PROPOSAL KEGIATAN PENELITIAN SAMPLING SPONGE LAUT

PROPOSAL KEGIATAN PENELITIAN
SAMPLING SPONGE LAUT SEBAGAI SUMBER BAKTERI GRAM NEGATIF
Disusun Oleh:
PRASTYO ABI WIDYANANTO
RIANTI PUTRI PANGASTUTI
SEPTHY KUSUMA RADJASA
RACHMAT AFRIYANTO
JURUSAN ILMU KELAUTAN
DEPARTEMEN ILMU KELAUTAN
FAKULTAS PERIKANAN DAN ILMU KELAUTAN
UNIVERSITAS DIPONEGORO
SEMARANG
2017
DAFTAR ISI
HALAMAN COVER...................................................................................................
DAFTAR ISI................................................................................................................
I.
PENDAHULUAN...................................................................................................
1.1. Latar belakang...................................................................................................
1.2. Tujuan penelitian...............................................................................................
II. TINJAUAN PUSTAKA..........................................................................................
2.1. Pulau Karimunjawa............................................................................................
2.2. Organisme Laut...................................................................................................
2.3. Mikroorganisme Laut Asosiasi............................................................................
III. METODE PENELITIAN
3.1. Waktu dan tempat penelitian............................................................................
3.2. Alat dan bahan..................................................................................................
3.3. Metode penelitian...............................................................................................
DAFTAR PUSTAKA......................................................................................................
LAMPIRAN.......................................................................................................................
I.
PENDAHULUAN
1.1. Latar Belakang
Keanekaragaman hayati di ekosistem laut lebih tinggi daripada di hutan hujan
tropis (Larsen et al., 2005). Laut merupakan sumber natural product yang unik,
umumnya bahan aktif ini terakumulasi pada invertebrata yang biasa hidup pada
ekosistem terumbu karang seperti spons, tunikata, bryozoan, karang lunak, dan moluska.
Bahan aktif tersebut merupakan senyawa alami yang dikeluarkan oleh oraganisme laut
dalam pertahanan diri untuk melangsungkan kehidupannya, biasanya bahan tersebut
berupa senyawa metabolit sekunder. Metabolit sekunder merupakan zat yang dimiliki
oleh invertebrata laut sebagai penangkal serangan predator, dan mempertahankan
eksistensinya di ekosistem. Beberapa metabolit sekunder dari invertebrata laut
menunjukkan adanya aktivitas farmakologi salah satunya sebagai antibakteri dan
memiliki peluang sebagai bahan obat (Proksch, 2002).
Spons merupakan salah satu invertebrata laut yang memiliki kandungan metabolit
sekunder, sehingga menjadi target eksplorasi sumber senyawa bioaktif alami (Sukarmi
dan Radjasa, 2007). Untuk memperoleh senyawa bioaktif dari suatu organisme dapat
dilakukan dengan mengekstrak organisme tersebut. Hal ini akan menimbulkan masalah
baru karena dibutuhkan massa organisme dalam jumlah yang sangat besar. Menurut
Proksch et al., 2003, senyawa yang sangat aktif pada invertebrata laut hanya berkisar
kurang dari 10-6 dari berat basahnya. Eksploitasi spons yang berelebihan akan menjadi
masalah serius bagi ekosistem terumbu karang dalam upaya konservasi. Hal tersebut
dapat dihindari dengan memanfaatkan mikroorganisme seperti jamur dan bakteri yang
bersimbiosis dengan spons yang memiliki metabolit sekunder dapat dijadikan sebagai
alternatif. Kelecom (2001) menyatakan bahwa mikroorganisme simbion biasanya
menghasilkan metabolit sekunder yang mirip dengan yang dihasilkan oleh inangnya.
Pembagian atas jenis sel bakteri dibedakan dalam pewarnaan gram yaitu bakteri
gram positif dan gram negatif. Bakteri gram negatif memilki perbedaan dengan bakteri
gram positif antara lain pada pewarnaan gram (1) bakteri gram positif memunculkan
warna biru akibat tertahanya reagen crystal violet yang berwarna biru pada sel bakteri,
sedangkan (2) bakteri gram negatif memunculkan warna merah dari reagen safranin
akibat lunturnya reagen crystal violet dari sel bakteri pada proses peluruhan. Gram
negatif merupakan sel bakteri dengan dinding sel yang mengandung peptidoglikan dalam
jumlah kecil, lipopolisakarida, lipoprotein dan makromolekul kompleks lainnya
(Madigan et al., 2015). Bakteri gram negatif biasanya menggunakan N-acyl homoserine
lactones (AHL) sebagai molekul sinyal yang berfungsi sebagai penghubung reseptor
protein untuk mengaktivasi ekpresi gen. Komunikasi bakteri terbeut difasilitasi oleh
produksi dan pengakuan akibat adanya sinyal molekul kecil (autoinduser), juga bisa
mengatur sifat fenotip yang penting seperti bioluminense, formasi biofilm, swarming
motility, biosintesis antibiotik dan faktor produksi virulensi (Teasdale et al., 2009).
Kepulauan Karimunjawa memiliki perairan dengan diversitas organisme laut
yang tinggi, sehingga menjadikan tempat ini sebagai potensi pariwisata bahari karena
menyajikan keindahan alam asli dengan keanekaragaman hayati. Pulau Karimunjawa
juga termasuk dalam salah satu daftar kawasan konservasi nasional. Diversitas
organisme yang tinggi tersebut menunjukkan bahwa kondisi lingkungan di Pulau
Karimunjawa sesuai dengan lingkungan organisme laut untuk hidup dan juga bakteri
asosiasinya syarat akan bahan bioaktif yang belum diexplorasi secara maksimal.
Penelitian tentang organisme avertebrata laut dan bakteri asosiasinya ini diharapkan
dapat menjadi salah satu upaya dalam pengembangan kawasan Karimun jawa, karena
masih sedikitnya penelitian tentang organisme laut dan bahan bioaktif bakteri asosiasi
pada organisme laut khususnya sponge.
1.2. Tujuan
Tujuan kegiatan penelitian ini adalah untuk mengisolasi dan mengidentifikasi
bakteri gram negatif yang berasosiasi pada invertebrata laut (spons) di Indonesia
khususnya berasal dari Pulau Karimunjawa.
II. TINJAUAN PUSTAKA
2.1. Pulau Karimunjawa
Secara geografis Karimunjawa merupakan kepulauan yang terletak antara
5°40’39 - 5°55’00 LS dan 110°05’57 - 110°31’15’ BT dengan luas wilayah sekitar
107.225 ha, tepatnya di sebelah utara dari Kabupaten Jepara, Jawa Tengah. Secara
administratif, daerah ini termasuk wilayah Kecamatan karimunjawa, Kabupaten Jepara,
Jawa Tengah. Kecamatan ini terbagi menjadi beberapa kawasan seperti kawasan
pemerintahan, kawasan pemukiman, kawasan konservasi, dan kawasan pariwisata
(BTNKJ, 2010).
Wilayah Kepulauan Karimunjawa mempunyai iklim tropis yang dipengaruhi oleh
angin laut dengan suhu rata-rata 26-30OC. Suhu maksimum 34OC dengan suhu minimum
22OC. Kelembaban antara 70-85%, dan tekanan udara berkisar antara 1,012 mbar. Dalam
satu tahun terdapat dua pergantian musim, yaitu musim kemarau dan musim penghujan
dengan musim pancaroba diantaranya. Musim kemarau (musim timur) terjadi pada bulan
Juni-Agustus. Pada musim ini cuaca sepanjang hari cerah dengan curah hujan rata-rata
<200 mm/bulan, rata-rata penyinaran matahari antara 70-80% setiap hari. Bulan kering
terjadi pada Maret-Agustus dengan curah hujan sekitar 60 mm/bulan. Arah angin datang
dari timur sampai tenggara dengan kecepatan 7-10 knot, kadang-kadang mencapai 16
knot lebih. Musim pancaroba pertama terjadi pada September – Oktober, pada periode
ini angin didominasi dari barat dan barat laut, juga dari timur dan utara dengan kecepatan
yang sangat bervariasi (BTNKJ, 2010).
Topografi Kepulauan Karimunjawa dapat dibedakan menjadi tiga, yaitu
perbukitan, perbukitan bergelombang, dan dataran rendah. Perbukitan terbentang luas di
Pulau Karimunjawa dengan ketinggian 200-500 m. Bertekstur kasar, berlereng terjal, dan
disusun oleh batuan sedimen pra-tersier. Perbukitan bergelombang terbentang di Pulau
Karimunjawa, Pulau Kemujan, Pulau Parang, dan Pulau Genting, dengan ketinggian 25200 m, bertekstur halus hingga agak kasar, berlereng landai, dan disusun oleh batuan
sedimen dan batuan gunung api. Gunung Walang dan beberapa gumuk (bukit kecil)
merupakan tonjolan topografi pada daerah ini. Dataran rendah terbentang di Pulau
Karimunjawa, Pulau Kemujan, Pulau Parang, Pulau Genting, Pulau Menjangan, Pulau
Cemara, Pulau Bengkoang, Pulau Geleang, dan Pulau Sintok dengan ketinggian antara 025 m. Penyusun substrat dataran rendah ini antara lain aluvium dan sedikit batuan
gunung api atau batuan sedimen (BTNKJ, 2010). Peta Karimunjawa dapat dilihat pada
gambar 2.1.
Kepulauan Karimunjawa sebagai tujuan pariwisata bahari merupakan daerah
kepulauan
dengan
topografi
yang
menyajikan
keindahan
alam
asli
dengan
keanekaragaman hayati seperti terumbu karang. Gugusan terumbu karang di Kepulauan
Karimunjawa umumnya dikelilingi oleh terumbu karang tepian (fringing reefs) hingga
kedalaman 20 meter.
Gambar 2.1. Peta Kepulauan Karimunjawa, Jepara
2.2. Organisme Laut
Terumbu karang merupakan ekosistem di perairan tropis yang kaya akan biotabiota penyusunnya, dengan keanekaragaman jenis yang tinggi. Salah satu biota penyusun
terumbu karang adalah karang lunak (Octocorallia,
Alcyionacea). Kelompok ini
diwakili oleh famili Alcyoniidae yang merupakan kelompok karang lunak yang tersebar
luas di perairan Indo-Pasifik Barat dalam jumlah besar (Manuputty, 2008).
Karang lunak menghasilkan senyawa bioaktif yang bermanfaat bagi karang lunak
tersebut dan bagi manusia. Senyawa bioaktif merupakan metabolit sebagai produk
metabolisme organisme yang melibatkan anabolisme dan katabolisme. Ada dua jenis
metabolit
yang
dihasilkan
oleh
organisme
selama
masa
pertumbuhan
dan
perkembangannya yaitu metabolit primer dan metabolit sekunder. Menurut Khatab et al.
(2008), senyawa bioaktif adalah senyawa kimia aktif yang dihasilkan oleh organisme
melalui jalur biosintetik metabolit sekunder. Muniarsih (2005) melaporkan bahwa
metabolit sekunder atau sering disebut natural product diproduksi oleh organisme pada
saat kebutuhan metabolisme primer sudah terpenuhi dan digunakan dalam mekanisme
evolusi atau strategi adaptasi lingkungan (fungsi penting dalam ekologi).
Karang lunak menghasilkan senyawa metabolit sekunder berfungsi untuk
menghadapi serangan predator, media kompetisi, mencegah infeksi bakteri, membantu
proses reproduksi, dan mencegah sengatan sinar ultra violet (Harper et al. 2001).
Elyakov dan Stonik (2003) melaporkan bahwa karang lunak menghasilkan beberapa dari
golongan senyawa hasil metabolit sekunder, seperti alkaloid, terpenoid, steroid,
flavonoid, fenol, saponin, dan peptide. Karang lunak genus Sarcophyton banyak
mengandung senyawa bioakif terpenoid, seperti cembranoid diterpenoid (Yulin Li et al.
2006). Koh et al. (2000) menambahkan bahwa jenis senyawa cembranoid diterpen lain
yang terdapat pada karang lunak Sarcophyton glaucum mengandung senyawa
sarcophytolide memiliki sifat neurotoksik dan berperan sebagai antibakteri dan antifungi.
Ekstrak eter Sarcophyton glaucum tersebut dapat menghambat bakteri S. aureus, E. coli,
dan Saccaromyces cerevisiae, sedangkan ekstrak etil asetat dapat menghambat bakteri S.
aureus, Clostridium albicans, dan S. cerevisiae. ( Badria et al, 1998). Senyawa kimia
tersebut berpotensi sebagai sumber obat alami. Hasil penelitian yang dilakukan Badria et
al. (1998) dan Swant et al. 2006) menunjukkan bahwa senyawa kimia aktif yang terdapat
pada karang lunak Sarcophyton sp. menunjukkan aktivitas sebagai antibakteri, antifungi,
antitumor, neurotoksik, dan anti-inflamantori yang bermanfaat bagi industri farmasi.
2.3. Mikroorganisme laut Asosisasi
Karakteristik bakteri laut ialah untuk pertumbuhannya memerlukan air laut atau
kadar garam, sehingga bakteri laut digolongkan ke dalam kelompok bakteri halofilik
(NaCl). Berdasarkan toleransi kadar garamnya, menurut Ogenski dan Umbreit (1959)
bakteri laut hanya dibagi dua yaitu bakteri halofilik moderat yaitu bakteri yang untuk
pertumbuhannya memerlukan 1% hingga 20% NaCl sedangkan bakteri halofilik ekstrim
yaitu bakteri yang memerlukan konsentrasi NaCl lebih dari 15% hingga 31%. Bakteri
laut 95% adalah Gram negatif, sebagian aktif bergerak, 70% mengandung pigmen dan
mempunyai toleransi yang besar terhadap suhu tetapi sensitif terhadap suhu tinggi
(Pelczar dan Chan, 1986). Mampu hidup dalam tekanan hidrostatik yang ekstrim di laut
yang sangat dalam (palung/trench).
Berdasarkan taksonominya bakteri dimasukkan ke dalam kategori prokaryota
oleh karena selnya tidak mempunyai kompartemen nukleus (inti sel). Sedangkan sel
yang mempunyai kompartemen nukleus disebut eukariota, yaitu biota tingkat tinggi yang
sudah mempunyai susunan jaringan tubuh yang lengkap. Prokaryota dibagi menjadi dua
kelompok utama yaitu eubakteria dan archaebakteria. Eubakteria adalah bakteri yang
sudah dikenal secara umum. Sedangkan yang termasuk kelompok archaebakteria adalah
bakteri penghasil metan, bakteri yang ekstrim halofil (kadar garam) dan ekstrim termofili
(suhu). Bakteri ekstrim halofil adalah bakteri yang hidup pada saturated brine (kadar
garam yang sangat tinggi) dan ekstrim termofil adalah kelompok bakteri yang hidup
pada suhu lebih besar dari 80°C (Fenchel, 2001). Bakteri laut memiliki kecenderungan
untuk berasosiasi dengan suatu lapisan permukaan padat. Penyebaran bakteri di laut
dipengaruhi oleh banyak faktor, seperti gerakan air laut, jarak dari pantai, kedalaman,
cahaya matahari, iklim dan organisme lain (Sidharta, 2000).
\
III. METODE PENELITIAN
3.1. Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Mei - Agustus 2017
yang berupa
pengambilan sampel di Karimun Jawa, Jawa Tengah pada bulan Mei 2017. Sedangkan
penelitian yang berkaitan dengan kultur bakteri dan senyawa bioaktif bakteri
dilaksanakan di Laboratorium Umum Unit Pelaksana Terpadu (UPT) Universitas
Diponegoro.
3.2. Alat dan Bahan
Daftar alat dan bahan yang digunakan dapat dilihat pada tabel berikut:
Tahapan
1. Koleksi dan identifikasi
2. Isolasi mikroorganisme asosiasi
3. Peremajaan bakteri uji
Alat
Scuba Diving, Snorkeling
Kamera underwater
Plastik tahan panas
Timbangan analitik
Kertas label
Cool box
Es batu
Buku identifikasi spons
Cawan petri
Jarum ose tusuk
Gunting
Tabung reaksi
Laminar Air Flow
Bunsen
Inkubator
Mortar
Mikropipet
Autoclave
Rak Tabung reaksi
Vortex
Salinometer
Mikroskop
Pinset
Tabung reaksi
Kapas
Aluminium foil
Autoklaf
Pipet
Akuades
Jarum ose
Cawan petri
Inkubator
Bahan
Air laut
Sampel (Sponge)
Alkohol 70%
Media Zobel 2216E
Air laut Steril
Sampel (Sponge)
Media Zobel 2216E
4. Pewarnaan gram bakteri
5. Pemurnian mikroorganisme bakteri
gram negatif
6. Kultur isolat bakteri
7. Ektraksi isolat
8. Analisis Kandungan senyawa
Cawan petri
Bunsen
preparat
Pipet
Kapas
Tisu
Aluminium foil
Laminar Air Flow
Cawan petri
Bunsen
Jarum ose
Hotplate
Pipet
Tabung reaksi
Kapas
Aluminium foil
Autoclave
Laminar Air Flow
Refrigerator
Erlenmeyer
Bunsen
Hotplate
Pipet
Tabung reaksi
Kapas
Aluminium foil
Autoclave
Laminar Air Flow
Refrigerator
Alat-alat gelas
Evaporator
Kertas saring
Shaker bath
Silicat Si 60
Pipa kapiler
Penggaris
UV transilluminator
Reagen pewarnaan
gram (crystal violet,
safranin,
alcohol,
dan iodine)
Media Zobel 2216E
Akuades
Air laut steril
Media
MEA
(MaltExtractBrooth)
Air laut steril
Jamur asosiasi aktif
Kultur jamur asosiasi
aktif
Metanol
Ekstrak
jamur
asosiasi aktif
Pelarut
(solven)
Metanol
3.3. Metode Penelitian
3.3.1. Koleksi dan Karakterisasi
Penelitian semi-eksploratif ini akan dilaksanakan dengan menggunakan metode
experimental laboratorium untuk proses isolasi dan identifikasi mikrosimbioan dan
bahan bioaktif. Dengan metoda semi-eksploratif, sampling biota dilakukan secara acak,
tetapi ditentukan jenis biota laut mana saja yang akan diambil. Jenis biota laut yang akan
diambil yaitu Sponges, tiga sampai sepuluh spesies.
Sampel yang digunakan dikoleksi dari Pulau Karimunjawa, Jawa Tengah. Sampel
dikoleksi dengan metoda scubadiving pada kedalaman 3 hingga 10 m. Jumlah sampel
yang diambil sebanyak tiga sampel dari setiap keenam biota laut. Setiap sampel diambil
sebanyak 5-10 cm/sampel, kemudian dimasukkan ke dalam plastik tahan panas. Setelah
sampai di daratan maka dilakukan isolasi bakteri asosiasi pada media agar zobel 2216E
yang telah disiapkan sebelumnya. Berikutnya sampel tersebut ditransportasikan dalam
keadaan dingin dengan menggunakan cool box yang diberi es. Pemberian label, difoto,
dan dicatat karakterisasi dari sampel yang diambil.
3.3.2. Isolasi Mikroorganisme Asosiasi
Sampel ditumbuk dengan mortar sehingga mikroba yang ada di permukaan atau
di dalam dapat terlepas kemudian dilarutkan ke dalam air laut steril. Perbandingan antara
berat sampel dengan pengenceran pertama adalah 1 : 9 (w/v). Lalu akan dilakukan
pengenceran untuk memperoleh konsentrasi 10-1, 10-2, 10-3, 10-4 dan 10-5. Setelah
dilakukan pengenceran kemudian diambil sebanyak 100 µl untuk dilakukan inokulasi
pada media zobel 2216E dengan cara spreading.
3.3.3 Peremajaan bakteri
Penyegaran atau peremajaan bakteri yang sudah single koloni menggunakan
media zobel 2216E strength agar. Media tersebut ditimbang sesuai ketentuan kemudian
dilarutkan ke dalam 500 ml air laut, media tersebut dihomogenkan menggunakan
hotplate pada suhu ±100oC, setelah homogen, bahan dituang ±15 ml kedalam cawan
petri. Sebelum digunakan, media disterilisasi dengan otoklaf pada suhu 121oC selama 15
menit. Media didinginkan di tempat yang steril pada suhu ruang. Setelah media agar
siap, kemudian sebanyak satu sampai dua ose bakteri single koloni dimasukkan ke dalam
media secara aseptik menggunakan metode streak. Selanjutnya diinkubasi pada suhu
37oC.
3.3.4 Pewarnaan Gram
Pewarnaan gram bakteri memiliki empat langkah yaitu kultur bakteri single koloni
tersebut ke dalam media zobel cair dengan optical density (OD) antara 0,5-0,8 (Lalitha,
2004). Kemudian ambil pipet dan letakan sampel di atas preparat, lakukan fiksasi.
Crystal violet dituangkan ke atas preparat tersebut, tunggu hingga 1 menit dan kemudian
dibasuh dengan air. Selanjutnya, iodine dituangkan ke atas preparat, tunggu hingga 1
menit dan dibasuh kembali dengan air, lakukan fiksasi. Dekolorisasi dengan alkohol 95
% dengan cara dituangkan ke atas preparat. Akhirnya, safranin dituangkan ke atas
preparat dan tunggu hingga 30 detik, basuh kembali dengan air dan lakukan fiksasi.
3.3.5. Pemurnian mikroorganisme penghasil bahan bioaktif
Pada tahap ini, koloni mikroorganisme asosiasi diisolasi secara aseptis untuk
dipindahkan pada media baru. Proses isolasi ini dilakukan beberapa kali sehingga
mendapatkan isolat asosiasi aktif yang murni (De Rosa et al., 2000).
3.3.6. Ekstraksi senyawa bioaktif
Mikroorganisme asosiasi yang telah diperbanyak kemudian diekstrak dengan cara
maserasi (perendaman) dengan metanol. Proses maserasi dilakukan selama 24 jam
dengan tiga kali pengulangan. Kemudian hasil maserasi akan disentrifugasi untuk
memisahkan media dan larutan ekstrak. Larutan ekstrak lalu disaring dengan dengan
kertas saring sebelum proses pemekatan ekstrak dengan rotari evaporator.
3.3.7. Analisis kandungan senyawa bioaktif pada metabolit sekunder
Mikroorganisme asosiasi baik jamur maupun Actinobacteria kandidat yang telah
diuji aktivitas antibakteri dianalisis kandungan senyawa bioaktifnya. Tahap ini dilakukan
dengan metoda uji TLC (Suzuki and Watanabe, 2005) dengan cara bahan bioaktif akan
ditotolkan pada plat TLC kemudian di-visualisasi dengan berbagai reagen sehingga akan
menghasilkan retention time dan warna yang khas yang mengindikasikan berbagai kelas
senyawa yang terkandung dalam sampel tersebut (Touchstone and Dobbins, 1983).
DAFTAR PUSTAKA
De Rosa, S.; A. Milone, A. Kujumgiev, K. Stefanov, I. Nechev, S. Popov. 2000.
Metabolites from a marine bacterium Pseudomonas:Alteromonas, associated with
the spons Dysidea fragilis, Comp. Biochem. Phys. Part B,126: 391–396.
Madigan, M.T., Martinko, J.M., Bender, K.S., Buckley, D.H., and Stahl, D. A. 2015.
Brock Biology of Microorganism (14th ed.). U.S: Pearson Education, Inc., 81 p.
Teasdale, M.E., Liu, J., Wallace, J., Akhlaghi, F., and Rowley, D.C. 2009. Secondary
Metabolites Produced by the Marine Bacterium. Appl. Environ. Microbiol.,
75(3):567–572.
LAMPIRAN
KEGIATAN SAMPLING SPONGE LAUT SEBAGAI SUMBER BAKTERI
GRAM NEGATIF DI TAMAN NASIONAL LAUT KARIMUNJAWA, JAWA
TENGAH
Penanggung Jawab
: Prof. Dr. Ocky Karna Radjasa, M. Sc.
Dr. Ir. Agus Triyanto, M. Sc.
Tim Ahli
: Muslihudin Aini, S.Pi., M.Si.
Sakti Imam Muclishin, S.Kel.
Tim Pelaksana
: Prastyo Abi Widyananto
Rianti Putri Pangastuti
Septhy Kusuma Radjasa
Rachmat Afriyanto
Lokasi pengambilan
: Pulau Menjangan
Pulau Burung
Pulau Gelean
Pulau Sintok
Pulau Kecil
Pulau Gosong
Objek yang diambil
: Sponges 10 – 15 spesies @ 3-6 cm