PRODUKSI, PEMURNIAN PARSIAL, DAN

PRODUKSI, PEMURNIAN PARSIAL, DAN KARAKTERISASI
L-ASPARAGINASE DARI BAKTERI TERMOFILIK
Bacillus licheniformis STRAIN HSA3-1a
PRODUCTION, PARTIAL PURIFICATION AND CHARACTERIZATION
OF L-ASPARAGINASE FROM THE THERMOPHILIC
BACTERIA Bacillus licheniformis STRAIN HSA3-1a
Abdul Muis Patta1, Ahyar Ahmad2 dan Hasnah Natsir3
1
Mahasiswa Program Magister Kimia, Fakultas Matematika Dan Ilmu Pengetahuan Alam,
Universitas Hasanuddin, Makassar
2Biokimia dan Bioorganik, Fakultas Matematika Dan Ilmu Pengetahuan Alam,
Universitas Hasanuddin, Makassar
3
Biokimia, Fakultas Matematika Dan Ilmu Pengetahuan Alam,
Universitas Hasanuddin, Makassar
Alamat Korespondensi:
Abdul Muis Patta
Jl. Tamalate 3 Stapak 51 No. 2
Perumnas Makassar, 90222
HP : 081342993996
Email : [email protected]
Abstrak
L-Asparaginase memberikan manfaat yang besar pada terapi kanker terutama pada leukemia limfoblastik
akut. L-Asparaginase juga terbukti dapat menurunkan kandungan akrilamida di dalam makanan. Banyak
penelitian dilakukan untuk menelusuri sumber potensial produksi L-Asparaginase dari bakteri termofilik
untuk memperoleh L-Asparaginase dengan aktivitas dan stabilitas yang tinggi. Tujuan penelitian adalah
melakukan isolasi, pemurnian, dan karakterisasi L-Asparaginase yang diproduksi dari Bacillus
licheniformis Strain HSA3-1a. Penelitian ini diawali dengan menguji B. licheniformis HSA3-1a dalam
medium skrining produksi L-Asparaginase. L-Asparaginase yang telah diisolasi dan dimurnikan lalu
dilakukan uji aktivitas dan karakterisasi. Aktivitas L-Asparaginase ditentukan secara kolorimetri dengan
mengukur jumlah amoniak yang dihasilkan dari katalisis asparaginase menggunakan reagen Nessler. Satu
unit L-Asparaginase (IU) didefenisikan sebagai jumlah enzim L-Asparaginase yang mengkatalisis
pembentukan satu µmol amoniak permenit pada kondisi pengujian. Hasil penelitian menunjukkan bahwa
B. licheniformis HSA3-1a dapat memproduksi L-Asparaginase ekstraseluler secara maksimum pada
konsentrasi asam amino L-Asparagin 2% dalam medium fermentasi dan waktu inkubasi 48 jam.
L-Asparaginase memiliki aktivitas yang optimum pada pH 8 suhu 50oC dengan aktivitas spesifik 616,26
IU/mg protein serta stabil pada suhu dan pH optimum selama 60 menit.
Kata Kunci : L-Asparaginase, Bacillus licheniformis Strain HSA3-1a, aktivitas spesifik
Abstract
L-Asparaginase gives a great benefit in the cancer treatment, especially in acute lymphoblastic
leukemia. L-Asparaginase is also proven to reduce the acrylamide content in the foods. The objective of
this study was to perform the isolation, purification, and characterization L-Asparaginase produced
from Bacillus licheniformis Strain HSA3-1a. This study begins by examining B. licheniformis HSA3-1a in
the medium screening L-Asparaginase production. L-asparaginase that has been isolated and purified and
then tested the activity and characterization. L-Asparaginase activity is determined by the colorimetric
method by measuring the amount of ammonia produced from L-Asparaginase catalysis using Nessler
reagent. One unit of L-Asparaginase (IU) is defined as the amount of the L-Asparaginase enzyme that
catalyzes the release of one μmol of ammonia per minute at the essay conditions. The results showed
that B. licheniformis HSA3-1a can produce maximum extracellular L-Asparaginase enzyme with 2%
L-Asparagine concentration in fermentation medium and 48 hours incubation. L-Asparaginase has
optimum activity at pH 8 and 50oC temperature with a specific activity of 616.26 IU/mg protein. and
stabilized at the optimum temperature and pH for 60 minutes.
Keywords
: L-Asparaginase, Bacillus licheniformis Strain HSA3-1a, specific activity
PENDAHULUAN
L-Asparaginase memberikan manfaat yang besar pada terapi kanker, terutama
pada leukemia limfoblastik akut. Pemberian L-Asparaginase pada sel kanker dapat
menguraikan L-Asparagin sebagai salah satu komponen nutrisi sel kanker, sehingga
dapat menghambat pertumbuhan sel tersebut (E-Moharam dkk., 2010). L-Asparaginase
juga
terbukti
dapat
menurunkan
kandungan
akrilamida
di
dalam
makanan.
L-Asparaginase dapat mencegah pembentukan akrilamida dengan mengkonversi asam
amino L-Asparagin sebagai prekursornya menjadi bentuk asam amino lain yaitu asam
aspartat yang umum terdapat dalam makanan (Antara, 2009).
L-Asparaginase dapat dijumpai pada banyak jaringan hewan, bakteri, tanaman,
dan dalam serum tikus, namun tidak pada manusia. L-Asparaginase dihasilkan dengan
jumlah yang besar oleh beberapa mikroorganisme; E. coli, Erwinia cartova, Enterobacter
aerogenes, Corynebacterium glutamicum, Candida utilities, Bacillus sp, dan Pisum
sativum (El-Bessoumy dkk., 2004; E-Moharam dkk., 2010).
Produksi enzim dari bakteri termofilik semakin digemari untuk ditelaah lebih jauh
karena bakteri termofilik dapat menghasilkan enzim yang memiliki stabilitas pada suhu
tinggi. Bakteri termofil sering ditemukan pada lingkungan ekstrim sumber air panas suhu
60–80oC antara lain Thermus, Bacillus, Clostridium, Thermoanaerabacter, dan
Desulfomaculum (Tika dkk., 2007; Ahmed dkk., 2007). Bakteri Bacillus sp dapat
digunakan dalam produksi enzim L-Asparaginase telah dipublikasikan oleh E-Moharam
dkk., (2010). Salah satu Bakteri termofil yang diisolasi dari sumber air panas di Sulawesi
Selatan adalah Bacillus licheniformis (Natsir dkk., 2010).
Penelitian ini bertujuan menguji kemampuan B. licheniformis HSA3-1a
memproduksi L-Asparaginase, menentukan konsentrasi optimum substrat L-Asparagin
dalam medium produksi dari bakteri B. licheniformis HSA3-1a untuk memperoleh
aktivitas L-Asparaginase maksimum dan mengkarakterisasi L-Asparaginase dari bakteri
B. licheniformis HSA3-1a.
BAHAN DAN METODE
Bahan dan Alat Penelitian
Penelitian ini menggunakan beberapa bahan yaitu; B. licheniformis HSA3-1a
diperoleh dari Laboratorium Biokimia Fakultas MIPA Universitas Hasanuddin Makassar
yeast ekstrak, pepton, NaCl, L-Asparagin p.a, KH2PO4 p.a, MgSO4.7H2O p.a,
CaCl2.2H2O, bakto agar, indikator fenol merah, (NH4)2SO4 p.a, NH4Cl, kantung selofan,
tris(hidroksimetil)-aminometan p.a, bovine serum albumin, KI, MgCl2 p.a , NaOHp.a,
folin-ciocalteus, Na2CO3, CuSO4.5H2O, natrium kalium tartart, trikloroasetat, karbon
aktif, kertas saring, akuades, dan akuabides.
Peralatan penelitian ini adalah spektrofotomer serapan UV-Vis (Spectronic 20D),
neraca digital analitik, sentripuge dingin, shaker inkubator, inkubator (Memmert),
autoclave (All American Model No. 1925X), cawan petri, tabung reaksi, ose, pipet
mikro, dan alat gelas lainnya yang umum di laboratorium.
Desain Penelitian dan Metode Pengumpulan Data
Penelitian ini diawali dengan pengujian kemampuan B. licheniformis HSA3-1a
memproduksi L-Asparaginase dalam medium pertumbuhan menggunakan indikator fenol
merah. Kemudian ditentukan konsentrasi optimum substrat L-Asparagin dalam medium
produksi dari bakteri B. licheniformis HSA3-1a untuk memperoleh aktivitas
L-Asparaginase maksimum. L-Asparaginase yang diproduksi kemudian diisolasi,
pemurnian parsial dan dikarakterisasi terhadap pengaruh pH, suhu, dan waktu pre
inkubasi terhadap stabilitas L-Asparaginase. Pengumpulan data penelitian berdasarkan
metode kuantitatif eksperimental laboratorium.
Pemurnian Bakteri Bacillus licheniformis
Peremajaan dilakukan dengan menumbuhkan stok bakteri B. licheniformis koleksi
Laboratorium Biokimia Jurusan Kimia FMIPA Universitas Hasanuddin Makassar ke
dalam medium plate pertumbuhan. Koloni yang tumbuh kemudian dibiakkan dalam
medium skrining produksi
L-Asparaginase. Komponen Medium yaitu Yeast Ekstrak
0,05%, Pepton 0,01%, NaCl 0,1%, KH2PO4 0,01%, MgSO4.7H2O 0,01%, L-Asparagin
1,0%, CaCl2 0,01% Amonium Sulfat 0,7%, Bakto Agar 1,5% dan Indikator Fenol Merah
0.005%. Larutan stok fenol merah dibuat 2,5% dalam etanol pH 7 kemudian disaring
dengan kertas saring selulosa 0,2 µm lalu ditambahkan ke dalam medium. L-Asparagin
digunakan sebagai sumber nitrogen. Bakteri diinkubasi selama 24 jam pada suhu 50oC.
Produksi L-Asparaginase oleh bakteri akan melepaskan amoniak sehingga meningkatkan
pH medium pembiakan. Perubahan pH membentuk warna pink disekitar koloni yang
memproduksi L-Asparaginase. Koloni yang tumbuh kemudian diisolasi, dimurnikan, dan
dibiakkan dalam medium kultur produksi L-Asparaginase (Gulati dkk., 1997; Moorthy
dkk., 2010; Ghasemi dkk., 2008; Natsir dkk., 2010).
Penentuan Konsentrasi Substrat L-Asparagin dan Waktu Inkubasi Optimum Produksi
L-Asparaginase
Penentuan konsentrasi optimum substrat L-Asparagin dalam medium produksi
L-Asparaginase dilakukan dengan menginokulasi koloni B. licheniformis HSA3-1a ke
dalam medium cair produksi enzim L-Asparaginase dengan variasi konsentrasi asam
amino L-Asparagin 0.75%, 1.0%, 1.5%, 2.0%, dan 2.5% terhadap volume medium.
Kemudian diinkubasi selama 3x24 jam pada suhu 50oC. Setiap 24 jam dilakukan
sampling untuk mengukur aktivitas L-Asparaginase tiap variasi konsentrasi substrat
L-Asparagin.
Produksi L-Asparaginase
Produksi L-Asparaginase dilakukan dengan membiakkan isolat ke dalam 45 mL
medium produksi dalam labu Erlenmeyer 250 mL. Erlenmeyer diinkubasi pada suhu
50oC dalam inkubator berpenggoyang selama 24 jam 200 rpm. Kemudian 45 mL
inokulum dicampurkan dengan medium produksi steril 500 mL lalu diinkubasi selama
3x24 jam pada suhu 50oC. Komposisi medium produksi yaitu; Yeast Ekstrak 0,05%,
Pepton 0,01%, NaCl 0,1%, KH2PO4 0,01%, MgSO4.7H2O 0,01%, L-Asparagin 2,0%,
CaCl2 0,01% Amonium Sulfat 0,7%. (Gulati dkk., 1997; Moorthy dkk., 2010; Ghasemi
dkk., 2008; Natsir dkk., 2010)..
Isolasi dan Pemurnian L-Asparaginase
Cairan medium hasil kultur sel dipisahkan dari massa sel dengan cara penyaringan.
Filtrat yang mengandung enzim selanjutnya ditambahkan amonium sulfat sedikit demi
sedikit sambil diaduk berdasarkan tingkat kejenuhan amonium sulfat (0-20%, 20-40%,
40-60%, dan 60-80% setelah didiamkan semalam. Endapan yang terbentuk dipisahkan
dengan cara sentrifugasi pada 10000 rpm selama 30 menit suhu 4oC. Endapan yang
diperoleh dilarutkan dalam masing-masing 10 mL buffer Tris-HCl pH 8.
Larutan enzim hasil fraksinasi ammonium sulfat dimasukkan ke dalam kantung
selofan kemudian dicelupkan ke dalam suatu bejana yang berisi akuades secukupnya.
Bejana dialisis ditempatkan di atas pengaduk magnet yang dipasang dengan kecepatan
rendah. Dialisis dilakukan selama 48 jam dengan cara mengganti larutan beberapa kali
dengan larutan buffer tris-HCl pH 8 hingga menunjukkan tidak ada lagi amoniak dalam
larutan buffer hasil dialisis. Pengujian dilakukan pereaksi Nessler yang akan bereaksi
membentuk warna coklat jika terdapat amoniak dalam larutan buffer.
Penentuan Kadar Protein
Penentuan kadar protein dilakukan dengan menggunakan metode termodifikasi
Lowry, dengan menggunakan larutan standar Bovine Serum Albumin.
Uji Aktivitas Enzim L-Asparaginase
Aktivitas L-Asparaginase ditentukan secara kolorimetri berdasarkan metode
Wriston dkk. (1973) pada suhu 50oC menggunakan spektrofotometer UV-Visible dengan
mengukur jumlah amoniak yang dihasilkan dari katalisis L-asparaginase menggunakan
reagen nessler. Campuran reaksi terdiri atas 0,1 mL enzim, 0,2 mL buffer Tris-HCl 0,05
M pH 8,6 dan 1,7 mL L-Asparagin 0,01 M diinkubasi pada suhu optimum selama 10
menit. Reaksi dihentikan oleh penambahan 0,5 mL larutan trikloroasetat 1,5 M. Setelah
sentrifugasi 10.000 rpm, 0,5 mL supernatan diencerkan dengan 8,5 mL akuabides
kemudian ditambahkan 1 mL reagen Nessler. Amonia yang dilepaskan oleh hidrolisis
enzim L-Asparaginase bereaksi dengan reagen Nessler. Lalu ditentukan kadarnya
menggunakan standar ammonium klorida. 1 unit L-Asparaginase (IU) didefenisikan
sebagai jumlah enzim L-Asparaginase yang mengkatalisis pelepasan satu µmol amoniak
permenit pada kondisi pengujian.
Karakterisasi Pengaruh pH terhadap aktivitas Enzim L-Asparaginase
Aktivitas L-Asparaginase dievaluasi pada pH yang beragam. Enzim bebas dan
teramobilisasi masing-masing diinkubasi pada buffer 0,05 M dari pH 6-10. Pada setiap
kondisi, jumlah ammonia yang dilepaskan masing-masing diukur. Buffer yang digunakan
adalah kalium fosfat (pH 6,0-7,0). Tris HCl (pH 8,0-9,0) dan Glisin-NaOH (pH 10-11).
Karakteriasasi Pengaruh temperatur terhadap aktivitas Enzim L-Asparaginase
Aktivitas L-Asparaginase dievaluasi pada temperatur yang beragam pada pH
optimum. Enzim bebas dan teramobilisasi masing-masing diinkubasi pada temperatur
antara 37oC, 40-70oC dengan interval 10oC.
Karakterisasi Penentuan Stabilitas L-Asparaginase terhadap pH dan Suhu
Stabilitas pH dan suhu terhadap aktivitas L-Asparaginase ditentukan dengan
melakukan pre inkubasi enzim dan buffer pada pH optimum. Pre inkubasi dilakukan
selama 2 jam dan diuji aktivitas L-Asparaginase setiap selang 30 menit pada suhu
optimum (E-Moharam dkk., 2010 dan Natsir dkk., 2010).
Analisis Data
Aktivitas Enzim (IU/mL)
Dimana :
y
a
b
V. Total
V. Analisis
V. Enzim
T. Inkubasi
=
=
=
=
=
=
=
=
Aktivitas Spesifik
=
Aktivitas Relatif
=
(
)
.
.
(1)
.
Absorbansi
slope
Intersept
Volume enzim + substrat + buffer + TCA (2,5 mL)
Volume total yang dianalisis (0,5 mL)
Volume enzim yang dianalisis (0,1 mL)
10 menit
Aktivitas Enzim (IU)
Kadar Protein (mg/mL)
(2)
Aktivitas L-Asparaginase Inkubasi “x” menit
-------------------------------------------------------- x 100 %
Aktivitas L-Asparaginase Inkubasi 0 menit
(3)
HASIL
Pemurnian dan Skrining B. licheniformis untuk Produksi L-Asparaginase
B.
licheniformis
yang
dibiakkan
dalam
medium
skrining
produksi
L-Asparaginase menunjukkan bahwa B. licheniformis HSA3-1a dapat memproduksi
enzim L-Asparaginase ekstraseluler ditandai oleh pembentukan warna pink di sekitar
koloni yang memproduksi L-Asparaginase.
Penentuan Konsentrasi Substrat L-Asparagin dan Waktu Inkubasi Optimum Produksi
L-Asparaginase
Aktivitas tertinggi L-Asparaginase 31.51 IU/mL pada konsentrasi substrat asam
amino L-Asparagin dalam medium fermentasi adalah 2,0% dengan waktu inkubasi 48
jam seperti yang tampak pada Gambar 1.
Penetapan Kadar Protein Tiap Fraksi Pengendapan Amonium Sulfat
Pengukuran kadar protein tiap fraksi tingkat kejenuhan amonium sulfat 0-20%,
20-40%, 40-60%, dan 60-80% masing-masing secara berurutan adalah; 0.0110 mg/mL,
0.075 mg/mL, 0.0070 mg/mL, dan 0.1140 mg/mL sedangkan kadar protein ekstrak kasar
adalah 0.027 mg/mL.
Penentuan Aktivitas L-Asparaginase Tiap Fraksi Pengendapan
Tiap fraksi pengendapan setelah dialisis ditentukan aktivitasnya. Aktivitas
tertinggi L-Asparaginase tiap fraksi pengendapan amonium sulfat setelah dialisis berada
pada tingkat kejenuhan amonium sulfat 20-40% memiliki aktivitas 42,95 IU/mL seperti
tampak pada Gambar 2.
Karakterisasi pengaruh pH terhadap aktivitas L-Asparaginase
Gambar 3 menunjukkan bahwa aktivitas L-Asparaginase meningkat seiring dengan
peningkatan pH hingga optimum pada pH 8. Aktivitas spesifik L-Asparaginase pada pH
6 adalah 345.8 IU/mg protein kemudian 506.64 IU/mg pada pH 7 dan optimum pada pH
8 dengan aktivitas spesifik 543.19 IU/mg protein yang selanjutnya menurun pada pH 9
dan 10.
Karakterisasi Pengaruh suhu terhadap aktivitas L-Asparaginase
Gambar 4 menunjukkan aktivitas
L-Asparaginase berbanding lurus dengan
meningkatnya suhu dari 30oC hingga optimum pada suhu 50oC yang kemudian menurun
pada suhu 60oC dan 70oC. Aktivitas spesifik L-Asparaginase pada suhu optimumnya
yakni 50oC adalah 616.26 IU/mg protein.
Karakterisasi Stabilitas L-Asparaginase terhadap pH dan suhu
Gambar 5 menunjukkan kestablilan L-Asparaginase terhadap pre inkubasi pada
pH dan suhu optimum (pH 8 dan 50oC) dapat stabil hingga 60 menit dengan aktivitas
relatif hingga 82.9%. Aktivitas relatifnya kemudian terus menurun pada pre inkubasi 90
menit dan 120 menit secara berurutan yaitu 59,9% dan 45,32%.
PEMBAHASAN
B. licheniformis
dibiakkan dalam medium skrining produksi L-Asparaginase
menunjukkan bahwa B. licheniformis HSA3-1a dapat memproduksi L-Asparaginase
ekstraseluler. Hal ini ditunjukkan oleh terjadinya perubahan warna medium yang
mengandung indikator fenol merah dari coklat menjadi pink. Pembentukan warna pink
menunjukkan terbentuknya amoniak sebagai hasil hidrolisis subtrat L-Asparagin menjadi
asam aspartat dan melepaskan molekul amoniak. Amoniak yang bersifat basa akan
merubah pH medium menjadi basa sehingga terjadi perubahan warna medium dari coklat
menjadi pink (Gashemi dkk., 2008).
Produksi enzim oleh bakteri secara maksimum dipengaruhi oleh substrat sebagai
komponen medium pertumbuhan pada konsentrasi dan waktu inkubasi tertentu.
Penentuan konsentrasi optimum substrat L-Asparagin dalam medium produksi
L-Asparaginase dilakukan dengan menumbuhkan B. licheniformis dalam medium cair
produksi L-Asparaginase dengan variasi konsentrasi substrat asam amino L-Asparagin
0.75%, 1.0%, 1.5%, 2.0%, dan 2.5% terhadap volume medium. Waktu inkubasi optimum
ditentukan dengan melakukan pengukuran aktivitas L-Asparaginase setiap 24 jam waktu
inkubasi. Hasil penelitian menunjukkan aktivitas tertinggi L-Asparaginase 31.51 IU/mL
pada konsentrasi substrat L-Asparagin dalam medium fermentasi adalah 2,0% dengan
waktu inkubasi 48 jam.
Tiap fraksi pengendapan amonium sulfat setelah dialisis, diukur kadar proteinnya
dan dibandingkan dengan kadar protein ekstrak kasar. Kadar protein ditentukan dengan
metode Lowry. Protein yang terkandung dalam tiap fraksi akan bereaksi dengan molekul
komponen reagen Lowry membentuk larutan berwarna biru. Kadar protein dihitung
berdasarkan nilai absorbansi yang sebanding dengan kadar protein pada panjang
gelombang optimum (680 nm) terhadap kurva standar bovine serum albumin. Hasil
pengukuran kadar protein tiap fraksi tingkat kejenuhan amonium sulfat 0-20%, 20-40%,
40-60%, dan 60-80% masing-masing secara berurutan adalah; 0.0110 mg/mL, 0.075
mg/mL, 0.0070 mg/mL, dan 0.1140 mg/mL sedangkan kadar protein ekstrak kasar adalah
0.027 mg/mL.
Aktivitas L-Asparaginase ditentukan dengan metode Nessler. Banyaknya amoniak
yang dihasilkan dari katalisis substrat asam amino L-Asparagin oleh enzim
L-Asparaginase dinyatakan sebagai aktivitasnya (Siddalingeshwara dkk., 2011). Amonia
yang dilepaskan oleh hidrolisis enzim L-Asparaginase bereaksi dengan reagen Nessler.
Lalu ditentukan kadarnya menggunakan standar ammonium klorida. Satu unit
L-Asparaginase (IU) didefenisikan sebagai jumlah enzim L-Asparaginase yang
mengkatalisis pembentukan satu µmol amoniak permenit pada kondisi pengujian (Basha
dkk., 2009). Tiap fraksi pengendapan setelah dialisis ditentukan aktivitasnya. Aktivitas
L-Asparaginase tertinggi berada pada tingkat kejenuhan amonium sulfat 20-40%
memiliki aktivitas 42,95 IU/mL.
Beberapa karakteristik enzim L-Asparaginase dalam bentuk bebas dan
teramobilisasi yang dipelajari dalam penelitian ini antara lain : pengaruh pH, suhu,
stabilitas pH dan stabilitas suhu enzim L-Asparaginase.
Enzim memiliki pH optimum yang khas, yaitu pH yang menyebabkan aktivitas
maksimal. Profil aktivitas pH enzim menggambarkan pH enzim pada saat gugus pemberi
dan penerima proton yang penting pada sisi katalitik enzim berada dalam tingat ionisasi
yang diinginkan. Aktivitas L-Asparaginase meningkat seiring dengan peningkatan pH
hingga optimum pada pH 8 dengan aktivitas spesifik 543.19 IU/mg protein.
Reaksi kimia termasuk reaksi katalisis enzim dapat dipengaruhi oleh suhu. Pada
suhu rendah reaksi kimia berlangsung lambat, sedangkan pada suhu yang lebih tinggi
reaksi berlangsung lebih cepat. Disamping itu, karena enzim adalah suatu protein, maka
kenaikan suhu dapat menyebabkan denaturasi yang merusak sisi aktif enzim dan
menurunkan
aktivitasnya.
Aktivitas
L-Asparaginase
o
berbanding
lurus
dengan
o
meningkatnya suhu dari 30 C hingga optimum pada suhu 50 C dengan aktivitas spesifik
616.26 IU/mg protein.
Kestabilan enzim terhadap pH dan suhu adalah kemampuan enzim menjaga
konformasinya, sehingga sisi aktif enzim sesuai dengan substrat dan mampu
mempertahankan aktivitasnya pada kondisi tertentu. Kestablilan L-Asparaginase terhadap
pre inkubasi pada pH dan suhu optimum (pH 8 dan 50oC) pada pre inkubasi hingga 60
menit memiliki aktivitas relatif hingga 82.9%. Aktivitas relatifnya kemudian terus
menurun pada pre inkubasi 90 menit dan 120 menit secara berurutan yaitu 59,9% dan
45,32%. Hal ini menunjukkan bahwa L-Asparaginase dapat mempertahankan sisi aktif
enzim dan masih dapat bekerja dengan baik meskipun telah dilakukan penyimpanan
selama 1 jam pada suhu optimumnya
KESIMPULAN DAN SARAN
B. licheniformis HSA3-1a dapat memproduksi L-Asparaginase ekstraseluler
secara maksimum pada konsentrasi asam amino L-Asparagin 2% dalam medium
fermentasi dan waktu inkubasi 48 jam. L-Asparaginase memiliki aktivitas yang optimum
pada pH 8 suhu 50oC dengan aktivitas spesifik 616,26 IU/mg protein serta stabil pada
suhu dan pH optimum selama 60 menit. Pengembangan hasil penelitian ini penulis
sarankan untuk melakukan penelitian lanjutan tentang optimasi produksi L-Asparaginase
dari bakteri
B. licheniformis dan pembuatan enzim amobil L-Asparaginase yang
menggunakan berbagai jenis karier pengamobilisasi.
DAFTAR PUSTAKA
Ahmed, S.A., Shireen, A.S., dan Abdel-Fattah, A.F., (2007), Stabilization of Bacillus
Licheniformis ATCC 21415 Alkaline Protease by Immobilization and
Modification, Australian Journal of Basic and Applied Sciences, 1(3) 313-322.
Antara, N.S., (2009), Mengurangi Pembentukan Akrilamida dengan Menggunakan
Enzim dan Mikroba pada Produk Pangan, FTP, UNUD.
Basha, N.S., Rekha, R., Komala, M., dan Ruby, S., (2009), Production of Extracellular
Anti-Lukaeia Enzyme L-asparaginase from Marine Actinomycetes by Solid-State
and Submerged Fermentation : Purification and Characterization, Tropical
Journal of Pharmaceutical Research, 8(4) 353-360.
El-Bessoumy, A.A., Sarhan, M., dan Mansour, J., (2004), Pruduction, Isolaton, and
Purification of L-Asparaginase from Pseudomonas Aeruginosa 50071 Using
Solid-state Fermentation, Journal of Biochemistry and Molecular Biology, 4(37)
387-393.
E-Moharam, M., Gamal-Eldeen, A.M., dan El-Sayed, S.T., (2010), Production,
Immobilization and Anti-Tumor Activity of L-Asparaginase of Bacillus sp R36,
Journal of American Science, 6(8) 157-165.
Ghasemi, Y., Ebrahimi, A., Rasoul-Amini, S., Zarrini, G., dan Ghoshoon, MB., (2008),
An Optimized Medium for Screening of L-Asparaginase Production by
Escherichia coli, American Journal of Biochemistry an Biotechnology, 4(4) 422424.
Gulati R., Saxena, R.K., dan Gupta, R., (1997), A Rapid Plate Assay for Screening LAsparaginase, Producing Microorganisms, Lett. Appl Microbiol, 24, 23-26.
Moorthy, V., Ramalingam, A., Sumantha, A., dan Shankaranaya, R.T., (2010),
Production, Purification, and Characterisation of Extacellular L-Asparaginase
from a Soil isolate of Bacillus sp., African Journal of Microbiology Research,
4(18) 1862-1867.
Natsir, H., Patong, A.R., Suhartono, M.T., dan Ahmad, A., (2010), Production and
Characterization of Chitinase Enzymes from Sulili Hot Spring in South Sulawesi,
Bacillus sp. HSA3-1a, Indo.J.Chem., 10(2) 263 - 267.
Siddalingeshwara, dan Lingappa, (2011), Production and Characterization of
L-Asparaginase–A Tumour inhibitor, International Journal PharmTech Research,
1(3) 314-319.
Tika I.N., Redhana, I.W., dan Ristiati, N.P., (2007), Isolasi Enzim Lipase Termostabil
dari bakteri Termofilik Isolat Air Panas Banyuwedang Kecamatan Gerobak,
Buleleng Bali, Akta Kimia Indonesia, (2), 2, 109-112.
Wriston, J.C, dan Yellin, (1970), Asparaginase, Method Enzymol, 16, 732-742.
Aktivitas L-Asparaginase (IU/mL)
Gambar 1. Aktivitas L-Asparaginase
Asparaginase tiap variasi konsentrasi substrat asam amino
L-asparagin dalam medium
50
42.95
24.28
12.83
22.47
19.46
0
Ekstrak
Kasar
F.0-20 %
F.20-40 %
F.40-60 %
F.60-80%
Ekstrak Kasar dan Fraksi Tiap Kejenuhan Amonium Sulfat (%)
Gambar 2. Aktivitas L-Asparaginase
Asparaginase tiap fraksi pengendapan kejenuhan amonium
sulfat setelah dialisis
Aktivitas Spesifik
(IU/mg Protein)
600
543.19
500
400
300
200
100
0
4
5
6
7
pH
8
9
10
11
Gambar 3. Pengaruh pH terhadap aktivitas L-Asparaginase
Aktivitas Spesifik (IU/mg Protein)
700
616.26
600
500
400
300
200
100
0
20
30
40
50
60
70
80
Suhu (°C)
Gambar 4. Pengaruh suhu terhadap aktivitas L-Asparaginase
Aktivitas Relatif (%)
120
100
100
95.14
80
82.99
60
59.9
40
45.32
20
0
0
Gambar 5.
30
60
90
120
Waktu Pre Inkubasi L-Asparaginase (Menit)
150
Pengaruh waktu pre inkubasi terhadap stabilitas L-Asparaginase
pada pH dan suhu optimum (pH 8 dan 50°C)