinfeksi dan mengalami peradangan yang serius (Baratawidjaja, 2004). Sel-sel sistem imun tersebar di seluruh tubuh dan ditemukan di dalam sumsum tulang, timus, darah, kelenjar getah bening, limpa, saluran nafas, saluran cerna, saluran kemih dan jaringan. Sel-sel tersebut berasal dari sel prekusor yang multipoten dalamsum-sum tulang yang kemudian berdiferensiasi menjadi dua golongan sel progenitor. Golongan sel progenitor pertama berkembang menjadi : 1. Megakariosit, sel asal trombosit 2. Eritroid, sel asal eritrosit 3. Sel myeloid, sel asal granulosit, sel mast/basofil, eosinofil, monosit dan makrofag. Golongan sel progenitor yang kedua berkembang menjadi sel limfoid, asal sel B dan sel T. Perkembangan sel B terjadi di sum-sum tulang, sedang sel T berkembang dalam timus dari prekusor timosit yang juga berasal dari sum-sum tulang. Sel myeloid kemudian berkembang menjadi sel-sel yang 29 berperan dalam sistem imun nonspesifik dan sel limfoid menjadi sel-sel yang berperan dalam sistem imun spesifik (Baratawidjaja, 2004). 2.6.1 SERUM Di dalam darah, serum merupakan komponen yang bukan merupakan sel darah ataupun faktor pembeku darah, serum merupakan plasma darah dengan fibrinogen yang telah dipisahkan. Serum mengandung semua protein yang tidak digunakan dalam mekanisme pembekuan darah. Serum mengandung semua elektrolit, antibodi, antigen, hormon, dan substansi eksogen ( misalnya obat dan mikroorganisme) (Kresno, 2003). Protein darah juga disebut protein serum (serum proteins), merupakan protein yang ditemukan dalam plasma darah . Total serum protein dalam darah adalah 7 g/dl, yang merupakan 7% dari total volume darah. Protein darah memiliki berbagai fungsi antara lain : (1) Tempat sirkulasi transpor molekul seperti lipid, hormon, vitamin dan mineral. (2) Enzim komplemen komponen, protease inhibitor, dan prekusor kinin. (3) Regulasi dari aktivitas acelular dan berperan penting dalam sistem imun. Protein darah Level normal % Fungsi Albumin 3.5-5.0 g/dl 60% Mengatur tekanan osmotik dan transport molekul yang lain Immunoglobulin 1.0-1.5 g/dl 18% Berperan penting dalam sistem imun dalam tubuh Menetralkan tripsin yang telah diproses dalam sistem pencernaan alpha 1-antitrypsin Protein regulator <1% Regulasi ekspresi gen Tabel 2. Fungsi protein darah dalam tubuh (Hames, 1998). 30 Serum adalah salah satu bagian dari plasma darah yaitu pada protein. Protein memiliki molekul yang cukup besar. Jika darah diputar dalam sentrifuge, maka protein tersebut akan mengendap, sisanya berupa cairan bening dan jernih yang disebut serum. Dalam serum terdapat zat antibodi untuk membinasakan protein asing atau antigen yang merangsang pembentukan zat antibodi, yang masuk kedalam tubuh. Pemisahan protein serum dapat dilakukan dengan elektroforesis, pemisahan tersebut merupakan alat diagnosis yang sangat berharga untuk memantau kemajuan klinis. Sehingga serum juga digunakan dalam beberapa tes diagnostik (Hames, 1998). Gambar 4. Pemisahan protein serum dengan elektroforesis (Hames, 1998). 2.7 PROTEIN Protein adalah suatu makro-molekul. Yang terkecilpun mempunyai berat molekul dalam ukuran 6000 Da dan beberapa mempunyai berat molekul lebih besar dari 1 juta Da. Semua protein terdiri atas satu atau lebih polimer yang linier dan tak bercabang. Monomer yang membuat polimer ini disebut 31 asam amino. Dalam kebanyakan protein terdapat 20 jenis asam amino. Asam amino terikat menjadi satu rantai dalam jumlah 100 sampai 300 (Kimball, 1993). Protein adalah sumber asam-asam amino yang mengandung unsurunsur C, H, O, dan N yang tidak dimiliki oleh lemak atau karbohidrat. Molekul protein mengandung pula fosfor, belerang, dan ada jenis protein yang mengandung unsur logam seperti besi dan tembaga (Winarno, 1992). Protein merupakan makromolekul polipeptida yang tersusun dari sejumlah L-amino yang dihubungkan oleh ikatan peptida, berbobot molekul tinggi dari 5000 sampai berjuta-juta. Suatu molekul protein disusun oleh sejumlah asam amino tertentu (Girindra, 1990). Molekul protein merupakan molekul dengan tingkat kompleksitas atau kerumitan yang tinggi. Selain berbeda satu sama lain karena perbedaan muatan listriknya, protein mungkin pula berbeda karena berat molekul atau jumlah ukuran molekulnya. Ini berarti, perbedaan tersebut disebabkan oleh jumlah asam amino yang menyusun protein. Berdasarkan perbedaan berat atau ukuran molekul ini, protein dapat dipisahkan satu sama lain. Yaitu dengan tehnik elektroforesis menggunakan gel poliakrilamid sebagai medium pemisah. Dalam cara ini, mula-mula protein didenaturasi dengan pemanasan dalam larutan dapar yang mengandung sodium dodesil sulfat (SDS). Denaturasi dalam SDS panas ini akan memberikan muatan negatif pada seluruh protein dalam larutan, karena terjadi interaksi hidrofobik antara molekul protein dengan molekul SDS. Interaksi ini sebanding dengan ukuran ukuran molekul protein. Jadi, makin besar ukuran molekul suatu protein, 32 makin banyak muatan listrik, kompleks protein terdenaturasi-SDS di dalam gel poliakrilamid akan berjalan satu arah, yaitu kutub positif (anoda). Jarak yang ditempuh ditentukan oleh ukuran molekul dalam menembus pori-pori gel. Makin kecil molekul tersebut, makin jauh jarak yang ditempuh. Dengan demikian terjadilah pemisahan protein berdasarkan berat molekul. Pada umumnya, teknik pemisahan protein dengan elektroforesis ini digunakan untuk tujuan analisis (Kurniati, 2002). Protein memegang peran penting dalam hampir semua proses biologi. Peran dan aktivitas protein terlihat dalam contoh berikut ini : 1 Katalisis enzimatik. Hampir semua reaksi kimia dalam sistem biologi dikatalisis oleh makromolekul spesifik yang disebut enzim. Sebagian reaksi seperti hidrasi karbondioksida bersifat sederhana, sedangkan reaksi lainnya seperti replikasi kromosom sangat rumit. Enzim mempunyai daya daya katalitik besar. Fakta menunjukkan bahwa hamper semua enzim yang dikenal adalah protein. Jadi protein merupakan pusat dalam menetapkan pola transformasi kimia dalam sistem biologis. 2 Transport dan penyimpanan Berbagai molekul kecil dan ion ditransport oleh protein spesifik. Misalnya transport oksigen dalam eritrosit oleh hemoglobin, dan mioglobin suatu protein sejenis mentransport oksigen dalam otot. 3 Koordinasi gerak Protein merupakan komponen utama dalam otot. Kontraksi otot berlangsung akibat pergeseran dua jenis filamen protein. Contoh lain 33 adalah pergerakan kromosom pada proses mitosis dan gerak sperma oleh flagela. 4 Penunjang mekanis. Ketegangan kulit dan tulang disebabkan oleh adanya kolagen yang merupakan protein fibrosa. 5 Proteksi imun Antibodi merupakan protein yang sangat spesifik dan dapat mengenal serta berkombinasi dengan benda asing seperti virus, bakteri dan sel yang berasal dari organisme lain. Protein berperan penting untuk membedakan dirinya dan zat asing yang masuk ke dalam tubuh. 6 Membangkitkan dan menghantar impuls saraf Respon sel saraf terhadap rangsang spesifik diperantarai oleh protein reseptor. Misalnya rodopin suatu protein yang sensitif terhadap cahaya ditemukan pada sel batang retina. 7 Pengaturan pertumbuhan dan diferensiasi Pengaturan urutan ekspresi informasi genetik sangat penting bagi pertumbuhan yang beraturan serta diferensiasi sel. Hanya bagian kecil genom dalam sel yang akan diekspresikan pada satu saat. Bermacam-macam fungsi protein bagi tubuh, diantaranya sebagai enzim, zat pengatur pergerakan, pertahanan tubuh, alat pengangkut dan lainlain tergantung sepenuhnya pada stuktur 3-dimensional protein tersebut. Pada suatu protein dapat dibubuhkan suatu zat yang dapat merubah struktur sekunder, tersier, dan kuartener dari protein tersebut (Stryer, 2002). 34 2.7.1 Denaturasi Protein Denaturasi protein dapat diartikan suatu perubahan atau modifikasi terhadap struktur sekunder, tersier, dan kuartener terhadap molekul protein, tanpa terjadinya pemecahan ikatan-ikatan kovalen. Karena itu denaturasi dapat diartikan pula suatu proses terpecahnya ikatan hidrogen, interaksi hidrofobik, ikatan garam dan terbukanya lipatan molekul. Protein yang terdenaturasi berkurang kelarutannya. Denaturasi protein dapat dilakukan dengan panas, pH, bahan kimia dan mekanik (Kimball, 1993). Ada dua macam denaturasi, yaitu pengembangan rantai peptida dan pemecahan protein menjadi unit yang lebih kecil tanpa disertai pengembangan moekul. Deterjen atau sabun dapat menyebabkan denaturasi protein, karena senyawa ini dapat membentuk jembatan antara gugus hidrofobik dengan hidrofilik sehingga praktis terdenaturasi (Winarno, 1992). Rantai polipeptida sebuah molekul protein mempunyai satu konformasi yang sudah tertentu pada suhu dan pH normal. Konformasi ini disebut konformasi asli, sangat stabil sehingga memungkinkan protein bisa diisolasi dalam keadaan konformasi aslinya itu. Kebanyakan protein hanya berfungsi aktif biologis pada daerah pH dan suhu yang terbatas. Jika pH dan suhu berubah melewati batas-batas tersebut, protein akan mengalami denaturasi. Kebanyakan denaturasi terjadi sekitar suhu 50-60 0C (Girindra, 1990). Sebagian besar molekul protein menampakkan aktivitas biologiknya pada kisaran pH dan suhu tertentu. Pada pH dan suhu yang tinggi maka protein globular mengalami perubahan fisik yang dinamakan denaturasi. 35 Salah satu sifat yang tampak adalah kelarutannya yang menurun. Struktur primer protein tidak mengalami perubahan. Denaturasi tidak lain adalah terbukanya lipatan alamiah struktur protein. Apabila yang mengalami perubahan struktur alamiah itu adalah enzim maka aktivitas biologiknya menghilang. Jika denaturasi protein itu belum lanjut maka polimer itu bisa melipat lagi dan kembali pada struktur alamiahnya (Martoharsono, 1981). 2.7.2 Penentuan Kuantitas Protein dengan Metode Lowry Metode Lowry dikembangkan pada tahun 1951 dengan menggunakan reagen pendeteksi Folin-Ciocalteu. Reagen ini biasa digunakan untuk mendeteksi gugus-gugus fenolik. Dalam analisa protein reagen FolinCiocalteu dapat mendeteksi residu tirosin yang mengandung gugus fenolik melalui reaksi reduksi oksidasi dimana gugus fenolik tirosin akan mereduksi fosfotungstat dan fosfomolibdat yang terdapat pada reagen tersebut menjadi tungsten dan molibden yang berwarna biru. Hasil reduksi ini dapat dianalisa lebih lanjut dengan melihat puncak absorpsi yang lebar pada daerah panjang gelombang sinar tampak (600-800 nm) (Dennison, 2002). Metode Lowry merupakan pengembangan dari metode Biuret. Dalam metode ini terlibat 2 reaksi. Awalnya, kompleks Cu(II)-protein akan terbentuk sebagaimana metode biuret, yang dalam suasana alkalis Cu(II) akan tereduksi menjadi Cu(I). Ion Cu+ kemudian akan mereduksi reagen FolinCiocalteu, kompleks phosphomolibdat-phosphotungstat (phosphomolybdotungstate), menghasilkan heteropolymolybdenum blue akibat reaksi oksidasi gugus aromatik (rantai samping asam amino) terkatalis Cu, yang memberikan warna biru intensif yang dapat dideteksi secara 36 kolorimetri. Kekuatan warna biru terutama bergantung pada kandungan residu tryptophan dan tyrosine-nya. Keuntungan metode Lowry adalah lebih sensitif (100 kali) daripada metode Biuret sehingga memerlukan sampel protein yang lebih sedikit. Batas deteksinya berkisar pada konsentrasi 0.01 mg/ml. Namun metode Lowry lebih banyak interferensinya akibat kesensitifannya (Dennison, 2002). Spektrofotometer merupakan suatu alat yang digunakan untuk mengukur energi yang diserap oleh suatu zat. Suatu sinar monokromatik yang dilewatkan pada suatu zat diserap oleh zat tersebut dan sisa sinar diteruskan. Penyerapan (absorban) suatu zat berbanding lurus dengan konsentrasinya. Pada penelitian ini spektrofotometer yang digunakan merupakan spektrofotometer visibel. Daerah visibel berada pada rentang 400-800 nm. Pada daerah visibel penentuan kadar protein dapat dilakukan dengan mereaksikan protein dengan suatu zat warna, misalnya coommassie brilliant blue G-250. Ikatan protein-coommassie mempunyai panjang gelombang maksimum pada 590 nm (Rodrigues, 2005). Kadar protein dapat ditentukan dengan membaca pada kurva standar, kurva standar dibuat dengan larutan protein murni yang telah diketahui kadar proteinnya misalnya BSA (bovine serum albumin) yang memiliki rentang konsentrasi tertentu dimana konsentrasi sample protein berada di dalam rentang tersebut dengan konsentrasi yang semakin tinggi (Sudarmadji, 1981). 2.8 ELEKTROFORESIS Elektroforesis merupakan tehnik pemisahan suatu molekul dalam suatu campuran di bawah pengaruh medan listrik. Molekul terlarut dalam 37 medan listrik bergerak atau migrasi dengan kecepatan yang ditentukan oleh rasio muatan dan massa. Sebagai contoh, jika dua molekul mempunyai massa dan bentuk yang sama, molekul dengan muatan lebih besar akan bergerak lebih cepat ke elektrode (Yuwono, 2005). Elektroforesis melalui gel agarosa atau poliakrilamid merupakan metode standar untuk pemisahan, identifikasi, dan pemurnian fragmen DNA. Selain itu elektroforesis gel poliakrilamid dapat juga digunakan untuk pemisahan, identifikasi, dan pemurnian protein. Teknik ini merupakan teknik sederhana, cepat dan dapat memisahkan molekul yang diinginkan dari matriksnya yang tidak dapat dilakukan oleh prosedur lainnya, seperti sentrifugasi gradien (Sudjadi, 2008). Suatu molekul yang bermuatan akan bergerak dalam medan listrik. Fenomena ini dikenal sebagai elektroforesis, dapat digunakan untuk memisahkan protein atau makromolekul lain seperti DNA dan RNA. Kecepatan migrasi (v) protein atau makromolekul lain dalam medan listrik tergantung pada kekuatan medan listrik tergantung pada kekuatan medan listrik (E), muatan protein (z) dan koefisien pergesekan (f) v = Ez f Kekuatan listrik (Ez) yang menggerakkan molekul kearah elektroda yang bermuatan berlawanan dihambat oleh fv yang timbul akibat gesekan molekul pada medium. Koefisien pergesekan (f) tergantung pada massa dan bentuk molekul yang bergerak dan viskositas (𝜂) medium (Lehninger, 1994). 38 Pemisahan secara elektroforesis hampir selalu dilakukan dalam gel, tidak dalam larutan dengan dua alasan, pertama gel mengurangi arus listrik yang timbul akibat perbedaan suhu yang kecil yang diperluan agar pemisahan menjadi efektif. Kedua, gel bertindak sebagai saringan molekul yang meningkatkan pemisahan. Molekul yang lebih kecil dibanding dengan poripori gel dapat bergerak dengan mudah di dalam sedangkan molekul yang lebih besar hamper tidak bergerak. Molekul dengan ukuran sedang dapat bergerak didalam gel sesuai ukuraannya. Media pilihan pada elektroforesis adalah gel poliakrilamida, sebab secara kimiawi bersifat inert dan dapat dengan mudah dibentuk dari polimerisasi akrilamida. Selain itu ukuran pori dapat diatur dengan memilih berbagai konsentrasi akrilamid dan metilenbisakrilamida (reagen pengikat) pada saat polimerisasi (Sudjadi, 2008). Setelah didenaturasi protein dapat dipisahkan berdasarkan massanya dengan elektroforesis gel poliakrilamida. Campuran protein mula-mula dilarutkan dalam larutan natrium dodesil sulfat (SDS), suatu detergen anoinik yang akan memutus hampir semua interaksi kovalen dalam protein alami. Juga ditambahkan merkaptoetanol atau ditiotreitol untuk mereduksi ikatan disulfida. Anion SDS akan berikatan pada rantai utama dengan perbandingan satu SDS untuk tiap dua residu asam amino, sehingga terbentuk kompleks SDS dengan protein terdenaturasi yang bermuatan negatif tinggi yang secara kasar sebanding dengan massa protein. Muatan negatif akibat pengikatan SDS ini umumnya lebih besar dari pada muatan protein alami ini menjadi tidak penting lagi. Pada kompleks SDS-protein terdenaturasi kemudian 39 dilakukan elektroforesis pada gel poliakrilamida, dalam bentuk lempeng tegak lurus. Arah elektroforesis dari atas ke bawah. Setelah terjadi pemisahan, protein dalam gel dapat diperlihatkan setelah diwarnai dengan Coommassie blue, yang akan terlihat sebagai pita-pita (Stryer, 2002). Protein kecil bergerak cepat dalam gel, sedangkan protein besar tinggal di atas, berdekatan dengan titik aplikasi campuran. Pergerakan sebagian rantai polipeptida pada kondisi seperti ini berbanding lurus dengan logaritma massanya. Elektroforesis SDS-gel poliakrilamid bersifat cepat, peka dengan kemampuan resolusi yang tinggi. Proses elektroforesis dan pewarnaan berlangsung beberapa jam. Sejumlah 0,1 mikrogram (2 pmol) protein menghasilkan pita yang jelas dengan pewarnaan coommassie blue dan dalam jumlah lebih sedikit (kira-kira 0,02 mikrogram) dapat dideteksi dengan pewarnaan perak (Stryer, 2002). 2.8.1 Gel Poliakrilamid Akrilamid merupakan suatu monomer, yang jika ada radikal bebas, biasanya diberikan oleh amonium persulfat dan distabilkan oleh TEMED, terjadi reaksi berantai sehingga monomer terpolimerasi manjadi rantai panjang. Jika dalam reaksi itu ada bisakrilamid reaksi menjadi bersambung melintang menjadi gel yang pori-porinya ditentukan oleh panjang rantai dan jumlah sambungan silang. Panjang rantai ini ditentukan oleh konsentrasi poliakrilamid dalam reaksi ini (3,5 %- 20%) dan satu molekul sambungan silang terjadi pada setiap 29 monomer akrilamid (Stryer, 2002). 40 Gambar 5. SDS-Polyacrylamide Gel Electrophoresis (Sudjadi, 2008) Gel poliakrilamid dibuat dengan cara menuangkan antara dua lempeng kaca yang dipisahkan dengan pembatas dengan ketebalan tertentu. Gel poliakrilamid dapat berukuran dari 5 cm samapai 50 cm panjangnya tergantung pada keperluannya dan dilakukan elektroforesis dengan cara vertikal. Sistem ini menunjukkan tiga keunggulan daripada gel agarosa : 1. Kekuatan pemisahannya sangat besar sehingga dapat memisahkan satu pasang basa sampai 500 pasang basa 2. Sistem ini dapat menampung jumlah sample lebih besar daripada agarosa 3. DNA yang diperoleh kembali dari gel poliakrilamid sangat murni sehingga dapat digunakan untuk keperluan percobaan mikroinjeksi embrio tikus (Yuwono, 2008). 2.8.2 SDS-Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE) Protein dapat dipisahkan berdasarkan ukuran massanya dengan elektroforesis gel poliakrilamid dengan sistem tegak. Sebelumnya campuran protein dipanasi dengan natrium dedosil sulfat (SDS), suatu detergen anionik untuk menyelubungi molekul protein. Penyelubungan ini menyebabkan 41 interaksi non-kovalen terganggu sehingga molekul protein dalam struktur primer. Anion SDS berikatan dengan rantai utama dengan rasio satu molekul SDS untuk dua residu asam amino (Sudjadi, 2008). Gambar 6. Prinsip Kerja SDS PAGE (Stryer, 2002) ((1)Denaturasi sample dengan sodium dedocylsulfate (SDS menyelubungi protein. (2) Penempatan protein sampel pada gel kemudian dialiri listrik. (3) Pewarnaan untuk visualisasi pemisahan pita). Sistem dapar yang umumnya digunakan pada elektroforesis protein dengan gel poliakrilamid-SDS adalah sistem dapar diskontinu. Sistem ini menggunakan ion dapar yang berbeda dalam gel dan larutan dapar elektroda. Keunggulan sistem ini adalah pemisahan protein berlangsung lebih baik dan lebih tajam. Gel yang digunakan pada sitem ini terdiri dari gel penumpuk (stacking gel) yang berpori besar dan gel pemisah (separating/ resolving gel) yang berpori kecil. Gel penumpuk berada di atas gel pemisah dan (separating/ resolving gel) yang berpori kecil. Sedangkan sampel diletakkan diatas gel penumpuk. Molekul sampel yang 42 melewati gel penumpuk dengan cepat akan bertumpuk dalam suatu zona yang sangat sempit (stacks). Sampel yang tertumpuk itu akan bergerak sepanjang gel penumpuk yang berpori besar dan kemudian masuk ke gel pemisah berpori kecil sebagai suatu pita yang tipis setelah memasuki gel pemisah, molekul sampel terpisah berdasarkan muatan dan ukuran (Yuwono, 2008). Untuk memisahkan protein berdasarkan berat molekul dapat dilakukan dengan menambahkan suatu detergen ionik pada tahap denaturasi. Pada proses persiapan sampel ditambahkan suatu detergen ionik seperti sodium dodesil sulfat (SDS). SDS akan menghilangkan konformasi di antara protein-protein tersebut dengan cara memberi muatan negatif. Agar seluruh rantai terpapar pada detergen dilakukan pemanasan pada suhu 100 0C selama 2 sampai 5 menit, dengan cara ini sebagian besar polipeptida akan diselubungi oleh SDS dengan rasio tertentu (1,4 gr per gram protein). Kompleks SDS-polipeptida berbentuk seperti batang dan bermuatan negatif, dan muatan ini tidak dipengaruhi oleh pH pada kisaran pH 7-10. Dengan demikian, migrasi polipeptida dalam gel poliakrilamid adalah berdasarkan berat molekulnya. Kecepatan migrasi protein selama elektroforesis akan berbanding terbalik dengan berat molekulnya. Makin besar molekul makin lambat migrasinya (Sudjadi, 2008). Gel poliakrilamid dibentuk oleh polimerisasi akrilamid (CH2=CHCO-NH2) dan bisakrilamid (N,N’-metilenbisakrilamid) (CH2=CH-CO-NHCH2-NH-CO-CH=CH2). Reaksi pembentukan polimer ini diawali suatu sistem yang menghasilkan radikal bebas. Umumnya, polimerisasi diawali 43 dengan menambahkan amonium persulfat (APS), sebagai inisiator dan tetraetilendiamin (TEMED), sebagai akselerator. Pada sistem ini TEMED mempercepat pemecahan molekul APS menjadi sulfat radikal bebas, yang selanjutnya akan mengawali reaksi polimerisasi akrilamid yang panjang, yang menghasilkan larutan kental namun bukan berupa gel. Dengan penambahan bisakrilamid, pada rantai akrilamid tersebut akan terbentuk ikatan lintas silang (cross-link) pada interval tertentu sehingga terbentuk suatu jaringan dengan besar pori tertentu. Konsentrasi akrilamid menentukan ukuran pori-pori gel yang terbentuk sehingga ukuran pori dapat diatur dengan mengatur konsentrasi akrilamid. Makin rendah konsentrasi akrilamid yang digunakan, makin besar ukuran pori-pori gel, namun gel menjadi lunak dan mudah patah. Merkaptoetanol atau ditiotreitol juga ditambahkan untuk mereduksi ikatan disulfida. Kompleks SDS dengan protein terdenaturasi mempunyai jumlah muatan negatif yang sebanding dengan ukuran protein. Muatan negatif yang terdapat pada ikatan SDS ini jauh lebih besar daripada mutan pada protein asli. Kompleks protein-SDS kemudian dielektroforesis sehingga semua molekul bergerak menuju kutub positif. Ketika elektroforesis selesai, protein dalam gel dapat ditampakkan oleh pewarnaan dengan perak atau zat warna seperti Coommassie blue, yang akan menampakkan beberapa pita. Coommassie blue berikatan dengan protein berdasarkan interaksi ionik antara gugus sulfit pada Coommassie blue dengan asam-asam amino basa, dan interaksi hidrofobik cincin Coommassie blue (Stryer, 2002). 44 Pewarna mampu menghasilkan pita pada jumlah protein 10-100 ng. Protein kecil akan bergerak cepat melewati gel, sedangkan protein besar bergerak lebih lambat. Mobilitas kebanyakan polipetida di bawah kondisi seperti ini berbanding lurus terhadap log ukurannya. Beberapa protein yang banyak mengandung karbohidrat dan protein membran tidak mengikuti aturan ini. Akan tetapi metode SDS-PAGE ini sangat cepat, peka dan dapat menghasilkan pemisahan yang baik. Sebanyak sekitar 0,1 mg (2 pmol) protein menghasilkan pita yang jelas dengan pewarna Coommassie blue. Pada jumlah yang kecil (0,02 mg) dapat dideteksi dengan pewarna perak. Protein dengan perbedaan ukuran seitar 2% (misalnya 40 dan 41 kD) biasanya dapat ditunjukan (Sudjadi, 2008). BAB III KERANGKA KONSEP Kendala peningkatan produksi ternak susu menurun mmmmmmmmmmmm mmmmmemenurunmen Mastitits urun Pengobatan K. pneumoniae Coliform Antibiotik Kurang efektif Resisten antibakteri Biaya mahal Alternatif K. pneumoniae Vaksin Inaktivasi Pemanasan Inaktivasi Iradiasi Uji In vivo Analisa Kondisi Fisik, SDM, SDP Analisa Kadar Protein Terbentuk sistem imunitas Analisa profil protein Elektroforesis SDS PAGE Gambar 7. Bagan Kerangka Konsep 45 BAB IV METODOLOGI PENELITIAN 4.1 TEMPAT DAN WAKTU PENELITIAN 4.1.1 Tempat Penelitian Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Nutrisi, Kesehatan dan Reproduksi Ternak (PATIR), Badan Tenaga Nuklir Nasional (BATAN), Pasar Jumat Jakarta Selatan. 4.1.2 Waktu Penelitian Penelitian ini berlangsung selama 5 bulan pada bulan Juni 2009 sampai dengan Oktober 2009. 4.2. ALAT DAN BAHAN PENELITIAN 4.2.1 Alat Penelitian Alat-alat yang digunakan adalah Autoklaf (Tommy SS-325), Inkubator (Memmert), Inkubator shaker (SM 25), Laminar Air Flow (Enviromental Air Control, Inc.), Mikropipet (Gilson), Sentrifuge 10000 rpm (Hitachi), Sonikator (Branson 2210), Spektrofotometer (WPA & Ultrospec 100 pro Amersham Biosciences), Mikropipet ukuran 100 ul, 1000 ul, dan 5000 ul, sarung tangan, kandang mencit, masker, botol semprot, tips, kain kassa, timbangan analitik, gelas ukur, gelas beker, labu Erlenmeyer, ose, pembakar spiritus, tabung sentrifus, tabung eppendorf, shaker, vortex, gunting bedah, pinset dan alat suntik (syringe). 47 4.2.2 Bahan penelitian Bahan yang digunakan adalah strain bakteri Klebsiella pneumoniae (K3) hasil isolasi dari susu sapi perah yang terinfeksi mastitis di Kabupaten Garut, yang resisten terhadap antibiotik, larutan Turk & Hayem, larutan NaCl fisiologis 0,85%, medium Triptose Soy Broth (TSB) Pronadisa, medium Triptic Soy Agar (TSA) Pronadisa, alkohol 95%, aquadest steril, aseton, NaCl 0,85%, larutan Lowry I (Na2CO3 4,9 ml dalam NaOH 0,1 N), larutan Lowry II (Folin dan aquadest (1: 1), standar BSA, buffer Laemmli, gel poliakrilamid 10 %, pewarna Coommassie R-250 dan 32 mencit (Mus musculus) galur Swiss yang diperoleh dari Departemen Kesehatan RI. 4.3. TAHAPAN PENELITIAN 1. Sterilisasi alat, bahan dan media 2. Pembuatan media 3. Inaktivasi bakteri K. pneumoniae dengan pemanasan 65 0C selama 30 menit 4. Inaktivasi bakteri K. pneumoniae dengan iradiasi sinar gamma 800 Gy 5. Injeksi bakteri K. pneumoniae aktif dan kultur hasil inaktivasi 6. Memperhatikan kondisi fisik mencit sebelum vaksinasi 7. Memperhatikan kondisi fisik mencit setelah vaksinasi 8. Pengambilan serum darah mencit pada 0, 6, 24, 48, jam setelah injeksi K. pneumoniae aktif, K. pneumoniae hasil inaktivasi dengan pemanasan, dan K. pneumoniae hasil inaktivasi iradiasi. 48 9. Uji tantang setelah 7 hari (dengan infeksi K. pneumoniae aktif pada mencit yang telah divaksinasi dengan kultur inaktivasi). 10. Pengambilan serum darah mencit pada 0, 6, 24, 48, jam setelah uji tantang. 11. Pengukuran kadar protein serum K. pneumoniae dengan metode Lowry 12. Penghitungan dan analisa sel darah merah 13. Penghitungan dan analisa sel darah putih 14. Karakterisasi profil protein serum darah mencit dengan SDS PAGE. 15. Analisa Statistik 4.4. PROSEDUR PENELITIAN 4.4.1 Pembuatan Medium TSB Ditimbang 18 gr medium TSB lalu dimasukkan ke dalam erlemeyer 500 ml, dilarutkan dengan ditambahkan aquadest sebanyak 200 ml, kemudian di homogenkan menggunakan magnetic stirrer di atas alat pemanas. Kemudian ditambahkan dengan aquadest sampai 500 ml lalu disterilisasi dalam autoklaf pada suhu 121oC selama 15 menit. 4.4.2 Pembuatan Medium TSA Ditimbang 12 gr medium TSA lalu dimasukkan ke dalam Erlenmeyer 500 ml, dilarutkan dengan ditambahkan aquadest sebanyak 300 ml dan agar sebanyak 15 gr, kemudian di homogenkan menggunakan magnetic strirrer di atas alat pemanas dan disterilisasi dalam autoklaf pada 49 suhu 121oC selama 15 menit. Setelah itu dimasukkan ke dalam cawan petri dan ditunggu sampai agarnya membeku. 4.4.3 Inaktivasi K. pneumoniae dengan Pemanasan Sebanyak 30 ml kultur pada fase mid log disentrifugasi pada suhu 4 0C selama 10 menit dengan kecepatan 10.000 rpm dan dibilas dua kali dengan NaCl 0,85%. Pelet yang diperoleh diencerkan hingga jumlah sel 1012 sel/ml dan ditempatkan pada tabung eppendorf sebanyak 4 ml. Kultur kemudian dipanaskan dalam penangas air pada suhu 65 0C selama 30 menit. Kultur hasil pemanasan selanjutnya di uji viabilitasnya dalam medium TSA. Bila tidak ada pertumbuhan koloni maka kultur dapat digunakan untuk percobaan selanjutnya. 4.4.4 Iradiasi Klebsiella pneumoniae dengan Sinar Gamma Kultur pada fase mid log disentrifugasi 10.000 rpm dan dibilas dengan larutan NaCl 0,85% 40 ml sebanyak 2 kali. Pelet yang diperoleh diencerkan hingga diperoleh jumlah sel 108 sel/ml dan ditempatkan di dalam vial gelas sebanyak 10 ml. Selanjutnya diiradiasi gamma dengan dosis 800 Gy di Iradiator Gamma Chamber 4.000 A dengan laju dosis 1089,59 Gy/jam. Kultur hasil iradiasi kemudian dihitung jumlah selnya dengan metode sebar untuk uji inaktivasi dengan cara menanam kembali kultur hasil iradiasi pada medium TSA. Selanjutnya diinkubasi pada suhu kamar selama 1 hari. Dari hasil yang diperoleh, didapatkan dosis inaktif kultur bakteri Klebsiella pneumoniae hasil iradiasi dengan cara melihat pertumbuhan bakteri Klebsiella pneumoniae pada medium TSA (Sugoro, 2004). 50 4.4.5 Persiapan Hewan Uji Mencit yang digunakan adalah mencit betina dengan galur Swiss sebanyak 32 ekor yang dibagi ke dalam 4 kelompok percobaan, yaitu masing-masing 8 ekor untuk kontrol normal dan kontrol negatif, dan masing-masing 8 ekor untuk inaktivasi K. pneumoniae pemanasan 65 0C selama 30 menit dan inaktivasi iradiasi. Sebelum diberikan perlakuan dilakukan pengamatan kondisi fisik dan penghitungan jumlah sel darah merah dan jumlah sel darah putih selama 3 hari. Usia mencit yang digunakan seragam antara 2 atau 3 bulan. Dalam satu kandang terdapat 4 ekor mencit dengan jenis dan jumlah makanan yang sama. Rumus Federer digunakan untuk menentukan jumlah hewan coba yang diperlukan untuk satu perlakuan. (n - 1) (t - 1) > 15 t = Jumlah perlakuan n = Jumlah ulangan dari tiap perlakuan (n - 1) (t - 1) > 15 (n - 1) (4 - 1) > 15 (n - 1) 3 > 15 3n - 3 > 15 3n n >8 >6 Jadi jumlah hewan yang di pakai setiap perlakuan > 6 ekor. 51 4.4.6 Uji In Vivo Uji bahan vaksin terhadap mencit dilakukan dengan 4 perlakuan, yaitu kontrol normal, kontrol negatif, kultur inaktivasi dengan pemanasan 65 0C selama 30 menit dan kultur inaktivasi dengan iradiasi. Pada kontrol negatif, mencit di infeksikan atau disuntik dengan K. pneumoniae aktif, sedangkan pada kontrol negatif, mencit disuntikkan dengan NaCl 0,85%. Pada perlakuan pemanasan dan iradiasi kultur hasil inaktivasi iradiasi disuntikkan pada mencit. 4.4.7 Uji Tantang Setelah 7 hari dari infeksi, mencit pada perlakuan pemanasan 65 0C selama 30 menit dan iradiasi 800 Gy ditantang dengan cara menyuntikkan isolat K. pneumoniae aktif pada mencit secara intraperitonial lalu dilihat profil protein pada selang waktu 0, 6, 24, 48 jam, untuk mengetahui respon imunitasnya. 4.4.8 Pengamatan Persentasi Mortalitas Diamati persentase mortalitas yang terjadi setiap hari selama dua minggu pengamatan. % Mortalitas = ∑ mencit mati X 100% =………% ∑ mencit awal 4.4.9 Pengambilan Serum Darah Diambil darah melalui jantung mencit sebanyak 2 ml pada masingmasing perlakuan (kontrol normal, kontrol negatif, pemanasan 65 0C selama 30 menit dan iradiasi 800 Gy) darah didiamkan selama 24 jam kemudian diperoleh serum berwarna bening pada lapisan atas, serum 52 kemudian diambil dengan mikropipet dan dipindahkan kedalam mikrotube, serum dapat disimpan pada refrigerator. 4.4.10 Penghitungan Jumlah Sel Darah Merah Sebanyak 2 µL darah diambil melalui ekor hewan uji dan dilarutkan pada mikrotub yang berisi 198 µL larutan Hayem. Pengambilan darah diambil setiap hari sampai dua minggu. Sel darah yang telah diambil diencerkan dengan NaCl 800µL selanjutnya di periksa di bawah mikroskop menggunakan kamar hitung Neubauer. Jumlah sel darah dihitung berdasarkan rumus yang tertera pada alat penghitung jumlah sel darah pada produk Blau Brand Germany Improve Neubauer. Rumus menghitung jumlah sel darah merah: Σ sel X FP =..........sel/mm3 0,0025 mm2 X 0,1 mm 4.4.11 Penghitungan Jumlah Sel Darah Putih Sebanyak 2 µL darah diambil melalui ekor hewan uji dan dilarutkan pada mikrotub yang berisi 98 µL larutan Turk. Darah di ambil melalui ekor karena untuk meminimalisir kontaminasi dari luar yang akan menyerang atau yang akan mengakibatkan penyakit pada mencit. Pengambilan darah diambil setiap hari sampai dua minggu. Sel darah yang telah diambil diencerkan dengan NaCl 800µL selanjutnya diperiksa dibawah mikroskop menggunakan kamar hitung Neubauer. Jumlah sel darah dihitung berdasarkan rumus yang tertera pada alat penghitung jumlah sel darah produk Blau Brand Germany Improve Neubauer. 53 Rumus menghitung jumlah sel darah putih: Σ sel X FP =..........sel/mm3 0,01 mm2 X 0,1mm 4.4.12 Pengamatan Kondisi Fisik Diamati kondisi fisik (berat badan, mata, rambut, hidung dan aktifitas gerak) pada mencit setiap harinya selama 2 minggu sebelum, saat perlakuan dan setelah perlakuan. 4.4.13 Pengukuran Protein Serum Darah Mencit Serum darah mencit yang diambil setelah vaksinasi selama 0, 6, 24, 48 jam serta serum darah mencit yang diambil setelah dilakukan uji tantang, kemudian diukur kandungan proteinnya. Jumlah protein total didapatkan dengan cara sebanyak 1 ml serum dalam aseton (1 : 9) dan disonikasi selama 10 menit. Kemudian ditambahkan 5 ml larutan Lowry I dan dibiarkan selama 10 menit. Selanjutnya ditambahkan 0,5 ml larutan Lowry II dan dibiarkan selama 30 menit. Absorban dibaca dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 750 nm. 4.4.14 Karakteristik Profil protein bakteri Klebsiella pneumoniae Pada penelitian ini, profil protein dianalisis dengan menggunakan metode elektroforesis satu dimensi SDS-PAGE dengan sistem buffer Laemmli dan konsentrasi gel poliakrilamida yang digunakan 10%. Kultur hasil iradiasi sinar gamma dan kultur hasil pemanasan diambil sebanyak 20 ul dengan mikropipet ke dalam tabung eppendorf, ditambahkan aseton 54 sebanyak 20 ul dan disonikasi hingga homogen, kemudian didihkan selama kurang 5 lebih menit. 1. Preparat Gel Elektroforesis A. Separating gel (10%) 3% Acrylamide solution 6 ml ditambahkan separating gel buffer (1,5 M Tris-HCl, pH 8,8) sebanyak 4,5 ml, kemudian aquabidest 7,5 ml dan 10% Ammonium persulfate 0,08 ml serta TEMED 0,01 ml B. Stacking gel (4,5%) 3% Acrilamide solution 0,9 ml ditambahkan stacking gel buffer (0,5 M Tris-HCl, pH 6,8) sebanyak 1,5 ml, kemudian aquabidest 3,6 ml dan 10% Ammonium persulfate 0,02 ml serta TEMED 0,01 ml. 2. Pembuatan Kolom Gel Setelah separating gel dibuat kemudian dimasukkan sedikit demi sedikit kedaam alat elektroforesis dengan perlahan-lahan, lalu ditambahkan aquabides untuk meratakan separating gel tersebut. Setelah separating gel membeku dimasukkan stacking gel sedikit demi sedikit, lalu pasang sisir pembentuk kolom biarkan hingga stacking gel membeku lalu angkat sisirnya. Kemudian dipasang hasil gel tersebut pada perangkat elektroforesis. A. Loading sampel Larutan buffer dimasukkan ke dalam tangki elektroforesis. Kemudian sampel sebanyak 10 ul dimasukkan ke dalam kolom gel dengan hatihati lalu dielektroforesis selama kurang lebih 100 menit pada 200 volt, 4 mA. 55 B. Pewarnaan Gel Gel diangkat lalu diwarnai dengan coommassie brilliant blue R-250 staining solution, selama kurang lebih 1 jam. C. Pencucian gel Gel dicuci dengan larutan destain solution coommassie blue R-250, selama kurang lebih 24 jam. D. Gel di Scan Pita-pita yang terbentuk kemudian dianalisis bobot molekulnya. 4.6 ANALISA DATA Untuk menganalisis data hasil elektroforesis SDS PAGE, gel discan, dihitung bobot molekulnya, kemudian dianalisa pita profil proteinnya. Untuk analisis data statistik digunakan Analisis Varian (Anova) satu arah, dengan parameter kadar protein, sel darah merah, sel darah putih dan profil protein, selanjutnya dilakukan analisis lanjutan Metode Duncan. Analisis dengan SPSS v.16 untuk mengetahui apakah ada perbedaan atau pengaruh yang signifikan pada tiap perlakuan. BAB V HASIL DAN PEMBAHASAN 5.1 HASIL PENELITIAN 5.1.1 Persentase Mortalitas Hasil persentase mortalitas mencit pada setiap perlakuan dapat dilihat pada tabel 3. % Mortalitas Waktu Kontrol Negatif 6 jam 24 jam 48 jam 0 100 - Kontrol Vaksinasi Normal Iradiasi 0 0 0 0 0 0 Uji Tantang Pemanasan Vaksinasi Iradiasi Uji Tantang Iradiasi 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Tabel 3. Persentase Mortalitas Mencit Dari data diatas mortalitas atau kematian pada mencit tidak ditemukan pada perlakuan iradiasi 800 Gy, pemanasan 65 0C selama 30 menit dan kontrol normal, tetapi pada perlakuan kontrol negatif kematian mencit mencapai 100 % setelah 24 jam infeksi K. pneumoniae aktif. 56 57 5.1.2 Kondisi Fisik Hasil perlakuan iradiasi 800 Gy terhadap kondisi fisik mencit dapat dilihat pada tabel 4. Perlakuan Kontrol - Kontrol Normal 800 Gy Pemanasan Bagian tubuh Mata Hidung Rambut Cara berjalan Limpa Mata Hidung Rambut Cara berjalan Limpa Mata Hidung Rambut Cara berjalan Limpa Mata Hidung Rambut Cara berjalan Limpa Kondisi Fisik Vaksinasi Uji tantang Tidak normal, merah pucat, berair Berair Berdiri Lambat, Kiposis Membengkak Normal Normal Normal Normal Normal Normal Normal Normal Normal Normal Normal Normal Normal Normal Normal Normal Normal Normal Normal Normal Normal Normal Normal Normal Normal Tabel 4. Kondisi Fisik Mencit Abnormalitas pada kontrol negatif ditunjukkan dengan kondisi mata mencit yang merah pucat dan berair, kondisi hidung mencit berair, berdirinya rambut mencit dan cara berjalan mencit yang cenderung lambat dan kiposis. Sedangkan pada mencit lainnya pada setiap jam di keseluruhan perlakuan menunjukkan kondisi fisik yang normal, hanya terjadi peningkatan suhu tubuh sebesar 39 0C dari suhu normal 37 0C setelah vaksinasi. 58 5.1.3 Analisa Sel Darah Merah & Sel Darah Putih A. Hasil Jumlah Sel Darah Putih Hasil pengukuran jumlah sel darah putih dapat dilihat pada tabel 5. Waktu 0 6 24 48 Kontrol Kontrol Vaksinasi Vaksinasi Negatif Normal Iradiasi Pemanasan Iradiasi 26250 28750 0 0 30000 31250 26250 30000 31250 65000 36250 33750 Uji Tantang 23750 58750 47500 30000 Uji Tantang Pemanasan 30000 70000 40000 27500 32500 65000 40000 27500 Tabel 5. Rata-rata Jumlah Sel Darah Putih Dari data di atas dibuat diagram seperti gambar dibawah ini : 80000 70000 SDP/mm3 60000 50000 0 JAM 40000 6 JAM 30000 24 JAM 20000 48 JAM 10000 0 K- K V Ir 800 V Heat Normal UT Ir UT Heat 800 Gambar 8. Grafik Rata-rata Jumlah Sel Darah Putih. Hasil pengamatan sel darah putih pada perlakuan iradiasi 800 Gy dan pemanasan 65 0C selama 30 menit memiliki pola yang berbeda dengan kontrol normal. Hasil terlihat lebih meningkat pada 6 jam. Infeksi kultur inaktif dan uji tantang mengakibatkan peningkatan jumlah sel darah putih, dan akan kembali normal setelahnya. 59 B. Hasil Jumlah Sel Darah Merah Hasil pengukuran jumlah sel darah merah dapat dilihat pada tabel 6. Waktu Kontrol Negatif 3410000 3490000 0 0 0 6 24 48 Kontrol Vaksinasi Vaksinasi Uji Tantang Uji Tantang Normal Iradiasi Pemanasan Iradiasi Pemanasan 3360000 3470000 3655000 3565000 3145000 3370000 2340000 2405000 2965000 3335000 3440000 3090000 2690000 3435000 3775000 3665000 3515000 2970000 3300000 3855000 Tabel 6. Rata-rata Jumlah Sel Darah Merah. Dari data di atas di buat diagram seperti gambar dibawah ini : 4500000 4000000 SDP / mm3 3500000 3000000 2500000 0 JAM 2000000 6 JAM 1500000 24 JAM 1000000 48 JAM 500000 0 K- K V Ir 800 V Heat Normal UT Ir 800 UT Heat Gambar 9. Grafik Jumlah Rata-rata Sel Darah Merah. Sel darah merah menunjukkan pola yang berbeda dengan normal, pada hasil terlihat sel darah merah mengalami penurunan setelah 24 jam pasca vaksinasi dan uji tantang iradiasi tetapi pola pada uji tantang pemanasan terjadi perbedaan, kemudian jumlah sel darah tersebut kembali normal pada 48 jam. Penurunan sel darah merah menandakan adanya indikasi anemia pada mencit. 60 5.1.4 Analisa Kadar Protein Serum dengan Menggunakan Metode Lowry Hasil analisa Kadar Protein Serum dengan Menggunakan Metode Lowry dapat dilihat pada tabel 7. Perlakuan KK Normal VP24 VP48 UTP6 UTP24 UTP48 Kadar Protein Perlakuan Pemanasan (mg/ml) 141.83 129.33 141.75 112.33 154.58 115.08 133.25 Kadar Protein Perlakuan Iradiasi (mg/ml) 141.83 129.33 153.75 143.33 139.58 138.25 137.25 Tabel 7. Hasil Analisa Kadar Protein Serum Mencit. Dari data diatas dapat dibuat grafik sebagai berikut : 180 160 protein (mg/ml) 140 120 100 Pemanasan 80 Iradiasi 60 40 20 0 K+ K- VP24 VP48 UTP6 UTP24 UTP48 Gambar 10. Grafik Hasil Analisa Kadar Protein Serum Mencit. Dari tabel diatas diketahui bahwa kadar protein meningkat ketika dilakukan vaksinasi iradiasi, hal ini disebabkan karena sistem imun tubuh 61 mulai bekerja, dan tubuh memproduksi suatu protein antibodi untuk mengendalikan antigen yang masuk. 5.1.5 Karakteristik Profil Protein Serum Darah Mencit Setelah Perlakuan A. Profil Protein Seluruh Perlakuan 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 M 200 116 97 66 45 31 21,5 Gambar 11. Hasil foto gel poliakrilamid serum mencit. NO 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 KETERANGAN Vaksinasi Inaktivasi Pemanasan 24 Jam Vaksinasi Inaktivasi Pemanasan 48 Jam Uji Tantang Inaktivasi Pemanasan 6 Jam Uji Tantang Inaktivasi Pemanasan 24 Jam Uji Tantang Inaktivasi Pemanasan 48 Jam Kontrol Negatif Kontrol Normal Vaksinasi Inaktivasi Iradiasi 24 Jam Vaksinasi Inaktvasi Iradiasi 48 Jam Uji Tantang Inaktivasi Iradiasi 6 Jam Uji Tantang Inaktivasi Iradiasi 24 Jam Uji Tantang Inaktivasi Iradiasi 48 Jam Pada profil protein dapat terlihat perbedaan profil protein antara kontrol normal dan kontrol negatif, pada kontrol negatif terjadi peningkatan 62 intensitas warna serta perbedaan letak dan jumlah pita. Jumlah pita pada vaksinasi pemanasan 24 jam sebanyak 8 pita, jumlah pita pemanasan 48 jam sebanyak 9 pita, jumlah pita uji tantang pemanasan 6 jam sebanyak 5 pita, jumlah pita pada uji tantang 24 jam meningkat sebanyak 10 pita, jumlah pita uji tantang pemanasan 48 jam sebanyak 8 pita, jumlah pita vaksinasi iradiasi 24 jam sebanyak 9 pita, jumlah pita vaksinasi iradiasi 48 jam sebanyak 7 pita, jumlah pita meningkat pada uji tantang iradiasi 6 jam sebanyak 8 pita, jumlah pita uji tantang iradiasi 24 jam sebanyak 8 pita, jumlah pita akan meningkat pada uji tantang iradiasi 48 jam sebanyak 12 pita. Pita IgE dideteksi pada 200 kDa dapat terlihat pada perlakuan kontrol negatif, uji tantang pemanasan 24 jam, dan keseluruhan perlakuan uji tantang iradiasi. Pita antibodi IgG dideteksi pada 150 kDa, dapat terlihat pada kontrol negatif, uji tantang pemanasan 48 jam, dan uji tantang pada keseluruhan waktu perlakuan iradiasi, intensitas pita IgG terlihat lebih meningkat serta lebih banyak jumlahnya pada uji tantang vaksin iradiasi dibandingkan uji tantang vaksin pemanasan. Hal ini menunjukkan bahwa vaksin iradiasi lebih banyak menginduksi terbentuknya antibodi yang sangat penting dalam mengatasi infeksi bakteri K. pneumoniae penyebab penyakit mastitis. 63 5.3 PEMBAHASAN Setelah dilakukan inaktivasi dari kultur K. pneumoniae dengan iradiasi dan pemanasan, kemudian hasil inaktivasi tersebut digunakan sebagai bahan vaksin. Setelah diberikan perlakuan hasil pengamatan mortalitas mencit menunjukan bahwa kematian pada mencit tidak ditemukan pada kontrol normal dan perlakuan baik setelah vaksinasi ataupun uji tantang, tetapi pada perlakuan kontrol negatif (K -) kematian mencit mencapai 100% setelah 24 jam induksi K. pneumoniae aktif. Kematian dapat terjadi karena infeksi dari kultur K. pneumoniae aktif, kultur aktif akan menginfeksi organ mencit lebih cepat disaat mekanisme imunitas belum bekerja maksimal sehingga mencit mengalami kematian (Sugoro, 2007). Sebelum mencit mengalami kematian terjadi abnormalitas pada kondisi fisik mencit diantaranya adalah suhu tubuh yang meningkat hingga 39 0C, hal ini disebabkan karena mencit mengalami infeksi pada tubuhnya, dan tubuhnya berusaha menghasilkan antibodi untuk melawan infeksi tersebut, tetapi karena mencit belum pernah terpajan bakteri tersebut sebelumnya mencit tidak dapat mengatasi infeksi tersebut sehingga terjadi kematian. K. pneumoniae memiliki dua tipe antigen pada permukaan selnya sehingga dapat menyebabkan penyakit, antigen ini berperan dalam patogenisitas tersebut (Umeh and Geffen, 2006) Hal berbeda terjadi pada mencit yang telah divaksinasi sebelumnya karena mencit tersebut telah mengenali antigen yang dihasilkan K.pneumoniae sehingga tubuh mencit memproduksi antibodi yang dapat menanggulangi infeksi tersebut sehingga tidak menimbulkan kematian, 64 karena vaksin merupakan suspensi biakan mikroorganisme yang telah dimatikan atau yang hidup tetapi telah diatenuasi (memiliki virulensi yang sudah dilemahkan), yang tidak menimbulkan penyakit dan dapat merangsang pembentukan kekebalan atau antibodi bila diinfeksikan (Gibco, 2000) Pada hasil pengamatan kondisi mencit yang mengalami kematian, mencit tersebut menunjukkan perbedaan mencit normal dilihat dari abnormalitas yang terjadi karena infeksi bakteri, diantaranya adalah setelah terjadi kematian dan dibedah tampak beberapa organ dalam mengalami pembengkakan terutama limpa karena limpa merupakan organ yang berperan penting dalam menetralkan kondisi fisik akibat infeksi, ciri khas lain infeksi disebabkan oleh bakteri K. pneumoniae adalah pembengkakan yang terjadi pada usus karena bakteri K. pneumoniae menyerang organ pencernaan. Hasil pengamatan kondisi fisik mencit (tabel 4) menunjukkan kondisi mata, hidung, rambut, dan cara berjalan mencit pada perlakuan iradiasi 800 Gy, pemanasan 65 0C selama 30 menit dan kontrol normal seluruhnya normal. Kondisi mata mencit setelah divaksinasi dengan bahan vaksin perlakuan iradiasi dan pemanasan tetap normal, yaitu berwarna merah, sedangkan abnormalitas pada kontrol negatif ditunjukkan dengan kondisi mata mencit yang merah pucat dan berair, kondisi hidung mencit berair, berdirinya rambut mencit dan cara berjalan mencit yang cenderung lambat dibandingkan kontrol normal. Abnormalitas pada mencit terjadi karena 65 metabolisme mencit terganggu akibat masuknya kultur aktif K. pneumoniae ke dalam tubuh mencit. Hasil analisa jumlah sel darah putih menunjukkan peningkatan jumlah sel darah putih pada jam keenam, hal tersebut dapat dilihat pada tabel 5. Pada vaksinasi pemanasan 6 jam sebanyak 58750 sel/mm3 dan vaksinasi iradiasi 6 jam sebanyak 65000 sel/mm3pada uji tantang iradiasi 6 jam yaitu 70000 sel/mm3,dan uji tantang pemanasan sebanyak 65000 sel/mm3, sel darah putih berperan dalam produksi antibodi yang digunakan untuk melawan infeksi, jika sel darah putih tinggi bearti tubuh berusaha melawan infeksi yang tengah terjadi, sehingga diketahui bahwa tubuh mulai memproduksi antibodi untuk melawan bakteri K. pneumoniae, kemudian agak menurun pada jam ke 24 dan 48 karena tubuh sudah mulai stabil, Secara statistik sel darah putih tidak ada perbedaan yang bermakna pada setiap kelompok perlakuan (p > 0,05). Jumlah normal sel darah putih dalam setiap millimeter kubik darah terdapat 6.000 sel/mm3 sampai 10.000 sel/mm3 sel darah putih. Rata-rata jumlah normal sel darah putih mencit adalah 7.200 sel/mm3 Hasil analisa sel darah merah menunjukkan penurunan setelah jam keenam pada seluruh perlakuan, kecuali pada uji tantang pemanasan, jumlah sel darah merah mengalami penurunan pada saat vaksinasi iradiasi,dan pada saat vaksinasi pemanasan (2405000 sel/mm3} dibandingkan dengan perlakuan lainnya, hal serupa juga terjadi pada perlakuan uji tantang iradiasi (2965000 sel/mm3). Infeksi kultur inaktif dan uji tantang menyebabkan terjadinya penurunan jumlah sel darah merah, dan akan kembali normal 66 setelahnya. Sel darah merah dibentuk di dalam sumsum tulang, terutama dari tulang pendek, pipih tak beraturan, dari jaringan kanselus pada ujung tulang pipa dan dari sumsum dalam batang iga-iga dan dari sternum. Jumlah normal sel darah merah setiap millimeter kubik darah adalah 4.500.000 sampai 5.500.000. Jumlah sel darah merah mencit betina 6.690 ± 0,192 juta/ml. Tetapi ketika terjadi infeksi terjadi pada sel darah merah terjadi penurunan jumlah suplai oksigen sehingga terjadi penurunan jumlah sel darah merah, ketika infeksi tubuh terfokus untuk meningkatkan imunitas dengan membentuk sel darah putih. Secara statistik pada penghitungan sel darah merah dan sel darah putih tidak ada perbedaan yang bermakna (p > 0,05) dibandingkan dengan mencit normal. Pada pengukuran kadar protein metode yang dipilih adalah metode Lowry. Pemilihan metode ini berdasar atas, pertama ikatan protein dengan protein Lowry lebih stabil sehingga absorban yang terbaca relatif stabil. Kedua interfensi zat lain menjadi lebih kecil karena hanya protein yang hanya berikatan dengan protein Lowry, keunggulan yang lain pengukurannya lebih sensitif (1 µg sampai 100 µg) sehingga data analisa menjadi lebih valid. Akan tetapi, protein yang telah direaksikan dengan suatu zat warna tidak dapat digunakan kembali untuk langkah selanjutnya dan ini menjadi kelemahan metode Lowry. Hasil analisa kadar protein dengan menggunakan metode Lowry menunjukkan pada kadar protein tertinggi ditunjukkan oleh uji tantang pemanasan setelah 6 jam sebanyak 154.58 mg/ml, dan terendah pada vaksinasi pemanasan 48 jam yaitu 112.33 mg/ml karena ketika terjadi 67 infeksi tubuh memproduksi antibodi yang berupa protein, sehingga ketika respon imun terjadi maka akan terjadi pula peningkatan protein yang dapat diamati oleh pengukuran kadar protein. Sedangkan kadar protein kontrol positif lebih besar dari kadar protein kontrol negatif, dari data ini diketahui bahwa respon imun tidak mampu mengatasi adanya infeksi. Sedangkan pada perlakuan vaksinasi 48 jam tubuh telah kembali pada kondisi normal karena jumlah kadar protein lebih rendah dibandingkan kontrol negatif dan vaksinasi 24 jam. Hasil data statistik menunjukkan perbedaan yang bermakna dengan nilai signifikansi < 0,05 yaitu 0,04 dibandingkan denga mencit normal. Dari data analisa kadar protein, diketahui bahwa kedua vaksin dapat dinyatakan telah inaktif dan berhasil mengatasi infeksi K. pneumoniae yang tejadi pada tubuh, vaksin menginduksi tubuh memproduksi antibodi untuk melawan bakteri, kedua vaksin dihasilkan dari bakteri K. pneumoniae aktif yang proteinnya telah mengalami denaturasi, tetapi pada ukuran tertentu sehingga sifat antigennya tidak berubah dan dapat digunakan sebagai bahan vaksin mastitis. Kemudian pada analisa profil protein metode yang digunakan adalah metode elektroforesis. Elektroforesis merupakan tehnik pemisahan suatu molekul dalam suatu campuran di bawah pengaruh medan listrik. Elektroforesis melalui gel agarosa atau poliakrilamid merupakan metode standar untuk pemisahan, identifikasi, dan pemurnian fragmen DNA. Selain itu elektroforesis gel poliakrilamid dapat juga digunakan untuk pemisahan, 68 identifikasi, dan pemurnian protein. Teknik ini merupakan teknik sederhana, cepat dan dapat memisahkan molekul yang diinginkan dari matriksnya. Pada dasarnya satu unit struktur antibodi pada mamalia adalah glikoprotein (berat molekul sekitar 150.000 dalton) yang terdiri dari empat rantai polipeptida. Semua antibodi mempunyai bentuk struktur yang sama yaitu dua rantai pendek (VL) dan dua rantai panjang (VH). Bentuk tersebut dihubungkan dengan bentuk kovalen (disulfida) dan erat hubungannya dengan sequens asam amino yang mempunyai struktur sekunder dan tertier. Setiap rantai pendek (VL) berat molekulnya sekitar 25.000 dalton, Setiap rantai panjang (VH) mempunyai berat molekul sekitar 50.000 dalton (Darmono, 1998). Setelah dilakukan analisa termasuk pengamatan intensitas warna dan jumlah pada hasil profil protein diketahui bahwa perlakuan yang menghasilkan paling banyak pita adalah kontrol negatif, kontrol negatif menunjukkan 10 pita tebal, sedangkan kontrol normal hanya menunjukan 6 pita tebal, pada kontrol negatif mencit diinfeksikan dengan bakteri K. pneumoniae aktif sehingga tubuh berusaha untuk menanggulangi infeksi tersebut dengan memproduksi antibodi dalam jumlah banyak. Dalam analisa ini diketahui bahwa antibodi yang dideteksi terlihat pada kisaran bobot molekul 150 kDa merupakan IgG. IgG merupakan antibodi dominan yang terbentuk terutama ketika tubuh mengalami infeksi. IgM merupakan kelas immunoglobulin yang pertama terbentuk dalam serum setelah infeksi tetapi pada hasil ini tidak terdeteksi karena bobot molekul protein ini sangat tinggi yaitu sekitar 950 kDa, IgG merupakan 69 antibodi utama dalam serum. Pada kejadian infeksi dapat dideteksi pada 150 kDa, IgA merupakan antibodi utama dalam sekret eksokrin dan pertahanan garis depan dalam melawan antigen bakteri dan virus sehingga dapat terlihat pada 180 kDa. Fungsi IgD belum diketahui secara pasti berada pada kisaran 175 kDa, sedangkan kelas immunoglobulin yang penting terhadap proteksi parasit adalah IgE yang terdapat pada kisaran 200 kDa (Stryer, 2002). Profil protein menunjukkan bahwa perlakuan yang dapat menghasilkan pita antibodi pada kisaran bobot molekul tersebut antara lain adalah kontrol negatif, uji tantang pemanasan 48 jam, dan uji tantang pada keseluruhan waktu perlakuan iradiasi, Intensitas pita IgG terlihat lebih meningkat serta lebih banyak jumlahnya pada uji tantang vaksin iradiasi dibandingkan uji tantang vaksin pemanasan. Sehingga dapat diketahui bahwa vaksin iradiasi lebih baik dalam menginduksi antibodi untuk melawan mastitis. BAB VI KESIMPULAN DAN SARAN 6.1 Kesimpulan 1. Vaksinasi bakteri K. pneumoniae hasil inaktivasi iradiasi γ dosis 800 Gy dan pemanasan 65 0C selama 30 menit mempengaruhi hasil kadar protein serum darah mencit secara signifikan. 2. Terdapat perbedaan yang signifikan pada analisa pita profil protein serum mencit yang divaksinasi bakteri K. pneumoniae hasil inaktivasi iradiasi γ dosis 800 Gy dan pemanasan 65 0C selama 30 menit 3. Vaksinasi bakteri K. pneumoniae hasil inaktivasi iradiasi γ dosis 800 Gy dan pemanasan 65 0C selama 30 menit tidak berpengaruh secara signifikan terhadap kondisi fisik, jumlah sel darah merah, sel darah putih pasca vaksinasi dan uji tantang. 4. Vaksin iradiasi lebih baik dalam menginduksi antibodi dilihat dari pita yang dihasilkan pada profil protein daripada vaksin pemanasan. 6.2 Saran Perlu dilakukan pengujian terhadap respon antigen dan antibodi mencit dengan menggunakan metode western blott untuk mengetahui respon imunitasnya secara lebih lanjut, serta analisa in vivo yang dilakukan dengan menggunakan hewan uji yang lebih besar seperti kelinci dan kambing. 70 DAFTAR PUSTAKA Agustina. Efriani. 2008. Profil Protein Bakteri Klebsiella pneumoniae Hasil Inaktivasi Sinar Gamma, Skripsi S1 Jurusan Biologi, Fakultas MIPA. Universitas Sriwijaya. Palembang. Baratawijadja. Karnen G. 2004. Imunologi Dasar Edisi ke-6 : Balai Penerbit Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia. Jakarta. Bagian Biokimia FKUI. 2000. Biokimia Eksperimen Laboratorium. Penerbit FKUI, Jakarta. Ditjen POM. 1995. Farmakope Indonesia Edisi 4. Departemen Kesehatan RI. Jakarta. Duval J. 1997. Treating Mastitis Without Antibiotics. Ecological Agriculture Projects. Journal. http://www.eap.mcgill.ca/Publications/EAP69.htm (akses : 15 Oktober 2009, pukul 20:32). Farid, A. 2005. Heat Shock Proteins dan Kanker: Antara Harapan dan Tantangan .Jurnal.http://www.Faridfaried.com/admin/dokumen/insight.pdf (akses 30 Oktober 2009, pukul 10.25). Gibco Invitrogen Corporation. 2000. Effectiveness of inactivation by gamma irradiation for powder trypsin products. Grand Island. USA. Girindra. Aisyah. 1990. Biokimia I. PT Gramedia. Jakarta. Goldman B. 2002. Heat Shock Proteins Vaccine Potensial : From Basic Science Breaktroughts to feashible Personalized Medicine. http://antigenics. com/whitepapers/hsp_potencial.html. (akses 28 Agustus 2009, pukul 19.04) Hames. B. D. 1998. Gel Electrophoresis of Proteins. Oxford University Press. New York. Hogan J., & K. L. Smith. 2002. Coliform Mastitis. The Ohio State University. Wooster. Ohio. USA. Indriastuti. N. 2008. Profil protein isolat bakteri Klebsiella pneumoniae (K3) hasil inaktivasi dengan pemanasan sebagai bahan vaksin mastitis. skripsi S1. ISTN. Jawetz. Melnick. 2004. Medical microbiology Twenty third edition, International edition. Mc Graw-Hill Companies. 71 72 Kimball. John. W. 1983. Biologi Edisi Kelima, Jilid 1, Alih Bahasa Prof. Dr. Ir. H. Siti Soetarmi Tjitrosomo. Institut Pertanian Bogor. Erlangga. Jakarta. Kresno. Siti B. 2003. Imunologi: Diagnosis dan prosedur laboratorium, Balai Penerbit FKUI. Jakarta Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia. Lehninger. A.L. 1998. Dasar-Dasar Biokimia, Alih Bahasa Dr. Ir. Maggy Thenawidjaya, Institut Pertanian Bogor. Erlangga. Jakarta. Maroney. Mike. 2005. Milk Money Fact. University of Winconsin. Madison. Martoharsono, Soeharso. 1981. Biokimia Jilid 1. Gadjah Mada University Press. Jogjakarta. Mc Gilvery. Robert. 1996. Biokimia, Suatu Pendekatan Fungsional Edisi Ketiga. Airlangga University Press. Surabaya. Paryati. S.P. 2002. Patogenesis Mastitis Subklinis pada Sapi Perah yang Disebabkan Oleh Staphylococcus aureus. Makalah Pengantar Falsafah Sains Program Pasca Sarjana IPB. Bogor. Plastridge. Wayne N. 1986. Bovine Mastitis A symposium. McGraw-Hill Book Company,Inc. New York & London. Poedjiadi A. 1994. Dasar-Dasar Biokimia. UI Press. Yogyakarta. Rodriques-Diaz, R., Wehr. And Tuck, S. 2005. Analytical Techniques for Biopharmaceutical Development. Taylor and Francis. Ruegg,Pamela L. 2001. Evaluating the Effectiveness of Mastitis Vaccine, DVM, MPVM, University of Winconsin, Madison. Santoso. Singgih. 2006. Menguasai Statistik di Era Informasi dengan SPSS 15. PT. Elex Media Komputindo. Jakarta. Soeripto. 2002. Pendekatan konsep Kesehatan Hewan Melalui Vaksinasi, Jurnal Litbang Pertanian, 21 (2).Bogor. Stryer. Lubert. 2002. Biokimia Edisi 4, Volume 1. EGC. Penerbit Buku Kedokteran. Jakarta. Sales, Frazier, Wilson, Knight. 1956. Microbiology Second Edition, General & Apllied. Harper & Brothers. New York. 73 Sanakkayala. N. 2005. Induction of antigen-specific Th1-type Immune Responses by Gamma-irradiated Recombinant Brucella abortus RB51. Clinical and diagnostic laboratory immunology, American Society for Microbiologi Vol.12. No12. Spangler, R. Dohoo & G.P. Keefe. 1997. Physiology and management, Herd Prevalence and Incidence of Streptococcus agalactiae in the Dairy Indstry of Prince Edward Island. Journal of Dairy Science Vol.80, No. 3, Canada. Subronto. 1989. Ilmu Penyakit Ternak I. UGM Press. Yogyakarta. Sudjadi. 2008. Bioteknologi Kesehatan. Penerbit Kanisius. Yogyakarta. Sugoro, Irawan. 2004. Pengontrolan Penyakit Mastitis dan Manajemen Pemerahan Susu. Artikel PATIR BATAN. Sugoro dkk. 2007. Pertumbuhan Streptococus agalactiae Sebagai bakteri penyebab mastitis subklinis pada sapi perah. Seminar Nasional Teknologi Peternakan dan Veteriner. Sugoro. Irawan. 2007. Vaksinasi, Reaksinya dan Nuklir Untuk Ketahanan Tubuh Ternak. Infovet. Jakarta. Sugoro. Irawan. 2007. Peran Teknik Nuklir di Bidang Peternakan, Laboratorium Nutrisi, Reproduksi, dan Kesehatan Ternak. Bidang Pertanian, Pusat Penelitian dan Pengembangan Isotop dan Radioisotop (P3TIR). Sugoro. Irawan, Lelaningtyas, N., Dinardi dan Pikoli, M. R. 2007. Laporan Penelitian : Isolasi Bakteri Coliform dari Susu Sapi yang Terinfeksi Mastitis di Kabupaten Garut. Program Studi Biologi Fakultas Sains dan Teknologi Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah. Jakarta. Suwandi. U. 1990. Perkembangan Pembuatan Vaksin. Cermin Dunia Kedokteran. No. 65. Jakarta. Hal. 5-7. Syukur. A Dadam. 2000. Beternak Sapi Perah, Dinas Peternakan dan Kesehatan Hewan. Propinsi Lampung. Bandar Lampung. Tetriana, D. dan Sugoro, I. 2007. Aplikasi Tehnik Nuklir dalam Bidang Vaksin. Vol .2. Buletein ALARA Umeh, O., and D. Geffen. 2006. Klebsiella Infection, Treatment Surgical Care. diakses dari http://www.emedicine.com/med/topic1237.(pada tanggal 20 Agustus 2009, pukul 15.00). Winarno, F.G. 2002. Kimia Pangan dan Gizi, Cetakan ke-7. PT. Gramedia Pustaka Utama, Jakarta. 74 Wahyuni, Hastuti, T., Teguh, I., & Hariyadi, M,. 2005, Karakterisasi Hemaglutinin Streptococcus agalactiae dan Staphylococcus aureus Penyebab Mastitis Subklinis Pada Sapi Perah., J. Sain Vet. Vol.23. No.2. Yuwono. S.S. 1990. Keadaan Nilai Normal Baku Mencit Strain CBR Swiss Derived di Pusat Penyakit Menular. Pusat Penelitian Penyakit Menular Badan Penelitian Dan Pengembangan Kesehatan. Departemen Kesehatan RI. Jakarta. Yuwono. Triwibowo. 2005. Biologi Molekuler. Erlangga. Jakarta. Lampiran 1. Bagan Tahapan Penelitian Bakteri uji K. pneumoniae Pembuatan kurva pertumbuhan K. pneumoniae untuk penentuan fase mid log Inaktivasi Pemanasan 6565odengpemanasan Persiapan Inaktivasi Iradiasi Induksi pada mencit mencit Kontrol Negatif Kontrol Normal Vaksinasi pemanasan Vaksinasi Iradiasi Pengamatan pada selang waktu 0, 6, 24, 48 jam Uji Tantang Pengamatan pada selang waktu 0, 6, 24, 48 jam Kondisi Fisik Serum darah % Mortalitas (Mata, Bulu, Gerak, Hidung) Elektroforesis Pengukuran SDS PAGE Kadar Protein Analisis Data RBC dan WBC RBC dan WBC Gambar 12. Bagan Tahapan Penelitian 75 76 Lampiran 2. Kurva Standar Lowry Serum Darah Mencit Pembuatan kurva standar digunakan untuk menentukan kadar protein dari serum darah mencit normal dan yang mengalami perlakuan berdasarkan nilai absorbansi hasil analisa spektrofotometer dengan panjang gelombang 750 nm sehingga menghasilkan kurva standar protein yang bisa digunakan untuk menghitung kadar protein totalnya. Berdasarkan perhitungan diperoleh persamaan garis Y = 0.015 x + 0.076 dan nilai R2 = 0.978 0.8 y = 0.015x + 0.076 R² = 0.978 0.7 Absorban 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 0 10 20 30 40 50 konsentrasi protein (mg/ml) Gambar 13. Kurva Standar Lowry Serum Darah Mencit Konsentrasi Protein Absorbansi ( mg/ml ) 40 0.706 20 0.398 10 0.282 5 0.1145 Tabel 8. Hubungan konsentrasi protein terhadap absorbansi serum darah mencit 77 Lampiran 3. Hasil Rata- Rata Kadar Protein Dengan Metode Lowry Hasil Rata-Rata Kadar Protein Perlakuan Perlakuan Pemanasan (mg/ml) Perlakuan Iradiasi (mg/ml) K- 141.83 141.83 K Normal 129.33 129.33 VP24 141.75 153.75 VP48 112.33 143.33 UTP6 154.58 139.58 UTP24 115.08 138.25 UTP48 133.25 137.25 Tabel 9. Hasil Rata-rata Kadar Protein Pada Kedua Jenis Perlakuan 78 Lampiran 4. Tabel Standar Marker Protein Gambar 14. Standar Marker Protein 79 Lampiran 5. Kurva Standar Marker Protein Kurva standar marker dibuat untuk mengetahui berat molekul (BM) protein sebelum dan sesudah pemanasan yang dihasilkan dari data elektroforesis SDS-PAGE. Perhitungan berat molekul diperoleh dari persamaan garis, dimana hasil yang diperoleh adalah y= -0.827x + 20.4 dengan nilai R2 = 0.988. 1 0.9 0.8 0.7 Log KDa 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 y = -0.827x + 2.04 R² = 0.988 0.1 0 0 0.5 1 1.5 Rf Gambar 15. Kurva Standar Marker Protein 2 2.5 80 Lampiran 6. Hubungan Log BM terhadap Rf pada kurva standar marker kDa Marker Letak pita (cm) Log kDa Rf 200 1 2.3 0.13 116.3 2.3 2.06 0.30 97.4 3 1.98 0.40 66.2 4 1.81 0.53 45 5.5 1.65 0.73 31 6 1.49 0.80 21.5 6.8 1.33 0.90 Tabel 10. Tabel Hubungan Log BM terhadap Rf pada kurva standar marker Keterangan: Letak pita diukur dari awal tinggi gel sampai pada pita yang muncul Tinggi gel 7.5 cm Rumus mencari Rf = letak pita yang muncul / 7.5. 81 Lampiran 7. Konsentrasi akrilamid yang digunakan untuk SDS-PAGE. Konsentrasi akrilamid di dalam gel disesuaikan dengan ukuran protein yang dielektroforesis. % akrilamid di dalam gel Ukuran Protein (kDa) 20 4-40 15 12-45 12,5 10-70 10 15-100 8 25-200 Tabel 11. Konsentrasi akrilamid yang digunakan untuk SDS-PAGE. Lampiran 8. Data Bobot Molekul Immunoglobulin dalam Serum Kelas Immunoglobulin Massa (kDa) IgG 150 IgA 180 – 500 IgM 950 IgD 175 IgE 200 Tabel 12. Data Bobot Molekul Immunoglobulin dalam Serum 82 Lampiran 9. Hasil Analisa Bobot Molekul Protein Serum Darah Mencit Kontrol Normal & Negatif BM (kDa) Kontrol Normal Kontrol Negatif 202.07 200 180.78 180.78 150.15 116,3 103.58 97,4 89.29 89.29 55.11 55.11 66,2 45 45.77 40.94 38.01 31 31.57 31.57 26.22 26.22 21.5 Tabel 13. Hasil Analisa Bobot Molekul Protein Serum Darah Mencit Kontrol Normal & Negatif. 83 A. Kontrol Negatif 1. Pita ke- 1 = 10 ((0.13– 2.04)/-0.827) = 202.07 = 200 kDa (IgE) 2. Pita ke- 2 = 10((0.17 – 2.04)/-0.827) = 180.78 = 180 kDa (IgA) 3. Pita ke- 3 = 10 ((0.24 – 2.04)/-0.827) = 150.15 = 150 kDa (IgG) 4. Pita ke- 3 = 10 ((0.37 – 2.04)/-0.827 ) = 103.58 kDa 5. Pita ke- 4 = 10((0.42– 2.04)/-0.827 ) = 89.29 kDa 6. Pita ke- 5 = 10((0.6 – 2.04)/-0.827) = 55.11 kDa 7. Pita ke- 3 = 10((0.70 – 2.04)/-0.827 ) = 40.94 kDa 8. Pita ke- 4 = 10 ((0.8 – 2.04)/-0.827 ) = 31.57 kDa 9. Pita ke- 5 = 10((0.86 – 2.04)/-0.827) = 26.22 kDa B. Kontrol Normal 1. Pita ke- 1 = 10 ((0.37 – 2.04)/-0.827 ) = 103.58 kDa 2. Pita ke- 2 = 10((0.42 – 2.04)/-0.827) = 89.29 kDa 3. Pita ke- 3 = 10 ((0.6 – 2.04)/-0.827) = 55.11 kDa 4. Pita ke- 3 = 10((0.66 – 2.04)/-0.827 ) = 45.77 kDa 5. Pita ke- 4 = 10((0.73– 2.04)/-0.827 ) = 38.01 kDa 6. Pita ke- 5 = 10((0.8 – 2.04)/-0.827) = 31.57 kDa 7. Pita ke- 6 = 10 ((0.86 – 2.04)/-0.827) = 26.22 kDa 84 Lampiran 10. Analisa Bobot Molekul Protein Serum Darah Mencit Setelah Vaksinasi dan Uji Tantang Pemanasan Pemanasan Suhu 650 C Selama 30 Menit Marker Kontrol Kontrol Normal Negatif 200 2 202.07 180.78 180.78 Vaksinasi 24 Jam Vaksinasi 48 Jam Uji Tantang 6 Jam Uji Tantang 24 Jam Uji Tantang 48 Jam 202.07 180.78 150.15 150.15 139.41 139.41 139.41 139.41 116,3 103.58 103.58 103.58 97,4 96.17 89.29 96.17 89.29 86.04 79.88 79.88 55.11 55.11 66,2 55.11 45 55.11 45.77 55.11 55.11 45.77 35.29 45.77 35.29 45.77 35.29 45.77 35.29 31.57 31.57 31.57 31.57 40.94 31 31.57 38.01 38.01 31.57 31.57 28.25 28.25 27.22 26.22 26.22 26.22 23.46 26.22 23.46 23.46 21.5 Tabel 14. Tabel Analisa Bobot Molekul Protein Serum Darah Mencit Setelah Vaksinasi dan Uji Tantang Pemanasan 85 A. Vaksinasi Pemanasan 24 Jam 1. Pita ke- 1 = 10 ((0.26– 2.04)/-0.827) = 139.41 kDa 2. Pita ke- 2 = 10 ((0.4 – 2.04)/-0.827) = 96.17 kDa 3. Pita ke- 3 = 10 4. Pita ke- 3 = 10 ((0.46 – 2.04)/-0.827) ((0.6 – 2.04)/-0.827 ) = 79.88 kDa = 55.11 kDa 5. Pita ke- 4 = 10 ((0.73– 2.04)/-0.827 ) = 38.01 kDa 6. Pita ke- 5 = 10 ((0.8 – 2.04)/-0.827) = 31.57 kDa 7. Pita ke- 6 = 10 ((0.86 – 2.04)/-0.827) = 26.22 kDa 8. Pita ke- 7 = 10 ((0.90– 2.04)/-0.827) = 23.46 kDa B. Vaksinasi Pemanasan 48 Jam 1. Pita ke- 1 = 10 ((0.26– 2.04)/-0.827) = 139.41 kDa 2. Pita ke- 2 = 10 ((0.4 – 2.04)/-0.827) = 96.17 kDa 3. Pita ke- 3 = 10 ((0.46 – 2.04)/-0.827) = 79.88 kDa 4. Pita ke- 3 = 10 ((0.6 – 2.04)/-0.827 ) = 55.11 kDa 5. Pita ke- 4 =10 ((0.66 – 2.04)/-0.827) = 45.77 kDa 6. Pita ke- 5 = 10 ((0.76– 2.04)/-0.827 ) = 35.29 kDa 7. Pita ke- 6 = 10 ((0.8 – 2.04)/-0.827) = 31.57 kDa 8. Pita ke- 7 = 10 ((0.85 – 2.04)/-0.827) = 27.22 kDa 9. Pita ke- 8 = 10 ((0.90– 2.04)/-0.827) = 23.46 kDa C. Uji Tantang Pemanasan 6 Jam 1. Pita ke- 1 = 10 ((0.26– 2.04)/-0.827) = 139.41 kDa 2. Pita ke- 2 = 10 ((0.66 – 2.04)/-0.827) = 45.77 kDa 3. Pita ke- 3 = 10 ((0.76 – 2.04)/-0.827) = 35.29 kDa 4. Pita ke- 3 = 10 ((0.8 – 2.04)/-0.827 ) = 31.57 kDa 86 5. Pita ke- 4 = 10 ((0.84– 2.04)/-0.827 ) = 28.25 kDa D. Uji Tantang Pemanasan 24 Jam 1. Pita ke- 1 = 10 ((0.18 – 2.04)/-0.827) = 202.07 = 200 kDa (IgE) 2. Pita ke- 2 = 10 ((0.26 – 2.04)/-0.827) = 139.41 kDa 3. Pita ke- 3 = 10 ((0.37 – 2.04)/-0.827) = 103.58 kDa 4. Pita ke- 3 = 10 ((0.44 – 2.04)/-0.827 ) = 86.04 kDa 5. Pita ke- 4 = 10 ((0.6 – 2.04)/-0.827 ) = 55.11 kDa 6. Pita ke- 5 = 10 ((0.66 – 2.04)/-0.827) = 45.77 kDa 7. Pita ke- 6 = 10 ((0.77 – 2.04)/-0.827) = 35.29 kDa 8. Pita ke- 7 = 10 ((0.8 – 2.04)/-0.827) = 31.57 kDa 9. Pita ke- 8 = 10 ((0.86 – 2.04)/-0.827 ) = 26.22 kDa 10. Pita ke- 9 = 10 ((0.90 – 2.04)/-0.827 ) = 23.46 kDa E. Uji Tantang Pemanasan 48 Jam 1. Pita ke- 1 = 10 ((0.17 – 2.04)/-0.827) = 180.78 = 180 kDa (IgM) 2. Pita ke- 2 = 10 ((0.24 – 2.04)/-0.827) = 150.15 = 150 kDa (IgG) 3. Pita ke- 3 = 10 ((0.37 – 2.04)/-0.827) = 103.58 kDa 4. Pita ke- 3 = 10 ((0.6 – 2.04)/-0.827 ) = 55.11 kDa 5. Pita ke- 4 = 10 ((0.66 – 2.04)/-0.827 ) = 45.77 kDa 6. Pita ke- 5 = 10 ((0.76 – 2.04)/-0.827) = 35.29 kDa 7. Pita ke- 6 = 10 ((0.8 – 2.04)/-0.827) = 31.57 kDa 8. Pita ke- 7 = 10 ((0.84 – 2.04)/-0.827) = 28.25 kDa 87 Lampiran 11. Analisa Berat Molekul Protein Serum Darah Mencit Setelah Vaksinasi dan Uji Tantang Iradiasi Marker Kontrol Normal 200 180.78 Iradiasi 800 Gy Kontrol Vaksinasi Vaksinasi Negatif 24 Jam 48 Jam 202.07 180.78 180.78 Uji Tantang 6 Jam Uji Tantang 24 Jam Uji Tantang 48 Jam 202.07 202.07 202.07 180.78 180.78 180.78 150.15 150.15 150.15 155.84 150.15 ` 150.15 116,3 107.50 107.50 96.17 96.17 103.58 97,4 89.29 89.29 89.29 89.29 89.29 59.35 59.35 59.35 55.11 49.30 49.30 66,2 55.11 45 55.11 45.77 55.11 55.11 45.77 45.77 45.77 38.01 31.57 38.01 31.57 31.57 31.57 31.57 28.25 28.25 28.25 28.25 40.94 31 31.57 38.01 31.57 26.22 27.22 26.22 26.22 21.5 Tabel 15. Analisa Berat Molekul Protein Serum Darah Mencit Setelah Vaksinasi dan Uji Tantang Iradiasi. 27.22 88 A. Vaksinasi Iradiasi 24 Jam 1. Pita ke- 1 = 10 ((0.17 – 2.04)/-0.827) = 180.78 = 180 kDa (IgA) 2. Pita ke- 2 = 10 ((0.22 – 2.04)/-0.827) = 155.83 kDa 3. Pita ke- 3 = 10 ((0.36 – 2.04)/-0.827) = 107.50 kDa 4. Pita ke- 3 = 10 ((0.4 – 2.04)/-0.827 ) = 96.17 kDa 5. Pita ke- 4 = 10 ((0.6– 2.04)/-0.827 ) = 55.11 kDa 6. Pita ke- 5 = 10 ((0.66 – 2.04)/-0.827) = 45.77 kDa 7. Pita ke- 6 = 10 ((0.73 – 2.04)/-0.827) = 38.01 kDa 8. Pita ke- 7 = 10 ((0.8– 2.04)/-0.827) = 31.57 kDa 9. Pita ke- 8 = 10 ((0.85– 2.04)/-0.827) = 27.22 kDa B. Vaksinasi Iradiasi 48 Jam 1. Pita ke- 1 = 10 ((0.24 – 2.04)/-0.827) = 150.15 = 150 kDa (IgG) 2. Pita ke- 2 = 10 ((0.6– 2.04)/-0.827) = 55.11 kDa 3. Pita ke- 3 = 10 ((0.66– 2.04)/-0.827) = 45.77 kDa 4. Pita ke- 4 = 10 ((0.73 – 2.04)/-0.827) = 38.01 kDa 5. Pita ke- 5 = 10 ((0.8– 2.04)/-0.827 ) = 31.57 kDa 6. Pita ke- 6 = 10 ((0.84– 2.04)/-0.827 ) = 28.25 kDa 7. Pita ke- 7 = 10 ((0.86 – 2.04)/-0.827) = 26.22 kDa 89 C. Uji Tantang Iradiasi 6 Jam 1. Pita ke- 1 = 10 ((0.18– 2.04)/-0.827) = 202.07 = 200 kDa (IgE) 2. Pita ke- 2 = 10 ((0.17 – 2.04)/-0.827) = 180.78 = 180 kDa (IgA) 3. Pita ke- 3 = 10 ((0.24 – 2.04)/-0.827) = 150.15 = 150 kDa (IgG) 4. Pita ke- 3 = 10 ((0.46 – 2.04)/-0.827 ) = 79.88 kDa 5. Pita ke- 4 = 10 ((0.57– 2.04)/-0.827 ) = 59.35 kDa 6. Pita ke- 5= 10 ((0.64 – 2.04)/-0.827) = 49.30 kDa 7. Pita ke- 6 = 10 ((0.8 – 2.04)/-0.827 ) = 31.57 kDa 8. Pita ke- 7 = 10 ((0.84 – 2.04)/-0.827 ) = 28.25 kDa D. Uji Tantang Iradiasi 24 Jam 1. Pita ke- 1 = 10 ((0.18– 2.04)/-0.827) = 202.07 = 200 kDa (IgE) 2. Pita ke- 2 = 10 ((0.17 – 2.04)/-0.827) = 180.78 = 180 kDa (IgA) 3. Pita ke- 3 = 10 ((0.24 – 2.04)/-0.827) = 150.15 = 150 kDa (IgG) 4. Pita ke- 4 = 10 ((0.44 – 2.04)/-0.827 ) = 89.29 kDa 5. Pita ke- 5 = 10 ((0.57 – 2.04)/-0.827 ) = 59.35 kDa 6. Pita ke- 6 = 10 ((0.64 – 2.04)/-0.827) = 49.30 kDa 7. Pita ke- 7 = 10 ((0.8 – 2.04)/-0.827 ) = 31.57 kDa 8. Pita ke- 8 = 10 ((0.84 – 2.04)/-0.827) = 28.25 kDa 90 E. Uji Tantang Iradiasi 48 Jam 1. Pita ke- 1 = 10 ((0.18– 2.04)/-0.827) = 202.07 = 200 kDa (IgE) 2. Pita ke- 2 = 10 ((0.17 – 2.04)/-0.827) = 180.78 = 180 kDa (IgA) 3. Pita ke- 3 = 10 ((0.24 – 2.04)/-0.827) = 150.15 = 150 kDa (IgG) 4. Pita ke- 4 = 10 ((0.36 – 2.04)/-0.827 ) = 107.50 kDa 5. Pita ke- 5 = 10 ((0.4 – 2.04)/-0.827 ) = 96.17 kDa 6. Pita ke- 6 = 10 ((0.44 – 2.04)/-0.827 ) = 89.29 kDa 7. Pita ke- 7 = 10 ((0.46 – 2.04)/-0.827) = 79.88 kDa 8. Pita ke- 8 = 10 ((0.53 – 2.04)/-0.827) = 66.35 kDa 9. Pita ke- 9 = 10 ((0.6 – 2.04)/-0.827) = 55.11 kDa 10. Pita ke- 10 = 10 ((0.66 – 2.04)/-0.827) = 45.77 kDa 11. Pita ke- 11= 10 ((0.70 – 2.04)/-0.827) = 40.94 kDa 12. Pita ke- 12 = 10 ((0.73 – 2.04)/-0.827) = 38.01 kDa 13. Pita ke- 13 = 10 ((0.8 – 2.04)/-0.827) = 31.57 kDa 91 Lampiran 12. Analisa Letak Pita Profil Protein Serum Darah Mencit Pada Perlakuan Vaksin Pemanasan Marker Kontrol Normal 200 ■■■ Pemanasan Suhu 650 C Selama 30 Menit Kontrol Vaksinasi Vaksinasi Uji Negatif 24 Jam 48 Jam Tantang 6 Jam Uji Tantang 24 Jam ■■■ ■■■ ■■■ ■■■ ■■■ ■■■ 150 Uji Tantang 48 Jam ■■■ ■■■ ■■■ ■■■ 116,3 ■■■ ■■■ ■■■ 97,4 ■■■ ■■■ ■■■ ■■■ ■■■ ■■■ ■■■ 66,2 45 31 ■■■ ■■■ ■■■ ■■■ ■■■ ■■■ ■■■ ■■■ ■■■ ■■■ ■■■ ■■■ ■■■ ■■■ ■■■ ■■■ ■■■ ■■■ ■■■ ■■■ ■■■ ■■■ ■■■ ■■■ ■■■ ■■■ ■■■ ■■■ ■■■ ■■■ ■■■ ■■■ ■■■ ■■■ ■■■ ■■■ ■■■ ■■■ ■■■ ■■■ ■■■ ■■■ ■■■ 21.5 Tabel 16. Analisa Letak Pita Profil Protein Serum Darah Mencit Pada Vaksin Pemanasan. 92 Lampiran 13. Analisa Letak Pita Profil Protein Serum Darah Mencit Pada Vaksin Iradiasi Marker Kontrol Normal Iradiasi 800 Gy Kotrol Vaksinasi Vaksinasi Negatif 24 Jam 48 Jam 200 ■■■ ■■■ Uji Tantang 6 Jam Uji Tantang 24 Jam Uji Tantang 48 Jam ■■■ ■■■ ■■■ ■■■ ■■■ ■■■ ■■■ ■■■ ■■■ ■■■ ■■■ ■■■ ■■■ ■■■ ■■■ ■■■ ■■■ ■■■ ■■■ ■■■ ■■■ ■■■ ■■■ ■■■ ■■■ ■■■ ■■■ ■■■ ■■■ ■■■ ■■■ ■■■ ■■■ ■■■ 150` ■■■ 116,3 ■■■ ■■■ 97,4 ■■■ ■■■ ■■■ ■■■ ■■■ ■■■ ■■■ 66,2 45 31 ■■■ ■■■ ■■■ ■■■ ■■■ ■■■ ■■■ ■■■ ■■■ ■■■ ■■■ ■■■ ■■■ ■■■ ■■■ ■■■ ■■■ ■■■ ■■■ ■■■ ■■■ ■■■ ■■■ ■■■ 21.5 Tabel 17. Analisa Letak Pita Profil Protein Serum Darah Mencit Pada Vaksin Iradiasi ■■■ 93 Lampiran 14. Hasil Statistik Pada Analisa Jumlah Kadar Protein, Sel Darah Merah dan Sel Darah Putih pada Seluruh Kelompok Perlakuan A. Uji Homogenitas Hipotesis : Ho = Data bervariasi homogen Ha = Data tidak bervariasi homogen Pengambilan Keputusan : Jika nilai signifikansi > 0,05 maka Ho diterima Jika nilai signifikansi < 0,05 maka Ho ditolak Levene Statistic df1 df2 Sig. Protein 1.758 5 16 .179 Sdm 1.669 5 16 .199 Sdp 2.010 5 16 .132 Tabel 18. Tabel Uji Homogenitas Protein, SDM, dan SDP. Hasil Analisis Variansi Satu Arah (One Way Anova) Hipotesis : Ho = Data tidak berbeda secara bermakna Ha = Data berbeda secara bermakna Pengambilan Keputusan : Jika nilai signifikansi > 0,05 maka Ho diterima Jika nilai signifikansi < 0,05 maka Ho ditolak 94 ANOVA Sum of Squares df Mean Square F Sig. 1214.076 5 242.815 3.055 .040 Within Groups 1271.699 16 79.481 Total 2485.775 21 1.050E12 5 2.100E11 1.422 .269 Within Groups 2.362E12 16 1.477E11 Total 3.412E12 21 6.861E8 5 1.372E8 .626 .682 Within Groups 3.507E9 16 2.192E8 Total 4.194E9 21 Protein Between Groups Sdm Between Groups Sdp Between Groups Tabel 19. Hasil Uji ANOVA analisa protein, SDM dan SDP Keputusan : Hasil jumlah kadar protein pada seluruh kelompok perlakuan berbeda secara bermakna (p<0,05) dengan jumlah kadar protein pada mencit normal, sedangkan pada sel darah merah dan sel darah putih tidak ada perbedaan yang bermakna (p>0,05) dengan mencit normal. 95 Lampiran 15. Hasil Analisa Profil Protein Pada Perlakuan Vaksinasi dan Uji Tantang Pemanasan A. Uji Deskriptif Profil Protein Pemanasan 95% Confidence Pita Interval for Mean Std. N Std. Lower Upper Mean Deviation Error Bound Bound Kontrol negatif 11 1.0000 .00000 .00000 1.0000 Kontrol Normal 11 .5455 .52223 .15746 v pemanasan 24 11 .4545 v pemanasan 48 11 UT Pemanasan 6 Min Max 1.0000 1.00 1.00 .1946 .8963 .00 1.00 .52223 .15746 .1037 .8054 .00 1.00 .4545 .52223 .15746 .1037 .8054 .00 1.00 11 .9091 .30151 .09091 .7065 1.1116 .00 1.00 UT Pemanasan 24 11 .5455 .52223 .15746 .1946 .8963 .00 1.00 UT Pemanasan 48 11 .6364 .50452 .15212 .2974 .9753 .00 1.00 Total 77 .6494 .48030 .05474 .5403 .7584 .00 1.00 Tabel 20.Tabel Uji Deskriptif Profil Protein Pemanasan a) Hasil Analisis Variansi Satu Arah (One Way Anova) Hipotesis : Ho = Data tidak berbeda secara bermakna Ha = Data berbeda secara bermakna Pengambilan Keputusan : Jika nilai signifikansi > 0,05 maka Ho diterima Jika nilai signifikansi < 0,05 maka Ho ditolak. 96 Sum of Pita Squares Between Groups Df Mean Square 3.169 6 .528 Within Groups 14.364 70 .205 Total 17.532 76 F Sig. 2.574 .026 Tabel 21. Tabel U ji Anova Profil Protein Pemanasan Keputusan : Hasil profil protein pada seluruh kelompok perlakuan pemanasan berbeda secara bermakna (p<0,05) dengan psofil protein pada mencit normal. b) Hasil Analisis Uji Duncan Subset for alpha = 0.05 Ulangan N 1 2 3 v pemanasan 24 11 .4545 v pemanasan 48 11 .4545 Kontrol Normal 11 .5455 .5455 UT Pemanasan 24 11 .5455 .5455 UT Pemanasan 48 11 .6364 .6364 .6364 UT Pemanasan 6 11 .9091 .9091 Kontrol negative 11 Sig. 1.0000 .411 .089 .079 Tabel 22. Tabel Hasil Analisis Uji Duncan Profil Protein Pemanasan Pada tabel uji Duncan, ketujuh perlakuan dari rata-rata profil protein dikelompokkan dalam satu subset. Dapat dilihat bahwa ketujuh perlakuan dikelompokkan menjadi tiga subset. Subset pertama adalah perlakuan pada vaksinasi pemanasan 24jam, 48 jam dan kontrol normal. Subset kedua 97 adalah perlakuan pada menit kontrol normal, uji tantang pemanasan 24 jam, 48 jam, 6 jam, dan kontrol normal. Sedangkan pada subset ketiga adalah perlakuan pada uji tantang pemanasan 48 jam, 6 jam, dan kontrol negatif. Lampiran 16. Hasil Analisa Profil Protein Pada Perlakuan Vaksinasi dan Uji Tantang Iradiasi a) Hasil Analisa Deskriptif Profil Protein 95% Confidence Iradiasi Interval for Mean Std. N Std. Lower Upper Mean Deviation Error Bound Bound Min Max Kontrol Negatif 11 1.0000 .00000 .00000 1.0000 Kontrol Normal 11 .5455 .52223 .15746 .1946 .8963 .00 1.00 Vaksinasi 24 Jam 11 .8182 .40452 .12197 .5464 1.0899 .00 1.00 Vaksinasi 48 Jam 11 .4545 .52223 .15746 .1037 .8054 .00 1.00 Uji Tantang 6 Jam 11 .7273 .46710 .14084 .4135 1.0411 .00 1.00 Uji Tantang 24 Jam 11 .6364 .50452 .15212 .2974 .9753 .00 1.00 Uji Tantang 48 Jam 11 .9091 .30151 .09091 .7065 1.1116 .00 1.00 Total 77 .7273 .44828 .05109 .6255 .8290 .00 1.00 1.0000 1.00 Tabel 23. Tabel Hasil Analisa Deskriptif Profil Protein Iradiasi b) Hasil Analisis Variansi Satu Arah (One Way Anova) Hipotesis : Ho = Data tidak berbeda secara bermakna Ha = Data berbeda secara bermakna Pengambilan Keputusan : Jika nilai signifikansi > 0,05 maka Ho diterima Jika nilai signifikansi < 0,05 maka Ho ditolak. 1.00 98 Sum of Iradiasi Squares Between Groups df Mean Square 2.545 6 .424 Within Groups 12.727 70 .182 Total 15.273 76 F Sig. 2.333 .041 Tabel 24. Tabel hasil Uji Anova Profil Protein Iradiasi Keputusan : Pada tabel tampak nilai probabilitas (sig) 0,041 ≤ 0,05, maka H0 ditolak atau terdapat perbedaan yang signifikan antara profil protein setiap perlakuan iradiasi. c) Hasil Analisa Duncan Pada Profil Protein Perlakuan Iradiasi Subset for alpha = 0.05 Ulangan Duncana Vaksinasi 48 Jam N 1 2 3 11 .4545 Kontrol Normal 11 .5455 .5455 Uji Tantang 24 Jam 11 .6364 .6364 .6364 Uji Tantang 6 Jam 11 .7273 .7273 .7273 Vaksinasi 24 Jam 11 .8182 .8182 .8182 Uji Tantang 48 Jam 11 .9091 .9091 Kontrol Negatif 11 Sig. 1.0000 .078 .078 Means for groups in homogeneous subsets are displayed. a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 11.000. Tabel 25. Tabel hasil uji Duncan pada profil protein iradiasi .078 99 Pada tabel uji Duncan, ketujuh perlakuan dari rata-rata profil protein dikelompokkan dalam satu subset. Dapat dilihat bahwa ketujuh perlakuan dikelompokkan menjadi tiga subset. Subset pertama adalah perlakuan pada vaksinasi iradiasi 24jam, 48 jam, uji tantang 6 jam, 24 jam dan kontrol normal. Subset kedua adalah perlakuan pada menit kontrol normal, uji tantang iradiasi 6 jam, 24 jam, 48 jam,dan vaksinasi 24 jam. Sedangkan pada subset ketiga adalah perlakuan pada uji tantang pemanasan 24 jam, 6 jam, 48 jam, vaksinasi 24 jam dan kontrol negatif, 100 Lampiran 16. Hasil Analisa Profil Protein Pada Perlakuan Vaksinasi dan Uji Tantang Pemanasan dan Iradiasi a) Hasil analisa uji deskriptif 95% Confidence Interval Pita Profil Protein for Mean Std. N Mean Std. Lower Upper Deviation Error Bound Bound Min Max Kontrol Negatif 11 1.0000 .00000 .00000 1.0000 1.0000 1.00 1.00 Kontrol Normal 11 .5455 .52223 .15746 .1946 .8963 .00 1.00 VP 24 JAM 11 .4545 .52223 .15746 .1037 .8054 .00 1.00 VP 48 JAM 11 .4545 .52223 .15746 .1037 .8054 .00 1.00 UTP 6 JAM 11 .9091 .30151 .09091 .7065 1.1116 .00 1.00 UTP 24 JAM 11 .5455 .52223 .15746 .1946 .8963 .00 1.00 UTP 48 JAM 11 .6364 .50452 .15212 .2974 .9753 .00 1.00 VI 24 JAM 11 .8182 .40452 .12197 .5464 1.0899 .00 1.00 VI 48 JAM 11 .4545 .52223 .15746 .1037 .8054 .00 1.00 UTI 6 JAM 11 .7273 .46710 .14084 .4135 1.0411 .00 1.00 UTI 24 JAM 11 .6364 .50452 .15212 .2974 .9753 .00 1.00 UTI 48 JAM 11 .9091 .30151 .09091 .7065 1.1116 .00 1.00 132 .6742 .47044 .04095 .5932 .7552 .00 1.00 Total Tabel 26. Tabel hasil analisis deskriptif profil protein pemanasan & iradiasi. 101 b) Hasil Analisis Variansi Satu Arah (One Way Anova) Hipotesis : Ho = Data tidak berbeda secara bermakna Ha = Data berbeda secara bermakna Pengambilan Keputusan : Jika nilai signifikansi > 0,05 maka Ho diterima Jika nilai signifikansi < 0,05 maka Ho ditolak Pita Profil Protein Sum of Squares df Mean Square F Sig. Between 4.629 11 .421 Within Groups 24.364 120 .203 Total 28.992 131 2.073 .027 Groups Tabel 27. Tabel hasil analisa uji Anova profil protein pemanasan dan iradiasi Keputusan : Pada tabel tampak nilai probabilitas (sig) 0,041 ≤ 0,05, maka H0 ditolak atau terdapat perbedaan yang signifikan antara profil protein perlakuan iradiasi dan pemanasan. 102 c) Uji Duncan Subset for alpha = 0.05 Ulangan a Duncan N 1 2 3 VP 24 JAM 11 .4545 VP 48 JAM 11 .4545 VI 48 JAM 11 .4545 Kontrol Normal 11 .5455 .5455 UTP 24 JAM 11 .5455 .5455 UTP 48 JAM 11 .6364 .6364 .6364 UTI 24 JAM 11 .6364 .6364 .6364 UTI 6 JAM 11 .7273 .7273 .7273 VI 24 JAM 11 .8182 .8182 .8182 UTP 6 JAM 11 .9091 .9091 UTI 48 JAM 11 .9091 .9091 Kontrol Negatif 11 1.0000 Sig. .114 .110 .106 Tabel 28. Tabel hasil uji Duncan pada profil protein pemanasan & iradiasi Pada tabel uji Duncan, ketujuh perlakuan dari rata-rata profil protein dikelompokkan dalam satu subset. Dapat dilihat bahwa ketujuh perlakuan dikelompokkan menjadi tiga subset. Subset pertama adalah perlakuan pada vaksinasi pemanasan 24jam, 48 jam, uji tantang 24 jam, 48 jam, kontrol normal, vaksinasi iradiasi 48 jam, 24 jam, uji tantang pemanasan 24 jam, 48 jam, dan uji tantang iradiasi 6 jam. Subset kedua adalah perlakuan pada kontrol normal, uji tantang pemanasan 24 jam, uji tantang pemanasan 48 jam, uji tantang iradiasi 6 jam, vaksinasi iradiasi 24 jam, uji tantang pemanasan 6 jam, dan uji tantang iradiasi 48 jam. Sedangkan pada subset ketiga adalah perlakuan pada uji tantang pemanasan 48 jam, uji tantang iradiasi 24 jam, uji tantang iradiasi 6 jam, vaksinasi iradiasi 24 jam, uji tantang pemanasan 6 jam, uji tantang iradiasi 48 jam, dan kontrol negatif. 103 Lampiran 17. Komposisi larutan Elektroforesis 1. 30% Acrylamid Acrylamid .................................................................................... 29,2g Bis (Metyl bis acrylamid) ............................................................ 0,8g Akuades ...................................................................................... 100ml 2. Separating Gel Buffer (1,5 tris-HCl, pH 8,8) Tris .............................................................................................. 18,2g SDS ............................................................................................. 0,4g Akuades ...................................................................................... 100ml 3. Stacking Gel Buffer (0,5 M tris-HCl, pH 6,8) Tris ............................................................................................ 6,1g SDS ............................................................................................ 0,4g Akuades ..................................................................................... 100ml 4. 10% Ammonium Persulfate Ammonium Persulfate .............................................................. 0,1g Akuades .................................................................................... 1ml 5. Running Buffer Tris ........................................................................................... 1,5g SDS .......................................................................................... 0,5g Glysin ...................................................................................... 7,2g Akuades ................................................................................... 500ml 104 Lampiran 18. Foto-Foto Penelitian Gambar 16.Water Bath Gambar 17. Irradiation Gamma Chamber Gambar 18. Larutan Staining & Destaining Gambar 19. Bahan- Bahan Kimia 105 Gambar 20. SDS PAGE Gambar 22. Spektrofotometer Gambar 21. Mikropipet Gambar 23. Tips 106 Gambar 24. Proses Inaktivasi Pemanasan Gambar 25. Proses Inaktivasi Iradiasi Gambar 26. Proses Persiapan Hewan Uji Gambar 27. Proses Injeksi Secara I.P (Intra Peritoneal) 107 Gambar 28.Proses Pengumpulan Gambar 29. Proses Loading Sample Sampel Darah Gambar 30. Preparasi Alat SDS PAGE Gambar 31. Proses Staining Gel 108 Gambar 32. Kondisi Mencit Normal Gambar 33. Perbedaan Limpa Mencit Normal dan Terinfeksi. Gambar 34. Perbedaan Limpa Mencit Kontrol Negatif dan Vaksinasi Gambar 35. Mortalitas Mencit Setelah Infeksi K.pneumoniae aktif
