Repository FMIPA 1 ISOLASI DAN AMPLIFIKASI

ISOLASI DAN AMPLIFIKASI FRAGMEN GEN COX3 PADA IKAN Ompok
hypophthalmus (Bleeker 1846) DARI SUNGAI TAPUNG PROVINSI RIAU
Khairunnisa Ul Fitri1, Roza Elvyra 2, Dewi Indriyani Roslim 3
1
Mahasiswa Program S1 Biologi
Dosen Bidang Zoologi Jurusan Biologi
3
Dosen Bidang Genetika JurusanBiologi
Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
Kampus BinaWidya Pekanbaru, 28293, Indonesia
[email protected]
2
ABSTRACT
Selais danau fish (Ompok hypophthalmus) is one of the fish which inhabit the floodplain
river. Genetic information on Ompok hypophthalmus is still limited. This research
aims to obtain total DNA of O. hypophthalmus and DNA fragment amplified from
COX3 gene. Samples of ten O. hypophthalmus, retrieved from a floodplain river,
Tapung River, were isolated using the isolation Kit. Purification of DNA has been
done using Dneasy Blood and Tissue Kit from Qiagen. Total DNA was amplified using
COX3 F1 and COX3 R1 primers which were designed using sequence of COX3 gene
from Ictalurus punctatus (Genbank 2002). The result indicated that eight samples of
total DNA were successfully isolated from ten of fish samples taken. Amplification of
total DNA using primer COX3 F1 and COX3 R1 produces DNA fragments which sized
671 bp.
Keywords : COX3 gene, DNA isolation, Ompok hypophthalmus, floodplain river,
Tapung River
ABSTRAK
Ikan selais danau (Ompok hypophthalmus) merupakan salah satu jenis ikan sungai
paparan banjir. Informasi genetik pada ikan Ompok hypophthalmus masih terbatas,
untuk itu perlu dikaji informasi ilmiah berbasis genetik berdasarkan gen COX3 pada
genom mitokondria. Penelitian ini bertujuan untuk memperoleh DNA total ikan selais
danau dan fragmen DNA hasil amplifikasi dari gen COX3. Sepuluh sampel Ompok
hypophthalmus yang diperoleh dari sungai paparan banjir yaitu Sungai Tapung,
kemudian diisolasi menggunakan Kit isolasi dan purifikasi DNA Dneasy Blood and
Tissue Kit dari Qiagen. Molekul DNA total yang diperoleh diamplifikasi menggunakan
primer COX3 F1 dan COX3 R1 yang didesain menggunakan sekuen gen COX3
Ictalurus punctatus sebagai acuannya (Genbank 2002). Hasil penelitian menunjukkan
delapan sampel DNA total berhasil diisolasi dari sepuluh sampel yang diambil. Hasil
amplifikasi menggunakan primer COX3 F1 dan COX3 R1 menghasilkan fragmen DNA
berukuran 671 bp.
Repository FMIPA
1
Kata kunci : gen COX3, isolasi DNA, Ompok hypophthalmus, PCR, sungai paparan
banjir
PENDAHULUAN
Provinsi Riau adalah salah satu
provinsi yang memiliki ekosistem sungai
paparan banjir (floodplain river) (Elvyra
2009).
Sungai paparan banjir
merupakan suatu ekosistem yang unik,
ekosistem ini subur dan sangat
dipengaruhi oleh fluktuasi curah hujan.
Salah satu sungai paparan banjir yang
terdapat di Provinsi Riau adalah Sungai
Tapung. Sungai Tapung memiliki
kedalaman 8-12 meter dengan panjang
±90 km. Sungai Tapung terbagi atas dua
muara, yaitu Tapung Kanan dan Tapung
Kiri (Diskanlut Provinsi 2007b).
Menurut Azwir (2006) Sungai Tapung
Kiri memiliki substrat berpasir, aliran
dari sungai ini bermuara di Sungai Siak.
Sungai paparan banjir adalah salah
satu
ekosistem
yang
produktif
(Mustakim 2008). Pada saat musim
penghujan banyak kelompok ikan yang
memijah dan membesarkan anak-anak
ikan. Berbagai jenis ikan yang bernilai
ekonomis dan bersifat endemik hidup
dan berkembang biak di sungai paparan
banjir. Salah satu jenis ikan yang hidup
di sungai paparan banjir adalah ikan
Ompok hypophthalmus dicirikan sebagai
kelompok ikan bersungut (catfish) dan
merupakan salah satu jenis ikan sungai
paparan banjir. Ompok hypophthalmus
di Provinsi Riau dikenal dengan sebutan
ikan selais danau. Ikan selais danau
merupakan jenis ikan yang sangat di
digemari oleh masyarakat, khususnya di
Provinsi Riau.
Beberapa tahun
belakangan produksi dari penangkapan
ikan menurun. Penurunan ini antara lain
disebabkan gagalnya regenerasi ikan di
Repository FMIPA
ekosistem sungai akibat rusaknya habitat
dari ikan tersebut. Kerusakan habitat
disebabkan disekitar daerah aliran sungai
telah beralih fungsi menjadi lahan
perkebunan sawit dan penurunan
kualitas
air
diakibatkan
adanya
sedimentasi
yang
cukup
tinggi
(Diskanlut Provinsi Riau 2007a).
Berdasarkan keberadaan ikan ini
sebagai ikan sungai paparan banjir,
sumber
ekonomi
dan
sumber
keanekaragaman hayati di Indonesia
khususnya wilayah Provinsi Riau, maka
perlu dilakukan penelitian berbasis
genetik menggunakan teknik molekuler
untuk mendapatkan penanda genetik dari
ikan Ompok hypophthalmus dan untuk
menunjang usaha pelestarian ikan
Ompok hypophthalmus yang ada di
sungai paparan banjir di Provinsi Riau.
Sebelum mendapatkan informasi
ilmiah mengenai penanda genetik ikan,
tahap awal yang dilakukan terlebih
dahulu adalah dengan mengisolasi DNA
total ikan dan amplifikasi wilayah
genom mitokondria berdasarkan gen
COX3. Penelitian ini bertujuan untuk
memperoleh DNA total ikan selais danau
dan fragmen DNA hasil amplifikasi dari
gen COX3.
METODE PENELITIAN
Penelitian dilakukan pada bulan
Oktober 2014 - April 2015. Penelitian ini
dilaksanakan di Laboratorium Zoologi
dan Genetika Jurusan Biologi, Fakultas
Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
Universitas Riau, Pekanbaru. Sampel
Ompok hypophthalmus diperoleh dari
2
Sungai Tapung desa Flamboyan
Kabupaten Kampar, Provinsi Riau.
Alat yang digunakan adalah rak
tabung mikro, pipet mikro berukuran 10
µl, 100 µl, dan 1000 µl, tip mikro,
tabung 50 ml, tabung mikro berukuran
1,5 ml dan 0,2 ml, gunting, pinset,
spatula, waterbath, timbangan analitik,
aluminium foil,
hot plate, kamera
(Olympus
SP-500
UZ),
UV
transluminator,
mesin
sentrifus,
perangkat elektroforesis horizontal, dan
mesin PCR. Bahan yang digunakan
pada penelitian ini adalah Kit isolasi dan
purifikasi DNA Dneasy Blood and
Tissue Kit dari Qiagen yang terdiri dari:
buffer ATL, AL, AW1, AW2, AE, dan
Proteinase K. Selain bahan-bahan diatas
dibutuhkan juga etanol absolut dan
buffer TE [1 mM EDTA pH 8,0; 10 mM
Tris-HCl pH 8,0; 40 mg/ml RNAse].
Amplifikasi fragmen DNA dengan PCR
memerlukan TopTaq Master Mix PCR
dari Qiagen yang terdiri dari: 2x TopTaq
Master Mix, 10x CoralLoad concentrate,
dan dH2O. Selain itu dibutuhkan juga
sepasang primer gen COX3 yaitu primer
COX3-F1 5’ CCA CCA AGC ACA
TGC ATA C -3’ dan primer COX3 - R1
5’CGA ATC CCA AGT GGT GTT CT 3’ yang didesain menggunakan program
primer3 output dengan sekuen Ictalurus
punctatus sebagai acuan gen COX3
(Genbank 2002), loading dye, dan DNA
ladder. Bahan untuk pembuatan gel
agarosa: 1% agarosa untuk elektroforesis
DNA total dan 1,2% agarosa untuk
elektroforesis hasil PCR, Buffer TBE
(Tris base - Boric acid – EDTA pH 8),
etidium bromida, dan akuades.
Repository FMIPA
a. Pengambilan Sampel
Sepuluh sampel ikan selais danau
dari Sungai Tapung yang diperoleh dari
nelayan, diidentifikasi menggunakan
kunci identifikasi menurut Kottelat et al.
(1993). Setelah itu cuplikan otot bagian
dekat ujung ekor ikan dipotong dengan
ukuran 1x1 mm kemudian dimasukkan
ke dalam tabung mikro yang berukuran
1,5 ml yang telah berisi etanol absolut.
Tabung diberi label pada bagian luarnya,
selanjutnya disimpan di dalam kulkas.
b. Penanganan
Lapangan
Sampel
dari
Sampel otot ikan yang telah
disimpan di dalam etanol absolut
dikeluarkan secukupnya, dan diletakkan
diatas tisu sambil dikeringanginkan agar
etanolnya menguap. Sampel kemudian
ditimbang seberat 20 mg lalu
dimasukkan ke dalam tabung mikro 1,5
ml yang baru. Setelah itu sampel dicuci
dengan larutan 1x TE sebanyak 100 µl.
kemudian divorteks selama 15 detik,
setelah itu disentrifus selama 2 menit
pada kecepatan 3000 rpm. Larutan 1x
TE dibuang dengan menggunakan pipet
mikro, lakukan proses ini sebanyak 3
kali. Sampel kembali dikeringanginkan
diatas tisu hingga etanol yang tersisa
menguap. Proses selanjutnya adalah
isolasi dan purifikasi DNA.
c. Isolasi dan Purifikasi
Proses isolasi dan purifikasi DNA
total otot ikan dilakukan menggunakan
Kit isolasi dan purifikasi DNA Dneasy
Blood and Tissue Kit dari Qiagen. Otot
ikan
dicacah
halus
kemudian
dimasukkan ke dalam tabung mikro 1,5
3
ml lalu ditambahkan larutan Buffer ATL
sebanyak 180 µl. Sampel divorteks
selama 15 detik kemudian diberi
penambahan proteinase K sebanyak 20
µl lalu divorteks kembali selama 15
detik. Setelah itu, sampel diinkubasi
dalam waterbath dengan suhu 56ºC
selama 1-3 jam sambil sesekali divorteks
selama 15 detik. Selanjutnya, buffer AL
ditambahkan kedalam sampel sebanyak
200 µl kemudian divorteks selama 15
detik.
Langkah selanjutnya, etanol
absolut ditambahkan sebanyak 200 µl
lalu divorteks selama 15 detik dan
disentrifus selama 2 menit dengan
kecepatan 4000 rpm.
Supernatan
dipindahkan ke dalam collection tube
yang telah terpasang dengan spin
column, kemudian sampel disentrifus
selama 2 menit dengan kecepatan 400
rpm. Supernatan yang tertinggal di
colletion tube dibuang, kemudian spin
column dipindahkan ke dalam collection
tube yang baru, kemudian ditambahkan
buffer AW1 sebanyak 500 µl, setelah itu
sampel disentrifus kembali selama 2
menit dengan kecepatan 4000 rpm.
Buang larutan yang ada di collection
tube kemudian pindahkan spin colomn
ke dalam collection tube yang baru, lalu
ditambahkan 500 µl buffer AW2 ke
dalam sampel dan disentrifus selama 10
menit dengan kecepatan 4000 rpm.
Supernatan yang tertinggal di collection
tube dibuang kemudian pindahkan spin
column ke dalam tabung mikro 1,5 ml
yang baru, ditambahkan 200 µl buffer
AE untuk mengelusi DNA yang melekat
pada
membran
spin
colomn.
Selanjutnya, sampel disentrifus selama 2
menit dengan kecepatan 4000 rpm.
Supernatan yang diperoleh disimpan
sebagai stok DNA 1. Proses elusi
diulang sebanyak 2 kali. Pindahkan spin
Repository FMIPA
colomn ke tabung mikro 1,5 ml yang
baru, lalu ditambahkan buffer AE
Sampel kembali
sebanyak 200 µl.
disentrifus selama 2 menit dengan
kecepatan 400 rpm (proses sentrifus
diulangi sebanyak 2 kali), supernatan
yang diperoleh disimpan sebagai stok
DNA 2. Supernatan disimpan pada suhu
4ºC dan selanjutnya digunakan sebagai
cetakan dalam proses amplifikasi
wilayah gen COX3 menggunakan PCR.
d. Elektroforesis
DNA Total
Hasil
Purifikasi
Hasil purifikasi DNA total diperiksa
kualitas dan keutuhannya menggunakan
mesin elektroforesis. Hasil purifikasi
DNA total dielektroforesis pada 1% gel
agarosa dalam larutan 1x TBE (Tris
base – Boric acid – EDTA). Molekul
DNA total diwarnai dengan etidium
bromida
(0,5
µg/ml)
kemudian
divisiualisasi diatas UV transluminator
(WiseUv WUV-M20, Daihan Scientific)
dengan pada gelombang 302 nm dan
difoto dengan kamera berfilter.
e. Amplifikasi Wilayah Gen COX3 dari
Mitokondria
Proses amplifikasi gen COX3
dilakukan menggunakan TopTaq Master
Mix Kit PCR dari Qiagen. Adapun
volume dari tiap komponen mix PCR
yang dimasukkan ke dalam tabung mikro
ukuran 0,2 ml antara lain 44 µl 10x
CoralLoad, 132 µl dH2O, 220 µl 2x
TopTaq Master Mix.
Selain itu
dibutuhkan juga sepasang primer COX3F1 5’ CCA CCA AGC ACA TGC ATA
C -3’ dan primer COX3 - R1 5’CGA
ATC CCA AGT GGT GTT CT -3’ yang
sudah diencerkan dengan volume 8,8 µl
4
primer COX3 FI dan 8,8 µl primer
COX3 R1 3’ yang telah didesain
menggunakan program primer3 output
(www.genome.wi.mit.edu)
dengan
sekuen Ictalurus punctatus (Genbank
2002) sebagai acuan gen COX3. Total
volume PCR yang digunakan adalah 50
µl.
Kondisi PCR yang digunakan
mengikuti Elvyra dan Duryadi (2007)
dengan sedikit modifikasi suhu pada
tahapan annealing. Adapun tahapan
proses PCR meliputi: pra-PCR pada
suhu 94ºC selama 5 menit, diikuti
dengan 35 siklus yang terdiri dari 3
tahapan yaitu: denaturasi pada suhu 94
ºC selama 1 menit, annealing dengan
suhu optimasi 51,6 ºC selama 1 menit
dan elongasi pada suhu 72 ºC selama 1
menit. Langkah terakhir adalah postPCR 72 ºC selama 5 menit.
f.
Elektroforesis Hasil PCR
Fragmen
DNA
hasil
PCR
dielektroforesis pada 1,2% gel agarosa
dalam larutan 1x TBE (Tris base – Boric
acid – EDTA) dengan menggunakan alat
elektroforesis. Setelah itu gel agarosa
diwarnai dengan etidium bromida (0,5
µg/ml) lalu divisiualisasi diatas UV
transluminator (WiseUv WUV-M20,
Daihan Scientific) dengan panjang
gelombang 302 nm dan difoto dengan
kamera (Olympus SP-500 UZ) berfilter.
HASIL DAN PEMBAHASAN
a. Molekul DNA Total
Proses ekstraksi DNA merupakan
proses untuk memisahkan DNA dari
komponen sel lainnya. Hasil ekstraksi
DNA O. hypophthalmus dicek kualitas
DNAnya
menggunakan
mesin
Repository FMIPA
elektroforesis. Elektroforesis merupakan
suatu proses memigrasikan partikel
bermuatan di bawah pengaruh medan
listrik dalam kondisi yang konstan. Pada
saat arus listrik diberikan, molekul akan
bermigrasi melalui media (biasanya
berupa gel), semakin kecil ukuran
molekul maka kecepatan bermigrasinya
semakin cepat begitu juga sebaliknya
(Green & Sambrook 2012).
Gel yang biasanya digunakan
sebagai media elektroforesis adalah
agarosa. Agarosa berasal dari ekstrak
rumput laut yang sudah dimurnikan dan
merupakan polisakarida yang tidak
bermuatan (netral). Elektroforesis gel
agarosa dapat memisahkan sampel DNA
yang
berukuran
200-50.000
bp,
sedangkan untuk memisahkan DNA
dengan ukuran lebih pendek yang
berkisar 5-500 bp dapat digunakan gel
poliakrilamid (Green & Sambrook
2012).
Hasil
elektroferesis
berupa
fragmen DNA dapat divisualisasikan
dengan beberapa cara, yaitu dengan
penambahan etidium bromida (EtBr) ke
dalam gel sewaktu pembuatannya atau
dengan cara gel direndam di dalam
larutan etidium bromida sebelum
divisualisasikan
dengan
UV
transluminator.
Molekul etidium
bromida berpendar ketika diiluminasi
dengan cahaya ultraviolet (UV).
Etidium bromida merupakan pewarna
mutagenik yang akan mengikat dengan
cara menyisip diantara ikatan basa pada
untai
ganda
DNA
sehingga
menyebabkan transmisi sinar UV
menjadi dapat dilihat (Fairbanks &
Andersen 1999).
Profil hasil
eletroforesis DNA total sampel O.
hypophthalmus tersaji pada Gambar 1.
5
a b
Gambar 1 Profil pita DNA total ikan
Ompok
hypophthalmus
menggunaka
1%
gel
agarosa. Keterangan: OH
(Ompok hypophthalmus)
Berdasarkan hasil elektroforesis dari
sepuluh sampel O. hypophthalmus yang
diisolasi, hanya delapan sampel yang
berhasil
diisolasi
yaitu
ditandai
munculnya pita DNA total pada saat
divisualisasi
menggunakan
UV
transluminator. Dari delapan sampel
yang berhasil diisolasi menunjukkan
hasil yang bervariasi (Gambar 1).
Molekul DNA total dikatakan baik
apabila profil pada pita DNA menunjuk
pita yang tebal, tegas dan tidak terdapat
smear (b). Pita DNA yang smear (a)
disebabkan karena DNA terdegradasi
pada saat proses isolasi. Sampel yang
pita DNA nya muncul dan bagus dipilih
untuk kemudian diamplifikasi fragmen
DNA mitokondrianya pada bagian gen
COX3 menggunakan mesin PCR.
b.
Amplifikasi Fragmen DNA
Mitokondria dari Gen COX3
Amplifikasi
merupakan
proses
perbanyak fragmen DNA secara in vitro
menggunakan teknik PCR (Polymerase
Chain Reaction) pada daerah yang
spesifik yang dibatasi oleh sepasang
primer. Salah satu faktor keberhasil dari
Repository FMIPA
proses amplifikasi PCR yaitu dari
pemilihan primer.
Primer berperan
sebagai penanda fragmen sampel DNA
yang akan diamplifikasi.
Primer
merupakan potongan untaian DNA
pendek utas tunggal (oligonukleotida)
dengan panjang berkisa 10 - 40 basa
(Zein & Prawiradilaga 2013). Pada
kondisi tertentu primer akan mengenali
dan berikatan dengan untaian DNA
komplemennya yang terletak diawal dan
diakhir dari fragmen DNA target.
Molekul DNA total hasil ekstraksi
digunakan sebagai cetakan untuk proses
amplifikasi.
Pada penelitian ini
digunakan sepasang primer yaitu primer
COX3-F1 5’ CCA CCA AGC ACA
TGC ATA C -3’ dan primer COX3-R1
5’CGA ATC CCA AGT GGT GTT CT 3’ yang telah didesain menggunakan
program
primer3
output
(www.genome.wi.mit.edu)
dengan
sekuen Ictalurus punctatus (Genbank
2002) sebagai acuan gen COX3. Adapun
tahapan PCR untuk mengamplifikasi gen
COX3 antara lain : pra-PCR 94ºC selama
5 menit, denaturasi 94ºC selama 1 menit,
untuk annealing, tahapan annealing
merupakan tahapan yang penting pada
proses PCR karena jika suhu annealing
terlalu rendah maka akan terjadi
penempelan primer pada template
(cetakan) DNA tidak spesifik sedangkan
jika suhu annealing terlalu tinggi maka
penempelan primer pada template DNA
akan lepas kembali sehingga produk
PCR tidak terbentuk (Wahyudi 2001).
Proses annealing menggunakan optimasi
suhu 51,6ºC selama 1 menit, elongasi
72ºC selama 1 menit, amplifikasi
dilakukan sebanyak 35 siklus kemudian
diakhir dengan post-PCR 72ºC selama 5
menit. Jumlah siklus yang dilakukan
pada proses PCR bervariasi tergantung
6
pada produk akhir PCR yang
diharapkan.
Siklus 23-35 biasanya
sudah cukup untuk menghasilkan
fragmen DNA, untuk kondisi PCR
seperti jumlah siklus pada penelitian ini
mengikuti Elvyra dan Duryadi (2007)
dengan jumlah siklus sebanyak 35
Produk PCR selanjutnya
siklus.
dideteksi dengan mesin elektroforesis
menggunakan gel agarosa 1,2%,
kemudian divisualisasi dengan bantuan
UV transluminator (WiseUv WUV-M20,
Daihan Scientific) dengan panjang
gelombang 302 nm dan difoto dengan
kamera (Olympus SP-500 UZ) berfilter
(Gambar 2).
Gambar 2 Profil fragmen gen COX3
Ompok
hypophthalmus
menggunakan 1,2% gel
agarosa. Keterangan: OH
(Ompok hypophthalmus)
Dari hasil amplifikasi gen COX3
pada
ikan
O.
hypophthalmus
menggunakan primer COX3 F1 dan
COX3 R1 menghasilkan fragmen gen
COX3 yang berukuran ±671 bp dengan
kualitas fragmen DNA yang baik.
KESIMPULAN
Molekul DNA total telah berhasil
diperoleh pada penelitian ini. Hasil
amplifikasi menggunakan primer COX3
F1 dan primer COX3 R1 menghasilkan
Repository FMIPA
fragmen gen COX3 yang berukuran
±671 bp dengan kualitas fragmen DNA
yang baik.
UCAPAN TERIMA KASIH
Penulis mengucapkan terima kasih
kepada DIKTI DP2M yang telah
membiayai penelitian ini melalui Hibah
Kompetensi atas nama Dr. Roza Elvyra,
M.Si tahun 2015.
DAFTAR PUSTAKA
Azwir. 2006. Analisa pencemaran air
sungai Tapung oleh limbah
industri kepala sawit PT. Peputra
Materindo di kabupaten Kampar
[tesis]. Semarang: Program Pasca
Sarjana
Ilmu
Lingkungan,
Universitas Diponegoro.
Dinas Perikanan dan Kelautan Provinsi
Riau. 2007a. Statistik perikanan
tangkap
Provinsi
Riau.
Pekanbaru: Diskanlut Provinsi
Riau.
Dinas Perikanan dan Kelautan Provinsi
Riau.
2007b. Sungai Tapung.
Pekanbaru: Diskanlut Provinsi
Riau.
Elvyra R, Duryadi D. 2007. Kajian
penanda genetik gen sitokrom b
DNA Sungai Kampar Riau. J
Natur Ind 10:6-12.
Elvyra R. 2009. Kajian Keragaman
genetik dan biologi reproduksi
ikan lais di Sungai Kampar Riau
[disertasi].
Bogor:
Sekolah
Pascasarjana, Institut Pertania
Bogor.
7
Fairbank DJ, Andersen WR. 1999.
Genetics: The Continuity of Life.
New York: Brooksdole Publishing
Company.
Genbank. 2002. Ictalurus punctatus
mitochondrion, complete genome.
http://www.ncbi.nml.nih.gov/nucc
ore/NC_003489.1. [Diakses pada
29 Maret 2015]
Green MR, Sambrook J.
2012.
Molecualr Cloning: A Labolatory
Manual. 4th ed. New York: Cold
Spring Harbor Labolatory Press
Kottelat M, Whitten AJ, Kartikasari SN,
Wirdjoatnodjo S. 1993. Freswater
fishes of western Indonesia and
Sulawesi. Jakarta: Periplus edition
(HK) in collaboration with the
environment Rep. of Indonesia.
Repository FMIPA
Mustakim M. 2008. Kajian Kebiasaan
Makanan dan Kaitannya Dengan
Aspek Reproduksi Ikan Betok
(Anabas testudineus Bloch) Pada
Habitat
Yang
Berbeda
Di
Lingkungan Danau Melintang
Kutai Kartanegara Kalimantan
Timur [tesis].Bogor : Sekolah
Pasca Sarjana. Institut Pertanian
Bogor.
Wahyudi TH. 2001. Pengaruh suhu
annealing dan jumlah siklus yang
berbeda pada program PCR
terhadap keberhasilan isolasi dan
amplifikasi mtDNA ikan Patin
(Pangasius
hypophthalmus)
[skripsi].
Bogor: Fakultas
Perikanan dan Ilmu kelautan,
Intitut Pertanian Bogor.
Zein
MSA,
Prawiradilaga
DM.
Barcode
Fauna
2013.DNA
Indonesia. Jakarta: Kencana.
8