time pcr untuk analisis kehalalan - UIN Repository
advertisement
UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA DETEKSI DNA GELATIN SAPI DAN GELATIN BABI PADA SIMULASI GUMMY VITAMIN C MENGGUNAKAN REAL -TIME PCR UNTUK ANALISIS KEHALALAN SKRIPSI YANTI PUSPITANINGRUM NIM : 1110102000043 FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN PROGRAM STUDI FARMASI UNIVERSITAS ISLAM NEGERI SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA JANUARI 2015 UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA DETEKSI DNA GELATIN SAPI DAN GELATIN BABI PADA SIMULASI GUMMY VITAMIN C MENGGUNAKAN REAL -TIME PCR UNTUK ANALISIS KEHALALAN SKRIPSI Diajukan sebagai salah satu syarat memperoleh gelar Sarjana Farmasi YANTI PUSPITANINGRUM NIM : 1110102000043 FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN PROGRAM STUDI FARMASI UNIVERSITAS ISLAM NEGERI SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA JANUARI 2015 HALAMAN PERNYATAAN ORISINALITAS Skripsi ini adalah hasil karya saya sendiri, dan semua sumber baik yang dikutip maupun dirujuk telah saya nyatakan dengan benar Nama : Yanti Puspitaningrum NIM : 1110102000043 Tanda Tangan : Tanggal : Januari 2015 iii UIN Syarif Hidayatullah Jakarta iv UIN Syarif Hidayatullah Jakarta v UIN Syarif Hidayatullah Jakarta KATA PENGANTAR Puji Syukur kehadirat Allah SWT yang telah memberikan rahmat dan karunia-Nya kepada penulis sehingga dapat menyelesaikan penelitian dan penulisan skripsi dengan judul Deteksi DNA Gelatin Sapi Dan Gelatin Babi Pada Simulasi Gummy Vitamin C Menggunakan Real -Time PCR Untuk Analisis Kehalalan Shalawat serta salam selalu tercurah kepada junjungan Nabi Muhammad SAW, keluarga, para sahabat, dan pengikutnya yang senantiasa istiqomah mengikuti sunnah-Nya. Skripsi ini disusun untuk memenuhi salah satu syarat untuk mencapai gelar Sarjana Farmasi (S.Far) pada Program Studi Farmasi Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta. Keberhasilan penelitian dan penyusunan skripsi ini tidak lepas dari bantuan dan dorongan semua pihak. Untuk itu pada kesempatan ini, perkenankanlah penulis menyampaikan ucapan terimakasih yang sebesar-besarnya kepada: 1. Bapak Prof. DR. (hc) dr. M.K Tadjudin Sp.And, selaku Dekan Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan UIN Syarif Hidayatullah Jakarta. 2. Bapak Drs.Umar Mansur, M.Sc.,Apt selaku Ketua Program Studi Farmasi Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah Jakarta sekaligus sebagai pembimbing II. 3. Ibu Zilhadia, M.Si., Apt. sebagai Pembimbing I yang sangat baik telah memberikan ilmu, nasehat, waktu, tenaga, pikiran, materi dan dukungan selama penelitian dan penulisan skripsi. 4. Kedua orang tua, ayahanda tersayang Edi Winarko dan ibunda tercinta Siti Rukmini yang selalu ikhlas memberikan dukungan moral, material, nasehatnasehat, serta doa yang tiada pernah putus hingga penulis dapat menyelesaikan studi di jurusan Farmasi FKIK UIN Syarif Hidayatullah Jakarta. Juga kepada adikku tercinta Koko Dwi Suryanto yang selalu memberikan dukungan dan semangat. Tiada apapun di dunia ini yang dapat membalas semua kebaikan, cinta dan kasih sayang yang telahkalian berikan. 5. Bapak dan Ibu staf pengajar, serta karyawan yang telah memberikan ilmu pengetahuan, bimbingan dan bantuan selama penulis menempuh pendidikan di farmasi, FKIK UIN Jakarta. vi UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 6. Teman-teman Andalusia yang telah menjadi kepingan memori yang berharga. Kebersamaan kita di dalam suka dan duka akan selalu terkenang didalam hati 7. Kak Rahmadi, Kak Liken, Kak Eris, Kak Lisna, Kak Rani, Kak Tiwi, Kak Lilis, dan Kak Ayu yang sangat banyak membantu penulis melakukan penelitian di laboratorium. 8. Teman-teman seperjuangan tim PCR: Afifah dan Kak Sulaiman yang selalu meluangkan waktunya untuk bekerja sama, berdiskusi, memberikan masukan, membantu penulis dalam melakukan peneltian, serta memberikan dukungan doa dan semangat kepada penulis dalam penyelesaian skripsi ini. Terimakasih atas kebersamaan yang indah ini, semoga balasan kebaikan selalu menaungi kita. 9. Tim Roche Indonesia: Pak Deka, Pak Yos, dan Mbak Helen yang telah memberikan masukan dan bantuan selama penulis melakukan penelitian. 10. Sahabat tersayang : Finti, Nurul, Rifa, Ninik, dan Luni. Terima kasih atas dukungan, kasih sayang, perhatian, doa dan persahabatan yang indah ini. 11. Farida, Yusna, Fahrur, Yuni, Vicka, Salma, Chandra, Ipho, yang menginspirasi. Terimakasih atas dukungan,bantuan dan semangatnya. 12. Dan kepada semua pihak yang telah membantu penulis selama ini yang tidak dapat disebutkan namanya satu persatu. Semoga semua bantuan yang telah diberikan mendapatkan balasan kebaikan dari Allah SWT. Penulis menyadari bahwa penulisan skripsi ini masih jauh dari kesempurnaan. Oleh karena itu, saran dan kritik yang bersifat membangun akan penulis nantikan. Dan semoga skripsi ini bisa bermanfaat bagi masyarakat umum dan pengembangan ilmu pengetahuan. Jakarta, Januari 2015 Penulis vii UIN Syarif Hidayatullah Jakarta ABSTRAK Nama : Yanti Puspitaningrum Nim : 1110102000043 Judul : Deteksi DNA Gelatin Sapi Dan Gelatin Babi Pada Simulasi Gummy Vitamin C Menggunakan Real -Time PCR Untuk Analisis Kehalalan Salah satu produk food supplement yang disukai oleh kalangan anak-anak adalah gummy vitamin C. Bahan basis gummy vitamin C salah satunya adalah gelatin. Produksi gelatin di dunia sebanyak 46% masih berasal dari kulit babi, maka dari itu perlu dilakukan penelitian tentang bahan asal gelatin. Sampel simulasi gummy yang digunakan adalah gummy sapi, gummy babi, gummy pencampuran gelatin babi dan gelatin sapi dengan konsentrasi 1%, 25%, 50%, dan 75%. Salah satu teknik analisis untuk membedakan gelatin babi dan gelatin sapi adalah teknik amplifikasi DNA dengan instrumen Real-Time PCR. Amplifikasi DNA membutuhkan sepasang primer spesifik yang diambil dari DNA mitokondria daerah sitokrom B serta hydrolysis probe sebagai pewarna fluoresensi. Proses ekstraksi dan isolasi DNA pada gummy mengkombinasikan presipitasi DNA dan kit komersial. Isolat DNA yang dianalisis dengan hydrolysis probe menggunakan suhu annealing 61ºC untuk primer sapi dan suhu 60ºC untuk primer babi. Hasil kurva amplifikasi dengan primer babi dari sampel simulasi gummy hanya muncul pada gummy babi, gummy pencampuran babi dengan konsentrasi 25%, 50% dan 75%. Tetapi pada gummy pencampuran babi konsentrasi 1% tidak muncul kurva amplifikasi. Kata Kunci: Real Time Polymerase Chain Reaction, Gelatin, Hydrolysis Probe, Gummy viii UIN Syarif Hidayatullah Jakarta ABSTRACT Name : Yanti Puspitaningrum Major : Pharmacy Title : Detection of DNA Bovine Gelatin and Porcine Gelatin in the Gummy Simulation Vitamin C Using Real -Time PCR Instruments for Halal Analysis One of the food supplement products which are favored by the children is gummy vitamin C. One of vitamin C gummy bases is gelatin. About 46 % of gelatin production in the world still comes from pig skin, therefore the research of gelatin bases is necessary. Gummy simulation samples consist of beef gummy, pig gummy and the mixing gummy between porcine gelatin and bovine gelatin with the concentration of 1 % , 25 % , 50 % , and 75 %. One of analysis technique which is used to distinguish bovine gelatin and porcine gelatin is DNA amplification technique using Real-Time PCR instrument. Amplification DNA needs a pair of specific primary DNA taken from mitochondria cytochrome b and hydrolysis probe as dye fluorescence. Extraction and isolation process of DNA in gummy combine the precipitation of DNA and commercial kit. DNA isolates analyzed by hydrolysis probe method using annealing temperature was 61ºC for bovine primer and using annealing temperature was 60ºC for porcine primer. The results of the amplification curves for sampel gummy simulation only showed the rising of amplification curve for porcine gummy, mixing gummy with a concentration of 25%, 50% and 75% of porvine gelatin. However, mixing of porcine gummy concentration of 1% does not show amplification curve. Keyword : Real Time Polymerase Chain Reaction, Gelatin, Hydrolysis Probe, Gummy ix UIN Syarif Hidayatullah Jakarta HALAMAN PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI TUGAS AKHIR UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIS Sebagai sivitas akademika Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah Jakarta, saya yang bertanda tangan di bawah ini: Nama : Yanti Puspitaningrum Nim : 1110102000043 Program Studi : Strata-1 Farmasi Fakultas : Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Jenis Karya : Skripsi demi pengembangan ilmu pengetahuan, saya menyetujui skripsi/karya ilmiah saya, dengan judul : Deteksi DNA Gelatin Sapi Dan Gelatin Babi Pada Simulasi Gummy Vitamin C Menggunakan Real -Time PCR Untuk Analisis Kehalalan untuk dipublikasikan atau ditampilkan di internet atau media lain yaitu Digital Library Perpustakaan Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah Jakarta untuk kepentingan akademik sebatas sesuai dengan Undang-Undang Hak Cipta. Demikian pernyataan publikasi karya ilmiah ini saya buat dengan sebenarnya. Dibuat di : Jakarta Pada Tanggal : 18 Januari 2015 Yang Menyatakan Yanti Puspitaningrum x UIN Syarif Hidayatullah Jakarta DAFTAR ISI HALAMAN PERNYATAAN ORISINALITAS………………………….......... iii HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING.................................................. iv LEMBAR PENGESAHAN SKRIPSI………………………………………….. v KATA PENGANTAR…………………………………………………………… vi ABSTRAK……………………………………………………………………….. viii ABSTRACT…………………………………………………………………........ ix HALAMAN PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI………………... x DAFTAR ISI........................................................................................................... xi DAFTAR TABEL................................................................................................... xiii DAFTAR GAMBAR.............................................................................................. xiv DAFTAR LAMPIRAN.......................................................................................... xv DAFTAR SINGAKATAN………………………………………………………. xvi BAB I PENDAHULUAN..................................................................................... 1 1.1 Latar Belakang................................................................................. 1 1.2 Rumusan Masalah............................................................................ 3 1.3 Hipotesis........................................................................................... 3 1.4 Tujuan Penelitian.............................................................................. 3 1.5 Manfaat Penelitian........................................................................... 5 BAB 2 TINJAUAN PUSTAKA............................................................................. 5 2.1 Gummy Candy ................................................................................ 5 2.2 Vitamin C.......................................................................................... 5 2.3 Gelatin............................................................................................... 6 2.3.1 Definisi Gelatin.................................................................... 6 2.3.2 Sifat Kimia dan Fisika Gelatin.............................................. 7 2.3.3 Sumber Gelatin..................................................................... 8 2.4 Sel..................................................................................................... 9 2.5 DNA.................................................................................................. 12 2.5.1 Struktur DNA....................................................................... 12 2.5.2 Isolasi DNA.......................................................................... 14 xi UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 2.5.3 2.6 2.7 DNA Mitokondria................................................................ 16 PCR.................................................................................................. 17 2.6.1 Komponen PCR.................................................................... 18 2.6.2. Tahapan PCR........................................................................ 21 Real Time PCR................................................................................. 22 BAB 3 METODOLOGI PENELITIAN................................................................ 24 3.1 Waktu dan Tempat............................................................................ 24 3.2 Alat dan Bahan.................................................................................. 24 3.2.1 Alat........................................................................................ 24 3.2.2 Bahan.................................................................................... 24 3.3 Tahapan Penelitian............................................................................ 25 3.4 Prosedur Kerja.................................................................................. 25 3.4.1 Pembuatan Simulasi Gummy Vitamin C dari Gelatin Babi dan gelatin Sapi................................................................ 25 3.4.2 Isolasi DNA........................................................................ 26 3.4.3 Pengujian Konsentrasi dan Kemurnian DNA dengan spektrofotometer DNA........................................................ 3.4.4 Amplifikasi Real Time 28 PCR...................................... 28 BAB 4 HASIL DAN PEMBAHASAN…………………………………………… 30 4.1. Pembuatan Simulasi Gummy Vitamin C……………………………. 30 4.2. Isolasi DNA………………………………………………………… 30 4.3. Analisa Konsentrasi Dan Kemurnian Isolat DNA dengan Spektrofotometer DNA....................................................................... 33 4.4. Amplifikasi DNA Daging, Gelatin, dan Sampel Simulasi Gummy Vitamin C pada Real Time PCR…………………………………… 34 BAB 5 KESIMPULAN……………………………………………………........... 40 5.1. Kesimpulan……………………………………………………........ 40 5.2. Saran……………………………………………………………….. 40 DAFTAR PUSTAKA............................................................................................. 41 xii UIN Syarif Hidayatullah Jakarta DAFTAR TABEL Tabel.1. Aplikasi Gelatin................................................................................ 7 Tabel.2. Perbedaan sel eukariotik dan sel prokariotik...................................... 11 Tabel 3. Susunan basa primer dan probe untuk DNA sapi dan babi................. 25 Tabel.4. Komposisi Formula Gummy Vitamin C........................................... 26 Tabel.5. Konsentrasi dan Kemurnian Isolat DNA........................................... 33 Tabel.6. Komposisi Kit Ekstraksi DNA……………………………………. 46 Tabel.7. Campuran reaksi Hydrolysis Probe mastermix…………………… 49 xiii UIN Syarif Hidayatullah Jakarta DAFTAR GAMBAR Gambar.1. Gummy candy............................................................................... 5 Gambar.2. Sel Prokariotik dan Sel Eukariotik................................................ 10 Gambar.3. Struktur Nukleotida...................................................................... 13 Gambar.4. Struktur DNA................................................................................ 14 Gambar 5. Struktur DNA Mitokondria…………………………………… 17 Gambar.6. Siklus PCR.................................................................................... 21 Gambar.7. Kurva Real Time PCR………………………………………….. 23 Gambar.8. Program Amplifikasi Real-Time PCR.......................................... 29 Gambar 9. Simulasi gummy vitamin C…………………………………… Gambar.10.Hasil Amplifikasi pada Uji Spesifitas Primer 30 Sapi Menggunakan Kontrol Positif Daging Sapi, Gelatin Sapi dan Gummy Sapi…………………………………………………… 35 Gambar.11.Hasil Amplifikasi Sampel Simulasi Gummy dengan Primer Sapi…………………………………………………………….. Gambar.12.Hasil Amplifikasi Pada Uji Spesifitas Primer 36 Babi Menggunakan Kontrol Positif Daging Babi, Gelatin Babi, dan Simulasi Gummy Babi………………………………………… 37 Gambar 13. Hasil Amplifikasi Sampel Simulasi Gummy dengan Primer Babi……………………………………………………………. xiv 38 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta DAFTAR LAMPIRAN Lampiran.1 Kerangka Konsep........................................................................ 45 Lampiran 2. Tabel Komposisi Kit Ekstraksi DNA Roche………………….. 46 Lampiran 3. Membuat Larutan Primer dan Probe dan Natrium Asetat…….. 47 Lampiran 4. Perhitungan Tm (Melting Temperature) Primer……………… 48 Lampiran 5. Campuran Reaksi Mastermix untuk Amplifikasi DNA………. 49 Lampiran 6. Hasil BLAST Berdasarkan Informasi NCBI…………………. 50 Lampiran 7. Gambar alat-alat dalam penelitian……………………………. 51 Lampiran 8. COA Gelatin Babi…………………………………………….. 52 Lampiran 9. COA Gelatin Sapi…………………………………………….. 53 xv UIN Syarif Hidayatullah Jakarta DAFTAR SINGKATAN BHQ-1 : Black Hole Quencher-1 BLAST : Basic Local Aligment Search Tool CP : Crossing Point cyt b : Cytochrome b dATP : Deoxyadenosine Triphosphate dCTP : Deoxycytidine Triphosphate dGTP : Deoxyguanosine Triphosphate dNTP : Deoxyribonucleaside Triphosphate dTTP : Deoxythymidine Triphosphate DNA : Deoxyribonucleic Acid ELISA : Enzyme-linked Immunosorbent Assay FAM : Fluorescein Amidite HPLC : High Performance Liquid Chromatography mtDNA : mitochondria DNA NCBI : National Center for Biotechnology Information NTC : No Template Control PCR : Polymerase Chain Reaction pb : Pasang Basa qPCR : Quantitative Polymerase Chain Reaction RE : Retikulum Endoplasma RNA : Ribonucleic Acid SDS : Sodium Dodesil Sulfat SNI : Standar Nasional Indonesia Tm : Temperature Melting Ta : Temperature Annealing xvi UIN Syarif Hidayatullah Jakarta xvii UIN Syarif Hidayatullah Jakarta BAB 1 PENDAHULUAN 1.1. Latar Belakang Food supplement atau disebut sebagai makanan tambahan pada aneka produk kesehatan yang mengandung satu atau lebih zat bersifat nutrisi dan obat. Nutrisi yang terkandung dalam food supplement meliputi vitamin, mineral dan asam amino, sedangkan food supplement yang bersifat obat umumnya diambil dari tanaman atau jaringan tubuh hewan yang berkhasiat sebagai obat (Yuliarti, 2009). Dalam pemenuhan nutrisi bagi anak-anak, terutama pada pemberian vitamin, maka industri farmasi mulai memproduksi sediaan vitamin dalam bentuk gummy. Alasan pemilihan bentuk gummy tersebut, karena bentuk sediaan gummy seperti permen jelly dan mudah dikunyah sehingga anak-anak lebih menyukai gummy daripada bentuk tablet. Bahan-bahan untuk membuat gummy diantaranya adalah sukrosa, glukosa, asam sitrat serta bahan basis gummy yaitu gelatin. (Lanelli, 2014). Gelatin merupakan protein yang berasal dari hidrolisis kolagen jaringan ikat dan tulang dengan perlakuan asam dan basa. Gelatin memiliki sifat sebagai gelling agent, thickening agent, zat penstabil, dan emulsifier. Oleh karena itu gelatin digunakan dalam produk makanan seperti marshmallow, permen gummy, daging olahan, es krim. Selain itu, gelatin juga digunakan dalam industri farmasi sebagai bahan untuk membuat kapsul keras dan kapsul lunak, tablet, salep untuk mukosa membran mulut, dan suplemen gummy (Hui et al.,2011; Nhari et al.,2012). Globalisasi dalam semua aspek kehidupan telah membawa konsekuensi banyak pada makanan produk lokal maupun produk impor, baik produk yang halal atau produk yang haram. Hal ini jelas sangat mengkhawatirkan karena sebagian besar penduduk Indonesia beragama Islam. LPPOM MUI sudah meluncurkan sistem jaminan halal sebagai pedoman yang diwujudkan dalam bentuk sertifikasi halal, tetapi masih banyak kendala. Salah satu kendala yang dihadapi adalah belum terdapat metode yang valid untuk menganalisa adanya zat non halal pada produk makanan. Salah 1 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 2 satu produk pangan yang masih diragukan kehalalannya yaitu produk makanan yang berbasis gelatin. Gelatin diekstraksi dari kulit, jaringan ikat putih dan tulang yang bersumber dari babi dan sapi. (Hermanto, Sumarlin, and Fatimah, 2013). Presentase produksi gelatin di dunia pada tahun 2006, masih didominasi oleh gelatin babi, dengan jumlah 45,8 % berasal dari kulit babi dan 28,4% berasal dari kulit sapi ( Phillips & William, 2009). Sementara itu, Al-Qur'an surat Al-Maidah: 3, menjelaskan bahwa umat Islam dilarang untuk mengkonsumsi produk babi dan hewan yang tidak disembelih berdasarkan hukum Islam. Hal ini jelas bahwa umat Islam dilarang untuk mengkonsumsi makanan diklasifikasikan sebagai bangkai (maytah), darah, daging babi dan daging yang didedikasikan untuk selain Allah (Raraswati et al., 2009). Banyak kajian yang telah dilakukan mengenai sifat, aplikasi dan struktur gelatin, mengingat luasnya penggunaan gelatin itu sendiri. Namun gelatin dari sumber yang berbeda bisa jadi sangat mirip ditinjau dari segi sifat fisika dan kimianya. Hal ini membuat sulit untuk membedakan antara gelatin yang haram dan gelatin halal (Nemati et al., 2004). Pada penentuan spesies hewan dapat dilakukan dengan analisis protein dan DNA. Pada analisis penentuan spesies hewan berbasis protein sering digunakan metode ELISA, HPLC, dan Spektrofotometri massa. Analisis penentuan spesies hewan berbasis DNA digunakan metode PCR atau Real Time PCR. Metode penentuan spesies hewan berbasis protein memiliki kekurangan yaitu protein terjadi denaturasi progresif yang disebabkan oleh perubahan suhu dan pH sehingga kehilangan heterogenitas dan stabilitas protein. Metode berbasis DNA memiliki kelebihan dibandingkan metode berbasis protein yaitu metode real time PCR menggunakan primer spesifik dengan jenis DNA hewan dan proses deteksi lebih sensitif dan cepat (Cai et al., 2012). Analisa kandungan babi dalam suatu produk dapat dilakukan melalui amplifikasi DNA dengan metode Polymerase Chain Reaction (PCR). Hal ini telah banyak dilakukan seperti pemeriksaan daging babi dalam produk olahan (Walker et al, 2003) dan pengujian pencemaran daging babi pada UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 3 produk bakso (Ridwan dan Margawati, 2010). Selain pada produk makanan, PCR dapat digunakan dalam identifikasi DNA babi dan sapi yang terkandung dalam gelatin pada sediaan kapsul dan gummy seperti yang telah dilakukan Demirhan et al. (2012) dan Cai et al. (2012). Penelitian ini dilakukan berdasarkan beberapa permasalahan, di antaranya adalah masih banyak obat-obatan di Indonesia yang belum mencantumkan label halal atau mendapatkan sertifikat halal dari lembaga yang berwenang. Sekitar 30 ribu obat dari 206 perusahaan hanya 34 produk yang bersertifikat halal, dengan rincian, obat sebanyak 4 produk, jamu sebanyak 17 produk dan suplemen sebanyak 13 produk. Sedangkan pemasaran gelatin di dunia didominasi oleh gelatin yang bersumber dari babi sehingga kemungkinan besar gelatin yang digunakan dalam pembuatan obat bentuk sediaan gummy adalah gelatin yang tidak halal (LPPOM MUI, 2013). Tujuan dari penelitian untuk membedakan amplifikasi DNA gelatin sapi dan gelatin babi pada sampel simulasi gummy vitamin C dengan menggunakan instrumen real time PCR. Sampel simulasi gummy vitamin C dibuat dengan campuran antara gelatin sapi dan gelatin babi dalam berbagai konsentrasi. 1.2. Rumusan Masalah 1. Bagaimana kondisi optimal pada proses isolasi DNA sehingga didapatkan isolat DNA ? 2. Apakah DNA gelatin babi dan gelatin sapi serta simulasi gummy vitamin C dapat teramplifikasi dengan alat real-time PCR ? 1.3. Hipotesis 1. Isolasi DNA dapat dilakukan pada produk gelatin 2. Real-time PCR dapat mengamplifikasi DNA gelatin sapi dan gelatin babi menggunakan primer spesifik babi dan sapi 1.4. Tujuan Penelitian 1. Menentukan kondisi optimal proses isolasi DNA dalam simulasi gummy vitamin C 2. Mendeteksi DNA gelatin babi dan gelatin sapi pada simulasi gummy vitamin C melalui amplifikasi DNA menggunakan real-time PCR UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 4 1.5. Manfaat Penelitian Manfaat yang diharapkan dari penelitian ini adalah memberikan informasi tentang metode deteksi DNA pada gelatin babi dan gelatin sapi yang dibuat dalam simulasi gummy vitamin C dengan instrumen Real-Time PCR sehingga dapat dijadikan dasar penelitian selanjutnya pada sampel berbasis gelatin dalam produk obat di pasaran. UIN Syarif Hidayatullah Jakarta BAB 2 TINJAUAN PUSTAKA 2.1. Gummy Candy Gummy Candy yaitu permen lunak yang diproses dengan penambahan komponen hidrokoloid seperti agar, gum, pektin, pati, karagenan, gelatin, dan lain-lain digunakan untuk modifikasi tekstur sehingga menghasilkan produk yang kenyal, harus dicetak dan diproses aging sebelum pengemasan (SNI, 2008). Gummy candy adalah permen unik berasal dari gelatin sebagai gelling agent, dan terjadi penyerapan air pada saat pengunyahan di mulut. Gelatin dalam industri gula tidak hanya digunakan untuk gel termoversibel, tetapi juga untuk pembentukan busa, busa yang dihasilkan untuk menstabilkan, mengikat, dan pengemulsi kualitas serta untuk mengontrol kristalisasi. Bahan dasar dari gummy candy terdiri dari empat bahan dasar, yaitu sirup glukosa, sukrosa, gelatin, dan air. (Schreiber, 2007). Gambar.1. Gummy candy (Sumber: GMIA, 2012) 2.2. Vitamin C Vitamin adalah senyawa organik yang termasuk bahan makanan esensial diperlukan oleh tubuh, tetapi tubuh sendiri mensintesis vitamin yang mana 5 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 6 laju sintesis vitaminnya kurang dari yang dibutuhkan oleh tubuh untuk tetap sehat. Vitamin dalam tubuh berfungsi sebagai zat untuk pertumbuhan dan pemeliharaan jaringan melalui peranannya. Vitamin dikenal sebagai mikronutrien karena dibutuhkan pada manusia hanya dalam jumlah miligram atau mikrogram per hari, jumlah vitamin yang sangat kecil sudah mencukupi dari sekitar 0,01 mg hingga 100 mg per hari tergantung pada jenis vitamin tetapi defisiensi vitamin dapat menyebabkan permasalahan berat. Kelebihan salah satu vitamin pada tubuh dalam jumlah yang banyak dikenal dengan istilah hipervitaminosis. Hiperavitaminosis vitamin yang larut dalam air tidak dapat menimbulkan masalah karena vitamin ini pada umumnya dibuang melalui urine, berbeda halnya dengan vitamin larut lemak dapat menimbulkan masalah. Secara klasik vitamin diklasifikasikan atas dasar kelarutannya, yaitu golongan vitamin yang larut dalam lemak (A,D,E,K) dan golongan vitamin larut dalam air yaitu vitamin C dan B-kompleks. Vitamin yang larut dalam lemak tidak diekskresikan tetapi didepositkan dalam lemak tubuh, sehingga kelebihan dosis bisa mengakibatkan akumulasi senyawa hingga kadar mencapai toksik (Sumardjo, 2006; Campbell, 2004 ). Vitamin C merupakan suatu zat yang berbentuk serbuk kristal putih, tidak berbau dan memiliki rasa asam. Kelarutan vitamin C yaitu mudah larut dalam air, sedikit larut dalam etanol dan praktis tidak larut dalam dietil eter. Vitamin C diperlukan dalam sintesis jaringan ikat.Vitamin E bersama dengan vitamin C melindungi fosfolipid dalam membran dari oksidasi. Dosis harian untuk dewasa yang digunakan yaitu 30-100 mg perhari (Japanese Pharmacopeia edisi ke-15; Martindale edisi ke-36 ). 2.3. Gelatin 2.3.1.Definisi Gelatin Gelatin berasal dari kata “gelatus” yang berarti pekat. Gelatin adalah suatu zat yang diperoleh dari hidrolisa parsial kolagen berasal dari kulit, jaringan ikat putih dan tulang hewan. Gelatin yang berasal dari prekusor yang diasamkan dikenal dengan gelatin tipe A dan yang berasal dari prekusor yang dibasakan dikenal sebagai gelatin tipe B (Farmakope IV,1995). Gelatin tipe A berasal dari kulit babi dan gelatin tipe B berasal dari kulit sapi. Gelatin yang UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 7 berasal dari mamalia lebih banyak digunakan dalam produksi makanan karena memiliki sifat-sifat yaitu titik leleh tinggi, gelling agent yang bagus serta termo reversible (Hafidz, 2011). Gelatin tersusun dari 18 asam amino yang saling terikat, terdiri dari asam aspartat, asam glutamat, serin, valin, tirosin, lisin, treonin, arginin, glisin, histidin, hidroksiprolin, isoleusin, leusin, hidroksilisin, fenilalanin, prolin, alanin dan metionin. Susunan asam amino gelatin berupa triplet peptida, yaitu Glisin-X-Y, dimana X umumnya adalah asam amino prolin dan Y umumnya adalah asam amino hidroksiprolin. Senyawa gelatin merupakan suatu polimer linier yang tersusun oleh satuan terulang asam amino glisinprolin-prolin dan glisin-prolin-hidroksiprolin yang bergabung membentuk rangkaian polipeptida (Suryani, Sulistiawati,Fajriani, 2009). Aplikasi gelatin dalam makanan maupun produk farmasi digunakan untuk memproduksi permen berbasis gelatin seperti gummy, emulsifier, thickener, dan aplikasi dalam farmasi seperti cangkang hard capsule dan soft capsul, mikroenkapsulasi dan lain sebagainya (GMIA, 2012). Tabel 1. Aplikasi Gelatin (Sumber: GMIA, 2012) 2.3.2.Sifat Kimia dan Fisika Gelatin Gelatin berbentuk serbuk kasar berwarna kuning samar tidak berbau dan tidak berasa. Dengan kelarutan praktis tidak larut dalam aseton, kloroform, etanol (95%), eter dan metanol. Larut dalam gliserin, larutan asam, larutan basa, dan air pada suhu di atas 40°C. Gelatin kering stabil dengan udara berbeda dengan larutan gelatin yang stabil dalam penyimpanan lama UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 8 pada kondisi dingin tetapi substansi gelatin terdegradasi oleh bakteri. Pada suhu di atas 50°C larutan gelatin mengalami perlambatan proses depolimerisasi dan penurunan kekuatan gellingnya, tetapi pada suhu di atas 65°C proses depolimerisasi menjadi lebih cepat daripada dibawah suhu 65°C. Tingkat dan luasnya proses depolimerisasi gelatin tergantung pada berat molekul. Pada berat molekul yang lebih rendah lebih cepat mengalami penguraian dibandingkan dengan berat molekul yang tinggi. Pada penyimpanan gelatin disimpan pada ruangan yang kering dalam wadah kedap udara (Handbook of Pharmaceutical Excipient, edisi ke-6). Gelatin bersifat amfoter, yaitu dapat stabil dalam asam dan basa. Dalam larutan asam gelatin bermuatan positif dan bermigrasi sebagai kation dalam medan listrik. Dalam larutan alkali gelatin bermuatan negtaif dan bermigrasi sebagai anion dalam medan listrik. pH isoelektrik gelatin tipe A yaitu pada pH 7 sampai pH 9, sedangkan pada tipe B memiliki pH isoelektrik pada pH 4,7 hingga 5,4 (GMIA, 2012). 2.3.3.Sumber Gelatin Gelatin merupakan produk yang diperoleh dari bahan baku kolagen, sifat-sifat gelatin tergantung pada sumber dan jenis kolagen, biasanya kolagen diproduksi dari kulit dan tulang sapi, babi dan ikan (Wangtueai and Noomhorm, 2009). Gelatin diekstrak dari jaringan hewan kaya kolagen seperti kulit, urat, dan tulang. Zat asing seperti mineral, lemak dan albuminoid dipisahkan secara kimiawi atau fisika untuk mendapatkan kolagen yang murni ( GMIA, 2012). Pada proses pre treatment, jaringan hewan didihkan terlebih dahulu dengan air yang mendidih selanjutnya akan dicampurkan asam atau basa untuk memperoleh gelatin tipe A atau tipe B. Proses pembuatan gelatin tipe A diperoleh dari tulang lunak ossein atau tulang tanpa mineral, otot, kulit babi, kulit sapi dan kulit ikan. Hal yang dilakukan dalam pembuatan gelatin yaitu pemotongan bahan-bahan dan pencucian dengan air dingin selama beberapa jam untuk menghilangkan lemak, kemudian penambahan larutan asam seperti HCl atau H2SO4 pada pH 1-3 dengan suhu 15- 20°C hingga bahan tersebut terlihat membesar. Proses ini terjadi selama 24 jam, setelah UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 9 terlihat pembesaran atau pembengkakan bahan tersebut dicuci dengan air untuk menghilangkan kelebihan asam. Dan pH disesuaikan menjadi pH 3,5-4 (kulit babi dan kulit ikan), pH 2-3,5 (semua jaringan) untuk konversi pada proses ekstraksi gelatin dengan air panas. Ekstraksi hidrolitik dilakukan pada suhu 50 0C - 75 0C selanjutnya larutan gelatin disaring dengan menggunakan bantalan selulosa yang disterilkan, kemudian deionisasikan hingga mencapai konstentrasi 20-25 % w/v kemudian disterilisasi dengan flashing pada suhu 1380C selama 4 detik. Dan kemudian gelatin kering akan terbentuk dengan mendinginkan larutan gelatin untuk membentuk gel selanjutnya dipanaskan pada oven dengan suhu terkontrol (Handbook of Pharmaceutical Excipient, edisi ke-6). Proses pembuatan gelatin tipe B atau disebut proses pengapuran, bahan yang digunakan yaitu tulang demineralisasi atau kulit sapi. Proses pembuatan gelatin tipe B diawali dengan mencampur bahan dengan kalium hidroksida selama 2- 4 bulan pada suhu 140C-180C. Pada akhir proses pengapuran, bahan dicuci dengan air dingin selama 24 jam untuk menghapus larutan kapur yang masih ada di dalam bahan tersebut. kemudian bahan dinetralkan dengan asam HCl, H2SO4, atau H3PO4. Dan proses ekstraksi gelatin sama dengan cara ekstraksi gelatin tipe A (Handbook of Pharmaceutical Excipient, edisi ke-6). 2.4. Sel Sel adalah unit kehidupan struktural dan fungsional terkecil dari tubuh. Sebagian besar reaksi kimia untuk mempertahankan kehidupan berlangsung dalam sel. Sel dan zat intraseluler membentuk keseluruhan jaringan tubuh. (Sloane Ethel, 1995). Hampir semua sel memiliki empat karakter sebagai berikut : 1. Dikelilingi oleh membran 2. Sebuah cairan tebal berada di dalam membran bersama yang berisi beberapa komponen sel (organel) disebut protoplasma 3. Organel, yang terletak di dalam protoplasma (eukariot) yang melakukan fungsi seluler tertentu UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 10 4. Sebuah pusat pengontrol yang disebut inti atau nukleus (pada eukariot) atau nukleoid (pada prokariot) yang berisi DNA materi herediter (Alters,2000) Berdasarkan sitologi, organisme dapat dikategorikan menjadi dua kelompok, yaitu prokariotik dan eukariotik. Sel prokariotik merupakan suatu jenis sel dengan inti yang tidak jelas hanya ada di dalam sitoplasma tampak adanya bagian berwarna terang yang mengandung bahan DNA. Sel yang termasuk jenis sel prokariotik yaitu jenis sel bakteri, virus, ganggang biru, dan ganggang hijau. Sedangkan sel eukariotik berbeda dengan sel prokariotik, yaitu sel eukariot memiliki inti sel yang jelas karena inti sel ini memiliki dinding atau membran inti. Yang termasuk dari jenis eukariotik yaitu sel manusia, sel hewan, dan sel tumbuhan ( Juwono dan Juniarto Zulfa Ahmad, 2000). Sel Prokariotik Sel Eukariotik Gambar 2. Sel Prokariotik dan Sel Eukariotik (Sumber: Alters,2000) UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 11 Tabel.2. Perbedaan sel eukariotik dan sel prokariotik (Sumber: Black, 2008) Karakteristik Prokariotik Euokariotik Struktur Genetik DNA Kromosom sirkular Kromosom tunggal berpasangan Lokasi informasi genetik nukleoid Membran nukleus Nukleus Tidak ada Ada Histon Tidak ada Ada DNA ekstrakromosal Di plasmid Di organel sel seperti, mitokondria, kloroplas,dan plasmid Struktur Intraseluler Benang mitosis Tidak ada Terdapat selama pembelahan sel Membran dalam Hanya terdapat pada Terdapat pada organel fotosintesis organisme yang tertutup membran Retikulum endoplasma Tidak ada Ada Kloroplas Tidak ada Ada Aparatus golgi Tidak ada Ada Lisosom Tidak ada Ada Peroksisom Tidak ada Ada Ribosom 70s 80s terdapat sitoplasma pada dan retikulum endoplasma, dan 70s terdapat pada organel lainnya Sitoskelesion Tidak ada Ada Sel Ekstraseluler Dinding sel Peptidoglikan terdapat Selulosa, kitin. Atau pada kebanyakan sel keduanya terdapat UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 12 pada tanaman dan jamur Pemukaan lapisan flagella Kapsul atau lapisan Ketika terlihat seperti yang berlendir ketika memiliki mengandung atau flagelin kandungan fibril membran tertutup yang oleh mikrotubuli 2.5. DNA Asam nukleat berfungsi menyimpan dan mentransmisikan informasi genetik dalam sel. Sel mempunyai dua jenis molekul asam nukleat yaitu DNA (asam deoksiribonukleat) dan RNA (asam ribonukleat). DNA menyimpan informasi genetik yang spesifik untuk setiap individu dan spesies tertentu, yang akan diwariskan ke generasi berikutnya. (Ghaffar,2009). DNA adalah polimer dari nukleotida-nukleotida. Nukleotidanukleotida dalam DNA dihubungkan satu dengan yang lainnya oleh ikatan fosfodiester, yaitu ikatan yang terjadi antara Carbon katida dari satu nukleotida terdiri dari sebuah gula pantosa (deoksiribosa), satu buah fosfat dan satu basa nitrogen. Basa nitrogen tersebut berikatan dengan karbon pertama dari gula deoksiribosa, sedangkan fosfat berikatan dengan karbon kelima dari gula yang sama (Stryer, 1988). 2.5.1.Struktur DNA DNA merupakan polimer linier (polinukleotida) yang tersusun dari subunit atau monomer nukleotida. Komponen penyusun nukleotida terdiri dari tiga jenis molekul, yaitu gula pentosa (deoksiribosa pada DNA atau ribosa pada RNA), basa nitrogen, dan gugus fosfat (Gambar 2.1). Basa yang ditemukan pada nukleotida adalah basa purin (adenin = A, guanin = G) dan basa pirimidin (cytosin = C, tymin = T, urasil = U) (Gambar 3). Monomer nukleotida mempunyai gugus hidroksil pada posisi karbon 3’, gugus fosfat pada posisi karbon 5’ dan basa pada posisi karbon 1’ molekul gula. UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 13 Nukleotida satu dengan yang lainnya berikatan melalui ikatan fosfodiester antara gugus 5’fosfat dengan gugus 3’hidroksil (Ghaffar, 2007). Gambar.3. Struktur nukleotida (Sumber: Ghaffar, 2009) Struktur molekul DNA merupakan rantai heliks ganda yang memutar ke kanan. Kedua rantai polinukleotida memutar pada sumbu yang sama dan bergabung satu dengan yang lainnya melalui ikatan hidrogen antara basa-basanya. Basa guanin berpasangan dengan basa cytosin, sedangkan basa adenin berpasangan dengan basa tymin. Antara basa guanin dan basa cytosin terbentuk tiga ikatan hidrogen, sedang antara basa adenin dan tymin terbentuk dua ikatan hidrogen. Sehingga dalam molekul DNA jumlah basa G akan selalu sama dengan jumlah basa C, sedangkan jumlah basa A=T. Kemudian jumlah basa purin (A + G) akan sama dengan jumlah basa pyrimidin (C + T). Kedua untai DNA saling berkomplementasi melalui basa penyusunnya dengan arah antiparalel (berlawanan 5’→ 3’ vs 3’→5’), ujung yang mengandung gugus fosfat bebas disebut ujung 5’ sedangkan pada ujung lainnya yang mengandung gugus hidroksil bebas disebut ujung 3’. Kedua untai tersebut saling melilit satu sama lain membentuk struktur heliks ganda. Gugus fosfat dan gula yang tersusun bergantian menjadi tulang punggung (backbone) molekul DNA sementara pada bagian dalam terdapat basa yang melekat pada molekul gula. UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 14 Gambar.4. Struktur DNA (Sumber: Black, 2008) Untai heliks DNA dapat memisah menjadi struktur untai tunggal dengan adanya pemanasan dengan suhu tinggi (> 90°C), peristiwa ini sering dikenal dengan denaturasi. Denaturasi DNA bersifat reversible. Proses pembentukan kembali struktur untai ganda dari keadaan terdenaturasi disebut renaturasi. Proses renaturasi dapat berjalan jika suhu mendekati suhu subdenaturasi (mendekati 60°C) (Yuwono, 2009). Selain itu derajat keasaman pH yang ekstrim (pH <3 atau pH >10) dapat menyebabkan DNA terdenaturasi (Fatiyach et al, 2011). 2.5.2.Isolasi DNA Pada proses analisis atau proses yang berkaitan dengan DNA dibutuhkan proses isolasi dan purifikasi DNA yang mana DNA terbungkus di dalam sel. Sebuah teknik yang ideal harus mengoptimalkan hasil DNA, meminimalkan degradasi DNA, dan efisiensi dalam biaya, waktu dan tenaga (Cheng Hon et al., 2010 ). Prinsip isolasi DNA adalah memisahkan DNA kromosom atau DNA genom dari komponen-komponen sel lain. Ada tiga langkah utama dalam ekstraksi DNA, yaitu perusakan dinding sel (lisis), pemisahan DNA dari bahan padat seperti selulosa dan protein, serta pemurnian DNA. Sumber DNA bisa dari tanaman, kultur mikroorganise, atau sel manusia. Membran sel dilisis dengan menambahkan detergen untuk membebaskan isinya, kemudian pada ekstrak sel tersebut ditambahkan protease (yang berfungsi mendegradasi protein) dan RNase (yang berfungsi UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 15 untuk mendegradasi RNA), sehingga yang tinggal adalah DNA. Selanjutnya ekstrak tersebut dipanaskan sampai suhu 90°C untuk menginaktifasi enzim yang mendegradasi DNA (DNase). Larutan DNA kemudian di presipitasi dengan etanol dan bisa dilarutkan lagi dengan air (Ghaffar, 2007; Ardiana, 2009). Salah satu cara untuk memecahkan sel dan mengisolasi DNA dengan menggunakan larutan EDTA, larutan tersebut mengandung ion pengkelat Mg2+ dikombinasi dengan enzim pendegradasi membran sel yaitu enzim lisozim. Setelah DNA terlepas dari sel maka selanjutnya dilakukan eliminasi RNA dengan enzim Rnase. (Rapley dan Walker, 2000). RNAse merupakan endoribonuklease yang secara khusus mendegradasi C dan U pada untai tunggal RNA. RNase memotong rantai fosfodiester antara 5’-ribosa pada nukleotida dan kelompok fosfat pada 3’- ribosa pirimidin yang saling berdekatan (Blackburn & Moore, 1982; Raines, 1998). Adanya garam (NaCl) dengan konsentrasi tinggi dapat mengendapkan protein karena adanya fenomena salting-out (Kurniati, 2009). Purifikasi DNA bertujuan untuk menghilangkan kontaminan (protein) selain DNA. Salah satu metode purifikasi DNA hasil ekstraksi adalah metode ekstraksi fenol-kloroform. Campuran fenol dan kloroform merupakan campuran yang homogen (Sambrook dan Russell, 2001). Cara ini menghilangkan protein dengan penambahan fenol atau campuran fenol: kloroform : isoamil alkohol (50:49:1). Larutan organik ini mengendapkan protein yang akan menggumpal pada batas antara fase air dan fase organik. Fungsi isoamil alkohol untuk mencegah terjadinya emulsi (Sudjadi, 2008). Metode pengendapan DNA paling banyak dilakukan dengan etanol yang mengandung natrium klorida pada suhu -200C. Pada preparasi sampel DNA, setelah pengendapan dengan etanol, DNA disentrifugasi kemudian dilarutkan kembali dalam buffer TE. DNA plasmid dapat dimurnikan lebih lanjut dengan sesium klorida. Sedangkan preparasi DNA kromosom, endapan DNA akan berbentuk kabut putih berisi molekul DNA dalam bentuk benang panjang yang dapat diambil dengan batang pengaduk (Sudjadi, 2008). UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 16 Pada zaman modern ini, telah dilakukan pengembangan dan modifikasi proses ekstraksi DNA, salah satunya menggunakan spin coloumn yang mengandung silicon dioxide. Prinsip dari metode ini adalah berdasarkan tingginya afinitas muatan negatif dari rantai utama DNA terhadap partikel silika yang bermuatan positif. DNA dapat terikat dengan kuat pada silika dibawah kondisi garam chaotropic seperti Guanidine-HCl. Garam ini dapat memecah ikatan hidrogen antara ion oksigen pada DNA dengan ion hidrogen pada air. DNA yang terabsorpsi oleh silika dapat dipisahkan dari protein dan sel debris dengan pencucian. DNA murni kemudian dapat dielusi dari silika dengan buffer Tris-EDTA atau Aquabidest (Chee Tan dan Chin Yiap, 2009). Untuk mengukur DNA, dapat dilakukan pengukuran konsentrasi DNA dengan spektrofotometri UV. Kemurnian larutan DNA murni memiliki rasio A260/A280 adalah 1,8. Jika rasio kurang dari 1,8 menunujukkan adanya pengotor protein atau fenol, sedangkan jika rasio lebih dari 1,8 menunjukkan adanya RNA (Sudjadi, 2008). 2.5.3.DNA Mitokondria Mitokondria merupakan organel intraseluler dengan ukuran 0,2 µm sampai 0,5 µm, berbentuk bulat atau berbentuk tongkat. Mitokondria diselubungi oleh dua membran yaitu membran luar bersifat licin dan berhubungan dengan sitoplasma, sedangkan membran dalam berbentuk lekukan dan lipatan ke dalam disebut dengan krista. Fungsi mitokondria sebagai tempat respirasi sel, yaitu proses katabolik yang membutuhkan oksigen dalam produksi adenosin trifosfat (ATP). Di dalam mitokondria mengandung DNA dan ribosom yang berfungsi melaksanakan proses sintesis protein (Brensick, 1996). Ukuran DNA mitokondria pada hewan 15 sampai 20 kb dan mengandung 37 gen (Boore, 1999). Penggunaan MtDNA dalam analisis karena memiliki jumlah kopi tinggi menjadikannya mudah diisolasi dan dipurifikasi untuk keperluan analisis genom (Sholihin, 1994). UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 17 Gambar 5. Struktur DNA Mitokondria (Sumber : Moraes et al, 2002) 2.6. PCR Polymerase Chain Reaction (PCR) adalah suatu teknik sintesis dan amplifikasi DNA secara in vitro, dimana setiap fragmen DNA dapat diamplifikasi dengan cepat tanpa menggunakan sel. DNA diinkubasi dalam tabung reaksi dengan DNA polimerase jenis khusus, suatu pasokan nukleotida, dan potongan pendek DNA untai tunggal sintetik yang berfungsi sebagai primer. (Campbell, Reece Nail, Jane B., Mitchell, Lawrence G. 2002). PCR memungkinkan adanya perbanyakan DNA antara dua primer, hanya di dalam tabung reaksi, tanpa perlu memasukkannya ke dalam sel (in vivo). Pada proses PCR dibutuhkan DNA untai ganda yang berfungsi sebagai cetakan (templat) yang mengandung DNA-target (yang akan di amplifikasi) untuk pembentukan molekul DNA baru, enzim DNA polimerase, deoksinukleosida trifosfat (dNTP), dan sepasang primer oligonukleotida. Pada kondisi tertentu, kedua primer akan mengenali dan berikatan dengan untaian DNA komplemennya yang terletak pada awal dan akhir fragmen DNA target, sehingga kedua primer tersebut akan menyediakan gugus hidroksil bebas pada karbon 3’. Setelah kedua primer menempel pada DNA UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 18 templat, DNA polimerase mengkatalisis proses pemanjangan kedua primer dengan menambahkan nukleotida yang komplemen dengan urutan nukleotida templat. DNA polimerase mengkatalisis pembentukan ikatan fosfodiester antara OH pada karbon 3’ dengan gugus 5’ fosfat dNTP yang ditambahkan. Sehingga proses penambahan dNTP yang dikatalisis oleh enzim DNA polimerase ini berlangsung dengan arah 5’→3’ dan disebut reaksi polimerisasi. Enzim DNA polimerase hanya akan menambahkan dNTP yang komplemen dengan nukleotida yang terdapat pada rantai DNA templat (Ghaffar, 2007). PCR melibatkan banyak siklus yang masing-masing terdiri dari tiga tahap berurutan, yaitu pemisahan (denaturasi) rantai DNA templat, penempelan (annealing) pasangan primer pada DNA target dan pemanjangan (extension) primer atau reaksi polimerisasi yang dikaalisis oleh DNA polimerase. (Ghaffar, 2007). 2.6.1.Komponen PCR Komponen-komponen yang diperlukan pada proses PCR adalah fragmen DNA yang akan diamplifikasi (template DNA), sepasang primer, yaitu suatu oligonukleotida pendek yang mempunyai urutan nukleotida yang komplementer dengan urutan nukleotida DNA template, dNTPs (Deoxynucleotide triphosphates), buffer PCR, magnesium klorida (MgCl 2) dan enzim polimerase DNA yang tahan panas (Taq polymerase). Semua komponen PCR dicampur dalam total volume 10 – 50 μL (Muladno, 2010; Handoyo dan Rudiretna, 2001; Sulistyaningsih, 2007). 1. Taq DNA Polymerase Enzim ini bersifat termostabil dan diisolasi dari Thermus aquaticus. Akitivitas polimerisasi DNA dari ujung-‘5 ke ujunug-‘3, dan aktivitas enzimatik ini memiliki waktu paruh sekitar 40 menit pada suhu 95 º C. Biasanya untuk setiap 100 uL volume reaksi, ditambahkan 2,0-2,5 unit Taq polymerase. Penggunaan enzim ini harus memperhatikan proses penyimpanan (selalu di freezer pada suhu -20ºC), dan pada saat UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 19 pengambilan tidak boleh terlalu lama di suhu ruang. Hal ini dilakukan untuk meminimalkan kerusakan enzim akibat pengaruh suhu. 2. Primer Merupakan oligonukleotida pendek rantai tunggal yang mempunyai urutan komplemen dengan DNA templat yang akan diperbanyak. Panjang primer berkisar antara 20-30 basa. Untuk merancang urutan primer, perlu diketahui urutan 55 nukleotida pada awal dan akhir DNA target. Primer oligonukleotida di sintesis menggunakan suatu alat yang disebut DNA synthesizer. Pasangan primer terdiri dari 2 oligonukleotida yang mengandung 16 – 30 nukleotida dan mempunyai 40 – 60 % GC content. Sekuen primer kurang dari 16 basa dapat memicu amplifikasi produk PCR non spesifik. Untuk ukuran primer yang pendek kemungkinan terjadinya mispriming (penempelan primer pada situs non-target) tinggi, ini akan menyebabkan berkurangnya spesifisitas dari primer tersebut yang nantinya akan berpengaruh pada efektifitas dan efisiensi proses PCR. Sedangkan untuk panjang primer lebih dari 30 basa tidak akan meningkatkan spesifisitas primer secara bermakna dan ini akan menyebabkan biaya yang lebih mahal. Interaksi primer-primer seperti self-homology dan crosshomology harus dihindari. Demikian juga dengan terjadinya mispriming pada daerah lain yang tidak dikehendaki, ini semua dapat menyebabkan spesifisitas primer menjadi rendah di samping itu konsentrasi primer menjadi berkurang. Melting temperatur (Tm) adalah temperatur di mana 50 % untai ganda DNA terpisah. Pemilihan Tm suatu primer sangat penting karena Tm primer sangat berpengaruh di dalam pemilihan suhu annealing proses PCR. Tm berkaitan dengan komposisi primer dan panjang primer. Secara teoritis Tm primer dapat dihitung dengan menggunakan rumus [2(A+T) + 4(C+G)]. Sebaiknya Tm primer berkisar antara 50° – 65°C. 3. dNTPs (Deoxynucleotide Triphosphates) UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 20 dNTPs merupakan suatu campuran yang terdiri atas dATP (deoksiadenosin trifosfat), dTTP (deoksitimidin trifosfat), dCTP (deoksisitidin trifosfat) dan dGTP (deoksiguanosin trifosfat). Dalam proses PCR dNTPs bertindak sebagai building block DNA yang diperlukan dalam proses ekstensi DNA. dNTP akan menempel pada gugus –OH pada ujung 3’ dari primer membentuk untai baru yang komplementer dengan untai DNA template. Konsentrasi dNTP harus seimbang untuk meminimalkan kesalahan penggabungan. Konsentrasi dNTP yang rendah akan mengurangi terjadinya mispriming pada daerah non target dan menurunkan kemungkinan perpanjangan nukleotida yang salah, oleh karena itu spesifitas dan ketepatan PCR meningkat pada konsentrasi dNTP yang lebih rendah. 4. Buffer PCR dan MgCl2 Reaksi PCR hanya akan berlangsung pada kondisi pH tertentu. Oleh karena itu untuk melakukan proses PCR diperlukan buffer PCR. Fungsi buffer di sini adalah untuk menjamin pH medium. Selain buffer PCR diperlukan juga adanya ion Mg2+, ion tersebut berasal dari berasal MgCl2. MgCl2 bertindak sebagai kofaktor yang berfungsi menstimulasi aktivitas DNA polimerase. Adanya MgCl2 akan meningkatkan interaksi primer dengan template DNA. 5. DNA Template Fungsi DNA template di dalam proses PCR adalah sebagai cetakan untuk pembentukan molekul DNA baru yang sama atau molekul DNA yang menjadi sekuen target yang akan diamplifikasi. Template DNA dapat berupa DNA kromosom, DNA plasmid ataupun fragmen DNA apapun asal di dalam DNA template tersebut mengandung fragmen DNA target yang dituju. Ukuran DNA bukan merupakan faktor utama keberhasilan PCR, berapapun panjangnya asal mengandung sekuen yang diinginkan. Konsentrasi DNA template harus dioptimasi. Jika konsentrasinya terlalu rendah maka primer mungkin tidak dapat menemukan target, sebaliknya bila terlalu tinggi akan meningkatkan UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 21 kemungkinan mispriming. Disamping itu perlu diperhatikan kemurnian template karena dapat mempengaruhi hasil reaksi. 2.6.2. Tahapan PCR 1.Denaturasi Selama proses denaturasi, DNA untai ganda akan membuka menjadi dua untai tunggal. Hal ini disebabkan karena suhu denaturasi yang tinggi menyebabkan putusnya ikatan hidrogen diantara basa-basa yang komplemen. Pada tahap ini, seluruh reaksi 53 enzim tidak berjalan, misalnya reaksi polimerisasi pada siklus yang sebelumnya. Denaturasi biasanya dilakukan antara suhu 90°C – 95°C. 2.Penempelan Primer Pada tahap penempelan primer (annealing), primer akan menuju daerah yang spesifik yang komplemen dengan urutan primer. Pada proses annealing ini, ikatan hidrogen akan terbentuk antara primer dengan urutan komplemen pada templat. Proses ini biasanya dilakukan pada suhu 50°C – 60°C. Selanjutnya, DNA polymerase akan berikatan sehingga ikatan hidrogen tersebut akan menjadi sangat kuat dan tidak akan putus kembali apabila dilakukan reaksi polimerisasi selanjutnya, misalnya pada 72 °C. 3.Reaksi Polimerisasi Umumnya, reaksi polimerisasi atau perpanjangan rantai ini, terjadi pada suhu 72 °C. Primer yang telah menempel tadi akan mengalami perpanjangan pada sisi 3’nya dengan penambahan dNTP yang komplemen dengan templat oleh DNA polimerase. Gambar.6. Siklus PCR, yang terdiri dari denaturasi, penempelan primer (annealing) dan polimerisasinya (Sumber: Ghaffar, 2007) UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 22 Jika siklus dilakukan berulang-ulang maka daerah yang dibatasi oleh dua primer akan di amplifikasi secara eksponensial (disebut amplikon yang berupa untai ganda), sehingga mencapai jumlah copy yang dapat dirumuskan dengan (2n)x. Dimana n adalah jumlah siklus dan x adalah jumlah awal molekul DNA. Jadi, seandainya ada 1 copy DNA sebelum siklus berlangsung, setelah satu siklus, akan menjadi 2 copy, sesudah 2 siklus akan menjadi 4, sesudah 3 siklus akan menjadi 8 kopi dan seterusnya. Sehingga perubahan ini akan berlangsung secara eksponensial. PCR dengan menggunakan enzim Taq DNA polimerase pada akhir dari setiap siklus akan menyebabkan penambahan satu nukleotida A pada ujung 3’ dari potongan DNA yang dihasilkan. Sehingga nantinya produk PCR ini dapat di kloning dengan menggunakan vektor yang ditambahkan nukleotida T pada ujung-ujung 5’-nya. Proses PCR dilakukan menggunakan suatu alat yang disebut thermocycler (Ghaffar, 2007). 2.7. Real-Time PCR Real-time PCR adalah suatu metode untuk mendeteksi dan penghitungan sinyal fluoresensi sebanding dengan dihasilkannya produk PCR setiap siklus amplifikasi PCR (Dennis Lo et al., 2006). Kuantifikasi level ekspresi gen dapat menghasilkan petunjuk tentang fungsi gen, sebagai contoh yaitu pengukuran ekspresi gen dapat membantu mengidentifikasi jenis sel atau jaringan dimana gen tersebut diekspresikan, selain itu juga menunjukkan tingkat ekspresi gen keadaan biologis individu seperti jenis penyakit yang terdapat pada individu tersebut (Fraga et al., 2008). Penggunaan Real-time PCR memiliki beberapa keunggulan yaitu mampu menganalisis sampel dengan jumlah relatif sedikit, memiliki kemampuan untuk menghasilkan data cepat dan akurat, dan mampu menganalisis lebih dari satu gen dalam satu waktu (Fraga et al., 2008). Dalam penggunaan alat real-time PCR memiliki dua jenis komponen bahan kimia untuk mendeteksi sampel selama siklus PCR yaitu pewarna fluoresensi SYBR green dan probe DNA. Pewarna berfluoresensi UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 23 menginterkalasi DNA beruntai ganda, sedangkan probe DNA terdiri dari oligonuklotida yang dihubungkan dengan pewarna fluoresensi dan quencher. Pada proses pendegradasian melepaskan pewarna fluoresensi dari komponen yang berfungsi untuk pendegradasi sehingga menghasilkan emisi fluoresensi yang sebanding dengan jumlah template DNA. Sinyal fluoresensi yang terbentuk diukur dan digunakan untuk kuantisasi DNA (Hui Chai et al., 2011). Instrumen real-time PCR mendeteksi amplikon dan mengukur peningkatan fluoresensi yang dihasilkan dari sintesis DNA. Fluoresensi ini dihasilkan ketika terjadi peningkatan ikatan double strand DNA dengan pewarna atau probe fluorogenic pada pencampuran amplifikasi. Peningkatan fluoresensi digambarkan dengan kurva yang terdiri dari tiga buah fasa yaitu fasa awal atau fasa inisiasi yaitu fase terjadi pada siklus pertama PCR dimana pancaran fluoresensi belum dapat dibedakan dari baseline, fasa eksponensial atau fasa puncak merupakan fase peningkatan eksponensial dalam fluoresensi sebelum fase plateau tercapai, dan fasa plateau atau fasa stabil yaitu tidak terjadi peningkatan fluoresensi yang diamati (Vaerman, 2004; Rodriguez, 2013). Instrumen Real-time PCR memiliki tiga komponen utama yaitu thermal block cycler sebagai akurasi data, optical system sebagai deteksi data, dan software sebagai analisa data. Real-time PCR dapat menganalisa banyak sampel hingga 96 sampel menggunakan multiwell plates (Rochec, 2008). Gambar 7. Bentuk Kurva Real- Time PCR (Sumber :Rodriguez, 2013) UIN Syarif Hidayatullah Jakarta BAB 3 METODOLOGI PENELITIAN 3.1. Waktu dan Tempat Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Halal Food and Drug Analysis, Laboratorium Penelitian II, dan Laboratorium MPR Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah, Jakarta. Waktu pelaksanaan dari bulan Januari 2014 hingga Desember 2014. 3.2. Alat dan Bahan 3.2.1. Alat Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah pisau steril, mikropipet ukuran 10 μL, 200 μL, 1000 μL [BIO RAD], tips 10 μL, 100 μL, 1000 μL, tube dan mikro tube, high pure filtrationn tube [Roche], collection tube [Roche], Spektrofotometer Nano Drop [BioDrop], dan mesin real-time PCR [LightCycler® 480.0-Roche]. Alat gelas yang digunakan adalah gelas ukur, gelas beaker [Pyrex], batang pengaduk dan cawan penguap. 3.2.2. Bahan Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah daging sapi, daging babi, standar gelatin babi dan gelatin sapi pro analisa [Sigma Aldrich], sukrosa, sirup glukosa, asam sitrat, tartrazine [Sigma Aldrich], aquadest, aquabidest, gelatin sapi teknis [EMS], Natrium Asetat 3M [Merck], Isopropanol [Merck] satu set High Pure PCR Template Preparation Kit® Roche (meliputi: Tissue Lysis Buffer, Binding Buffer, Proteinase K, Inhibitor Removal Buffer, Wash Buffer, dan Elution Buffer),etanol absolut [Merck],isopropanol [Merck], ddH2O [Roche], LC TaqMan Probe Master [Roche] yang terdiri: FastStart Taq DNA Polymerase, buffer, dNTP mix, MgCl2 6,4 mM. Dan primer-probe seperti pada tabel berikut. 24 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 25 Tabel. 3. Susunan basa primer dan probe untuk DNA sapi dan babi (Sumber : Tanabe et al., 2007 dengan modifikasi) Babi Forward 5'-ATCTTGCAAATCCTAACAGGCCTG-3' Sapi Reverse 5'-CGTTTGCATGTAGATAGCGAATAAC-3' Probe 5'-(FAM)-CACAACAACAGCTTTCTCATCAGTTAC-(BHQ1)-3' Forward 5'-CCCGATTCTTCGCTTTCCAT-3' Reverse 5'-AATGGGATTTTGCTACGTCTGAGG-3' Probe 5'-(FAM)-CCACCTACTATTCCTCCACGAAACA-(BHQ1)-3' 3.3. Tahapan Penelitian 1. Pembuatan Gummy Simulasi Vitamin C Dari Gelatin Babi Dan Gelatin Sapi 2. Isolasi DNA dari Daging, Gelatin, dan Gummy Simulasi 3. Analisis Konsentrasi dan Kemurnian Isolat DNA dengan Spektrofotometri DNA 4. Amplifikasi Isolat DNA dengan Real-Time PCR 5. Analisis Hasil Amplifikasi 3.4. Prosedur Kerja 3.4.1.Pembuatan Simulasi Gummy Vitamin C dari Gelatin Babi dan Gelatin Sapi Sebanyak 0,95 gr sukrosa, 0,9 gr glukosa dan 0,05 gr asam sitrat dilarutkan dengan 1,4 mL aquadest diatas penangas air pada suhu 65 ºC (larutan A). Pada wadah lain 0,5 gr gelatin dilarutkan dengan 1 mL aquadest di atas penangas air dengan suhu 60º C (Larutan B). Sebanyak 0,075 gr vitamin C dilarutkan dengan 0,1 ml aquadest diaduk hingga melarut (Larutan C). Kemudian larutan A dan larutan C dicampur pada larutan B, diaduk hingga homogen. Sebanyak 0,025 ml tartrazine dicampurkan ke larutan B diaduk hingga terlihat warna yang homogen. Massa yang terbentuk disimpan di dalam refigrator selama 24 jam. Untuk pembuatan sampel simulasi gummy dengan berbagai presentase campuran babi sama perlakuan dengan prosedur di atas (Schrieber and Gareis, 2007 dengan modifikasi). UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 26 Tabel.4. Komposisi Formula Simulasi Gummy Vitamin C Penimbangan Bahan Konsentrasi Bahan % Gummy Gummy Simulasi Simulasi Sapi 1% Babi Gummy Gummy Gummy Simulasi Simulasi Simulasi 25% 50% 75% Babi Babi Babi Gummy Simulasi Babi Sukrosa 19 % 0,95 gr 0,95 gr 0,95 gr 0,95 gr 0,95 gr 0,95 gr Glukosa 18 % 0,9 gr 0,9 gr 0,9 gr 0,9 gr 0,9 gr 0,9 gr 10 % 0,5 gr 0,495 gr 0,375 gr 0,25 gr 0,375 gr - - 0,005 gr 0,125 gr 0.25 gr 0,125 gr 0,5 gr Gelatin *) Gelatin Sapi *) Gelatin Babi Asam sitrat 1% 0,05 gr 0,05 gr 0,05 gr 0,05 gr 0,05 gr 0,05 gr Vitamin C 1,5 % 0,075 gr 0,075 gr 0,075 gr 0,075 gr 0,075 gr 0,075 gr Tartazine 0,5 % 0,025 ml 0,025 ml 0,025 ml 0,025 ml 0,025 ml 0,025 ml Aquadest 50 % 2,5 ml 2,5 ml 2,5 ml 2,5 ml 2,5 ml 2,5 ml Total 100 % 5 gr 5 gr 5 gr 5 gr 5 gr 5 gr 3.4.2. Isolasi DNA Proses isolasi DNA dilakukan dengan menggunakan High Pure PCR Template Preparation Kit dari Roche. 1.Preparasi sampel a. Daging Segar (Rochea, 2012; Erwanto et al., 2012) Sebanyak 50 mg masing-masing daging sapi dan daging babi dipotong halus dengan pisau steril. Masing masing daging tersebut dimasukkan ke dalam microsentrifuge tube. Kemudian ke dalam tube tersebut masing-masing ditambahkan 200 μl Tissue Lysis Buffer dan 40 μl larutan Proteinase K. Campuran divortex selama 1 menit dan diinkubasi pada suhu 55ºC selama 24 jam dalam waterbath. b.Gelatin dan Sampel Simulasi Gummy Vitamin C (Rochea, 2012; Erwanto et al., 2012;Sambrook et al, 2001 dengan modifikasi) Sebanyak 500 mg masing-masing gelatin sapi, gelatin babi dan sampel simulasi gummy vitamin C dimasukkan ke dalam microtube,sampel simulasi gummy vitamin C dileburkan diatas penangas UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 27 dengan suhu 60ºC. Kemudian ditambahkan 500 µL natrium asetat 3M dan 500 µL isopropanol (equal volume). Sampel dikocok dengan membalikkan tube tiga kali hingga homogen. 2. Proses isolasi DNA (Roche a, 2012; Erwanto et al., 2012) Sebanyak 600 µL sampel yang diambil dari campuran natrium asetat dan isopropanol dilarutkan dalam 200 uL Tissue Lysis Buffer dan 40 uL proteinase K kemudian diinkubasi pada suhu 55 °C selama 24 jam. Setelah sampel melebur, ditambahkan 200 uL binding buffer divortex selama 2 menit lalu diinkubasi pada suhu 70 °C selama 10 menit. Lalu ditambahkan 200 μl isopropanol dan dihomogenkan dengan vortex selama 2 menit. Campuran sampel dipipet ke atas High Pure Filter Tube yang telah dipasangkan Collection Tube, kemudian tube ditutup dan dilakukan sentrifugasi dengan kecepatan 8700 rpm selama 1 menit. Filter tube dilepaskan dari collection tube dan cairan yang melewati filter dibuang bersamaan collection tube. Filter tube dipasangkan kembali dengan collection tube yang baru. Ditambahkan 500 μl Inhibitor Removal Buffer melalui penyangga atas Filter Tube dan disentrifugasi kembali dengan kecepatan 8700 rpm selama 1 menit. Filter tube dilepaskan dari collection tube dan cairan yang melewati filter dibuang bersamaan collection tube. Filter tube dipasangkan kembali dengan collection tube yang baru. Ditambahkan 500 μl Wash Buffer kemudian sentrifugasi kembali dengan kecepatan 8700 rpm selama 1 menit. Filter tube dilepaskan dari collection tube dan cairan yang melewati filter dibuang bersamaan collection tube. Filter tube dipasangkan kembali dengan collection tube yang baru. Ditambahkan 500 μl Wash Buffer kemudian sentrifugasi kembali dengan kecepatan 8700 rpm selama 1 menit. Filter tube dilepaskan dari collection tube dan cairan yang melewati filter dibuang. Filter tube dipasang kembali dengan collection tube dan dilakukan sentrifugasi selama 10 detik dengan kecepatan maksimum. Hal ini dilakukan agar semua wash buffer tidak tertinggal pada filter. Collection tube dilepaskan dari Filter tube dan dibuang. Untuk mengelusi DNA yang terdapat pada filter, pasang Filter tube UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 28 tersebut pada 1.5 ml Microsentrifuge tube yang bersih dan steril. Elution Bufffer dihangatkan dengan Penangas Air pada suhu ±70oC terlebih dahulu. Kemudian ditambahkan 150 μl Elution Buffer yang telah dihangatkan sebelumnya dan penambahan elution buffer dibagi menjadi tiga kali dengan volume 50 uL. Sentrifugasi kembali selama 1 menit dengan kecepatan 8000 rpm. Filter tube dilepaskan. Pada Microsentrifuge tube telah mengandung DNA terpurifikasi yang dapat disimpan pada suhu 2oC, 8o C, 15o C, dan 25oC untuk dianalisa selanjutnya. 3.4.3.Pengujian Konsentrasi dan Kemurnian Isolat DNA dengan Spektrofotometer DNA Alat spektrofotometer Biodrop dinyalakan, bagian ‘’nucleic acid’’ditekan. Dipilih pathlength 0.5mm. Pedestal dibersihkan terlebih dahulu dengan tissu kemudian dipipet sebanyak 1 μL blanko elution buffer dan diteteskan pada pedestal. Bagian‘’BLANK’’pada layar ditekan untuk pengukuran blanko, setelah selesai pedestal dibersihkan dengan tissue. Larutan isolat DNA sebanyak 1μL dipipet dan dimasukkan ke dalam pedestal, kemudian klik tombol ‘’ Measure’’ sehingga layar akan menampilkan spektrum dan jumlah konsentrasi yang dihitung (Biodrop, 2012). 3.4.4.Amplifikasi Real-Time PCR Proses yang dilakukan pada amplifikasi DNA dengan Real Time PCR adalah sebagai berikut: Larutan induk primer dan probe dengan konsentrasi 100 μM dibuat dan dimasukkan ke dalam tube.Primer dan probe konsentrasi 10 μM yang dibuat dari larutan induk 100 μM dan disimpan ke dalam tube yang lain. Kemudian Master Mix dibuat dengan volume total 20 μL yang terdiri dari 5 μL template DNA, 1.4 μL Aquabidest, 1.6 μL primer forward konsentrasi 0,8 μM, 1.6 μL primer reverse konsentrasi 0,8 μM, 0.4 μL probe konsentrasi 0,2 μM, dan 10 μL LightCycler® 480 probe master (enzim FastStart Taq DNA Polymerase, dNTP mix, dan 6.4 mM MgCl2). Masing-masing DNA template dimasukkan ke well terlebih dahulu kemudian master mix UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 29 dimasukkan ke dalam multiwell plate pada well yang diinginkan dan ditutup dengan sealing foil. Dilakukan proses pengaturan program LightCycler® 480 Real-Time PCR yang akan digunakan untuk proses amplifikasi. Setelah campuran reaksi total PCR dan program amplifikasi telah siap, campuran reaksi total PCR diletakkan pada multiwell plate yang ditutup menggunakan sealing foil, kemudian diletakkan pada mesin real-time PCR. Instrumen Real-Time PCR akan mengamplifikasi DNA secara otomatis dan langsung memberikan hasil amplifikasi melalui monitor dalam bentuk kurva (Rochec, 2008). Gambar.8. Program Amplifikasi Real-Time PCR (Sumber : Rochec,2008) UIN Syarif Hidayatullah Jakarta BAB 4 HASIL DAN PEMBAHASAN 4.1. Pembuatan Simulasi Gummy Vitamin C Gambar 9. Simulasi gummy vitamin C Pada penelitian ini dilakukan pembuatan simulasi gummy vitamin C yang terdiri dari simulasi gummy vitamin C sapi, simulasi gummy vitamin C babi, serta simulasi gummy vitamin C campuran sapi dan babi dengan persentase 1% babi, 25% babi, 50% babi, dan 75% babi. Formulasi simulasi gummy vitamin c yang digunakan adalah sukrosa dan glukosa sebagai pemanis, gelatin sebagai basis gummy, asam sitrat sebagai agen pengasam dan tartrazin sebagai pewarna. Formulasi gummy simulasi vitamin C merupakan modifikasi dari formulasi gummy yang terdapat pada Gelatine Handbook : Theory and Industrial Practice (Schriber & Gareis, 2007). Simulasi Gummy vitamin C yang dihasilkan pada penelitian ini memiliki sifat organoleptis yaitu berwarna oranye, memiliki rasa asam, kenyal, dan meleleh dalam mulut saat dikunyah. Berat sediaan gummy ratarata 3,8 gr. Berat sediaan tersebut masih belum memenuhi standar berat sebenarnya yaitu 5 gr. Hal ini kemungkinan disebabkan oleh beberapa hal diantaranya sisa larutan gummy masih ada yang menempel pada dinding cawan sehingga tidak tertuang keseluruhan. 4.2. Isolasi DNA Proses isolasi DNA merupakan tahap awal sebelum dilakukannya analisis sumber DNA pada sediaan gummy simulasi vitamin C. Isolasi DNA dilakukan untuk mendapatkan DNA genom dari daging sapi, daging babi, 30 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 31 gelatin sapi, gelatin babi, simulasi gummy vitamin C sapi, simulasi gummy vitamin C babi, serta simulasi gummy vitamin C campuran sapi dan babi dengan berbagai konsentrasi. Ada tiga tahap umum dalam proses isolasi DNA yaitu perusakan dinding sel (lisis), pemisahan DNA dari bahan padat seperti selulosa dan protein, serta pemurnian DNA (Ardiana, 2009). Pada penelitian ini isolasi DNA dilakukan dengan metode ekstraksi fase solid menggunakan matriks silika dari kit komersial High Pure PCR Template Preparation Roche. Alasan pemilihan metode ekstraksi dengan kit komersial ini dibandingkan dengan metode konvensial dikarenakan metode konvensional membutuhkan proses yang lama, jumlah sampel yang cukup banyak dalam mengekstraksi serta jumlah reagen yang begitu besar. Kit komersial yang digunakan pada penelitian ini menggunakan teknologi filter matriks silika untuk mengisolasi DNA dari sampel. Prinsipnya yaitu asam nukleat akan teradsorbsi oleh matriks silika pada filter dengan adanya garam chaotropic seperti natrium asetat, guanidin tiosianat atau guanidin hidroklorida. Adsorbsi asam nukleat dengan matriks silika disebabkan adanya afinitas tinggi antara rantai asam nukleat yang bermuatan negatif terhadap partikel silika bermuatan positif. Kekuatan adsorbsi silika terhadap asam nukleat bergantung pada kekuatan ion dan pH lingkungan. Asam nukleat yang teradsorbsi oleh silika akan mudah dibersihkan dari pengotor lainnya dibawah tekanan gaya sentrifugal. Asam nukleat yang teradsorbsi pada matriks silika dapat dielusi dengan menambahkan larutan rendah garam (Tan C,S & Yiap CB.,2009; Jaiprakash, 2014; Chacon & Griffiths, 2014). Pada penelitian ini dilakukan beberapa modifikasi diantaranya pada berat sampel yang digunakan, penambahan volume pereaksi, kecepatan sentrifugasi, lama inkubasi, dan urutan langkah kerja. Sebelum memulai proses isolasi, DNA sampel dipresipitasi terlebih dahulu menggunakan isopropanol dan garam natrium asetat dengan volume yang sama. Adanya isopropanol dapat mengurangi kelarutan DNA pada air serta adanya garam natrium asetat berfungsi untuk mengikatkan muatan negatif pada gugus fosfat DNA dengan kation natrium asetat (Greene, 1998). Langkah selanjutnya dalam isolasi DNA ini sampel dilisiskan UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 32 terlebih dahulu dengan 200 µL tissue lysis buffer. Larutan tissue lysis buffer mengandung EDTA yang merupakan zat yang mengikat ion magnesium pada dinding sel sehingga memudahkan proses pelisisan dinding sel (Sudjadi, 2008). Urea 4M merupakan zat kaotropik yang mendenaturasi protein pada sel. Tris 200 mM sebagai buffer yang menjaga kestabilan pH DNA efektif pada pH 7-9 (Tan Alex, 2014). Langkah selanjutnya sampel ditambahkan proteinase K lalu diinkubasi pada suhu 55ºC selama 24 jam. Proteinase K berfungsi sebagai pendegradasi protein yang terikat pada DNA. Proses degradasi protein diperlukan kondisi yang optimal pada suhu 50-55º C dengan pH 7.5 sampai 8 (Kieleczawa, 2006). Selanjutnya ditambahkan 200 µL binding buffer diinkubasi 10 menit pada suhu 70 ºC dan ditambahkan 250 µL isopropanol untuk mengikat DNA pada membran. Larutan sampel kemudian dimasukkan pada filter tube yang telah terpasang pada collection tube kemudian disentrifugasi. Filter tube yang telah digunakan sebelumnya, dipasangkan collection tube baru dan ditambahkan inhibitor removal buffer.Tujuan dari penambahan inhibitor removal buffer ini adalah untuk menghilangkan zat-zat pengotor seperti protein yang menghambat pada amplifikasi PCR. Filter tube kemudian dipasangkan dengan collection tube baru dan ditambahkan wash buffer. Larutan wash buffer berfungsi menghilangkan sisa kotoran protein dan garam kaotropik yang terikat pada DNA. Setelah dilakukan pencucian, DNA yang terikat pada matriks silika kemudian dielusi dengan Elution Buffer yang telah dipanaskan pada suhu 70 °C, tujuan pemanasan untuk pengelusian isolat DNA secara optimal. (Roche, 2012; Kennedy, 2010). Isolat DNA kemudian dianalisis konsentrasi dan kemurniannya dengan spektrofotometer DNA. UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 33 4.3. Analisa Konsentrasi dan Kemurnian Isolat DNA dengan Spektrofotometer DNA Tabel .5. Konsentrasi dan kemurnian Isolat DNA NO SAMPEL KONSENTRASI KEMURNIAN ( ng/µL) (A260/A280) 1 Daging sapi 36,54 1,923 2 Daging babi 46 1,804 3 Gelatin sapi 29,44 1,597 4 Gelatin babi 10,36 1,610 5 Gummy sapi 17,18 1,606 6 Gummy babi 18 1,645 7 Gummy campuran babi 1% 13,85 1,565 8 Gummy campuran babi 25% 10,23 1,588 9 Gummy campuran babi 50% 12,06 1,504 10 Gummy campuran babi 75% 30,13 1,638 Analisa konsentrasi dan kemurnian DNA dilakukan dengan menggunakan spektrofotometer DNA. Prinsip kerja spektrofotometer DNA sesuai dengan spektrofotometer UV tetapi pengukuran dilakukan pada panjang gelombang 260 nm dan 280 nm. Kemurnian isolat DNA dilihat dengan rasio A260/A280 adalah 1,8-2 (Sambrook et al, 2001 ; Sudjadi, 2008;Conn, 2012). Konsentrasi DNA yang didapatkan pada daging sapi sebesar 36,45 ng/µL dan daging babi sebesar 46 ng/µL. Sedangkan gelatin sapi sebesar 29,44 ng/µL, gelatin babi sebesar 10,36 ng/µL, serta gummy 1% babi sebesar13,85 ng/µL, gummy 25% babi sebesar 10,23ng/µL, gummy 50% babi sebesar 12,06 ng/µL, dan gummy 75% babi sebesar 30,13 ng/µL. Konsentrasi isolat DNA daging yang didapatkan jauh lebih besar dibandingkan DNA gelatin dan DNA sampel gummy. Hal ini dikarenakan pada daging memiliki jumlah sel yang banyak dan belum mengalami proses pengolahan sedangkan gelatin merupakan produk hasil hidrolisis dari kolagen yang menyebabkan denaturasi DNA sehingga DNA yang UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 34 didapatkan sedikit. Kemurnian DNA daging kisaran 1,9-1,8. Sedangkan kemurnian gelatin berada pada kisaran 1,6-1,5. Sampel gummy vitamin C memiliki kemurnian pada kisaran 1,5-1,6. Nilai kemurnian DNA pada daging termasuk dalam kategori murni karena memenuhi rasio antara 1,82,0. Adapun nilai kemurnian DNA pada gelatin maupun sampel simulasi gummy vitamin C termasuk dalam kategori belum murni, karena nilai kemurnian dibawah 1,8. Nilai kemurnian DNA pada sampel gelatin sapi, gelatin babi, dan simulasi gummy vitamin C rendah disebabkan terdapat kontaminan protein dimana nilai kemurnian 1,5 memiliki perbandingan persentase protein dan asam nukleat yaitu sekitar 80% dan 20% selain hal tersebut sebanyak 92% komposisi gelatin adalah protein maka dari itu dengan presentase protein yang besar memungkinkan terdapat sisa protein yang tertinggal dalam isolat DNA (Sambrook et al, 2001; Schrieber, 2007). 4.4. Amplifikasi DNA Daging, Gelatin, dan Sampel Simulasi Gummy Vitamin C pada Real Time PCR DNA yang berhasil diisolasi kemudian diamplifikasi dengan menggunakan alat Real-Time PCR. Komponen yang digunakan pada proses amplifikasi Real Time PCR adalah DNA template, satu pasang primer spesifik sapi dan babi, hydrolysis probe, dan LC 480 probe master. Proses deteksi dengan alat Real Time PCR membutuhkan sepasang primer spesifik dengan spesies DNA sapi dan DNA babi yang diidentifikasi secara in silico dengan website BLAST NCBI. Region DNA yang dipakai terletak pada mitokondria cytB. Selain sepasang primer spesifik, dibutuhkan juga pewarna fluoresensi probe. Hydrolysis probe merupakan oligonuklotida probe yang dilabel dengan pemancar atau reporter dye pada bagian ‘5 eksonuklease dan peredam atau quencher dye pada bagian ‘3 eksonuklease. Probe pada Real-Time PCR digunakan sebagai pewarna pendeteksi adanya sinar fluoresen yang ditangkap. Pada proses annealing setiap siklus, reporter probe akan dipisah dari quencher probe melalui hibridisasi atau aktifitas nuklease Taq Polimerase (Johansson, 2006). UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 35 Campuran reaksi total PCR (Lampiran 5) dibuat dalam volume 20 μL dengan konsentrasi tiap primer forward dan reverse 0,8 μM serta untuk konsentrasi probe adalah 0,2 μM. Konsentrasi primer dan probe dibuat dari larutan induk 10 μM (Lampiran 3). Konsentrasi primer untuk PCR sebaiknya berkisar antara 0,3-1 μM dan untuk konsentrasi hydrolysis probe berkisar antara 0,05-0,2 μM (Rocheb, 2008). Konsentrasi primer yang optimal adalah konsentrasi terendah yang dapat menghasilkan nilai CP awal dan kurva fluoresensi yang baik, begitu juga dengan probe. Analisa kurva amplifikasi pada Real Time PCR dapat dilihat pada kenaikan kurva amplifikasi dan nilai CP (crossing point). Nilai crossing point (CP) yaitu siklus dimana fluoresensi mencapai ambang batas atau threshold sehingga terjadi peningkatan signifikan saat pertama kali terdeteksi (Rodriguez, 2013). Gambar 10. Hasil Amplifikasi pada Uji Spesifitas Primer Sapi Menggunakan Kontrol Positif Daging Sapi, Gelatin Sapi dan Simulasi Gummy Vitamin C Sapi * Keterangan :DS = Daging sapi; GS = Gelatin Sapi; GB = Gelatin Babi; DB = Daging Babi; GMS = Gummy Sapi; GMB = Gummy babi; NTC = No Template Control; dan CP = Crossing Point UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 36 Gambar 11. Hasil Amplifikasi Sampel Simulasi Gummy Vitamin C dengan Primer Sapi * Keterangan:DS = Da ging sapi; GS = Gelatin Sapi; GB = Gelatin Babi; DB = Daging Babi; GMS = Gummy Sapi; GMB = Gummy babi; NTC = No Template Control; dan CP = Crossing Point Sebelum pengujian sampel simulasi gummy, dilakukan pengecekan spesifitas primer sapi dan babi. Pada uji spesifitas primer sapi dilakukan dengan 40 siklus dengan suhu annealing 61º C. Hasil dari uji terlihat pada gambar 8 primer dan probe sapi hanya mengamplifikasi daging sapi dengan nilai CP 18,89, gelatin sapi dengan nilai CP 25,88, dan gummy sapi dengan nilai CP 26,19. Seluruh sampel simulasi gummy vitamin C diuji dengan menggunakan primer sapi dan primer babi. Pada uji ini dilakukan dengan suhu annealing 61º C dan dilakukan sebanyak 40 siklus. Hasil kurva amplifikasi primer sapi pada gambar 9 terlihat adanya perbedaan kenaikan kurva amplifikasi. Kontrol positif daging sapi terlihat kenaikan kurva amplifikasi pertama kali yaitu pada siklus 18,27 dengan konsentrasi DNA 36,54 ng/µL. Kurva amplifikasi yang kedua yaitu pada gummy konsentrasi 75% babi pada siklus 24,91 dengan konsentrasi DNA 30,13 ng/µL. Kurva ketiga yang muncul yaitu kontrol positif gelatin sapi pada siklus 25,31 dengan konsentrasi DNA UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 37 29,44 ng/µL. Kurva keempat yang muncul yakni gummy sapi pada siklus 25,49 dengan konsentrasi DNA 17,18 ng/µL. Adapun kurva kelima yaitu gummy babi 50% pada siklus 26,06 dengan konsentrasi 12,06 ng/µL. Kurva keenam muncul gummy babi 25% pada siklus 26,36 dengan konsentrasi DNA 10,23 ng/µL. Secara teoritis, konsentrasi DNA yang tinggi membutuhkan siklus amplifikasi lebih sedikit untuk mencapai CP, begitu juga dengan konsentrasi DNA yang rendah membutuhkan siklus amplifikasi lebih panjang untuk mencapai CP. Data di atas menunjukkan bahwa semakin besar konsentrasi DNA maka semakin kecil nilai CP, dan sebaliknya semakin sedikit konsentrasi DNA semakin besar nilai CP (Rochec, 2008). Gambar 12. Hasil Amplifikasi Pada Uji Spesifitas Primer Babi Menggunakan Kontrol Positif Daging Babi, Gelatin Babi, dan Simulasi Gummy Vitamin C Babi *Keterangan :DS = Daging sapi; GS = Gelatin Sapi; GB = Gelatin Babi; DB = Daging Babi; GMS = Gummy Sapi; GMB = Gummy babi; NTC = No Template Control; dan CP = Crossing Point UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 38 Gambar 13. Hasil Amplifikasi Sampel Simulasi Gummy Vitamin C dengan Primer Babi *Keterangan:DS = Daging sapi; GS = Gelatin Sapi; GB = Gelatin Babi; DB = Daging Babi; GMS = Gummy Sapi; GMB = Gummy babi; NTC = No Template Control; dan CP = Crossing Point Pada uji spesifitas primer babi dilakukan dengan 50 siklus lebih panjang dari siklus uji spesifitas primer sapi dengan suhu annealing 60º C. Hasil pada pengujian ini terlihat pada gambar 10 adapun primer dan probe babi hanya mengamplifikasi daging babi dengan nilai CP 20,77, gelatin babi dengan nilai CP 38,40 dan gummy babi dengan nilai CP 37,01. Dan kontrol negatif tidak terjadi kenaikan kurva amplifikasi. Pada pengujian sampel simulasi gummy dilakukan sebanyak 50 siklus dengan suhu annealing 60º C. Hasil kurva amplifikasi dengan primer babi ditunjukkan pada gambar 11. Berdasarkan hasil tersebut terlihat kenaikan kurva pertama kali pada kontrol positif daging babi, pada siklus ke 18,81 dengan konsentrasi DNA 46 ng/µL. Kemudian pada kurva amplifikasi kedua muncul sampel babi konsentrasi 75% pada siklus 37,20 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 39 dengan konsentrasi DNA 30,13 ng/µL. Pada kurva amplifikasi ketiga muncul gummy babi pada siklus 37,63 dengan nilai konsentrasi DNA 18 ng/µL. Adapun pada kurva amplifikasi keempat muncul gelatin babi pada siklus 41,62 dengan konsentrasi DNA 10,36 ng/µL. Sedangkan pada kurva kelima muncul sampel gummy 50% babi pada siklus 41,95 dengan nilai konsentrasi DNA 12,06 ng/µL. Pada kurva keenam muncul sampel simulasi gummy 25% babi pada siklus 42,08 dengan konsentrasi DNA 10,23 ng/µL. Sedangkan pada sampel gummy 1% babi tidak terlihat kenaikan kurva amplifikasi yang disebabkan konsentrasi gelatin dalam sediaan yang relatif kecil sehingga pada proses ekstraksi tidak didapatkan isolat DNA. Secara teoritis, konsentrasi DNA yang tinggi membutuhkan siklus amplifikasi lebih sedikit untuk mencapai CP, begitu juga dengan konsentrasi DNA yang rendah membutuhkan siklus amplifikasi lebih panjang untuk mencapai CP. Data di atas menunjukkan bahwa semakin besar konsentrasi DNA maka semakin kecil nilai CP, dan sebaliknya semakin sedikit konsentrasi DNA semakin besar nilai CP (Rochec, 2008). UIN Syarif Hidayatullah Jakarta BAB 5 KESIMPULAN 5.1. Kesimpulan 1. Kondisi optimal proses isolasi DNA dari gummy dan gelatin diperoleh melalui metode presipitasi DNA kombinasi natrium asetat dan isopropanol dengan perbandingan volume 1:1. 2. Amplifikasi DNA dengan primer spesifik sapi dilakukan sebanyak 40 siklus dan kondisi annealing pada suhu 61ºC. Sedangkan amplifikasi DNA dengan primer spesifik babi dilakukan sebanyak 50 siklus dengan kondisi annealing pada suhu 60ºC. 3. Kurva amplifikasi real-time PCR menggunakan primer spesifik sapi menunjukkan bahwa kontrol positif daging sapi, gelatin sapi dan simulasi gummy sapi teramplifikasi dengan nilai CP 18,27, 25,31, dan 25,49 sedangkan kontrol negatif tidak menunjukkan kurva amplifikasi. 4. Kurva amplifikasi real-time PCR menggunakan primer spesifik babi menunjukkan bahwa hanya kontrol positif yang teramplifikasi yaitu pada daging babi, gelatin babi, dan gummy babi dengan nilai CP 18,81, 41,62, 37,63. 5.2. Saran 1. Sebaiknya dilakukan optimasi dan validasi metode isolasi DNA agar mendapatkan isolat DNA dengan kemurnian 1,8-2,0. 2. Sebaiknya dilakukan uji kuantifikasi pada simulasi gummy untuk mengetahui konsentrasi DNA setelah teramplifikasi. 40 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 41 DAFTAR PUSTAKA Anonim (2006 ). Japanense Pharmacopoeia, Fifteen Edition. Electronic Version. hal.333. Ardiana, DW.(2009). Teknik Isolasi DNA Genom Tanaman Pepaya Dan Jeruk Dengan Menggunakan Modifikasi Bufer CTAB, Buletin Teknik Pertanian Vol. 14 No. 1, 2009: 12-16. BioDrop. (2012). Quick Start Guide. http://www.biodrop.co.uk. Diakses pada tanggal 30 November 2014 pukul 20.30. Boran, G., & Regenstein, J. M. (2010). Chapter 5. Fish gelatin. Advances in Food and Nutrition Research, 60, 119–143. Boore.L.Jeffrey, Survey And Summary Animal mitochondrial genomes, Nucleic Acids Research, (1999), Vol. 27, No. 8. Brenstick Stephen.(1996).Intisari Biologi. Jakarta: Hipokrates. Campbell, Nail A., Reece, Jane B., Mitchell, Lawrence G. (2002). BIOLOGI Edisi Kelima Jilid 1, alih bahasa Rahayu Lestari. Jakarta: Erlangga. Cai, H., X. Gu, M.S. Scanlan, D.H. Ramatlapeng and C.R. Lively, (2012), Realtime PCR assays for detection and quantitation of porcine and bovine DNA in gelatin mixtures and gelatin capsules, J. Food Compos. Anal., 25, 83-87. Chacon & Griffiths.( 2014). Methods for extracting genomic DNA from whole blood samples: current perspectives, Journal of Biorepository Science for Applied Medicine 2014:2. Cheng Hon, Rangasamy Murugesan, Tan Yee Sek, Wang Haichuan, Siegfried Blair D. Evaluation of Five Methods for Total DNA Extraction from Western Corn Rootworm Beetles. Journal Pone; e11963. Conn, P. (2012). Laboratory Methods in Cell Biology: Biochemistry and Cell Culture Volume 112. UK: Academic Press. Dennis Lo, Chiu Rossa, Chan Allen.(2006). Clinical Application Of PCR Second Edition. New Jersey. Humana Press. Dean Fraga, Tea Meulia, and Steven Fenster.(2008). Current Protocols Essential Laboratory Techniques 10.3.1-10.3.33. Dirjen POM Departemen Kesehatan Republik Indonesi, (1995), Farmakope Indonesia, Edisi IV, Jakarta. UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 42 Erwanto, Y., Abidin, M.Z., Sismindari, dan Rohman, A. (2012). Pig Species Identification in Meatballs Using Polymerase Chain Reaction- Restriction Fragment Length Polymorphism for Halal Authentication. International Food Research Journal 19 (3): 901-906. Ethel sloane.(1995). Anatomi dan Fisiologi Pemula.Jakarta: EGC. Fatchiyah, Arumingtyas L,Widyarti, Rahayu S. (2011). Biologi Molekular. Jakarta : Erlangga. Gaffar, Shabrani, M.Si. (2007). Buku Ajar Bioteknologi Molekul. Bandung :Universitas Padjajaran. Greene, J. (1998). Recombinant DNA Principles and Methodologies. United States: Marcel Dekker Inc. http://www.halalmui.org. Diakses pada tanggal 8 April 2014, pukul 09.38 WIB. Handbook of Pharmaceutical Excipients edisi ke-6.pdf. Hermanto,S., Sumarlin, L., Fatimah, W., (2013). Differentiation of Bovine and Porcine Gelatin Based on Spectroscopic and Electrophoretic Analysis, J.Food Pharm.Sci. 1 (2013) 68-73. Johansson, Mary Katherine. (2006). Choosing Reporter-Quencher Pairs for Efficient Quenching Through Formation of Intramolecular Dimers. From: Methods in Molecular Biology, vol. 335: Fluorescent Energy Transfer Nucleic Acid Probe: Design and protocols. Edited by: V.V. Didenko. Humana Press Inc., Totowa, NJ. Juwono dan Juniarto Zulfa Ahmad,(2000). Biologi Sel. Jakarta. EGC. Kieleczawa, (2006). DNA Sequencing II: Optimizing Preparation and Cleanup. Canada. Jonet and Barllet Publisher. Kurniati, Elly.(2009). Pembuatan Konsentrat Protein dari Biji Kecipir dengan Penambahan HCl. Jurnal Penelitian Ilmu Teknik 9(2) : 115 – 122. Marks, BD. Marks, Allan. Smith, MC.1996.Biokimia Kedokteran Dasar. Jakarta.EGC. Lanelli. (2014). Gummy Vitamins - Gummy Bear Vitamins for Kids. Diambil di http://pediatrics.about.com/od/vitamins/a/810_gummy_vitamins.htm. Diakses 12 Desember 2014 pukul 21.00. Muladno.(2010). Teknologi Rekayasa Genetik Edisi Kedua. Bogor : IPB Press. M. Nemati, M. R. Oveisi, H. Abdollahi and O. Sabzevari, Differentiation of Bovine and Porcine Gelatins Using Principal Component Analysis, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, vol. 34, 2004, 485-492. UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 43 Moraes,TC., Srivastava, Kirkinezos, (2002). Mitochondrial DNA Structure And Function. International Review Of Neurobiology, Vol 53. Nhari, R.M.H.R., A. Ismail and Y.B. Che Man, (2012), Analytical methods for gelatin differentiation from bovine and porcine origins and food products, J. Food Sci., 71, R42-R46. Phillips, Williams. (2009). Handbook of Hydrocolloid Second Edition. Cambridge: Woodhead publishing limited UK. Raja Mohd Hafidz, R. N., *Yaakob, C. M., Amin, I. and Noorfaizan, A, Chemical and functional properties of bovine and porcine skin gelatin, International Food Research Journal 18: 813-817 (2011). Rapley Ralph, Walker John.(2000).Molecular Biology and Biotechnology Fifth Edition.RSC. United Kingdom. Sambrook, J., & Russell, D. W. (2001). Molecular Cloning, A Laboratory Manual 3rd Edition. New York : Cold Spring Harbor Laboratory Press. Raraswati, A.,Triyana, K., Triwahyudi., Rahman, A. (2012). Differentiation of Bovine and Porcine Gelatins in Soft Candy Based on Amino Acid Profiles and Chemometric. J. Food Pharm. Sci. 2 (2014) 1-6. Rochea. (2012). High Pure PCR Template Preparation Kit. http://www.roche-appliedscience.com. Diakses pada 13 November 2014 pukul 17.05 Rocheb.(2008). LightCycler® 480 Probes Master. www.rocheapplied-science.com. Diakses pada 15 November 2014 pukul 12.30 Rochec.(2008). The LightCycler® 480 Instrument Operator’s Manual. www.rocheapplied-science.com Diakses pada 20 November 2014 pukul 12.50 Rodriguez, D.,&Lazaro.(2013). Real-time PCR in Food Science Current Technology and Applications. Spanyol: Caister Academia Press. Schreiber, R., & Gareis, H. (2007). Gelatine Handbook : Theory and Industrial Practice. Jerman : Wiley Vch Verlag Gmbh dan Co. KgaA. Solihin, Dedy Duryadi. (1994). Ulas balik Peran DNA Mitokondria (mtDNA) dalam Studi Keragaman Genetik dan Biologi Populasi pada Hewan. Bogor : FMIPA IPB. ISSN 0854-8587. Sudjadi.(2008).Bioteknologi Kesehatan. Yogyakarta. Kanisius. Sumardjo, Damin.(2006).Pengantar Kimia : Buku Panduan Kuliah Mahasiswa Kedokteran dan Program Strata I Fakultas Bioeksakta. Jakarta. EGC. UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 44 Suryani,N.,Sulistiawati, F.,Fajriani,A. (2009). Kekuatan Gel Gelatin Tipe B Dalam Formulasi Granul Terhadap Kemampuan Mukoadhesif. Makara, Kesehatan, Vol. 13, No. 1, Juni 2009: 1-4. Sweetman, S.C. (2009). Martindale 36 The Complete Drug Reference. London: The Pharmaceutical Press. Tanabe, Soichi., Makiko Hase., Takeo Yano., Masahiko Sato., Tasuya Fujimura., and Hiroshi Akiyama. (2007). A Real-Time Quantitative PCR Detection Method for Pork, Chicken, Beef, Mutton, and Horseflesh in Foods. Japan : Setagaya-ku, Tokyo. 71 (12). 3131-3135.2007. Tan Alex, (2014). Diambil di http://www.ehow.com/about_6370973_function-trisbuffer-dna- extraction_.html. Diakses 13 Desember 2014 pukul 13.34 WIB. Tan, CS., Yiap, BC, (2009). DNA, RNA, and Protein Extraction: The Past and The Present. Journal of Biomedicine and Biotechnology Volume 2009, Article ID 574398, 10 pages doi:10.1155/2009/574398. Wangtueai,S.,Noomhorm,A.(2009). Processing optimization and characterization of gelatin from lizardfish (Saurida spp.) scales, LWT - Food Science and Technology 42 (2009) 825–834. Y.H.Hui.(2005). Handbook Of Food Science Technology And Engineering third Volume. Crc Pr I Llc: China Yuliarti, N. (2009). A To Z Food Supplement First Edition. Yogyakarta : CV Andi Offset. Yuwono, Triwibowo. (2009). Biologi Molekular. Jakarta : Erlangga. UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 45 Lampiran I. Kerangka Konsep Pembuatan sampel gummy simulasi vitamin C dari gelatin babi dan gelatin sapi dan berbagai konsentrasi campuran gelatin babi 1%,25%,50%,75% Isolasi DNA dari daging sapi,daging babi, gelatin babi, gelatin sapi, sampel simulasi gummy vitamin C Isolat DNA Mengecek konsentrasi dan Kemurnian DNA dengan Spektrofotometer biodrop DNA tidak murni DNA murni Amplifikasi DNA dengan Real- Time PCR Analisa data kurva amplifikasi Real Time PCR UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 46 Lampiran 2. Tabel Komposisi Kit Ekstraksi DNA Roche Tabel.6. Komposisi Kit Ekstraksi DNA NO 1 NAMA REAGEN Tissue Lysis Buffer KOMPOSISI 4M urea, 200mM Tris, 20 mM NaCl,200 mM EDTA,pH 7,4 2 Binding Buffer 6 M guanidine HCl, 10 mM urea, 10 mM TrisHCl, 20% Triton X-100 (v/v),pH 4,4 3 4 Proteinase K Inhibitor Removal Buffer 5 Wash Buffer 6 7 Elution Buffer High Pure Filter Tube 8 Collection Tube Enzim proteinase PCR grade 5 M guanidine-HCl, 20 mM Tris-HCl pH 6,6 20 mM NaCl, 2mM Tris-HCl pH 7,5 10 mM Tris-HCl pH 8,5 Berasal dari bahan polipropilen yang terdiri dari dua lapisan serat kaca Berasal dari bahan polipropilen UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 47 Lampiran 3. Membuat Larutan Primer dan Probe dan Natrium Asetat 1. Membuat larutan primer dan probe konsentrasi 10 µM dari larutan induk 100 µM V1 . M1 = V2 . M2 X . 100 µM = 100 µL. 10 µM 1000 X = 100 = 10 µL Maka, 10 μL diambil dari masing-masing primer dan probe 100 μM dan di add 90 μL PCR water grade 2. Rekomendasi konsentrasi untuk primer (LightCycler ® 480) adalah 0.3-1 µM, dipilih konsentrasi 0.8 µM untuk tiap primer V1 . M1 = V2 . M2 X . 10 µM = 20 µL . 0.8 µM 16 X = 10 = 1.6 µL Maka, diambil 1,6 μL dari larutan primer konsentrasi 10 μM 3. Rekomendasi konsentrasi untuk probe (LightCycler ® 480) adalah 0.05-1 µM, dipilih konsentrasi 0.2 µM untuk tiap probe V1 . M1 = V2 . M2 X . 10 µM = 20 µL . 0.2 µM 4 X = 10 = 0.4 µL Maka, diambil 0,4 μL dari larutan probe konsentrasi 10 μM 4. Membuat larutan natrium asetat konsentrasi 3M 3M = 𝑔𝑟 𝑀𝑅 𝑔𝑟 82,03 gr = x 1000 𝑣 1000 x 100 𝑚𝐿 3𝑥82,03 100 𝑚𝐿 = 24,609 gr Maka 24,609 gr Natrium Asetat dilarutkan dalam 100 mL aquadest UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 48 Lampiran 4. Perhitungan Tm (Melting Temperature) Primer Rumus Tm = 2ºC (A+T) + 4ºC (G+C) 1. Primer Sapi Primer sapi forward Tm = 2ºC (2+8) + 4ºC (2+8) = 60 Primer sapi reverse Tm = 2ºC (5+8) + 4ºC (8+3) = 70 Probe sapi Tm = 2ºC (8+5) + 4ºC (1+11) = 74 2. Primer babi Primer babi forward Tm = 2ºC (7+6) + 4ºC (4+7) = 70 Primer babi reverse Tm = 2ºC (8+7) + 4ºC (6+3) = 66ºC Probe babi Tm = 2ºC (9+7) + 4ºC (2+9) = 76ºC UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 49 Lampiran 5. Campuran Reaksi Mastermix untuk Amplifikasi DNA Tabel .7. Campuran reaksi Hydrolysis Probe mastermix Primer Forward Primer Reverse Probe LightCycler® 480 Probe Master ddH2O DNA template Konsentrasi Larutan Induk Jumlah yang digunakan 0.8 μM 0.8 μM 0.2 μM - 10 μM 10 μM 10 μM - 1.6 μL 1.6 μL 0.4 μL 10 μL - - 1,4 μL - - 5 μL Total volume reaksi 20 μL UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 50 Lampiran 6. Hasil BLAST Berdasarkan Informasi NCBI a.PRIMER BABI *keterangan Primer forward Probe Babi Primer Reverse b.PRIMER SAPI *keterangan Primer Forward probe sapi Primer Reverse UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 51 Lampiran 7. Gambar Alat-Alat Dalam Penelitian Gambar 1. Kit Isolasi DNA Roche Gambar 2. Spektrofotometer DNA Gambar 3. Instrumen Real-Time PCR (ROCHE) UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 52 Lampiran 8. COA Gelatin Babi UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 53 Lampiran 9. COA Gelatin Sapi UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
