IV. HASIL DAN PEMBAHASAN

IV. HASIL DAN PEMBAHASAN
A. Isolat Actinomycetes Amilolitik Terpilih
1. Isolat Actinomycetes Terpilih
Peremajaan isolat actinomycetes dilakukan dengan tujuan sebagai pemeliharaan isolat
actinomycetes agar nantinya dapat terus digunakan sampai pada akhir penelitian dan
menjaga kelangsungan hidup isolat actinomycetes itu sendiri.
Biasanya peremajaan
actinomycetes ini dilakukan 3-4minggu sekali setelah dilihat pada sumber-sumber nutrien
makanan bagi pertumbuhan actinomycetes tersebut akan mulai habis digunakan. Isolat
yang digunakan pada proses peremajaan isolat actinomyetes ini didapatkan dari penelitian
sebelumnya, yaitu isolat ANLd-2b-3, ANL-14 dan ANL-12 (Lina, 2009). Dipilihnya ketiga
isolat actinomycetes tersebut berdasarkan pertumbuhan yang lebih baik karena tidak
adanya kontaminan dibandingkan dengan isolat-isolat actinomycetes yang ada.
Pertumbuhan isolat actinomycetes yang sempurna baru dapat terlihat selama 7 hari. Biakan
ketiga isolat actinomycetes pada media ISP-2 disajikan pada Gambar 9.
35
ANLd-2b-3
ANL-12
ANL-4
Gambar 9. Isolat Actinomycetes
Isolat actinomycetes ANLd-2b-3 mempunyai warna keabu-abuan, isolat actinomycetes
ANL-12 mempunyai warna kuning keabuan dan isolat actinomycetes ANL-4 mempunyai
warna kuning kecoklatan. Sedangkan bentuk dari ketiga isolat diatas mempunyai bentuk
yang hampir sama yaitu ketiganya memiliki hifa atau percabangan, berbubuk, tebal, dan
pertumbuhannya lebih lama di bandingkan bakteri, oleh sebab itu pertumbuhan isolat
actinomycetes ini umumnya muncul dengan perlahan antara 7-10 hari baru dapat terlihat
bentuk isolatnya.
2. Aktivitas Amilolitik Terpilih
Uji amilolitik dilakukan dengan tujuan memilih salah satu isolat actinomycetes dari ketiga
isolat actinomycetes yang ada, yang kemudian akan digunakan sebagai sumber enzim
amilase yang akan dihasilkan, dengan cara melihat isolat actinomycetes mana yang
mempunyai aktivitas enzim amilase paling besar. Pengujiannya dilakukan dengan melihat
besarnya zona bening yang terbentuk setelah dilarutkan dengan larutan iodin.
36
Amilase merupakan enzim yang mampu menghidrolisis molekul amilum menjadi glukosa
atau oligosakarida. Dengan indikator larutan Iodin tersebut akan memberikan warna bening
yang menandakan bahwa isolat actinomycetes dapat menghidrolisis amilum.
Ketiga isolat menunjukkan hasil yang positif dengan larutan iodin yang membentuk zona
bening. Daerah zona bening tersebut adalah daerah hasil hidrolisis amilum. Kemudian
ketiga isolat itu dihitung indeks amilolitiknya. Indeks amilolitik diartikan sebagai hasil bagi
diameter zona bening dengan diameter koloni.
Dari hasil yang telah dilakukan pada ketiga isolat actinomycetes maka diperoleh gambar
hasil zona bening dan data indeks amilolitiknya, seperti disajikan pada Gambar 10 dan
Tabel 1. Hasil penelitian menunjukkan bahwa isolat ANLd-2b-3 mempunyai kemampuan
amilolitik yang lebih besar dibandingkan dua isolat lainnya.
ANLd-2b-3
ANL-12
ANL-4
Gambar 10. Hasil Uji Amilolitik pada actinomycetes
Tabel 1. Indeks Amilolitik dari berbagai isolat actinomycetes
Nama
Isolat
Diameter
Koloni (cm)
Diameter Zona Bening
(cm)
Indeks Amilolitik
37
ANLd-2b-3
ANL-12
ANL-4
1,7
1,4
1,6
2,6
2,0
1,8
1,529
1,428
1,128
B. Kondisi waktu dan pH optimum pertumbuhan Actinomycetes.
Penentuan kondisi optimum pertumbuhan actinomycetes perlu dilakukan untuk mengetahui
lingkungan optimum pertumbuhan actinomycetes dan mendapatkan kondisi terbaik dalam
memproduksi enzim. Diharapkan enzim yang diproduksi akan lebih maksimal atau
mempunyai aktivitas enzim yang tinggi. Proses ini dilakukan sebelum proses isolasi
enzim.
Pada proses penentuan kondisi optimum pertumbuhan actinomycetes isolat ANLd-2b-3
didapatkan pH optimum dan waktu optimumnya yaitu pada pH 7 dan waktu 120 jam.
Sedangkan dari hasil penelitian sebelumnya yang dilakukan oleh Bruhlmann, et al
didapatkan pH dan waktu inkubasi optimum actinomycetes yaitu pada pH 7,3 dan waktu 4
hari (96 jam).
Berikut merupakan kurva pertumbuhan actinomycetes dapat dilihat pada Gambar 11 (dari
data pada Tabel 3 dan 4, Lampiran 1).
1.5
0.12
1
0.06
0.5
OD Sel
0.18
0
Aktivitas Unit (U/mL)
38
0
0
72
144
216
Waktu (Jam)
OD Sel
Aktivitas Unit (U/mL)
Gambar 11. Hubungan antara jumlah sel (OD600) dan aktivitas unit amilase
dengan lama waktu fermentasi
Dari Gambar 11 dapat dilihat fase eksponensial pertumbuhan actinomycetes tercapai pada
waktu inkubasi 96 jam. Produksi enzim amilase dengan aktivitas tertinggi pada waktu
inkubasi 120 jam, atau pada awal fase stasioner pertumbuhan actinomycetes.
Setelah didapatkan waktu pertumbuhan optimum actinomycetes dalam menghasilkan
enzim amilase dengan aktivitas tertinggi, kemudian ditentukan pH optimum pertumbuhan
actinomycetes. Hasil pengukuran absorbansi pada panjang gelombang 600nm menggunakan
metode densitas optikal (OD600) didapatkan pH optimum pada pH 7 dengan absorbansi sebesar
OD600 = 0,165. Kurva kondisi optimum actinomycetes pada variasi pH dapat dilihat pada
Gambar 12 (dari data Tabel 5, Lampiran 1).
39
OD Sel
0.2
0.15
0.1
0.05
0
5.5
6
6.5
7
7.5
8
8.5
pH
Gambar 12. Hubungan antara jumlah sel (OD600) dengan pH pada saat fermentasi
C. Inokulum dan Enzim Amilase Hasil Produksi
Penyiapan inokulum atau media starter ini dilakukan dengan tujuan untuk mendapatkan
enzim yang diproduksi lebih banyak dan maksimal. Media starter atau inokulum diinkubasi
selama waktu inkubasi pertumbuhan optimum dan pH optimum, yaitu waktu inkubasi
selama 120 jam dengan pH 7.
D. Aktivitas Enzim Amilase Hasil Isolasi
Setelah actinomycetes diinkubasi selama 120 jam dengan pH 7 dalam media fermentasi,
setelah itu dilakukan pemisahan enzim amilase dari konstituen seluler lainnya sehingga
diperoleh ekstrak kasar enzim. Proses isolasi enzim dilakukan dengan mensentrifugasi
media fermentasi dengan kecepatan 3500 rpm selama 30 menit. Pada proses isolasi ini
diperoleh ekstrak kasar enzim sebanyak 469 ml dari 500 ml media fermentasi, dengan
aktivitas unit 1,4 U/mL, kadar protein 0,26 mg/mL, dan aktivitas spesifik 5,4 U/mg.
E. Enzim Amilase Hasil Pemurnian
40
1. Hasil Fraksinasi dengan Amonium Sulfat
Proses fraksinasi dengan penambahan garam ammonium sulfat kedalam larutan enzim akan
menyebabkan menurunnya kelarutan enzim tersebut, sehingga terbentuk endapan protein.
Dengan adanya penambahan garam, kelarutan protein akan meningkat hal ini dikarenakan
karena pada konsentrasi garam yang tinggi, garam akan lebih cenderung mengikat air dan
menyebabkan agregasi Sehingga molekul protein mengalami pengendapan. Peristiwa ini
disebut salting out. Proses fraksinasi ini dilakukan pada suhu 0-4oC, hal ini betujuan agar
kemungkinan hilangnya aktivitas enzim oleh adanya denaturasi dapat diminimalkan.
Pemurnian enzim pada tahap pertama ini dilakukan dengan menambahkan garam amonium
sulfat dalam 5 tingkat fraksi kejenuhan Fraksi kejenuhan amonium sulfat yang digunakan
pada penelitian ini adalah (0-20)%, (20-40)%, (40-60)%, (60-80)%, dan (80-100)% jenuh.
Pada tahapan pemurnian ini tidak dilakukan uji aktivitas unit, kadar protein dan aktivitas
spesifiknya tetapi pengujiannya dilakukan setelah tahap dialisis. Hal ini dilakukan agar
garam yang ada dalam larutan enzim dapat terpisah terlebih dahulu, sehingga garam yang
digunakan untuk mengendapkan protein tidak mempengaruhi pengukuran aktivitas enzim
amilasenya, yang menyebabkan aktivitas unit enzim amilase menurun.
2. Aktivitas Dialisis Terpilih
Proses pemurnian dialisis dilakukan karena adanya molekul garam dari hasil fraksinasi
yang dapat mempengaruhi aktivitas dan kestabilan enzim. Oleh karena itu, dengan
dilakukan tahapan pemurnian dialisis dapat mengeluarkan ion pengganggu (garam) tersebut
41
agar didapatkan enzim dengan aktivitas lebih tinggi dan kemurnian meningkat. Tahapan
dialisis ini dilakukan pada kondisi dingin untuk mencegah terjadinya kerusakan protein
enzim yang dimurnikan dan juga dilakukan dengan menggunakan membran berdasarkan
difusi partikel zat terlarut yang menyebabkan protein enzim akan terpisah dari ion-ion
garamnya dan membran yang digunakan adalah kantung selofan (Reed et al, 1998).
Pada setiap pergantian buffer phospat yang dilakukan setiap 4 jam sekali, dilakukan
pengujian dengan cara meneteskan larutan Ba(OH)2 0,1M pada buffer untuk mengetahui
masih ada tidaknya garam ammonium sulfat pada enzim. Jika pada larutan buffer tersebut
tidak terdapat endapan putih setelah ditetesi larutan Ba(OH)2, maka tahap dialisis telah
selesai.
Gambar 13 (Lampiran 2, Tabel 6) menunjukan hubungan antara fraksi enzim pada berbagai
Aktivitas Unit (U/mL)
tingkat kejenuhan amonium sulfat setelah didialisis dengan aktivitas unit enzim amilase.
3
2.5
2
1.5
1
0.5
0
(0-20)%
(20-40)%
(40-60)%
(60-80)%
(80-100)%
Fraksi Dialisis
Gambar 13. Kurva aktivitas amilolitik setelah fraksinasi amonium sulfat dan dialisis
42
Pada Gambar diatas dapat dilihat enzim amilase yang memiliki aktivitas unit tertinggi yaitu
pada fraksi (40-60)% sebesar 2.6 U/mL. Pada fraksi-fraksi sesudah fraksi (40-60)%, masih
terlihat tinggi aktivitas enzimnya, yang menandakan bahwa amonium sulfat masih dapat
mengendapkan protein enzim pada fraksi-fraksi tersebut. Aktivitas unit tiap fraksi berbeda
karena dipengaruhi oleh tinkat kejenuhan garam amonim sulfat yang semakin meningkat.
Berikut adalah Tabel Pemurnian enzim amilase dari actinomycetes pada berbagai tahap
pemurnian. Dapat dilihat bahwa pada Tabel di bawah ini terjadi peningkatan aktivitas dan
tingkat kemurnian enzim amilase pada tahap pemurnian dialisis dari fraksi (40-60) %
dibandingkan dengan ekstrak kasar.
Tabel 2. Hasil Pemurnian Enzim Amilase
Tahap
Ektrak
Kasar
Fraksi
(40-60)%
Setelah
Dialisis
Volume
Aktivitas
Aktivitas
Kadar
Aktivitas
Tingkat
Enzim
Unit
Total
Protein
Spesifik
kemurnian
(mL)
(U/mL)
(U)
(mg/mL)
(U/mg)
(kali)
500
1.4
697
0.26
5.4
1
100
23.5
2.6
60.8
0.35
7.4
1.37
10
Perolehan
(%)
Hasil dialisis menunjukan aktivitas enzim yang meningkat dengan tingkat kemurnian yang
lebih tinggi yaitu 1,37 kali lebih murni dibandingkan ekstrak kasar dan dengan perolehan
10 %.
F. Enzim Amilase Hasil Karakterisasi
43
Pada proses karakterisasi enzim ini dilakukan agar dapat diaplikasikan pada kebutuhan
industri terhadap enzim yang semakin meningkat dan bervariasi yang menuntut adanya
upaya peningkatan produksi jumlah enzim.
1. Suhu Optimum Enzim Amilase
Aktivitas tertinggi (U/mL) enzim hasil pemurnian dari actinomycetes dapat dilihat pada
Gambar 14. Suhu optimum enzim amilase berdasarkan Gambar 14 adalah 500C (dari data
Aktivitas Unit (U/mL)
tabel 7, Lampiran 2 ).
3
2.5
2
1.5
1
0.5
0
20
30
40
50
60
70
80
90
Suhu (o C)
Gambar 14. Penentuan suhu optimum enzim amilase
Pada Gambar di atas, aktivitas enzim semakin meningkat seiring dengan kenaikan suhu
sampai pada suhu optimum. Setelah mencapai aktivitas maksimum pada suhu optimum,
aktivitas enzim akan menurun seiring dengan kenaikan suhu. Pada suhu kurang dari 50 oC
kestabilan enzim cukup tinggi namun kemampuan hidrolisis pati oleh enzim tidak berjalan
secara maksimal.
Dengan
meningkatnya temperatur
(suhu)
akan menyebabkan
meningkatnya energi kinetik yang akan mempercepat gerak vibrasi, translasi, serta gerak
44
rotasi dari enzim sehingga peluang enzim dan substrat untuk bertumbukan dan bereaksi
meningkat, dan produk yang dihasilkan akan semakin bertambah pula.
Akan tetapi diatas temperatur optimum, aktivitas enzim menurun tajam. Hal ini terjadi
karena enzim mulai mengalami perubahan konformasi yang menyebabkan sisi aktifnya
tidak sesuai lagi dengan substrat. Hal ini dikarenakan gugus reaktifnya mengalami
hambatan untuk memasuki sisi aktif enzim sehingga struktur enzim akan mengalami
kerusakan dan aktivitas enzim semakin menurun (Suhartono, 1989).
2. pH Optimum Enzim Amilase
Aktivitas optimum amilase dicapai pada pH 7, hal ini disebabkan karena pada kondisi pH
7, gugus pemberi atau penerima proton yang penting pada sisi katalitik enzim berada pada
tingkat yang diinginkan sehingga aktivitas katalitiknya tinggi dan karena terjadinya
perubahan ionisasi pada gugus ionik sisi enzim tersebut yang
mempengaruhi sisi aktifnya, maka hal ini menyebabkan enzim dapat mengikat substrat
lebih efektif dan mengubahnya menjadi produk.
Dibawah pH optimum, ion H+ akan berikatan dengan gugus NH2- bebas membentuk NH3+,
sehingga ikatan hidrogen dari amina (NH2) dengan gugus karbonil dalam molekul protein
enzim akan putus dan menyebabkan perubahan konformasi pada pusat aktif enzim.
Sedangkan diatas pH optimum , ion OH- akan berikatan dengan atom hidrogen dari
molekul enzim membentuk H2O, sehingga ikatan hidrogen yang ada dalam molekul protein
enzim akan putus. Jika pH semakin jauh dari pH optimum, akan menyebabkan enzim
45
mengalami penurunan aktivitas hingga laju reaksi mencapai nol. Laju reaksi akan menurun
dikarenakan perubahan gugus yang bermuatan akan menyebabkan perubahan konformasi
lipatan pada enzim sehingga konformasi sisi aktif enzim ikut terpengaruh akibatnya
aktivitas enzim akan menurun dengan adanya perubahan konformasi dari sisi aktif enzim.
Hal ini juga disebabkan karena telah berkurangnya komponen didalam medium yang
Aktivitas Unit (U/mL)
menjadi penginduksi sintesis enzim atau substrat (Abianto, 1989).
3
2.5
2
1.5
1
0.5
0
5.5
6
6.5
7
7.5
8
8.5
pH
Gambar 15. Penentuan pH optimum enzim amilase
Aktivitas unit amilase (U/mL) optimum hasil pemurnian dari actinomycetes adalah pada
pH 7 (Tabel 8, lampiran 2) dapat dilihat pada Gambar 15.
3. Waktu Optimum Enzim Amilase
Aktivitas tertinggi (U/mL) enzim hasil pemurnian dari actinomycetes dapat dilihat pada
Gambar 16. Waktu optimum enzim amilase berdasarkan Gambar 16 adalah 30 menit (dari
data Tabel 9, Lampiran 3).
Aktivitas Unit (U/mL)
46
2.5
2
1.5
1
0.5
0
0
10
20
30
40
50
60
70
Waktu (menit)
Gambar 16. Penentuan waktu inkubasi optimum enzim amilase
Pada Gambar di atas, aktivitas enzim semakin meningkat seiring dengan bertambahnya
waktu inkubasi sampai pada waktu optimum. Setelah mencapai aktivitas maksimum pada
waktu optimum, aktivitas enzim akan menurun seiring dengan bertambahnya waktu
inkubasi. Hal ini dapat disebabkan adanya perbedaan waktu yang dibutuhkan oleh setiap
enzim untuk bereaksi dengan substrat. Namun ada saatnya jumlah produk menjadi konstan
sementara waktu terus meningkat, yang biasa dikenal sebagai istilah turunnya laju reaksi
(product over time). Hal ini disebabkan karena jumlah substrat yang berkurang ataupun
hasil dari reaksi enzim
atau produk menghambat pembentukkan dari kompleks enezim substrat sehingga aktivitas
enzim akan semakin menurun nilainya.
4. KM dan Vmaks Enzim Hasil Pemurnian.
Kecepatan reaksi enzim akan meningkat seiring dengan meningkatnya konsentrasi substrat
sampai pada suatu harga yang memberikan kecepatan reaksi tetap. Pada keadaan tersebut,
kecepatan reaksi enzim mencapai maksimum karena reaksi enzim dengan substratnya
47
menjadi lebih jenuh dan tidak dapat bereaksi lebih cepat. Harga KM dari suatu enzim
berfungsi untuk mengetahui konsentrasi dari subsrat yang menghasilkan laju reaksi
maksimum.
Grafik Penentuan harga KM dan Vmaks enzim amilase dapat dilihat pada Gambar 17.
y = 0.103x + 0.0327
1/[V] (mL/U)
0.25
0.2
0.15
0.1
0.05
0
-0.5
0
0.5
1
1.5
2
2.5
1/[S] (mL/mg)
Gambar 17. Grafik Lienweaver-Burk enzim amilase
Berdasarkan data pada Gambar tersebut, laju reaksi meningkat seiring dengan
meningkatnya konsentrasi substrat. Jika konsentrasi substrat terus dinaikan, akan ada suatu
saat enzim jenuh dengan substratnya sehingga peningkatan konsentrasi substrat tidak lagi
meningkatkan laju reaksi dan walaupun substrat terus mengalami penambahan,
pembentukan kompleks enzim substrat tidak lagi dimungkinkan, keadaan ini disebut laju
reaksi maksimum (Vmaks) (Lehninger, 1982).
48
Dari persamaan Lineweaver-burk diperoleh harga Vmaks hasil pemurnian sebesar 30,6 μmol
mL-1 menit-1 , sedangkan nilai KM sebesar 3,15 mg mL-1 (dari data pada Tabel 10,
Lampiran 3).
49