Over-ekspresi Gen OsWRKY76 untuk Ketahanan

PENDAHULUAN
Perbaikan suatu sifat tanaman dapat dilakukan melalui modifikasi genetik
baik dengan pemuliaan secara konvensional maupun dengan bioteknologi
khususnya teknologi rekayasa genetik (Herman 2002). Pemuliaan secara
konvensional memperbaiki sifat tanaman dengan cara menyilangkan antara
kultivar. Dengan cara ini gen yang berpindah bukan hanya yang mengontrol sifat
yang diinginkan saja, namun juga gen-gen lain (yang tidak diiginkan), sehingga
hasil yang diperoleh sering tidak sesuai dengan yang diharapkan. Selain itu, untuk
mendapatkan sifat yang diinginkan dari proses persilangan tersebut memakan
waktu yang cukup lama, karena membutuhkan seleksi terus menerus yang
memakan waktu, biaya, dan tempat yang tidak sedikit. Teknologi rekayasa genetik
tanaman bekerja pada tingkat DNA, sehingga melalui teknik ini memungkinkan
untuk mentransfer gen spesifik yang diinginkan ke dalam genom tanaman.
Dengan teknik ini kendala yang dihadapi dari sistem konvensional dapat
dipecahkan, misalnya adanya hambatan seksual, karena dengan teknik ini dapat
diintroduksikan gen dari spesies tanaman maupun gen dari organisme lain ke
dalam genom tanaman.
Teknologi untuk mentransfer suatu gen dibedakan menjadi dua, yaitu
secara langsung dan tidak langsung. Transfer gen secara langsung dapat dilakukan
dengan penembakan partikel, elektroporasi, atau dengan PEG (Herman 2002).
Sedangkan transfer gen secara tidak langsung paling banyak dilakukan dengan
bantuan Agrobacterium tumefaciens. Agrobacterium mampu mentransfer gen ke
dalam genom tanaman. Gen yang ditransfer tersebut terletak pada bagian T-DNA
(transfer DNA) dari plasmid Ti (tumor inducing).
Keberhasilan teknologi rekayasa genetik tanaman tergantung dari 3 hal,
yaitu gen yang akan diintroduksikan, metode transformasi dan regenerasi
tanaman, ekspresi transgen di dalam sel tanaman target. Gen yang diintroduksikan
ke dalam genom tanaman harus dapat diinsersikan ke genom tanaman,
diekspresikan, dan tetap terpelihara dalam seluruh proses pembelahan sel
berikutnya (Herman 1999). Sel atau jaringan yang ditransformasi harus dapat
diregenerasikan menjadi tanaman utuh. Regenerasi tanaman dapat dilakukan baik
secara orgnogenesis ataupun embriogenesis (Sticklen 1991; Zhong et al. 1991).
Dengan telah selesainya pengurutan DNA dari genom tanaman padi
memungkinkan untuk mengetahui keberadaan, macam dan sifat dari gen-gen yang
ada pada tanaman padi termasuk gen-gen penyandi ketahanan. Sampai saat ini
masih sebagian kecil dari gen-gen yang ada pada tanaman padi tersebut diketahui
fungsinya. Saat ini telah dikembangkan metode analisis fungsi dari gen berdasar
urutan informasi pengurutan genom padi. Salah satu metode analisis fungsi gen
tersebut adalah dengan cara yang dikenal dengan istilah Revers Genetic (Bouches
and Hofte 1998). Metode ini berawal dari pengetahuan tentang sekuen gen
kandidat, yang dilanjutkan dengan identifikasi mutan untuk gen tersebut dan
analisis fungsi dari gen-gen dengan menggunakan mutan tersebut.
Faktor transkripsi yang juga biasa dikenal dengan istilah sequence-specific
DNA binding factor adalah merupakan suatu protein yang melekat secara spesifik
pada DNA dengan menggunakan daerah yang disebut dengan DNA binding
domain yang merupakan bagian dari sistem yang mengontrol transfer transkripsi.
Faktor transkripsi dalam menjalankan fungsinya secara tunggal atau bersamasama dengan protein-protein yang lain yang bergabung secara kompleks, bersama
RNA polimerase dapat meningkatkan (bertindak sebagai activator) atau menekan
(bertindak sebagai repressor) transkripsi. Faktor transkripsi mempunyai fungsi di
dalam pengaturan pada basal transkripsi, perkembangan sel dan jaringan, memberi
respon terhadap sinyal-sinyal interseluler, lingkungan dan siklus sel.
Regulasi (pengaturan) dari ekspresi gen diperantarai oleh adanya
pengenalan yang spesifik atas cis-acting element yang ada pada bagian promotor
dari gen target terhadap trans acting specific sequent DNA-binding factor dari gen
regulator (Schwechheimer and Bevan 1998). Beberapa kelas dari faktor
transkripsi terkait dengan respon pertahanan (Chen 2004). Faktor transkripsi dapat
meregulasikan banyak gen untuk mengekspresikan sifat-sifat tertentu. Faktor
transkripsi mempunyai kemampuan untuk menempel pada bagian promotor dari
gen-gen target dan meningkatkan atau menekan transkripsinya.
Saat ini dimungkinkan untuk melakukan rekayasa genetik untuk perbaikan
ketahanan tanaman terhadap patogen melalui modifikasi tingkat ekspresi dari
faktor transkripsi yang terlibat dalam mekanisme pertahanan. Untuk memodifikasi
tingkat ekspresi dapat dilakukan dengan strategi over-ekspresi dari gen regulator
yang terkait dengan sistem pertahanan tanaman.
Beberapa penelitian telah menunjukkan keberhasilan dalam mendapatkan
tanaman padi tahan penyakit dengan menggunakan teknik transformasi dengan
strategi overekspresi. Penelitian overekspresi dari gen penyandi protein regulator
Mitogen-activated protein kinase-1 (MK1) dari Capsicum annuum dan OsMAPK5
meningkatkan ketahanan terhadap cendawan blas pada padi. Overekspresi dari
gen MK1 dan OsMAPK5 ini menyebabkan peningkatan ekspresi dari gen-gen
yang terkait dengan patogenisitas yaitu PR1a, PR1b, dan PR10 yang mungkin
bertanggung jawab terhadap peningkatan ketahanan terhadap blas (Xiong dan
Yang 2003; Lee et al. 2004). Sedangkan penelitian overekspresi gen OsWRKY13
yang dilakukan oleh Qiu et al. (2007) menunjukkan hasil peningkatan ketahanan
tanaman padi terhadap patogen blas dan blb. Penelitian selanjutnya (Qiu et al.
2007) menunjukkan bahwa OsWRKY13 bertindak sebagai activator dari jalur
persinyalan asam salisilat dan bertindak sebagai repressor (penekan) dari jalur
persinyalan asam jasmonat. OsWRKY13 dapat secara langsung maupun tidak
langsung mengatur ekspresi dari gen-gen-gen upstream maupun downstream dari
asam salisilat dan asam jasmonat. Asam salisilat dan asam jasmonat merupakan
molekul yang telah diketahui terlibat dalam persinyalan untuk mengaktifkan gengen yang terlibat dalam pertahanan terhadap berbagai serangan patogen pada
tanaman (Ryu et al. 2006; Qiu et al. 2007).
WRKY merupakan suatu protein faktor transkripsi yang terlibat dalam
regulasi jalur respon pertahanan tanaman. Famili atau keluarga faktor transkripsi
WRKY banyak berperan di dalam merespon stres biotik dan abiotik, proses
penuaan, perkecambahan biji, dan perkembangan trikoma (Zhang et al. 2004;
Chen 2004; Franzisca et. al. 2004). Banyak protein WRKY yang terlibat dalam
pertahanan terhadap serangan patogen tanaman (Ryu et al. 2006). Protein WRKY
adalah protein yang terdiri dari ± 60 asam amino yang mengandung N-terminal
heptapeptida
WRKYGQK (secara berurutan adalah asam amino: Triptopan,
Arginin, Lisin, Tirosin, Glisin, Glutamin, dan Lisin) dan satu C-terminal yang
berupa struktur yang menyerupai “zinc-finger”. Untuk dapat mengatur ekspresi
gen,
protein
WRKY
mengikat
secara
spesifik
pada
urutan
DNA
(T)(T)TGACC(C/T) yang dikenal dengan “W-box” yang terdapat pada daerah
promotor dari gen-gen target. Sejumlah gen yang berhubungan dengan
pertahanan, termasuk gen PR (pathogenesis releted), mengandung “W-box” pada
daerah promotornya. Dengan kemampuan menempel pada bagian promoter dari
gen target tersebut, protein WRKY akan mampu menekan atau meningkatkan
transkripsi dari gen target (Zang and Wang 2005; Ryu et al. 2006).
Pada tanaman padi diperkirakan terdapat 109 gen yang termasuk dalam
famili OsWRKY, tetapi banyak dari gen-gen tersebut belum diketahui fungsinya
(Zhang and Wang 2005; Qiu et al. 2007). Gen OsWRKY76 terletak pada segmen
di kromosom 9 tanaman padi yang sebelumnya diidentifikasi terkait dengan
ketahanan berspektrum luas (Wisser et al. 2005).
Untuk mendukung kegiatan rekayasa genetik tanaman, teknologi kloning
gen yang bertujuan untuk mendapatkan konstruk dari kandidat gen adalah salah
satu kegiatan yang penting dilakukan. Suatu gen dapat berfungsi dengan baik
(dapat melakukan fungsi gennya) apabila mempunyai bagian-bagian yang disebut
promotor, unit transkripsional, dan terminator. Promotor adalah suatu bagian dari
gen yang berfungsi untuk mengatur proses transkripsi. Unit transkripsional adalah
bagian dari gen yang ditranskripsikan sehingga menghasilkan produk protein.
Terminator adalah bagian dari gen yang mengakhiri proses transkripsi.
Ada beberapa tahapan yang harus dilakukan dalam kegiatan kloning gen,
yaitu : isolasi DNA (gen), penyisipan DNA ke dalam sistem vektor untuk
membentuk vektor rekombinan dan introduksi vektor rekombinan yang membawa
sisipan ke dalam sel inang. Sedangkan perangkat yang diperlukan dalam kloning
ini adalah vektor (biotransport) yaitu molekul pembawa DNA, enzim restriksi dan
enzim ligase (Campbell et al. 2002).
Kegiatan perakitan tanaman transgenik yang melibatkan transfer DNA
asing dari luar ke dalam tanaman target keberhasilannya selain tergantung pada
gen yang dimasukkan ke dalam tanaman target, sistem transformasi dan
regenerasi tanaman transgenik, juga sangat tergantung pada tingkat ekspresi dari
gen yang dimasukkan di dalam tanaman target. Teknik transfer gen melalui
Agrobacterium telah banyak dilakukan untuk pengembangan tanaman tahan
terhadap hama dan penyakit. A tumefaciens menginfeksi tanaman dan
mengintroduksikan sebagian dari plasmid-Ti (tumor inducing) yang disebut
dengan T-DNA (transfer DNA) ke dalam genom tanaman. Fragmen T-DNA yang
berpindah dari sel bakteri ke dalam sel tanaman akan terintegrasi secara stabil
dalam genom inti. Proses integrasi T-DNA ke dalam genom tanaman diatur dan
dikontrol oleh beberapa gen yang dikenal dengan gen Vir pada plasmid Ti.
Menurut
Opabode
(2006)
efisiensi
transformasi
menggunakan
Agrobacterium tumefaciens dalam pembentukan tanaman transgenik sangat
tergantung dari beberapa hal diantaranya adalah genotipe tanaman, strain
Agrobacterium, vektor plasmid biner, senyawa penginduksi gen Vir, komposisi
medium transformasi, dan suhu lingkungan.
Pada penelitian ini dilakukan konstruksi dan introduksi konstruk overekspresi gen OsWRKY76 ke dalam tanaman padi Nipponbare melalui A.
tumefaciens. Adapun tujuan dari kegiatan ini adalah merakit (mengkonstruksi)
dan mengintroduksikan konstruk over-ekspresi gen OsWRKY76 ke dalam tanaman
padi Nipponbare melalui A. tumefaciens.