PENGEMBANGAN METODE SPEKTROFOTOMETRI UV

PENGEMBANGAN METODE SPEKTROFOTOMETRI UV-Vis
UNTUK PENETAPAN KADAR ANTIBIOTIK SEFADROKSIL
HIKMATULLAH
DEPARTEMEN KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2013
PENGEMBANGAN METODE SPEKTROFOTOMETRI UV-Vis
UNTUK PENETAPAN KADAR ANTIBIOTIK SEFADROKSIL
HIKMATULLAH
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains pada
Departemen Kimia
DEPARTEMEN KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2013
Judul Skripsi : Pengembangan Metode Spektrofotometri UV-Vis untuk Penetapan
Kadar Antibiotik Sefadroksil
Nama
: Hikmatullah
NIM
: G44076012
Disetujui
Pembimbing I
Pembimbing II
Drs Dudi Tohir, MS
NIP 195711041989031001
Rudi Heryanto, SSi, MSi
NIP 197604282005011002
Diketahui
Ketua Departemen Kimia
Prof Dr Ir Tun Tedja Irawadi, MS
NIP 195012271976032002
Tanggal Lulus:
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas segala karuniaNya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Karya ilmiah ini disusun
berdasarkan penelitian dan studi pustaka yang dilaksanakan pada bulan Juni
hingga September 2012 bertempat di Laboratorium Kimia Organik dan
Laboratorium Bersama Institut Pertanian Bogor dengan judul Pengembangan
Metode Spektrofotometri UV-Vis untuk Penetapan Kadar Antibiotik Sefadroksil.
Penulis mengucapkan terima kasih kepada bapak Drs Dudi Tohir, MS dan
bapak Rudi Heryanto, SSi, MSi selaku pembimbing yang telah memberikan
bimbingan dan pengarahan selama penelitian dan penulisan karya ilmiah ini.
Terima kasih penulis ucapkan kepada Pak Sabur dan keluarga besar Laboratorium
Kimia Organik yang telah membantu penulis selama menjalani penelitian. Terima
Kasih juga kepada Pak Eko dari Laboratorium Bersama yang menyediakan
spektrofotometer UV-Vis yang akan digunakan penulis. Ucapan terima kasih juga
penulis sampaikan kepada Saudari Yuniorita, Saudara Yulianto, Endro yang
membantu dalam pencarian literatur dan informasi farmasi lainnya.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor, Desember 2012
Hikmatullah
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Serang pada tanggal 9 Oktober 1983 dari Ayah Arsad
M Sulaeman dan Ibu Nurhayati. Penulis merupakan putra keempat dari empat
bersaudara.
Tahun 2001 penulis lulus dari SMU Negeri 21 Bandung dan diterima di IPB
pada Program Studi Analisis Kimia, Departemen Kimia, Fakultas Matematika dan
Ilmu Pengetahuan Alam. Pada tahun 2004 penulis lulus dari Program Diploma
Analisis Kimia setelah menyelesaikan tugas akhir praktik kerja lapangan di Balai
Besar Industri Agro, Bogor, Jawa Barat.
Setelah lulus, penulis bekerja di PT Panen Djaya Abadi, Jakarta dan PT
Guardhian Pharmatama, Tangerang. Tahun 2007, penulis masuk IPB melalui tes
pada Program Sarjana Kimia Penyelenggaraan Khusus, Fakultas Matematika dan
Ilmu Pengetahuan Alam.
ABSTRAK
HIKMATULLAH. Pengembangan Metode Spektrofotometri UV-Vis untuk
Penetapan Kadar Antibiotik Sefadroksil. Dibimbing oleh DUDI TOHIR dan RUDI
HERYANTO.
Antibiotik sefadroksil dihasilkan oleh jamur Cephalosporium acremonium dan
telah digunakan secara luas. Pada penelitian ini, dikembangkan metode penetapan
kadar sefadroksil dalam kapsul obat dengan menggunakan spektrofotometer
ultraviolet-tampak (UV-Vis). Metode ini lebih cepat, mudah, murah, dan terbukti
memberikan hasil pengukuran yang tidak berbeda nyata dengan metode
kromatografi cair kinerja tinggi yang menjadi rujukan United States
Pharmacopeia, untuk waktu hidrolisis selama 30 menit. Panjang gelombang
maksimum ialah 355.5 nm untuk pelarut akuades dan 351.8 nm untuk pelarut
bufer fosfat pH 5. Validasi metode spektrofotometri UV-Vis menghasilkan
akurasi, presisi, linearitas, limit deteksi dan kuantitasi yang memenuhi persyaratan
International Conference on Harmonization. Secara keseluruhan, pelarut akuades
memberikan hasil validasi yang lebih baik daripada pelarut bufer fosfat pH 5.
ABSTRACT
HIKMATULLAH. Development of UV-Vis Spectrophotometric Method for
Determination of Cefadroxil in antibiotic. Supervised by DUDI TOHIR and RUDI
HERYANTO.
Cefadroxil antibiotic is produced by Cephalosporium acremonium fungi and
has been utilized widely. In the research, determination of cefadroxil in drug
capsule by using ultraviolet-visible (UV-Vis) spectrophotometer was developed.
This method is faster, easier, cheaper, and was proven to give results which were
not different with the high performance liquid chromatograpy method which is
used as the reference method in the Unites States Pharmacopeia for 30 minutes of
hydrolysis time. The maximum wavelength was 355.5 nm in aquadest and 351.6
nm in phosphate buffer pH 5. Validation of the UV-Vis spectrophotometric
method resulted accuration, precision, linearity, detection limit and quantitation
limit complied with International Conference on Harmonization regulations.
Overall, aquadest gave better validation results as solven than phosphate buffer
pH 5.
DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR TABEL ........................................................................................
DAFTAR GAMBAR ...................................................................................
DAFTAR LAMPIRAN ................................................................................
PENDAHULUAN ........................................................................................
BAHAN DAN METODE
Bahan dan Alat ...................................................................................
Pemilihan Pelarut Standar dan Sampel ...............................................
Validasi Metode Spektrofotometri UV-Vis .........................................
Pengukuran Sefadroksil dengan Metode KCKT ...............................
HASIL DAN PEMBAHASAN
Spektrum Sefadroksil dalam Kapsul Obat ...........................................
Kadar Sefadroksil dengan Metode Spektrofotometri UV-Vis ............
Kadar Sefadroksil dengan Metode KCKT ..........................................
Perbandingan Metode Spektrofotometri UV-Vis dengan KCKT ........
Hasil Validasi Metode Spektrofotometri UV-Vis ...............................
vii
vii
viii
1
1
1
1
2
2
3
4
4
5
SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan ..............................................................................................
Saran ....................................................................................................
6
6
DAFTAR PUSTAKA ...................................................................................
7
LAMPIRAN ..................................................................................................
8
DAFTAR TABEL
1
2
3
4
Halaman
Serapan sampel sefadroksil-KOH 1 N ..........................................................
3
Kadar sefadroksil dalam sediaan kapsul obat antobiotik ...............................
4
Hasil uji statistik metode spektrofotometri UV-Vis dan KCKT ..................
5
Hasil validasi metode spektrofotometri UV-Vis ...........................................
6
DAFTAR GAMBAR
1
2
Halaman
Spektrum serapan standar sefadroksil dalam akuades dan dalam bufer
fosfat pH 5 tanpa pemanasan ........................................................................
3
Spektrum serapan standar sefadroksil 25 µg/mL dalam akuades dan dalam
bufer fosfat pH 5 setelah pemanasan selama 30 menit dengan KOH 1 N .....
3
1
PENDAHULUAN
Antibiotik adalah senyawa organik yang
dihasilkan oleh spesies mikroorganisme
tertentu dan bersifat toksik bagi spesies
mikroorganisme lain. Sifat toksik senyawa
antibiotik dapat menghambat pertumbuhan
bakteri (efek bakteriostatik) atau langsung
membunuh bakteri (efek bakteriosida)
(Sumardjo
2008).
Sefadroksil
adalah
antibiotik -laktam generasi pertama dari
sefalosporin yang mempunyai aktivitas
antibakteri spektrum luas dan bersifat
bakteriosida, bekerja dengan menghambat
pembentukan dinding sel mikroorganisme
(Tjay & Rahardja 2002).
Secara umum, obat memiliki efek samping
yang tidak diinginkan dan bersifat merugikan
bila berlebihan (Ditjen POM 1996). Untuk itu,
diperlukan pengawasan yang ketat dalam
bidang farmasi, sejak proses pembuatan
hingga penetapan kadar pada produk akhir.
Penetapan kadar sefadroksil telah banyak
dilakukan dengan menggunakan berbagai
teknik analisis, di antaranya kromatografi
lapis tipis dan kromatografi cair kinerja tinggi
(KCKT) (USP 2011).
Salah
satu
metode
lain
yang
dikembangkan untuk penetapan kadar
sefadroksil dalam sediaan farmasi (kapsul)
adalah spektrofotometri ultraviolet-tampak
(UV-Vis). Kelebihan metode ini di antaranya
menghasilkan absorbans maksimum lebih
besar dan analisanya lebih cepat. Shantier et
al. (2011) telah menunjukkan bahwa
penggunaan NaOH memberikan hasil yang
sesuai dengan International Conference on
Harmonisation
(ICH)
of
Technical
Requirement
for
Registration
of
Pharmaceutical for Human Use, namun
puncak serapannya melebar. Penelitian ini
memodifikasi pereaksi basa yang digunakan
menjadi KOH. Larutan yang digunakan juga
dimodifikasi mengikuti metode KCKT
berdasarkan USP (2011). Hasil validasi
metode modifikasi ini diharapkan akan
memenuhi persyaratan ICH.
BAHAN DAN METODE
Bahan dan Alat
Bahan-bahan yang digunakan adalah
kapsul sefadroksil, standar sefadroksil (U.S.
Pharmacopoeia), KH2PO4 (p.a. Merck), pelet
KOH (p.a. Merck), dan akuades.
Alat
yang
digunakan
adalah
spektrofotometer UV-1700 Shimadzu, kuvet
kuarsa 1 cm, instrumen KCKT Prominence
LC20AD Shimadzu, kolom Shim-pack VPODS C18 4.6 mm × 25 cm, neraca analitik,
peralatan kaca, komputer, perangkat lunak UV
Probe solution versi 2.21, perangkat lunak
Microsoft Excel tahun 2007, dan saringan
Nilon 0.02 µm.
Pemilihan Pelarut Standar dan Sampel
Sepuluh
mg
standar
sefadroksil
dimasukkan ke dalam gelas piala dan
ditambahkan 20 mL akuades kemudian diaduk
dengan pengaduk magnetik selama 30 menit.
Larutan dipindahkan ke labu takar 100 mL
dan ditepatkan volumenya dengan akuades.
Larutan stok standar dengan konsentrasi 100
µg/mL tersebut diencerkan menjadi 10, 20,
30, 40, dan 50 µg/mL, masing-masing
ditambahkan KOH 1 N dan dimasukkan ke
dalam penangas air selama 15, 30, 45, dan 60
menit.
Larutan sampel dibuat dengan menimbang
serbuk kapsul setara dengan 25 mg sefadroksil
dan dimasukkan ke dalam gelas piala,
kemudian ditambahkan 60 mL akuades dan
diaduk dengan pengaduk magnetik. Larutan
dimasukkan ke dalam labu takar 100 mL dan
ditepatkan volumenya dengan akuades.
Larutan stok sampel dengan konsentrasi 250
µg/mL tersebut diencerkan menjadi 25
µg/mL, lalu ditambahkan KOH 1 N dan
dimasukkan ke dalam penangas air selama 15,
30, 45, dan 60 menit
Larutan standar dan sampel juga dibuat
dalam pelarut bufer fosfat pH 5. Prosedur
pembuatannya sama seperti di atas, dengan
akuades digantikan oleh bufer tersebut.
Sampel adalah kapsul sefadroksil dengan label
klaim per kapsul mengandung 500 mg
sefadroksil.
Semua larutan standar dan
sampel diukur serapannya pada panjang
gelombang maksimum.
Validasi Metode Spektrofotometri UV-Vis
Akurasi
Serbuk kapsul setara dengan 5 mg
sefadroksil ditimbang dan dimasukan ke
dalam gelas piala, kemudian ditambah 60 mL
akuades dan diaduk dengan pengaduk
magnetik. Larutan dimasukan ke dalam labu
takar 100mL dan ditepatkan volumenya
dengan akuades. Sepuluh mL larutan sampel
50 µg/mL ini dipipet masing-masing ke dalam
3 buah labu takar berukuran 50 mL, lalu
ditambahkan larutan standar 100 µg/mL
sebanyak 10, 15, dan 20 mL, dan ditera
2
dengan pelarut. Pengukuran dilakukan 3 kali
ulangan. Nilai perolehan kembali dihitung
dengan rumus
Perolehan kembali (%) =
× 100%
Keterangan:
a = konsentrasi sampel + standar yang
terukur (mg)
b = konsentrasi sampel (mg)
c = konsentrasi standar teoretis yang
ditambahkan (mg)
Presisi
Larutan
sampel
diukur
dengan
spektrofotometer UV-Vis sebanyak 9 ulangan
pada hari yang sama. Nilai presisi diukur
dengan menghitung persentase simpangan
baku relatif (% RSD) data dengan
menggunakan rumus
2
=
=1
n–1
RSD (%) =
× 100%
Keterangan :
s
= simpangan baku
RSD = simpangan baku relatif
xi
= kadar sefadroksil tiap pengulangan
= rerata kadar sefadroksil
n
= jumlah ulangan
Linearitas
Setiap konsentrasi larutan standar diukur
sebanyak 6 ulangan pada kondisi optimum
dan ditentukan persamaan garisnya dengan
metode regresi linear (y = a + bx). Peubah a
menyatakan intersep dan b adalah kemiringan
garis. Linearitas kurva kalibrasi dilihat dari
nilai koefisien korelasi (r).
Limit Deteksi dan Limit Kuantitasi
Persamaan linear yang diperoleh pada uji
linearitas digunakan untuk menghitung limit
deteksi dan limit kuantitasi. Limit deteksi dan
limit kuantitasi dihitung dari rerata
kemiringan garis dan simpangan baku intersep
kurva standar tersebut dengan rumus sebagai
berikut:
Limit deteksi = 3.3
Limit kuantitasi = 10
Keterangan:
Sa = Simpangan baku intersep
b = Rerata kemiringan
Pengukuran Sefadroksil
dengan Metode KCKT
Fase gerak ialah larutan bufer fosfat pH 5,
disiapkan dengan melarutkan 13.6 g KH2PO4
dalam 2 L akuades lalu diatur ke pH 5 dengan
KOH 10 N yang dicampur dengan asetonitril
dengan nisbah 960:40. Larutan disaring
dengan saringan nilon sebelum digunakan.
Kolom yang dipakai berukuran 4.6 mm × 250
mm dengan fase diam C18, panjang
gelombang deteksi 230 nm, dan laju alir 1.5
mL/menit.
Standar dibuat dengan menimbang secara
saksama sefadroksil lalu dilarutkan dalam
larutan bufer fosfat pH 5 hingga diperoleh
konsentrasi sekitar 1.06 mg/mL, dan disaring
dengan membran nilon. Sebanyak 10 kapsul
dikeluarkan
isinya,
dicampurkan,
dihomogenkan dengan mortar. Serbuk obat ini
ditimbang setara dengan 212 mg sefadroksil
ke dalam labu ukur 200 mL dan ditambahkan
100 mL bufer fosfat pH 5 kemudian di kocok
selama 5 menit. Larutan ditera dengan bufer
fosfat pH 5, disaring dengan membran nilon.
Larutan standar dan sampel diinjeksikan ke
dalam sistem KCKT sebanyak 10 µL dengan
kondisi kerja yang sama.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Spektrum Sefadroksil dalam Kapsul Obat
Dalam
penelitian
ini,
sefadroksil
dihidrolisis dalam pelarut akuades dan bufer
fosfat pH 5 yang lazim digunakan pada
pemisahan secara KCKT (USP 2011).
Pereaksi basa yang digunakan untuk hidrolisis
ialah KOH. Sebelumnya, Shantier et al.
(2011) telah melaporkan hidrolisis sefadroksil
menggunakan pereaksi NaOH dan akuades.
KOH digunakan dalam penelitian ini karena
merupakan basa kuat juga dan diharapkan
memberikan spektrum yang lebih baik
dibandingkan dengan menggunakan NaOH
yang spektrumnya melebar. Diagram alir
penelitian terdapat pada Lampiran 1.
Gambar 1 menunjukkan spektrum serapan
standar sefadroksil menggunakan 2 pelarut.
Terdapat 2 puncak, yaitu puncak A (229 nm
untuk akuades dan 228 nm untuk bufer fosfat
pH 5) dan puncak B (263 nm untuk akuades
dan 262 nm untuk bufer fosfat pH 5).
3
Berdasarkan USP (2011), panjang gelombang
sefadroksil dalam akuades ialah 263 nm,
maka puncak B merupakan serapan
sefadroksil. Serapan puncak B lebih rendah
dibandingkan dengan puncak A. Hal ini akan
mengakibatkan sensitivitas pengukuran tidak
baik pada konsentrasi rendah.
A
B
Gambar 1 Spektrum serapan standar sefadroksil dalam akuades (merah) dan
dalam bufer fosfat pH 5 (biru)
tanpa pemanasan.
Setelah dihidrolisis dengan KOH 1 N dan
dipanaskan dalam akuades 98 oC, kedua
pelarut memberikan spektrum serapan yang
lebih baik (Gambar 2), bila dibandingkan
dengan spektrum setelah dihidrolisis dengan
NaOH (Shantier et al. 2011). Terbentuk
serapan tunggal yang lebih kuat intensitasnya .
Puncak A pada Gambar 1 bergeser sebagai
akibat pemutusan ikatan C-N pada cincin
ß-laktam (Lampiran 2). Hasil ini serupa
dengan hasil penelitian Ivama et al. (1999)
dalam menentukan kadar sefaklor dalam
sediaan farmasi, yaitu puncak kedua pada
sefaklor menghilang setelah aminolisis dan
bergeser serapan maksimumnya ke 340 nm.
Lampiran 3 dan 4 menunjukkan spektrum
serapan
berbagai
konsentrasi
standar
sefadroksil pada pelarut akuades dan pelarut
bufer fosfat pH 5 dengan berbagai waktu
pemanasan.
Gambar 2 Spektrum serapan standar sefadroksil 25 µg/mL dalam akuades
(merah) dan dalam bufer fosfat
pH 5 (biru) setelah pemanasan selama 30 menit dengan KOH 1N.
Hidrolisis sefadroksil dengan KOH
menghasilkan larutan berwarna kuning yang
memberikan serapan maksimum 355.5 nm
pada pelarut akuades dan 351.6 nm pada
pelarut bufer fosfat pH 5. Perubahan warna
larutan menjadi kuning menunjukkan bahwa
proses hidrolisis telah berhasil. Pemutusan
ikatan C-N pada cincin ß-laktam mengubah
hibridisasi sp3 pada N menjadi sp2 dan proses
ini
disertai
eksitasi
elektron
yang
memunculkan warna kuning. Hidrolisis
ß-laktam dimungkinkan karena memiliki
regangan sudut yang besar. Atom karbon
karbonil sp2 secara normal memiliki sudut
ikatan 120o, sedangkan sudut ikatan amida
dalam cincin ß-laktam mendekati 90o
(Cairns 2004). Hasil ini serupa dengan hasil
penelitian Susidarti et al. (2008) dalam
menentukan kadar sefadroksil dalam sediaan
farmasi, yaitu perubahan larutan menjadi
kuning oleh etil asetoasetat dan formaldehida.
Selama hidrolisis sampel, intensitas
serapan meningkat hingga menit ke-45
(Tabel 1). Efek hiperkromik ini berasal dari
gugus auksokrom OH fenolik (Cairns 2004).
Tabel 1 Serapan sampel sefadroksil-KOH 1 N
Serapan
Waktu pemanasan (menit)*
15
30
45
60
0.4422 0,5668 0.6713 0.6367
Akuades
Bufer
fosfat
0.4792 0.5582 0.6717 0.6218
pH 5
Keterangan: *= rerata dari 9 ulangan presisi
Kadar Sefadroksil dengan Metode
Spektrofotometri UV-Vis
Kadar sefadroksil dalam kapsul obat
ditentukan dengan spektrofotometri UV-Vis
pada panjang gelombang maksimum, yaitu
355.5 nm untuk pelarut akuades dan 351.6 nm
untuk pelarut bufer fosfat pH 5. Rentang
konsentrasi standar yang digunakan adalah
10−50
g/mL. Lampiran 5 dan 6
menunjukkan persamaan kurva standar yang
diperoleh pada berbagai waktu pemanasan,
berturut-turut dalam kedua pelarut tersebut.
Penentuan konsentrasi sefadroksil dalam
sampel dilakukan dengan metode standar
eksternal, yaitu standar diukur terpisah dengan
sampel (Harvey 2000). Semua nilai koefisien
korelasi yang didapat memenuhi syarat ICH,
yaitu lebih besar dari 0.9970. Hasil ini
menunjukkan bahwa metode spektrofotometri
UV-Vis mampu memberikan hasil uji yang
proporsional dengan konsentrasi sefadroksil
dalam sampel.
4
Tabel 2 menunjukkan kadar sefadroksil
dalam sediaan kapsul obat yang diperoleh dari
9 ulangan dengan spektrofotometer UV-Vis.
Larutan dalam kedua pelarut memiliki kisaran
kadar 503.1 hingga 504.6 mg/kapsul.
Lampiran 7 dan 8 menunjukkan perhitungan
kadar sefadroksil tersebut.
Kadar Sefadroksil dengan Metode KCKT
(USP 2011)
Metode KCKT yang merujuk pada USP
(2011)
digunakan
sebagai
metode
pembanding
untuk
penetapan
kadar
sefadroksil. Konsentrasi standar sefadroksil
yang digunakan adalah 5, 10, dan 15 g/mL,
sedangkan sampel dibuat setara dengan 10
g/mL, disiapkan sebanyak 6 kali ulangan.
Lampiran
9
dan
10
menunjukkan
kromatogram standar dan sampel sefadroksil.
Lampiran 11 menunjukkan waktu retensi
dan luas puncak standar dan sampel
sefadroksil. Waktu retensi sefadroksil berada
di sekitar menit ke-3.3. Sedikit perbedaan
waktu antara standar dan sampel terjadi
karena terdapat perbedaan matriks di antara
keduanya. Kurva kalibrasi dibuat sebagai
hubungan konsentrasi standar dengan luas
puncak yang dihasilkan. Persamaan garis yang
diperoleh adalah y = -336887 + 2542421.2x.
Nilai koefisien korelasi yang didapat juga
sesuai dengan ICH, yaitu lebih besar dari
0.9970, menunjukkan bahwa metode KCKT
juga mampu memberikan hasil uji yang
proporsional dengan konsentrasi sefadroksil
dalam sampel.
Perbandingan luas puncak kromatogram
standar dan sampel menghasilkan kadar
sefadroksil dalam sampel kapsul obat sebesar
505.1 mg/kapsul. Nilai tersebut diperoleh dari
rerata 6 kali ulangan.
Perbandingan Metode Spektrofotmetri
UV-Vis dengan KCKT
Metode spektrofotometri UV-Vis teknik
pengerjaannya lebih mudah dibandingkan
dengan metode KCKT (sebagai rujukan).
Metode alternatif ini didapati memberikan
hasil yang sama baiknya dengan metode
KCKT. Pengujian statistik dilakukan dengan
uji beda nyata, dengan membandingkan
varians dan rerata sampel dari kedua metode.
Uji-F membandingkan ketelitian kedua
metode dan mengukur varians, sedangkan ujit membandingkan ketepatan kedua metode
dan mengukur rerata.
Hasil uji-F menunjukkan bahwa nilai
F hitung lebih kecil daripada F tabel (Tabel 3).
Artinya, varians yang dihasilkan dengan
metode spektrofotometri UV-Vis tidak
berbeda nyata dengan metode KCKT.
Sementara itu, uji-t tidak berpasangan
mendapatkan nilai thitung lebih kecil daripada
ttabel hanya pada waktu pemanasan 30 menit
(Tabel 3). Nilai thitung pada menit ke-15, 45,
dan 60 lebih besar daripada ttabel. Dapat
disimpulkan bahwa nilai rerata yang
dihasilkan kedua metode berbeda nyata pada
15, 45, dan 60 menit, tetapi tidak berbeda
nyata pada 30 menit waktu pemanasan. Uji
beda nyata ini dilakukan pada taraf
kepercayaan 95%. Lampiran 12 menunjukkan
perhitungan uji distribusi F dan uji t.
Hasil uji statistik menyatakan bahwa hasil
hidrolisis memberikan varians yang sama
untuk semua perlakuan, tetapi menunjukkan
perbedaan rerata pada menit ke-15, 45, dan
60. Berdasarkan hasil tersebut kondisi yang
baik untuk hidrolisis ialah 30 menit yang
memberikan varians yang sama dan tidak
berbeda nyata hasilnya bila dibandingkan
dengan metode KCKT.
Tabel 2 Kadar sefadroksil dalam sediaan kapsul obat antibiotik
Spektrofotometer UV-Vis
Parameter
15 menit
Akuades
30 menit 45 menit
KCKT
60 menit
15 menit
504.1
504.1
504.0
504.5
504.2
504.1
505.1
0.9974
0.9993
0.9980
0.9998
0.9998
0.9955
0.9999
0.9998
0.
1.1404
0.5124
0.5360
0.9999
0.8485
0.5671
0.5125
0.9456
0.12
0.22
0.10
0.10
0.20
0.17
0.11
0.10
0.19
Kadar
sefadroksil
(mg/kapsul)
503.1
504.1
Koefisien
korelasi (r)
0.9968
Simpangan baku
(SD)
Simpangan baku
relatif (RSD)
Bufer fosfat pH 5
30 menit 45 menit
60 menit
5
Tabel 3 Uji statistik metode spektrofotometri UV-Vis dan KCKT
Larutan
Akuades
Bufer fosfat pH 5
Waktu (menit)
Uji F
Fhitung
Uji t
F tabel
thitung
15
1.593
30
0.75
45
1.269
60
1.024
2.289
15
1.271
2.426
30
1.243
45
2.875
60
2.591
Hasil Validasi Metode Spektrofotometri
UV-Vis
Validasi adalah suatu tindakan untuk
membuktikan bahwa suatu proses atau metode
dapat memberikan hasil yang konsisten sesuai
dengan spesifikasi yang telah ditetapkan dan
terdokumentasi dengan baik (Valcarcel 2000).
Keabsahan hasil yang didapatkan dari
pengembangan
metode
spektrofotometri
UV-Vis perlu dievaluasi dengan melakukan
validasi metode. Berdasarkan hasil uji
statistik, validasi hanya dilakukan pada menit
ke-30. Parameter validasi meliputi akurasi,
presisi, linearitas, limit deteksi, dan limit
kuantitasi.
Akurasi
Akurasi atau ketepatan metode analisis
ditentukan dengan metode penambahan
standar dan dinyatakan sebagai perolehan
kembali (%). Standar sefadroksil sebanyak
1.0, 1.5, dan 2.0 mg ditambahkan ke dalam
sampel obat yang berisi 0.5 mg sefadroksil.
Perolehan kembali pada pelarut akuades
berkisar 99.52−100.30%, sedangkan dalam
pelarut bufer fosfat pH 5 99.56−100.58%
(Tabel 4). Hasil ini sesuai dengan yang
disyaratkan oleh ICH, yaitu 98−102%, yang
menunjukkan bahwa metode penetapan kadar
sefadroksil secara spektrofotometri UV-Vis
telah memiliki akurasi yang tinggi dengan
hasil pengukuran dekat dengan nilai
sebenarnya. Lampiran 12 menunjukkan
perhitungan akurasi pada pelarut akuades dan
bufer fosfat pH 5.
Presisi
Presisi menggambarkan kedekatan nilai
antara serangkaian pengukuran yang didapat
dari sampel yang homogen pada kondisi
tertentu (ICH 1996). Nilai presisi merupakan
ukuran sebaran data di sekitar nilai tengahnya
ttabel
4.763
3.687
3.687
2.014
2.448
1.448
2.244
2.160
2.160
2.398
dan lazim dituliskan sebagai simpangan baku
relatif (RSD) dari sederet pengukuran (Meier
& Z nd 2000).
Tabel 4 menunjukan nilai presisi yang
didapatkan dari 9 kali pengukuran larutan
sampel 25 µg/mL. Dalam akuades, nilainya
0.2262% dan dalam bufer fosfat pH 5,
0.1683%. Hasil ini menunjukkan bahwa
analisis
antibiotik
sefadroksil
teliti
berdasarkan kriteria yang ditetapkan ICH
(1996), karena nilai RSD di bawah 2%.
Ketelitian yang tinggi menunjukkan bahwa
hasil analisis oleh analisis yang sama dalam
periode
kerja
tertentu
dan
dengan
menggunakan larutan dan peralatan yang
sama, memiliki keterulangan yang baik.
Linearitas
Linearitas menunjukkan kemampuan suatu
prosedur analisis untuk memperoleh hasil
pengujian yang sesuai dengan konsentrasi
analit dalam sampel (ICH 1996). Nilai
linearitas dievaluasi sebagai koefisien korelasi
(r).
Koefisien
korelasi
menunjukkan
hubungan antara jumlah atau konsentrasi
sampel dan respons dari persamaan kurva
regresi linear (y = a + bx).
Penentuan linearitas dilakukan dengan 5
konsentrasim sampel yaitu 10, 20, 30, 40, dan
50 g/mL, masing-masing sebanyak 6 kali
ulangan. Pada pelarut akuades, koefisien
korelasi berkisar 0.9997 dan pada pelarut
bufer fosfat pH 5 berkisar 0.9993 (Tabel 4).
Nilai koefisien korelasi yang tinggi
menunjukkan hubungan yang linear antara
sinyal detektor yang terukur dan jumlah sefadroksil dalam sampel. Nilai koefisien korelasi
yang didapatkan positif, maka kedua peubah
mempunyai hubungan searah (Supranto 2001).
Nilai kemiringan garis (a) menyatakan
sensitivitas suatu metode. Nilai kemiringan
yang kecil menunjukkan bahwa perubahan
konsentrasi yang kecil tidak terlalu
6
Tabel 4 Hasil validasi metode spektrofotometri UV-Vis
Akuades
Bufer fosfat
pH 5
Standar
ICH
Simpulan
0.2262
0.1683
0–2
Kedua pelarut memberikan hasil
yang teliti
Akurasi (%)
a) Standar 1.0 mg
99.52
100.13
b) Standar 1.5 mg
c) Standar 2.0 mg
100.30
100.07
100.58
99.55
98 – 102
Hasil pengukuran kedua pelarut
dekat dengan nilai sebenarnya
Parameter
Presisi (% RSD)
Linearitas
Koefisien korelasi
0.9997
0.9993
0.9970
Limit deteksi (µg/mL)
0.2164
0.7087
–
Limit kuantasi (µg/mL)
0.6557
2.1474
–
berpengaruh terhadap sinyal detektor yang
dihasilkan. Nilai intersep (b) menyatakan
pengaruh matriks pada larutan. Nilai intersep
yang semakin jauh dari nol menandakan
pengaruh matriks dalam larutan yang semakin
besar. Matriks memengaruhi kemampuan
suatu metode untuk mengukur konsentrasi
terkecil. Hal ini dapat mengganggu penentuan
analit dalam sampel yang ditentukan.
Lampiran 13 menunjukkan nilai a dan b yang
relatif kecil, yang menunjukkan bahwa
metode ini cukup sensitif dan pengaruh
matriks tidak signifikan.
Limit Deteksi dan Limit Kuantitasi
Limit deteksi dan limit kuantitasi
ditentukan dari persamaan regresi linear rerata
hasil uji linearitas. Limit deteksi merupakan
jumlah atau konsentrasi terkecil analit yang
dapat dideteksi dan secara statistis dapat
dibedakan dari sinyal blangko. Limit
kuantitasi adalah jumlah atau konsentrasi
terkecil analit yang dapat ditentukan dan dapat
dipercaya (Valcarcel 2000). Limit deteksi dan
kuantitasi dihitung dari nilai simpangan baku
intersep dan rerata kemiringan dari persamaan
regresi linear rerata.
Limit deteksi metode spektrofotometri
UV-Vis pada pelarut akuades ialah 0.2164
g/mL (Tabel 4). Nilai ini menunjukkan
bahwa pada konsentrasi kurang dari 0.2164
g/mL keberadaan sefadroksil menjadi tidak
terdeteksi dalam akuades. Limit deteksi pada
pelarut bufer fosfat pH 5 lebih tinggi, yaitu
0.7087 g/mL.
Kedua pelarut menunjukkan hubungan linear antara sinyal yang
terukur dan jumlah sefadroksil
dalam sampel .
Konsentrasi terendah pada kedua
pelarut yang dapat membedakan
sinyal sefadroksil dan blangko
Konsentrasi terendah pada kedua
pelarut yang memberikan ketelitian dan ketepatan yang baik
Nilai limit kuantitasi diperoleh sebesar
0.6557 g/mL pada pelarut akuades dan
2.1476 g/mL pada pelarut bufer fosfat pH 5.
Konsentrasi analit yang terukur di bawah nilai
ini akan memberikan ketelitian dan ketepatan
yang tidak baik. Lampiran 14 menunjukkan
perhitungan limit deteksi dan limit kuantitasi.
SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Metode spektrofotometri UV-Vis dengan
hidrolisis selama 30 menit dapat digunakan
dalam penetapan kadar sefadroksil dalam
kapsul
obat
antibiotik.
Metode
ini
memberikan hasil pengukuran yang tidak
berbeda nyata dengan metode KCKT. Hasil
validasi metode spektrofotometri UV-Vis
menghasilkan akurasi, presisi, linearitas, limit
deteksi dan kuantitasi yang memenuhi
persyaratan ICH. Secara umum, pelarut
akuades memberikan hasil validasi yang lebih
baik daripada pelarut bufer fosfat pH 5.
Saran
Perlu
dilakukan
analisis
terhadap
parameter-parameter validasi yang lain seperti
intermediet presisi, ketersalinan, spesifisitas,
ketangguhan, dan uji kesesuaian sistem.
7
DAFTAR PUSTAKA
Cairns D. 2004. Intisari Kimia Farmasi.
Puspita RM, penerjemah; Simanjuntak J,
editor. Jakarta: ECG. Terjemahan dari:
Essential of Pharmaceutical Chemistry.
Ditjen POM Depkes RI. 1996. Kompedia
Obat Bebas. Jakarta: Ditjen POM Depkes
RI.
Harvey D. 2000. Modern Analytical
Chemistry. New York: McGraw-Hill.
[ICH] International Conference on Harmonization. 1995. Validation of Analytical
Procedures: Text and Methodology Q2
(R1) [terhubung berkala]. www.ich.org.
[1 Nov 2012]
Ivama VM et al. 1999. Spectrophotometric
determination of cefaclor in pharmaceutical preparations. J Quimica Nova
22:201-204.
Meier PC, Z nd RE. 2000. Statistical Methods
in Analytical Chemistry. Ed ke-2.
New York: J Wiley.
Shantier SW, Gadkariem EA, Ibrahim KE,
El-Obied HA. 2011. Spectrophotometric
determination of cefadroxil in bulk and
dosage form using sodium hydroxide.
E-J Chem 8(3):1314-1322.
Sumardjo D. 2008. Buku Panduan
Kuliah
mahasiswa Kedokteran Program Strata 1
Fakultas Bioeksata. Jakarta: ECG.
Supranto J. 2001. Statistik. Jakarta: Erlangga.
Susidarti RA. Rianti A, Martono S. 2008.
Penetapan kadar sefadroksil secara
spektrofotometri visible menggunakan
pereaksi etil asetoasetat dan formaldehida.
Maj Farmi Indones 19:41-47.
Tjay TH, Rahardja K. 2002. Obat-obat
Penting: Khasiat Penggunaan, dan Efekefek Sampingnya. Ed ke-4. Jakarta: Elex
Media Komputindo.
[USP] United States Pharmacopoiea 2011.
USP 34. Maryland: USP Convention.
Valcarcel M. 2000. Principle of Analytical
Chemistry. Heidelberg: Springer.
DAFTAR LAMPIRAN
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
Halaman
Diagram alir penelitian ..................................................................................
9
Reaksi hidrolisis sefadroksil .. ......................................................................
10
Spektrum serapan standar dan sampel sefadroksil dalam akuades ...............
11
Spektrum serapan standar dan sampel sefadroksil dalam bufer fosfat pH 5..
12
Kurva standar sefadroksil dalam akuades pada 355.5 nm ..........................
13
Kurva standar sefadroksil dalam bufer fosfat pH 5 pada 351.5 nm ...........
14
Kadar sefadroksil dalam kapsul obat dengan metode spektrofotometri
UV-Vis dalam akuades .................................................................................
15
Kadar sefadroksil dalam kapsul obat dengan metode spektrofotometri
UV-Vis dalam bufer fosfat pH 5 ....................................................................
17
Kromatogram standar sefadroksil .................................................................
19
Kromatogram sampel sefadroksil 10 µg/mL .................................................
20
Kadar sefadroksil dalam kapsul obat dengan metode KCKT ........................
21
Uji statistika metode spektrofotometri UV-Vis dan KCKT ...........................
22
Perolehan kembali kadar sefadroksil dalam kapsul obat dengan metode
spektrofotometri UV-Vis pada waktu pemanasan 30 menit ..........................
24
Linearitas kadar sefadroksil dengan metode spektrofotometri UV-Vis .........
25
Limit deteksi (LOD) dan limit kuantitasi (LOQ) sefadroksil dengan
metode spektrofotometri UV-Vis ..................................................................
26
LAMPIRAN
9
Lampiran 1 Diagram alir penelitian
Standar sefadroksil dan
sampel obat
Metode spektrofotometri:
Metode rujukan
USP (2011)
(KCKT)
1. Preparasi standar dan sampel
2. Penentuan panjang gelombang
maksimum
3. Penentuan kurva standar
4. Penentuan kadar sefadroksil
dalam sampel
Uji statistika
Validasi metode:
Akurasi, presisi, linearitas,
limit deteksi, dan kuantitasi
Pelarut: Akuades, bufer fosfat pH 5
Waktu hidrolisis: 15, 30, 45, 60 menit
10
Lampiran 2 Reaksi hidrolisis sefadroksil
S
HO
CONH
+ KOH
NH2
N
H3C CH3
O
Sefadroksil
COOH
O
HO
NH
COOH
HN
C
H
N
O
Turunan 2,5-diketopiperazina
C
C
CH3
CH2SH
11
Lampiran 3 Spektrum serapan standar dan sampel sefadroksil dalam akuades
(a) Waktu pemanasan 15 menit
(b) Waktu pemanasan 30 menit
(c) Waktu pemanasan 45 menit
(d) Waktu pemanasan 60 menit
Keterangan :
=
=
=
=
=
=
Standar sefadroksil 10 µg/mL
Standar sefadroksil 20 µg/mL
Standar sefadroksil 30 µg/mL
Standar sefadroksil 40 µg/mL
Standar sefadroksil 50 µg/mL
Sampel kapsul sefadroksil 25 µg/mL
12
Lampiran 4 Spektrum serapan standar dan sampel sefadroksil dalam bufer fosfat pH 5
(a) Waktu pemanasan 15 menit
(c) Waktu pemanasan 45 menit
Keterangan :
=
=
=
=
=
=
Standar sefadroksil 10 µg/mL
Standar sefadroksil 20 µg/mL
Standar sefadroksil 30 µg/mL
Standar sefadroksil 40 µg/mL
Standar sefadroksil 50 µg/mL
Sampel kapsul sefadroksil 25 µg/mL
(a) Waktu pemanasan 30 menit
(d) Waktu pemanasan 60 menit
13
Waktu pemanasan 15 menit
Konsentrasi
No
Absorbans
(µg/mL)
1
10
0.1340
2
3
4
5
20
30
40
50
0.3629
0.5447
0.7275
0.8972
Waktu pemanasan 45 menit
Konsentrasi
No
(µg/mL)
1
10
2
20
3
30
4
40
5
50
Waktu pemanasan 60 menit
Konsentrasi
No
(µg/mL)
1
10
2
20
3
30
4
40
5
50
Absorbans
0.2289
0.4436
0.6627
0.8867
1.1620
Absorbans
0.2059
0.5226
0.7734
1.0244
1.2902
60
y = - 0.016010 + 0.023093x
r = 0.9974
1,0000
0,5000
0,0000
0
20
40
60
Konsentrasi (µg/mL)
Absorbans
0.2678
0.5357
0.8035
1.0448
1.3392
40
1,5000
Absorbans
10
20
30
40
50
20
Konsentrasi (µg/mL)
1,5000
Absorbans
1
2
3
4
5
y = - 0.034040 + 0.018910x
r = 0.9968
1,0000
0,8000
0,6000
0,4000
0,2000
0,0000
0
y = 0.00263 + 0.026519x
r = 0.9993
1,0000
0,5000
0,0000
0
20
40
60
Konsentrasi (µg/mL)
Absorbans
Waktu pemanasan 30 menit
Konsentrasi
No
(µg/mL)
Absorbans
Lampiran 5 Kurva standar sefadroksil dalam akuades pada 355.5 nm
1,5000
y = - 0.03782 + 0.026704x
r = 0.9980
1,0000
0,5000
0,0000
0
20
40
Konsentrasi (µg/mL)
60
14
Lampiran 6 Kurva standar sefadroksil dalam bufer fosfat pH 5 pada 351.5 nm
1
10
0.1832
2
3
4
5
20
30
40
50
0.3698
0.5729
0.7700
0.9730
Absorbans
Waktu pemanasan 15 menit
Konsentrasi
No
Absorbans
(µg/mL)
1,2000
1,0000
0,8000
0,6000
0,4000
0,2000
0,0000
0
Waktu pemanasan 45 menit
Konsentrasi
No
Absorbans
(µg/mL)
1
2
3
4
5
10
20
30
40
50
0.2408
0.5422
0.8342
1.0311
1.3539
Waktu pemanasan 60 menit
Konsentrasi
No
Absorbans
(µg/mL)
1
2
3
4
5
10
20
30
40
50
0.2466
0.4935
0.7408
0.9856
1.2334
40
60
Absorbans
y = - 0.00775 + 0.022425x
r = 0.9998
0
20
40
60
Konsentrasi (µg/mL)
1,6000
1,4000
1,2000
1,0000
0,8000
0,6000
0,4000
0,2000
0,0000
y = - 0.01409 + 0.027151x
r = 0.9955
Absorbans
0.2139
0.4484
0.6581
0.8905
1.1141
1,2000
1,0000
0,8000
0,6000
0,4000
0,2000
0,0000
0
20
40
60
Konsentrasi (µg/mL)
Absorbans
10
20
30
40
50
20
Konsentrasi (µg/mL)
Waktu pemanasan 30 menit
Konsentrasi
No
Absorbans
(µg/mL)
1
2
3
4
5
y = - 0.02016 + 0.019798x
r = 0.9998
1,4000
1,2000
1,0000
0,8000
0,6000
0,4000
0,2000
0,0000
y = 0.00027 + 0.024657x
r = 0.9999
0
20
40
Konsentrasi (µg/mL)
60
15
Lampiran 7 Kadar sefadroksil dalam kapsul obat dengan metode spektrofotometri UV-Vis dalam
akuades
Waktu pemanasan 15 menit
Ulangan
Bobot obat
(mg)
Absorbans
Konsentrasi
terbaca (µg/mL)
Kadar dalam
1 kapsul (mg)
1
26.90
0.4431
25.2322
503.1343
2
26.90
0.4429
25.2216
502.9229
3
26.90
0.4424
25.1951
502.3945
4
26.80
0.4409
25.1158
502.6819
5
26.80
0.4403
25.0841
502.0475
6
26.90
0.4442
25.2903
504.2928
7
26.90
0.4426
25.2057
502.6059
8
26.80
0.4416
25.1528
503.4225
9
26.80
0.4422
25.1846
504.0589
Rerata
503.0624
Selang kepercayaan
0.6826
Waktu pemanasan 30 menit
1
Bobot obat
(mg)
26.90
0.5668
Konsentrasi
terbaca (µg/mL)
25.2375
2
26.90
0.5666
25.2289
503.0685
3
26.80
0.5648
25.1509
503.3844
4
26.90
0.5682
25.2981
504.4483
5
26.80
0.5644
25.1336
503.0382
6
26.90
0.5683
25.3025
504.5361
7
26.80
0.5683
25.3025
506.4187
8
26.90
0.5673
25.2592
503.6727
9
26.80
0.5662
25.2115
504.5973
Ulangan
Absorbans
Rerata
Kadar dalam
1 kapsul (mg)
503.2399
504.0449
Selang kepercayaan
0.8781
Waktu pemanasan 45 menit
Ulangan
Bobot obat
(mg)
Absorbans
Konsentrasi
terbaca (µg/mL)
Kadar dalam
1 kapsul (mg)
1
26.80
0.6699
25.1620
503.6066
2
26.80
0.6697
25.1544
503.4545
3
26.80
0.6709
25.1997
504.3612
4
26.90
0.6719
25.2374
503.2380
5
26.80
0.6712
25.2110
504.5873
6
26.90
0.6736
25.3015
504.5161
7
26.90
0.6729
25.2751
503.9897
8
26.80
0.6707
25.1921
504.2090
9
26.80
0.6711
25.2072
504.5113
Rerata
Selang kepercayaan
504.0526
0.3945
16
lanjutan Lampiran 7
Waktu pemanasan 60 menit
Ulangan
Bobot obat
(mg)
Absorbans
Konsentrasi
terbaca (µg/mL)
Kadar dalam
1 kapsul (mg)
1
26.80
0.6342
25.1655
503.6767
2
26.90
0.6368
25.2629
503.7464
3
26.80
0.6353
25.2067
504.5013
4
26.90
0.6369
25.2666
503.8202
5
26.90
0.6365
25.2516
503.5211
6
27.00
0.6401
25.3865
504.3362
7
26.90
0.6374
25.2854
504.1951
8
26.80
0.6361
25.2367
505.1017
9
26.90
0.6374
25.2854
504.1951
Rerata
504.1215
Selang kepercayaan
Keterangan :
1 kapsul ~ 500 mg sefadroksil
Bobot 10 kapsul dengan isi
Bobot 10 kapsul kosong
Bobot rerata isi kapsul
Contoh perhitungan:
(Ulangan 1, waktu
pemanasan 60 menit)
Kadar sefadroksil .=.
0.4127
= 6.7302 g
= 1.0981 g
= 0.56321 g
yy .= .-0.03782 + 0.026701x
0.6342 .= .-0.03782 + 0.026701x
0.6342 + 0.037682
x .=
0.026701
.= 25.1655 µg/mL
25.1655 µg
mL
×
1000 mg
1g
×
×
1 mg
1000 µg
500 mg
525 mg
×
100 mL
26.8 mg
×
100 mL
1 mL
× 0.56321 g
.=. 505.5899 mg
.=. 503.6767 mg
t × SD
√n
2.31 × 0.5360
.=.
√9
Selang kepercayaan (taraf kepercayaan 95%, t : 2.31) .=.
.=. 0.4127
17
Lampiran 8 Kadar sefadroksil dalam kapsul obat dengan metode spektrofotometri UV-Vis
dalam bufer fosfat pH 5
Waktu pemanasan 15 menit
Ulangan
Bobot obat
(mg)
Absorbans
Konsentrasi
terbaca (µg/mL)
Kadar dalam
1 kapsul (mg)
1
26.80
0.4790
25.2126
504.6193
2
26.90
0.4803
25.2783
504.0535
3
26.80
0.4779
25.1571
503.5085
4
26.90
0.4811
25.3187
504.8591
5
26.80
0.4766
25.0914
502.1936
6
26.90
0.4802
25.2733
503.9538
7
26.80
0.4781
25.1672
503.7107
8
26.90
0.4811
25.3187
504.8591
9
26.80
25.2025
504.4171
504.0194
0.7699
0.4788
Rerata
Selang kepercayaan
Waktu pemanasan 30 menit
Ulangan
Bobot obat
(mg)
Absorbans
Konsentrasi
terbaca (µg/mL)
Kadar dalam
1 kapsul (mg)
1
26.80
0.5589
25.2687
505.7422
2
26.90
0.5590
25.2731
503.9498
3
26.80
0.5578
25.2196
504.7594
4
26.90
0.5596
25.2999
504.4842
5
26.80
0.5586
25.2553
505.4740
6
26.80
0.5569
25.1795
503.9569
7
26.90
0.5596
25.2999
504.4842
8
26.80
0.5557
25.1260
502.8861
9
26.80
0.5575
Rerata
25.2062
504.4913
504.4698
Selang kepercayaan
0.6533
Waktu pemanasan 45 menit
Ulangan
Bobot obat
(mg)
Absorbans
Konsentrasi
terbaca (µg/mL)
Kadar dalam
1 kapsul (mg)
1
26.80
0.6699
25.1921
504.2090
2
26.90
0.6727
25.2952
504.3905
3
26.80
0.6695
25.1773
503.9128
4
26.90
0.6727
25.2952
504.3905
5
26.90
0.6723
25.2805
504.0974
6
26.90
0.6717
25.2584
503.6567
7
26.90
0.6715
25.2510
503.5091
8
26.80
0.6709
25.2289
504.9456
9
26.90
0.6731
25.3099
504.6836
Rerata
Selang kepercayaan
504.1995
0.4367
18
lanjutan Lampiran 8
Waktu pemanasan 60 menit
1
Bobot obat
(mg)
26.80
0.6212
Konsentrasi
terbaca (µg/mL)
25.1827
2
26.80
0.6212
25.1827
504.0209
3
26.80
0.6217
25.2023
504.4272
4
26.90
0.6227
25.2435
503.3596
5
26.80
0.6219
25.21111
504.5893
6
26.80
0.6213
25.1868
504.1030
7
26.90
0.6231
25.2598
503.6846
8
26.80
0.6215
25.1949
504.2651
9
26.80
0.6220
25.2152
504.6714
Ulangan
Absorbans
Kadar dalam
1 kapsul (mg)
504.0209
Rerata
504.1269
Selang kepercayaan
Keterangan :
1 kapsul ~ 500 mg sefadroksil
Bobot 10 kapsul dengan isi
Bobot 10 kapsul kosong
Bobot rerata isi kapsul
= 6.7302 g
= 1.0981 g
= 0.56321 g
yy = -0.00027 + 0.024657x
0.6212 = -0.000027 + 0.024657x
0.6212 – 0.000027
x=
0.024657
x = 25.1827 µg/mL
Contoh perhitungan:
(Ulangan 1, waktu
pemanasan 60 menit)
Kadar sefadroksil .=.
0.3946
25.1827 µg
1 mg
100 mL
50 mL
×
×
×
× 0.56321 g
mL
1000 µg
26.8 mg
5 mL
×
1000 mg
500 mg
×
.=. 505.5899 mg
1g
525 mg
.=. 504.0209 mg
t × SD
√n
2.31 × 0.5125
.=.
√9
Selang kepercayaan (taraf kepercayaan 95%, t : 2.31) .=.
.=. 0.3946
19
Lampiran 9 Kromatogram standar sefadroksil
3.343
mAU
1000 230nm,4nm (1.00)
900
800
700
600
500
400
300
200
100
0
-100
0.0
1.0
2.0
3.0
4.0
5.0
6.0
7.0
8.0
9.0
min
7.0
8.0
9.0
min
(a) Konsentrasi 5 µg/mL
3.363
mAU
230nm,4nm (1.00)
3500
3250
3000
2750
2500
2250
2000
1750
1500
1250
1000
750
500
250
0
-250
-500
0.0
1.0
2.0
3.0
4.0
5.0
6.0
(b) Konsentrasi 10 µg/mL
3.382
mAU
4000 230nm,4nm (1.00)
3500
3000
2500
2000
1500
1000
500
0
-500
0.0
1.0
2.0
3.0
4.0
5.0
6.0
(c) Konsentrasi 15 µg/mL
7.0
8.0
9.0
min
20
Lampiran 10 Kromatogram sampel sefadroksil 10 µg/mL
3.325
mAU
230nm,4nm (1.00)
3500
3000
2500
2000
1500
1000
500
0
-500
0.0
1.0
2.0
3.0
4.0
5.0
6.0
7.0
8.0
9.0
min
21
Lampiran 11 Kadar sefadroksil dalam kapsul obat dengan metode KCKT
Luas
puncak
9243138
22255487
34667350
Kadar sefadroksil dalam kapsul obat
Waktu retensi Bobot obat
Ulangan
(menit)
(mg)
1
3.325
218
2
3.336
218
3
4
5
6
3.354
3.352
3.363
3.359
216
216
216
216
y = -3368887 + 2542421.2x
r = 0.9998
40000000
Luas puncak
Luas puncak dan standar sefadroksil
Waktu
Konsentrasi
No
retensi
(µg/mL)
(menit)
1
5
3.344
2
10
3.362
3
15
3.364
30000000
20000000
10000000
0
0
5
Luas
puncak
22752306
22661617
Konsentrasi
terbaca (µg/mL)
10.2741
10.2385
Kadar dalam 1 kapsul
(mg)
505.5899
503.8380
22538935
22502523
22525714
22436522
10.1902
10.1759
10.1850
10.1499
506.1043
505.3941
505.8460
504.1027
Rerata
Selang kepercayaan
Keterangan :
1 kapsul ~ 500 mg sefadroksil
Bobot 10 kapsul dengan isi
Bobot 10 kapsul kosong
Bobot rerata isi kapsul
505.1458
0.9916
= 6.7302 g
= 1.0981 g
= 0.56321 g
y .= .-3368887 + 2542421.2x
22752306 .= .-3368887 + 2542421.2x
22752306 + 3368887
x .=
2542421.2
.= 10.2741 µg/mL
Contoh perhitungan:
(Ulangan 1 )
Kadar sefadroksil .=.
10
15
Konsentrasi (µg/mL)
10.2741 µg
mL
×
1000 mg
1g
×
×
1 mg
1000 µg
500 mg
525 mg
×
200 mL
218.0 mg
×
100 mL
1 mL
× 0.56321 g
.=. 505.5899 mg
.=.505.5899 mg
t × SD
√n
2.57 x 0.9456
.=.
√9
Selang kepercayaan (taraf kepercayaan 95%, t : 2.31) .=.
.=. 0.9916
20
22
Lampiran 12 Uji statistika metode spektrofotometri UV-Vis dan KCKT
Uji distribusi F
No
1
Larutan
Waktu (menit)
Akuades
S2
Fhitung
15
0.7492
1.591
30
1.0916
0.750
45
0.5124
3.402
0.9990
0.895
0.9999
0.893
30
0.8485
1.241
45
0.5671
2.777
60
0.5125
3.401
60
2
15
Bufer fosfat pH 5
S1
0.9451
Keterangan: S1 = Simpangan baku metode spektrofotometri UV-Vis
S2 = Simpangan baku metode KCKT
Contoh perhitungan:
(Akuades, 15 menit)
F hitung
.=
.=
(S 1 )2
(S 2 )2
(0.9451)2
(0.7492)2
.= 0.1591
F tabel (derajat bebas; v1 = 5, v2 = 8 pada taraf kepercayaan 95%) = 3.687
F hitung < F tabel (Varians kedua metode tidak berbeda nyata)
Uji perbedaan (uji-t)
No
1
2
Larutan
Akuadest
Bufer fosfat pH 5
Keterangan :
n1
n2
S2pool
Waktu (menit)
S2pool
Spool
thitung
15
0.6890
0.8301
4.763
30
1.0768
1.0377
2.013
45
0.5051
0.7107
2.919
60
0.5203
0.7213
2.694
15
0.9588
0.9792
2.183
30
0.7866
0.8869
1.446
45
0.5415
0.7359
2.240
60
0.5052
0.7108
2.720
= Jumlah sampel KCKT = 6
= Jumlah sampel spektrofotometri UV-Vis = 9
= Varian dari kedua kelompok
23
lanjutan Lampiran 12
Contoh perhitungan:
(Bufer fosfat pH 5, 60 menit)
S 2 pool .=
(n 1 –1)2S 1 2 + (n 2 –1)2S 2 2
(n 1 + n 2 – 2)
(6–1) 0.94512 + (9–1) 0.51252
.=
(6 + 9 – 2)
.= 0.5052
S pool .= 0.7108
t hitung .=
| x1 – x2 |
√n
1
S pool
.+
1
1
n
2
.= |505.1458 – 504.1269|
0.5052
.= 2.270
Derajat bebas =
√
1 .+ 1
6 9
n1 + n2 – 2
=6+9–2
= 13
ttabel dengan derajat bebas = 13 pada taraf kepercayaan 95% = 2.398
thitung < ttabel (tidak berbeda nyata)
24
Lampiran 13 Perolehan kembali kadar sefadroksil dalam kapsul obat dengan metode spektrofotometri UV-Vis pada waktu pemanasan 30 menit
Pelarut akuades
Standar sefadroksil (mg)
Ditambahkan
Terukur
0.9968
1.0031
1.5598
2.0552
Sampel sefadroksil
terbaca (mg)
Perolehan
kembali
Rerata
(%)
Selang
kepercayaan
RSD
(%)
99.52
0.3307
0.13
100.30
0.7743
0.31
100.07
0.7425
0.30
99.37
0.9990
0.5017
99.59
0.9992
99.61
1.5589
99.94
1.5674
0.5017
100.48
1.5671
100.47
2.0554
100.01
2.0511
0.5017
99.80
2.0632
100.39
Pelarut bufer fosfat pH 5
Standar sefadroksil (mg)
Ditambahkan
0.9918
1.5242
2.0132
Terukur
Sampel sefadroksil
terbaca (mg)
0.9958
0.9909
0.9926
1.5329
1.5307
1.5353
2.0082
2.0018
2.0027
Perolehan
kembali
100.40
99.91
100.09
100.57
100.42
100.73
99.75
99.44
99.48
0.5169
0.5169
0.5169
Rerata
Selang
RSD
(%)
kepercayaan
(%)
100.13
0.6177
0.25
100.58
0.3736
0.15
99.55
0.4273
0.17
Contoh perhitungan:
a –b
× 100%
c
2.5251 – 0.51699 100%
.=
×
2.0132
Perolehan kembali (%) .=
.= 99.75%
Keterangan :
a = konsentrasi sampel + konsentrasi standar terukur (mg)
b = konsentrasi sampel (mg)
c = konsentrasi standar yang ditambahkan (mg)
t × SD
√3
4.30 × 0.1721
.=
√3
.= 0.4273
Selang kepercayaan .=
SD
× 100%
Rerata
0.1721
.=
× 100%
99.55
.= 0.17%
Simpangan baku relatif (%) .=
25
Lampiran 14 Linearitas kadar sefadroksil dengan metode spektrofotometri UV-Vis
Serapan standar sefadroksil dalam pelarut akuades
Konsentrasi (µg/mL)
10
20
30
40
50
1
0.2264
0.4481
0.6619
0.8807
1.1609
2
0.2266
0.4443
0.6633
0.8821
1.1671
Absorbans
3
4
0.2269
0.2273
0.4463
0.4454
0.6619
0.6616
0.8861
0.8871
1.1635
1.1659
5
0.2289
0.4436
0.6627
0.8867
1.1620
6
0.2244
0.4444
0.6656
0.8801
1.1619
Serapan standar sefadroksil dalam pelarut bufer fosfat pH 5
Konsentrasi (µg/mL)
10
20
30
40
50
1
0.2125
0.4454
0.6536
0.8870
1.1146
2
0.2115
0.4489
0.6609
0.8820
1.1150
Absorbans
3
4
0.2148
0.2139
0.4503
0.4484
0.6591
0.6581
0.8873
0.8905
1.1089
1.1141
5
0.2289
0.4436
0.6627
0.8867
1.1620
Linearitas standar sefadroksil dalam pelarut akuades
Ulangan
1
2
3
4
5
6
Rerata
Simpangan baku
Selang kepercayaan
=
=
=
Persaman garis (y = a+ bx)
a
b
r
-0.014880
0.023016
0.9970
-0.018960
0.023188
0.9967
-0.016960
0.023130
0.9973
-0.018210
0.023189
0.9971
-0.016010
0.023093
0.9974
-0.017930
0.023107
0.9972
-0.017158
0.023121
0.9971
0.001516
0.000065
0.000248
1.59 × 10-3 6.82 × 10-5
2.60 × 10-4
Linearitas standar sefadroksil dalam pelarut bufer fosfat pH 5 pada 30 menit
Ulangan
1
2
3
4
5
6
Rerata
Simpangan baku
Selang kepercayaan
Contoh perhitungan :
(Pelarut bufer fosfat pH 5)
=
=
=
Persaman garis (y = a+ bx)
a
b
r
-0.011120
0.022458
0.9997
-0.008370
0.022401
0.9997
-0.003480
0.022252
0.9997
-0.007750
0.022425
0.9998
-0.016010
0.023093
0.9974
-0.003240
0.022254
0.9997
-0.008328
0.022481
0.9993
0.004828
0.000313
0.000948
5.06 × 10-3
3.28 × 10-4
9.94 × 10-4
t × SD
√n
2.57 × 0.004828
.=.
√6
Selang kepercayaan (taraf kepercayaan 95%, t : 2.57) .=.
.=. 5.06 × 10-3
6
0.2140
0.4513
0.6595
0.8877
1.1085
26
Lampiran 15 Limit deteksi (LOD) dan limit kuantitasi (LOQ) sefadroksil dengan metode spektrofotometri UV-Vis
Intersep (a)
Parameter
Kemiringan (b)
Akuades
Bufer fosfat pH 5
Akuades
Bufer fosfat pH 5
Rerata
-0.017158
-0.008328
0.023121
0.022481
Simpangan baku
0.001516
0.004828
0.000065
0.000313
LOD
.= 3.3 ×
Sa
b
0.001516
.= 3.3 ×
0.023121
.= 0.2163 µg/mL
LOQ
.=
.=
Sa
b
0.001516
10 ×
0.023121
10 ×
.= 0.6557 µg/mL