BAB I - Blogs Unpad

BAB I
MEDIA
Media adalah suatu substrat yang digunakan untuk menumbuhkan dan
mengembangbiakkan mikroorganisme.
Syarat-syarat Media
1. Mengandung komposisi :
•
Air
•
Sumber energi metabolik (fermentasi, respirasi, fotosintesis)
•
Zat hara (sumber karbon, nitrogen, sulfur, fosfor, oksigen, hidrogen &
trace elements)
•
Asam amino, vitamin, nukleosida
2. Memiliki pH, temperatur dan tekanan osmotik yang sesuai dengan kebutuhan
mikroorganisme.
3. Steril, agar tidak ditumbuhi oleh mikroorganisme pencemar.
Fungsi Komponen-komponen Media
 Mayoritas sel terdiri atas karbon, oksigen, hidrogen, nitrogen, fosfor.
Senyawa diatas dibutuhkan dalam pembentukan membran sel, protein,
asam nukleat dan struktur lain dari sel.
 Senyawa tersebut diatas dibutuhkan dalam jumlah banyak, meliputi 1%
dari berat kering sel, disebut MAKRONUTRIEN.
 Senyawa lainnya yang dibutuhkan dalam jumlah yang lebih kecil antara
lain kalsium, potassium, magnesium, sulfur, besi, mangan. Senyawa ini
disebut MIKRONUTRIEN. Mikronutrien meliputi 0.1-1.0% dari berat
kering sel. Walaupun dibutuhkan dalam jumlah yang sedikit, mikronutrien
berperan penting dalam fungsi sel.
HANDBOOK OF TA HAYATI
1
 Trace elements dibutuhkan dalam jumlah yang sangat kecil yang sukar
ditentukan. Jumlah yang dibutuhkan adalah <0.1%.
 Growth factors (faktor pertumbuhan) adalah molekul organik yang
dibutuhkan
dalam
pertumbuhan
dan
tidak
bisa
disintesis
oleh
mikroorganisme itu sendiri, misalnya vitamin, asam amino dan nukleotida.
Faktor pertumbuhan juga merupakan substansi kimia yang digunakan oleh
mikroorganisme untuk proses biosintesis dan sebagai sumber energi..
Pengaruh
pH,
temperatur
dan
tekanan
osmotik
terhadap
pertumbuhan mikroorganisme

pH  bila mikroorganisme tumbuh, pH media sering berubah-ubah

Mikroorganisme yang melakukan fermentasi  menghasilkan asam  pH 3.5

Pada saat terjadi metabolisme protein dan asam amino  melepaskan ion
ammonium  basa

pH optimum 7, tetapi dapat hidup pada pH 5-8

Suhu optimum pertumbuhan 0-20oC  PSIKROFIL

Suhu optimum pertumbuhan 20-50oC  MESOFIL

Suhu optimum pertumbuhan 50-100oC  THERMOFIL

ISOTONIK  konsentrasi cairan ekstrasel = konsentrasi cairan intrasel 
tidak terjadi perpindahan cairan dari dalam sel ke luar sel.

HIPERTONIK  konsentrasi cairan ekstrasel > konsentrasi cairan intrasel 
terjadi dehidrasi dan pengkerutan sel (PLASMOLISIS).

HIPOTONIK  konsentrasi cairan ekstrasel < konsentrasi cairan intrasel 
terjadi pembengkakan.
Jenis media
Berdasarkan konsistensi :
• Media padat (agar/gelatin)
• Dibuat dengan cara menambahkan agen pemadat, misalnya agar, gelatin
atau silica gel ke dalam media cair.
HANDBOOK OF TA HAYATI
2
• Agen pemadat yang baik adalah tidak diuraikan oleh mikroorganisme,
tidak menghambat pertumbuhan mikroorganisme, tidak mencair pada
suhu ruang.
• Agar dan silica gel tidak mencair pada suhu ruang dan tidak diuraikan
oleh
mikroorganisme.
Sebaliknya,
gelatin,
diuraikan
oleh
mikroorganisme dan mencair pada suhu ruang.
• Contoh : agar nutrien, agar darah, Saboraud’s agar.
• Media cair (broth)
• Meliputi nutrient broth (kaldu nutrien), citrate broth, glucose broth,
litmus milk dsb.
• Media cair digunakan dalam propagasi banyak mikroorganisme, uji
fermentasi dan uji lainnya.
• Media semi-padat
Berdasarkan kimiawi :
• Media sintetik
• Media non-sintetik (alami)
Berdasarkan sifat :
• Media Umum
– Untuk pertumbuhan atau perkembangan satu atau lebih kelompok
mikroorganisme.
• Media Pengaya
– Untuk
memberikan
kesempatan
terhadap
suatu
jenis/kelompok
mikroorganisme untuk tumbuh dan berkembang biak lebih cepat dari
jenis/kelompok lain dalam satu media.
• Media Penguji
– Media yang digunakan untuk pengujian senyawa atau benda tertentu
dengan bantuan mikroorganisme.
• Media Perhitungan
– Media yang digunakan untuk menghitung jumlah mikroorganisme pada
suatu bahan
HANDBOOK OF TA HAYATI
3
 Media Selektif
– Media yang hanya menumbuhkan mikroorganisme yang diinginkan saja
yang dapat tumbuh karena tidak adanya nutrien penting bagi
mikroorganisme yang tidak diinginkan untuk tumbuh dan kehadiran
substansi inhibitor seperti NaCL, asam, kristal violet (toksik), antibiotika
(misal : streptomisin) dsb.
 Media Diferensial
– Media yang mengandung substansi yang dapat menyebabkan munculnya
karakteristik dari masing-masing mikroorganisme yang ditumbuhkan.
Contoh media selektif dan diferensial : Levine EMB agar  untuk analisis koliform
dalam air.
Contoh Media
HANDBOOK OF TA HAYATI
4
Pembuatan Media
 Bila tabung/cawan petri yang digunakan untuk pembuatan media sudah dalam
keadaan bersih dan bebas kontaminasi, maka tidak perlu dilakukan pencucian.
 Pencucian dilakukan dengan menggunakan air hangat dan deterjen, bagian
dalamnya disikat. Cuci sebanyak dua kali, pada pencucian kedua, gunakan
aquadest untuk membersihkan sisa-sisa deterjen yang masih tertinggal.
 Tempatkan tabung/cawan petri tersebut pada keranjang/rak untuk pengeringan.
Jangan dikeringkan dengan menggunakan handuk.
 Sterilisasi.
Pembuatan Media Sintetik
• Glukosa
0,2 g
• Kalium fosfat
0,1 g
• Ammonium klorida
0,05 g
• Magnesium sulfat
0,02 g
• Feri klorida
0,0005 g
• Aquadest
100 ml
Siapkan 100 ml kaldu glukosa garam mineral dengan kandungan seperti pada
tabel
Siapkan labu erlenmeyer 250 ml
Masukkan aquadest sebanyak 75 ml
HANDBOOK OF TA HAYATI
5
Tambahkan setiap bahan sesuai urutan pada tabel
Kocok pada setiap penambahan bahan dan biarkan larut dulu
sebelum penambahan bahan berikutnya
Tambahkan sisa aquadest sebanyak 25 ml
Masukkan 10 ml larutan ke dalam 10 buah tabung dengan menggunakan pipet 10 ml
Tutup tabung dengan kapas yang dibalut oleh kain kasa
Beri label dan sterilisasi
Pembuatan Media Non-Sintetik
KALDU NUTRIEN
• Pepton
1,0 g
• NaCl
1,6 g
• Ekstrak daging
0,6 g
• Aquadest
200 ml
HANDBOOK OF TA HAYATI
6
• Siapkan 1 labu erlenmeyer 250 ml.
• Masukkan 150 ml aquadest.
• Tambahkan ketiga bahan berikutnya, campur dan kocok pada setiap
penambahan bahan.
• Tambahkan 50 ml sisa aquadest.
• Panaskan larutan ini hingga semua bahan larut.
• Ukur pH
• Masukkan 10 ml larutan ke dalam 10 tube steril
• Tutup tabung
• Beri label
• Tempatkan ke rak
• Sterilkan
Untuk membentuk media padat  tambahkan 1.5 g agar pada sisa larutan
• Panaskan larutan  supaya agar larut
• Kocok labu  supaya agar tidak menempel pada dasar labu
• Masukkan 10 ml larutan ke dalam tube steril
HANDBOOK OF TA HAYATI
7
• Tutup tabung
• Beri label
• Tempatkan ke rak
• Sterilisasi
PERHATIKAN :
• Pemanasan larutan dengan menggunakan api bunsen atau electric hot plate.
• Tandai tinggi larutan awal sebelum dipanaskan  untuk menghindari water
loss.
• Bila terjadi water loss  tambahkan aquadest.
• Suhu pemanasan  tergantung komposisi medium, ada yang 600C.
• Agar akan membeku pada suhu 40-420C.
HANDBOOK OF TA HAYATI
8
BAB II
STERILISASI
Pengertian
Suatu proses (dengan metode tertentu) yang memberikan hasil akhir suatu keadaan
dimana tidak dapat ditunjukkan lagi adanya mikroorganisme hidup.
Prinsip Dasar Sterilisasi
• Adanya derajat kontaminasi yang serendah mungkin sebagai pra-kondisi.
• Pemilihan metode sterilisasi yang paling tepat.
• Ada tolak ukur yang tepat untuk mengukur efisiensi proses sterilisasi atau hasil
akhir.
• Ada sarana penunjang untuk menjaga mutu hasil akhir produk steril.
Dekontaminasi
• Jumlah kontaminan tinggi  hasil akhir meragukan atau akan membutuhkan
waktu proses lebih lama.
• Proses dekontaminasi meliputi :
- pembilasan
- penyikatan
- pencucian (dengan desinfektan), baik dengan manual/alat
Pemilihan Metode Sterilisasi
• Sifat bahan yang akan disterilkan.
• Proses yang paling mudah, murah, namun cukup efektif.
HANDBOOK OF TA HAYATI
9
Cara sterilisasi menurut FI Ed. IV
1. Sterilisasi Panas Basah (Uap)
– Proses sterilisasi termal menggunakan uap jenuh di bawah tekanan
berlangsung di suatu bejana yang disebut autoclave.
– Metode yang paling sering digunakan.
– Suhu 1210C selama 15-20’  tergantung bahan/prosedur sterilisasi.
– Prinsip : Udara di dalam bejana diganti dengan uap jenuh.
Fase Siklus Sterilisasi
– Pemanasan/Vakum (Conditioning)
– Fase Pemaparan Uap (Exposure)
132°C 2’
121°C 12’
116°C 30’
– Pembuangan Uap (Exhaust)
– Fase Pengeringan (Drying)
Metode ini paling banyak digunakan karena :
• Hampir 80% alat dan bahan dapat disterilkan dengan metode ini, seperti
karet.
• Biaya operasional cukup rendah dibanding metode lain.
• Temperatur merata pada setiap tempat selama proses.
• Cepat dan hasil kering.
HANDBOOK OF TA HAYATI
10
Bejana autoclave
Prinsip kerja autoclave
HANDBOOK OF TA HAYATI
11
2. Sterilisasi Panas Kering
– Alat : Oven
– Prinsip :
• Udara dipanaskan dan disaring.
• Didistribusikan secara merata ke seluruh bejana dengan cara
sirkulasi atau radiasi.
– Temperatur dan waktu yang digunakan :
• 1500C
60-150’
• 1600C
45-120’
• 1700C
20-60’
• 1800C
20-30’
Kelebihan :
– Hasil kering.
– Dapat digunakan untuk semua bahan termostabil, seperti alat-alat gelas.
– Mudah dilaksanakan.
Kekurangan :
– Waktu yang dihabiskan cukup lama.
– Penetrasi panas terbatas pada lapisan tertentu.
–
Dibutuhkan tenaga listrik cukup besar.
Oven
HANDBOOK OF TA HAYATI
12
3. Sterilisasi Gas
• Sebagai alternatif dari sterilisasi termal dilakukan bila bahan yang
disterilkan tidak tahan terhadap suhu tinggi seperti pada proses sterilisasi
uap atau panas kering.
• Daya penetrasi dan absorpsi tinggi sehingga sterilisasi dapat dilakukan pada
pembungkus akhir.
• Sterilisasi dengan menggunakan gas kimia :
Etilen oksida (EtO2)
• Sifat : mudah meledak dan iritatif.
• Dalam perdagangan dicampur dengan gas CO2 atau freon dalam kadar 1090%.
• Mekanisme kerja : melalui alkilasi gugus biologis esensial dari
mikroorganisme.
• Meninggalkan residu toksik.
• Mutagenik.
• Afinitas tinggi sehingga perlu diangin-anginkan sebelum digunakan, tujuan
untuk menghilangkan EtO2  yaitu selama 8-30 jam pada 450C atau 4-10
hari pada temperatur kamar.
Formaldehida
– Mekanisme kerja :
• Melalui ikatan dengan gugus imino dan amino dari protein
mikroorganisme.
– Keunggulan dibanding etilen oksid :
• Lebih murah
• Kurang meninggalkan residu
• Tidak mudah meledak
• Kurang toksik
HANDBOOK OF TA HAYATI
13
4. Sterilisasi dengan radiasi ion
 Digunakan sinar beta (sinar elektron) dari generator Van De Graaf.
 Atau sinar gamma.
 Sterilisasi dingin  karena dilakukan pada temperatur kamar.
 Kemampuan daya tembus baik  penyebaran energi homogen.
5. Sterilisasi dengan penyaringan/filtrasi
 Digunakan untuk mensterilkan udara atau bahan dalam bentuk cairan.
Contohnya adalah filter udara seperti HEPA ( High Efficiency
Particulated Air) untuk menghindari terjadinya kontaminasi atau infeksi
silang.
HEPA Filter
6. Sterilisasi dengan radiasi ultraviolet (UV)
 Efek maksimum : pada gel. radiasi 265 nm
 Aplikasi :
•
Untuk sterilisasi ruangan/udara.
•
Inaktivasi mikroorganisme pada permukaan bahan.
•
Produk yang tidak stabil, dan sulit disterilkan dengan cara
konvensional.
HANDBOOK OF TA HAYATI
14
INDIKATOR STERILISASI
•
Indikator Fisik/Mekanik
•
Indikator Kimia
•
Indikator Biologis
INDIKATOR FISIK/MEKANIK
• Bagian dari mesin sterilisasi.
• Biasanya menunjukkan bahwa alat berfungsi baik.
• Contoh : Pada alat high prevacum autoclave yang menunjukkan hub. T dan P
 konstan  proses sterilisasi sempurna.
INDIKATOR KIMIA
• Yaitu indikator dari bahan kimia yang pada temperatur tertentu (± 121OC) akan
berubah warna.
• Contoh : autoclave tape, wipack med.
HANDBOOK OF TA HAYATI
15
INDIKATOR BIOLOGIS
Menggunakan bakteri thermophilus dan kertas pH/pH meter.
Kontrol Kualitas
Selain dengan penggunaan indikator, kontrol kualitas sterilisasi juga dapat dilakukan
dengan kalibrasi alat secara periodik dan ditetapkan standar deviasinya.
HANDBOOK OF TA HAYATI
16
BAB III
INOKULASI MIKROORGANISME
INOKULASI=KULTUR=BIAK=TUMBUH
 Inokulasi adalah penempatan sesuatu dengan tujuan penumbuhan atau
reproduksi.
 Inokulasi mikroorganisme  penempatan mikroorganisme dari suatu suspensi
ke media steril agar dapat tumbuh dan berkembangbiak.
 Media steril yang dimaksud disini  media padat dan cair dalam petri/tabung.
 Ketika kita akan mengamati dan mempelajari flora bakteri pada tubuh, tanah,
air, makanan dan lingkungan sekitar kita lainnya, kita akan menemukan
populasi mikroorganisme campuran. Mikroorganisme jarang ditemukan dalam
satu spesies.
 Hal yang penting dilakukan agar dapat mempelajari karakteristik kultur,
morfologi dan fisiologi satu spesies mikroorganisme adalah pemisahan
mikroorganisme tersebut dari spesies lainnya. Dengan kata lain, kita harus
membuat suatu biakan murni dari mikroorganisme tersebut.
 Pure culture = biakan murni.
BIAKAN MURNI
 Bagaimana memperoleh suatu biakan murni  teknik aseptik.
 Tidak tercemar dari luar  biasanya dari udara.
 Media yang digunakan harus steril.
 Untuk memperoleh biakan murni dapat dilakukan pengenceran dengan
menggunakan bahan cair atau bahan padat.
HANDBOOK OF TA HAYATI
17
TEKNIK ASEPTIK
 Teknik aseptik mengacu pada praktek yang dilakukan oleh para ahli
mikrobiologi untuk mematikan seluruh mikroorganisme yang dapat
mencemari media, sel/jaringan hidup dan suatu proses pemindahan
mikroorganisme pada biakan.
 Transfer
atau
pemindahan
meliputi
pemindahan
suatu
mikroorganisme dari koloninya pada media padat ke media cair atau
inokulasi mikroorganisme pada suatu media padat maupun cair
(Dibutuhkan saat memindahkan mikroorganisme dari suspensi
mikroorganisme ke media steril).
 Suatu proses aseptik dikatakan sukses apabila tidak terdapat
mikroorganisme pencemar yang dapat mencemari proses.
HANDBOOK OF TA HAYATI
18
Prosedur Umum
 Desinfeksi area kerja.
o Area kerja harus didesinfeksi terlebih dahulu untuk mengurangi
kontaminan yang dapat mencemari proses aseptik.
 Ose dan jarum harus steril.
o Cara sterilisasi adalah dengan cara fiksasi dengan panas/pemijaran
menggunakan lampu bunsen.
o Pemanasan dapat mematikan mikoorganisme pencemar.
 Pemijaran/pemanasan pada tabung.
o Pada mulut tabung terkandung mikroorganisme yang dapat mencemari
biakan. Oleh karena itu, lakukan pemijaran/pemanasan pada mulut
tabung menggunakan lampu bunsen.
 Desinfeksi akhir.
o Setelah melakukan suatu proses aseptik, lakukan desinfeksi akhir untuk
mematikan mikroorganisme yang kemungkinan tertinggal.
Teknik Biakan Murni
 Teknik Penggoresan Agar (Streak plate method)
 Teknik Agar Tuang (Pour plate method)
 Teknik Agar Sebar
 Teknik Tusukan  gelatin
Media Biakan
 Media biakan yang digunakan pada inokulasi :
 Media pembiakan dasar
 Media pembiakan penyubur
 Media pembiakan selektif
HANDBOOK OF TA HAYATI
19
Media Pembiakan Dasar
 Adalah media pembiakan sederhana yang mengandung zat-zat yang umum
diperlukan oleh sebagian besar mikroorganisme dan dipakai sebagai komponen
dasar dalam pembuatan media pembiakan lainnya.
 Mengandung pepton dan ekstrak daging.
Media Pembiakan Penyubur
 Komponen sama seperti pada media pembiakan dasar, ditambah darah, ekstrak
hati, dsbnya.
 Zat tambahan  untuk mempersubur pertumbuhan mikroorganisme tertentu,
yang pada media pertumbuhan dasar tidak dapat tumbuh dengan baik.
Media Pembiakan Selektif
 Menghambat pertumbuhan mikroorganisme lain yang tidak dicari.
 Berdasarkan konsistensi :
 Bentuk cair  broth
 Bentuk padat (lempeng, miring, tegak)
BIAKAN MURNI
 Dengan biakan murni  nantinya akan diperoleh koloni terpisah yang
mengandung satu macam mikroorganisme dalam satu petri.
 Hasil akhir  koloni yang terpisah.
Urutan : Suspensi mikroorganisme campuran  biakan murni  isolasi (satu macam
mikroorganisme).
Setelah mendapatkan biakan murni, lakukan proses identifikasi mikroorganisme.
HANDBOOK OF TA HAYATI
20
STREAK PLATE METHOD
 Dikenal dengan teknik penggoresan agar.
 Metode ini hemat waktu dan ekonomis, hanya saja membutuhkan keterampilan
menggores yang dapat diperoleh dengan pengalaman.
 Penggoresan yang baik nantinya akan dapat menghasilkan isolat yang baik.
 Untuk mendapatkan koloni terpisah pada saat penggoresan, perhatikan :
o Dinginkan ose setelah dipijarkan.
 Gunakan ose yang telah dingin untuk menggores pada permukaan
lempengan agar.
 Ose yang panas akan mematikan mikroorganisme sehingga tidak
terjadi pertumbuhan pada bekas goresan.
o Ose disentuhkan pada lempengan agar.
 Pada saat menggores, ose dibuat meluncur diatas permukaan
lempengan agar.
 Agar jangan sampai terluka, karena agar yang luka mengganggu
pertumbuhan
mikroorganisme sehingga nantinya akan sulit memperoleh koloni
terpisah.
o Pijarkan ose setelah menggores satu daerah.
 Pemijaran ose mematikan mikroorganisme yang melekat pada
mata ose dan mencegah pencemaran pada penggoresan daerah
berikutnya.
o Gunakan tutup cawan petri untuk melindungi permukaan agar dari
pencemaran.
o Balikkan lempengan agar untuk mencegah air kondensasi jatuh ke atas
permukaan agar.
o Apabila air kondensasi jatuh ke koloni, akan menghancurkan koloni dan
seluruh teknik biakan yang telah dilakukan.
HANDBOOK OF TA HAYATI
21
Beberapa teknik goresan :
 Goresan T :
 Lempengan dibagi menjadi 3 bagian dengan membentuk huruf T pada
bagian luar dasar petri.
 Inokulasi daerah I sebanyak mungkin dengan gerakan sinambung.
 Panaskan ose dan biarkan dingin kembali.
 Gores ulang daerah I sebanyak 3-4 kali dan teruskan goresan di daerah
II.
 Pijarkan ose dan biarkan dingin kembali.
 Ulangi prosedur 3-5 untuk menggores daerah III.
 Pijarkan ose.
 Goresan Kuadran :
 Sama dengan goresan T, hanya saja lempengan agar dibagi 4.
 Goresan Radian
 Goresan dimulai di bagian pinggir lempengan.
 Pijarkan ose dan dinginkan kembali.
 Putar lempengan agar 900 dan buat goresan terputus dimulai dari bagian
pinggir lempengan.
 Putar lempengan agar 900 dan buat goresan terputus diatas goresan
sebelumnya.
 Pijarkan ose.
 Goresan Sinambung
 Ambil satu mata ose suspensi dan gores secara sinambung pada setengah
permukaan lempengan agar.
 Jangan pijarkan ose, putar lempengan 1800, gunakan sisi mata ose yang
sama dan gores pada sisa permukaan lempengan agar.
HANDBOOK OF TA HAYATI
22
Contoh hasil penggoresan
POUR PLATE METHOD
 Dikenal dengan teknik agar tuang.
 Isolasi menggunakan media cair dengan cara pengenceran.
 Dasar melakukan pengenceran adalah penurunan jumlah mikroorganisme
sehingga pada suatu saat hanya ditemukan satu sel dalam tabung.
 Pada metode ini, dilakukan pengenceran satu mata loop suspensi ke dalam tiga
tabung, sehingga akan diperoleh lempengan dengan jumlah bakteri yang
optimum untuk isolasi.
 Teknik ini lebih mudah karena tidak memerlukan keterampilan seperti pada
teknik penggoresan.
HANDBOOK OF TA HAYATI
23
TEKNIK AGAR SEBAR
 Langkah pertama sama dengan POUR PLATE METHOD.
 Kemudian media agar yang telah ditanami oleh mikroorganisme disebari oleh
cairan dibantu dengan suatu alat penyebar yang telah disterilkan.
 Alat penyebar terbuat dari gelas.
 Cara :
 Pipet 0,1 ml cairan dari botol pengencer dan biarkan cairan mengalir ke
atas permukaan agar.
 Cairan disebarkan dengan alat penyebar.
 Sterilisasi penyebar dilakukan dengan mencelupkan ke alkohol 
dipanaskan.
 Setelah itu penyebar didinginkan terlebih dahulu sebelum digunakan
untuk menyebarkan cairan di permukaan agar.
 Penyebaran dilakukan dengan memutar petri.
TEKNIK TUSUKAN
 Menggunakan jarum (needle), bukan ose.
 Jarum (needle) ditusukkan hingga ke dasar media.
 Sterilisasi jarum (needle) sama dengan ose.
 Media  gelatin.
HANDBOOK OF TA HAYATI
24
Cara Pemeriksaan Pertumbuhan Mikroorganisme
 Media Pembiakan Cair
 Media menjadi keruh merata (homogen) atau tampak granuler melekat
pada dinding dan dasar tabung.
 Permukaan cairan berbentuk membran.
 Apakah pertumbuhan menghasilkan gas atau tidak.
 Apakah pertumbuhan menimbulkan bau yang khas.
KOLONI
 Sifat Koloni
 Adalah sifat yang berhubungan dengan bentuk, susunan, permukaan,
pengkilatan dsb.
 Dapat diamati tanpa mikroskop  makroskopi.
 Media Pembiakan Padat
 Pada semua media pembiakan padat umumnya, baik yang berbentuk
lempeng maupun miring perlu diperhatikan sifat-sifat koloni:
 Bentuk koloni  koloni bulat, memanjang, tepi rata, tidak rata.
 Ukuran koloni  menurut diameter rata-rata, ukuran koloni
berbeda-beda pada berbagai jenis, selebar titik hingga menutupi
permukaan media.
 Kenaikan permukaan  koloni yang rata dengan permukaan
media, ada koloni yang timbul diatas permukaan media.
HANDBOOK OF TA HAYATI
25
Sifat-sifat Umum Koloni
 Halus kasarnya permukaan  koloni yang permukaannya halus, ada juga yang
kasar.
 Wajah permukaan  koloni yang permukaannya mengkilap, ada yang kusam.
 Warna  keputihan atau kekuning-kuningan, kemerah-merahan, coklat, jingga,
biru, hijau, ungu.
 Kepekatan  koloni lunak seperti lendir, lunak seperti mentega, ada juga yang
keras dan kering.
 Bau koloni  ada koloni yang berbau khas dan ada yang tidak berbau sama sekali.
Gambar contoh koloni baik pada media cair (broth), agar, maupun gelatin
HANDBOOK OF TA HAYATI
26
 TEKNIK SUBKULTUR
 Langkah selanjutnya setelah mendapatkan biakan murni adalah
memindahkan mikroorganisme dari cawan petri ke tabing berisi nutrient
broth atau nutrient agar (subkultur). Hasil dari subkultur kemudian
diinkubasi selama 24 jam. Pewarnaan mikroorganisme dilakukan untuk
memeriksa apakah sudah terbentuk biakan yang benar-benar murni atau
belum.
 Ketika memindahkan mikroorganisme dari suatu cawan petri yang
mengandung media, sebaiknya menggunakan jarum yang ditusukkan.
Jarum ditusukkan pada bagian tengah koloni untuk mendapatkan koloni
yang benar-benar mengandung satu macam mikroorganisme saja.
HANDBOOK OF TA HAYATI
27
BAB IV
PEWARNAAN BAKTERI
BAKTERI
 Hanya dapat dilihat dengan mikroskop  mikroskopi.
 Satuan untuk ukuran bakteri  mikron.
 Bakteri rata-rata berukuran lebar 0,5-1 mikron dan panjang hingga 10 mikron.
 1 mikron = 10-3 mm.
BENTUK BAKTERI
 Bulat/bola :
 Monococcus
 e.g. Neisseria gonorrhoeae (penyebab kencing nanah).
 Diplococcus
 e.g. Diplococcus pneumoniae (penyebab penyakit pneumonia).
 Sarkina.
 Streptococcus.
 Staphylococcus.
 Batang (Basil)
 Basil tunggal
 e.g. Salmonella typhi (penyebab penyakit tifus).
 Diplobasil
 Streptobasil
 e.g. Bacillus anthracis (penyebab penyakit antraks).
HANDBOOK OF TA HAYATI
28
 Melilit
 Spiral; sel tubuh umumnya kaku.
 e.g. Spirillum.
 Vibrio; seperti koma.
 e.g. Vibrio cholerae (penyebab penyakit kolera).
 Spirochaeta; dapat memanjang dan memendek karena sifatnya yang sangat lentur.
PEWARNAAN BAKTERI
 Tubuh bakteri tidak mengadsorpsi dan membiaskan cahaya sehingga sukar diamati walau sudah
menggunakan mikroskop.
 Untuk melihat bakteri dengan jelas  tubuhnya diisi dengan zat warna  PEWARNAAN
BAKTERI.
 Zat warna mengadsorpsi dan membiaskan cahaya sehingga kontras tubuh bakteri dengan
sekelilingnya ditingkatkan
o Sudah dilakukan sejak pertengahan abad ke-19, oleh Louis Pasteur dan Robert Koch.
o Ada 2 macam zat warna yang sering dipakai:

Zat warna bersifat asam : komponen warnanya adalah anion (-).

Zat warna bersifat alkali : komponen warnanya adalah kation (+).
 Muatan negatif banyak ditemukan pada dinding sel, membran sel, dan sitoplasma  muatan
positif pada zat warna alkali akan berikatan dengan muatan negatif dalam sel  bakteri
akan lebih jelas terlihat.
 Zat warna asam digunakan untuk mewarnai bagian sel yang bermuatan positif.
Pewarnaan Positif :
 Yang diwarnai adalah bakteri.
 Bisa menggunakan zat warna asam dan alkali
Pewarnaan Negatif
 Beberapa bakteri sukar diwarnai dengan zat warna alkali  lakukan pewarnaan negatif.
 Latar belakang di sekeliling bakteri diwarnai untuk meningkatkan kontras dengan bakteri yang tidak
berwarna.
HANDBOOK OF TA HAYATI
29
 Cara  bakteri dicampur dengan nigrosin  gesekkan di object glass  zat warna akan mewarnai
lingkungan sekitar bakteri, bukan bakteri  dengan mikroskop, bakteri akan terlihat tidak
berwarna dengan latar belakang hitam.
 Pada metode ini  preparat tidak dipanaskan, tetapi dikeringkan di udara.
Ciri pewarnaan negatif :
 Menggunakan zat warna asam (bermuatan negatif).
 Penggunaan zat warna asam menyebabkan zat warna tidak akan mewarnai permukaan sel yang
mempunyai muatan negatif.
 Pewarnaan ini bukan merupakan pewarnaan sel bakteri karena sel bakteri tetap tidak berwarna
setelah penambahan zat warna.
Larutan zat warna yang digunakan  larutan encer (<1%).
Larutan encer yang dibiarkan berkontak agak lama dengan bakteri bekerja lebih baik dari larutan
pekat dengan waktu yang singkat.
Setelah dilakukan pewarnaan, dalam tubuh bakteri akan terjadi proses pertukaran ion-ion zat
warna dengan ion-ion yang terdapat pada bagian tubuh/sel bakteri.
MORDANT  Zat yang dapat bergabung dengan komponen zat warna tertentu, sehingga terbentuk
senyawa yang tidak dapat larut dan melekat pada tubuh bakteri.
 Contoh : ammonium oksalat, fenol, asam tanat, garam aluminium, besi, timah, seng,
tembaga, krom dll.
 Cara penggunaan :
o Sebelum penambahan zat warna
o Dimasukkan ke dalam campuran zat warna
o Diberikan antara pemakaian dua larutan zat warna
CARA PEWARNAAN
 Pewarnaan Sederhana
 Mudah dan cepat
 Untuk membedakan bakteri dari benda-benda mati lain yang bukan bakteri dan
untuk melihat bentuk, ukuran dan penataan bakteri.
 Zat warna hanya terdiri satu macam yang dilarutkan dalam suatu pelarut.
HANDBOOK OF TA HAYATI
30
 Misal : kristal violet, methylen blue, safranin (zat warna alkali), nigrosin, merah
kongo (zat warna asam).
 Pewarnaan Khusus
 Untuk melihat salah satu struktur sel.
 Pewarnaan Kapsel
 Pewarnaan Spora
 Pewarnaan Flagela
 Pewarnaan Badan Inklusi
 Pewarnaan Diferensial
 Digunakan lebih dari satu zat warna.
 Adakalanya menggunakan pelarut yang sama (satu larutan mengandung dua atau
lebih zat warna).
 Adakalanya menggunakan pelarut yang berbeda.
 Contoh : pewarnaan Gram, pewarnaan Tahan Asam (Ziehl-Neelsen).
Sediaan (preparat) untuk proses pewarnaan
 Dibuat ulasan bakteri diatas object glass
 Jumlah bakteri dalam ulasan jangan terlalu padat dan jangan terlalu encer.
 Apabila terlalu padat, akan terlihat menumpuk di bawah mikroskop. Apabila terlalu
cair, tidak akan terlihat dibawah mikroskop.
 Keringkan di udara sebentar.
 Fiksasi  melewatkan preparat diatas api.
 Fiksasi berguna untuk melekatkan bakteri pada object glass dan mematikan bakteri.
 Proses pewarnaan.
HANDBOOK OF TA HAYATI
31
PEWARNAAN KHUSUS
 Pewarnaan Kapsel
 Kapsel  lapisan yang melekat di luar dinding sel yang terdiri dari polisakarida atau
polipeptida.
 Fungsi kapsel  melindungi bakteri terhadap sel fagosit.
 Bacillus anthracis, Streptococcus pneumoniae, S.mutans.
 Lapisan kapsel  tebal, sukar diwarnai  Jadi digunakan pewarnaan negatif.
 Pada pewarnaan negatif  latar belakang diwarnai zat warna asam, sedangkan
bakteri diwarnai dengan zat warna alkali. Kapsel tidak menyerap warna sehingga
terlihat sebagai lapisan tembus-terang dengan latar belakang yang berwarna.
 Pewarnaan Spora
 Spora pada bakteri  struktur tahan panas dan bahan kimia.
 Spora  dibentuk oleh bakteri pada saat keadaan/ lingkungan tidak menguntungkan.
 Bacillus, Clostridium.
 Lapisan luar spora  penahan yang baik terhadap bahan kimia, sehingga spora sukar
diwarnai.
 Spora bakteri  diwarnai dengan cara dipanaskan.
 Pemanasan menyebabkan lapisan luar spora mengembang, sehingga zat warna dapat
masuk.
 Pewarnaan Flagela
 Flagela  tipis dan panjang  sukar dilihat di bawah mikroskop cahaya.
 Flagela pada bakteri  sebagai alat gerak.
 Pewarnaan  menggunakan mordant untuk membengkakkan flagela.
 Pewarnaan Badan Inklusi
 Beberapa bakteri  mensintesis badan inklusi atau granula yang disimpan dalam
sitoplasma.
HANDBOOK OF TA HAYATI
32
 Granula  cadangan bahan makanan dan merupakan sumber karbon dan energi
yang siap pakai.
 Dalam sel bakteri  badan inklusi berupa granula metakromatik, asam poli-betahidroksibutirat, pati dan glikogen.
PEWARNAAN DIFERENSIAL
 Pewarnaan Gram
 Dilakukan pertama kali oleh Christian Gram.
 Paling banyak digunakan di laboratorium.
 Untuk memisahkan bakteri menjadi kelompok Gram-positif dan Gram-negatif.
 Bakteri Gram-positif berwarna ungu disebabkan kompleks zat warna kristal violetiodium tetap bertahan walaupun sudah diberi larutan pemucat.
 Bakteri Gram-negatif berwarna merah karena kompleks tersebut larut sewaktu
pemberian larutan pemucat dan menjadi warna merah.
 Memberikan hasil baik  bila digunakan biakan segar berusia 24-48 jam.
 Biakan segar  dinding sel belum mengalami kerusakan.
 Biakan tua  dinding sel sudah mulai mengalami kerusakan  zat warna dapat
keluar saat diberikan larutan.
Gram-positif
Gram-negatif
Kristal violet
Ungu
Ungu
Larutan mordant
Ungu
Ungu
Ungu
Tidak
(lugol)
Larutan pemucat
(aseton, alkohol)
Safranin
HANDBOOK OF TA HAYATI
berwarna
Ungu
Merah
33
 Perbedaan pada tahapan pewarnaan Gram disebabkan oleh :
 Perbedaan struktur dinding sel bakteri Gram-positif dan Gram-negatif
 Bakteri Gram-positif : dinding sel mengandung peptidoglikan.
 Bakteri Gram-negatif : dinding sel mengandung lipida.
 Pada bakteri Gram-negatif, lipida akan larut saat diberikan larutan pemucat (aseton,
alkohol).
 Kompleks kristal violet-iodium yang terbentuk pada dinding sel juga ikut larut.
 Safranin. Pada bakteri Gram-negatif, penambahan safranin menyebabkan sel bakteri
berwarna merah.
 Fungsi safranin  sebagai pembeda (kontras) terhadap warna kristal violet-iodium.
 Larutan mordant  meningkatkan afinitas pengikatan zat warna oleh bakteri
sehingga pengikatan zat warna oleh bakteri menjadi lebih kuat.
 Setelah penambahan larutan mordant  zat warna lebih sulit dilarutkan sehingga zat
warna akan lebih jelas terlihat.
 Larutan mordant  lugol.
 Tanpa penambahan larutan lugol  zat warna kristal violet-iodium akan larut
sewaktu penambahan larutan pemucat, sehingga bakteri Gram-positif tidak akan
berwarna ungu.
TABEL PEWARNAAN DIFERENSIAL (pewarnaan Gram)
No
Bakteri Gram-positif
Bakteri Gram-negatif
1
Sensitif terhadap penisilin
Sensitif terhadap streptomisin
2
Resisten terhadap alkali;tidak larut
Sensitif terhadap alkali;larut oleh
oleh 1% KOH
1% KOH
Biasanya coccus atau basil
Biasanya basil bukan pembentuk
pembentuk spora
spora
Dapat bersifat tahan asam
Biasanya tidak pernah tahan
3
4
asam
HANDBOOK OF TA HAYATI
34
 Pewarnaan Ziehl-Neelsen
 Untuk memisahkan bakteri menjadi kelompok tahan asam dan tidak tahan asam.
TABEL PEWARNAAN DIFERENSIAL (pewarnaan Ziehl-Neelsen)
Tahan Asam
Tidak Tahan Asam
Karbol fuksin
Merah
Merah
Larutan pemucat
Merah
Tidak berwarna/pucat
Merah
Biru
( mengandung asam
dan alkohol)
Biru metilen
 Zat warna pertama  karbol fuksin.
 Pada bakteri yang tidak tahan asam, setelah diberi larutan pemucat  karbol fuksin
akan melarut dengan cepat  sel bakteri tidak berwarna.
 Setelah penambahan zat warna kedua (biru metilen)  bakteri tidak tahan asam
berwarna biru.
 Mycobacterium dan Nocardia  bakteri tahan asam.
 Memiliki keistimewaan karena dinding sel mengandung lipida yang terlihat sebagai
lapisan lilin.
 Kandungan lipida  mencapai 60% dari berat dinding sel  sukar diwarnai karena
zat warna tidak bisa menembus lapisan lilin.
 Oleh karena itu, digunakan pemanasan sehingga zat warna dapat masuk ke dalam sel
bakteri yang mengandung lipida.
HANDBOOK OF TA HAYATI
35
BAB V
UJI IDENTIFIKASI BAKTERI
 Media untuk uji identifikasi bakteri
–
Endo Agar
–
Brilliant Green Agar
–
Mac Conkey Agar
–
China-Blue Lactose Agar
–
Manitol Salt Agar
–
Agar Darah
–
Litmus Milk
 Media selektif : mengandung paling sedikit 1 bahan yg menghambat perkembangan bakteri yg
tidak diinginkan dan membolehkan perkembangbiakkan bakteri tertentu yg ingin diisolasi.
Contoh : antibiotika (streptomycin, penisilin), kristal violet dsb.
 Media diferensial : berbagai kelompok bakteri dapat tumbuh pada media ini.
 Kelompok bakteri dapat dibedakan berdasarkan perubahan pada media biakan atau penampilan
koloninya.
ENDO AGAR
 Mengandung : laktosa, Na-sulfit
 Sifat pertumbuhan koloni :
 Bakteri yang tidak memfermentasikan laktosa  terlihat sebagai koloni yang tembus
terang, tidak berwarna dan dikelilingi oleh media yang berwarna merah muda.
 Bakteri yang memfermentasikan laktosa  terlihat sebagai koloni yang berwarna
merah metalik dan dikelilingi oleh media yang berwarna kemerahan.
HANDBOOK OF TA HAYATI
36
TABEL ENDO AGAR
Koloni
Bakteri
Tidak berwarna, bening
Laktose negatif
(Salmonella, Shigella)
Merah metalik
Laktose positif (E.coli)
Merah muda
Enterobacter,
Klebsiella,
Citrobacter
BRILLIANT GREEN AGAR
 Mengandung gula laktosa dan sukrosa.
 Zat warna brilliant green menghambat pertumbuhan E. coli, Proteus dan Pseudomonas.
 Media ini banyak digunakan untuk isolasi dan identifikasi Salmonella dari tinja dan bahan
makanan.
 Indikator : merah fenol  merah (basa) , kuning (asam).
 Sifat pertumbuhan koloni :
 Salmonella  Koloni berwarna merah muda dikelilingi oleh media berwarna merah.
 Proteus  Akan terlihat sebagai koloni merah tanpa penyebaran koloni.
 Pseudomonas  Koloni kecil berwarna merah dengan permukaan yang menjorok ke
dalam.
 Bakteri yang memfermentasikan laktosa atau sukrosa  Pertumbuhan kelompok
bakteri ini juga dihambat. Akan tampak sebagai koloni hijau-kuning dikelilingi oleh
media yang berwarna hijau-kuning.
HANDBOOK OF TA HAYATI
37
MAC CONKEY AGAR
 Mengandung laktosa, garam empedu.
 Media ini menghambat pertumbuhan bakteri Gram-positif.
 Koloni dari bakteri Gram-negatif yang memfermentasikan laktosa berwarna merah bata dan
dapat dikelilingi oleh endapan garam empedu.
 Endapan garam empedu  karena penguraian laktosa menjadi asam yang akan bereaksi
dengan garam empedu.
 Bakteri yang tidak memfermentasikan laktosa biasanya bersifat patogen  tidak
memperlihatkan perubahan pada media. Warna koloni = warna media.
TABEL MAC CONKEY AGAR
Koloni
Bakteri
Serupa media
Salmonella, Shigella
Merah, dikelilingi oleh
E. coli
zona keruh
Merah muda
Enterobacter, Klebsiella
Kecil dan tidak terang
Enterococcus,
tembus
Staphylococcus
CHINA-BLUE LACTOSE AGAR
 Untuk membedakan bakteri yang memfermentasikan dan tidak memfermentasikan
laktosa.
 Tidak ada bahan yang menghambat pertumbuhan bakteri.
 Bakteri Gram-positif dan Gram-negatif dapat tumbuh pada media ini.
 Penguraian laktosa menjadi asam akan terlihat karena adanya indikator china blue
sehingga warna akan menjadi biru tua.
HANDBOOK OF TA HAYATI
38
TABEL CHINA-BLUE LACTOSE AGAR
Koloni
Bakteri
Biru tua dikelilingi oleh zona biru
E. coli
Putih, kadang-kadang dikelilingi
Laktose-negatif
zona bening
Biru hijau dan tidak terang tembus
Staphylococcus
Biru muda dan tidak terang tembus
Enterococcus
MANITOL SALT AGAR
 Mengandung NaCl 7.5%, manitol.
 Digunakan untuk membedakan Staphylococcus yang bersifat patogen dan yang tidak
patogen.
 Indikator untuk melihat adanya pembentukan asam  merah fenol.
 Zona warna merah  disebabkan oleh manitol yang tidak terfermentasikan.
 Zona warna kuning  disebabkan oleh fermentasi manitol disertai pembentukan asam.
 Misal :
 S. aureus  membentuk zona kuning  patogen.
 S. epidermidis  membentuk zona merah  tidak patogen.
AGAR DARAH
 Untuk menumbuhkan bakteri yang sulit untuk dibiakkan dan untuk membedakan kelompok
bakteri yang melisis atau tidak melisiskan butir darah merah.
 Mengandung 5% darah domba.
 Lisis butir darah merah terlihat sebagai wilayah jernih di sekitar koloni.
 Jenis-jenis hemolisis :
o Beta-hemolisis : lisis sempurna, wilayah benar-benar jernih.
o Alpha-hemolisis : proses lisis tidak sempurna, media berwarna kehijauan.
HANDBOOK OF TA HAYATI
39
o Gamma-hemolisis : bakteri tidak mampu melisiskan butir darah merah dan tidak
menyebabkan perubahan nyata pada media.
o Proses hemolisis disebabkan oleh enzim yang dilepaskan bakteri.
LITMUS MILK
 Mengandung skim milk dan indikator litmus.
 Reaksi yang terjadi :
o Asam : Media berubah warna menjadi merah muda.
o Basa : Media berubah warna menjadi biru atau ungu.
o Reduksi : Media berubah warna menjadi putih.
o Koagulasi : Media akan terlihat padat karena koagulasi protein pada keadaan asam.
o Peptonisasi : Media berubah warna menjadi biru.
o Pembentukan Gas : Terjadi penguraian laktosa menjadi asam dan gas.
Contoh media uji identifikasi bakteri
Isolasi dan identifikasi mikroorganisme penyebab penyakit ataupun keracunan
harus dilaksanakan dengan cepat dan tepat sehingga pengobatan dapat diberikan
sedini mungkin. Morfologi mikroorganisme seperti bentuk, ukuran dan penataan
belum cukup untuk melakukan identifikasi suatu mikroorganisme. Oleh karena itu,
diperlukan teknik lain dalam uji identifikasi mikroorganisme, misalnya sifat biakan
HANDBOOK OF TA HAYATI
40
dan uji biokimia. Mikroorganisme yang akan diisolasi berasal dari biakan murni.
Setelah biakan murni diperoleh, serangkaian uji dilakukan untuk memperoleh sifat
biokimiawi mikroorganisme.
Acuan yang digunakan dalam identifikasi bakteri pada saat ini adalah
Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology. Identifikasi Bergey’s mendasarkan pada
morfologi, sifat faal dan sifat biokimiawi bakteri. Adapun tahapan dalam isolasi dan
identifikasi bakteri dari suatu suspensi sebagai berikut :
1. Pembiakan ; untuk mengetahui sifat biakan. Suspensi bakteri digoreskan pada
agar lempengan, agar miring atau media cair. Koloni yang terbentuk harus
diperhatikan untuk mengetahui sifat pertumbuhan bakteri pada biakan.
2. Pewarnaan
Pewarnaan Gram dibuat untuk mengetahui sifat Gram serta morfologi bakteri.
Jika diperoleh suatu bakteri berbentuk batang Gram-positif, harus ditentukan
ada dan tidak adanya endospora serta letaknya. Bakteri berbentuk batang
Gram-negatif jarang menghasilkan spora. Jika bakteri yang ditemukan
berbentuk batang, Gram-positif dan tidak membentuk spora, maka perlu
dilakukan pewarnaan Ziehl-Neelsen. Apabila diperlukan, pewarnaan khusus
dapat dilakukan.
3. Uji Biokimia
Setelah diperoleh koloni yang terpisah pada biakan, dapat dilakukan uji
biokimia. Uji biokimia memerlukan berbagai media, maka perlu dibuat biakan
harian (working culture) dari koloni terpisah tersebut.
HANDBOOK OF TA HAYATI
41
Penggunaan zat hara pada media (zat pati, lemak, protein, asam nukleat, asam
amino, sakarida) tergantung aktivitas metabolisme bakteri. Hasil sampingan dari
metabolisme tersebut dapat digunakan untuk identifikasi bakteri.
1. Uji Fermentasi Karbohidrat
 Hasil akhir fermentasi karbohidrat ditentukan oleh sifat bakteri, media
biakan yang digunakan, serta faktor lingkungan antara lain suhu dan pH.
Media fermentasi harus mengandung senyawa yang dapat dioksidasikan
dan difermentasikan oleh bakteri. Pembentukan asam hasil fermentasi dapat
diketahui dengan cara pemberian indikator ke dalam media.
 Media : Kaldu karbohidrat (glukosa, laktosa, manitol, maltosa dan sukrosa).
Media digunakan untuk uji pembentukan asam dan gas hasil fermentasi.
Pembentukan gas dapat ditentukan dengan menggunakan tabung Smith
atau Durham.
 Tabung Smith digunakan bila jumlah dan macam gas yang dihasilkan harus
ditentukan.
 Tabung Durham digunakan bila jumlah dan macam gas yang dihasilkan
tidak perlu diketahui. Bila terbentuk gas, gas masuk ke dalam tabung
Durham dan mendesak cairan dalam tabung ini; gas ini terlihat sebagai
gelembung udara yang terperangkap dalam tabung Durham.
 Asam hasil fermentasi menyebabkan penurunan pH. Indikator yang
digunakan : merah fenol dan bromcresol purple. Pembentukan asam
ditandai oleh perubahan warna menjadi kuning.
HANDBOOK OF TA HAYATI
42
2. Uji Metil Merah
 Uji metil merah sangat berguna dalam identifikasi kelompok bakteri yang
menempati saluran pencernaan.
 Pada uji fermentasi menggunakan tabung Durham, hasil produksi
fermentasi tidak diketahui.
 Uji metil merah digunakan untuk menentukan adanya fermentasi asam
campuran dengan menggunakan media : MR-VP (Methyl Red-Voges
Proskauer).
 Fermentasi asam campuran ditentukan dengan menumbuhkan bakteri dalam
kaldu yang mengandung glukosa dan menambahkan indikator metil merah
ke dalam kaldu setelah masa inkubasi. Indikator berwarna merah pada pH
4.4 dan berwarna kuning pada pH 6.2.
 Bila terjadi fermentasi asam campuran kaldu biakan akan tetap berwarna
merah karena terjadi penurunan pH pada kaldu biakan. Bila tidak terjadi
fermentasi asam campuran maka kaldu biakan akan menjadi berwarna
kuning.
3. Uji Voges-Proskauer
 Uji ini digunakan untuk identifikasi bakteri yang memfermentasikan
karbohidrat menjadi 2,3-butanadiol.
 Asetoin (asetilmetilkarbinol) adalah senyawa pendahulu dari 2,3butanadiol.
HANDBOOK OF TA HAYATI
43
 Penambahan KOH dan alphanaphtol dapat menentukan adanya asetoin.
Pada penambahan KOH, adanya asetoin ditunjukkan oleh perubahan warna
kaldu menjadi merah muda. Perubahan warna ini diperjelas dengan
penambahan larutan alphanaphtol.
 Media yang digunakan : MR-VP.
4. Respirasi Karbohidrat
Bakteri
menggunakan
glukosa
sebagai
sumber
energi
dengan
mengoksidasikannya menjadi piruvat melalui glikolisis. Piruvat masuk ke dalam
siklus Krebs. Dalam siklus Krebs, terjadi oksidasi menghasilkan proton dan
elektron. Proton dan elektron masuk ke dalam sistem transport elektron untuk
menghasilkan ATP. Proton dan elektron akan ditangkap oleh akseptor elektron,
misalnya oksigen atau nitrat. Bila akseptor elektron terakhir berupa oksigen,
prosesnya disebut respirasi aerobik. Bila akseptor elektron terakhir berupa
nitrat atau molekul inorganik lainnya, prosesnya disebut respirasi anaerobik.
a. Uji Oksidase
o Uji ini berguna untuk menentukan adanya oksidase sitokrom yang
ditemukan pada bakteri tertentu.
o Uji ini berguna dalam identifikasi bakteri patogen seperti Neisseria
gonorrhoea dan Pseudomonas aeruginosa.
o Bila koloni bakteri yang bersifat oksidase-positif diberi reagen oksidase
(dimetil-p-fenillendiamin oksalat), maka warna koloni berubah menjadi
hitam. Perubahan warna ini disebabkan oleh oksidase sitokrom yang
HANDBOOK OF TA HAYATI
44
mengoksidasi larutan reagen. Bila tidak terjadi proses oksidasi, misalnya
terjadi reaksi reduksi, tidak akan terjadi perubahan warna pada koloni.
b. Uji Katalase
o Pada bakteri berbentuk coccus, uji katalase berguna untuk membedakan
Staphylococcus dan Streptococcus. Kelompok Staphylococcus bersifat
katalase-positif, sedangkan kelompok Streptococcus bersifat katalasenegatif.
o Uji katalase menggunakan larutan H2O2. Pada bakteri bersifat katalasepositif terlihat pembentukan gelembung udara sekitar koloni. Reaksi :
H 2O 2  H 2O  1 / 2O 2
Katalase
Gelembung O2
o H2O2 bersifat toksik terhadap sel karena menginaktivasikan enzim dalam
sel.
o H2O2 terbentuk sewaktu metabolisme aerob, sehingga bakteri yang tumbuh
pada lingkungan aerob harus menguraikan zat toksik tersebut.
c. Uji Reduksi Nitrat
o Nitrat digunakan oleh beberapa bakteri sebagai akseptor elektron terakhir.
o Nitrat (NO3-) direduksi menjadi nitrit (NO2-) kemudian menjadi N2.
o Kemampuan mereduksikan nitrat digunakan sebagai ciri dalam identifikasi
bakteri. E. coli mereduksi nitrat menjadi nitrit, sedangkan P. aeruginosa
mereduksi mereduksi nitrat hingga menjadi N2.
HANDBOOK OF TA HAYATI
45
o Uji reduksi nitrat menggunakan kaldu nutrien yang mengandung KNO3 dan
tabung Durham. Perhatikan apakah terbentuk gas pada tabung serta nitrit
pada media biakan.
o Gas yang terperangkap dalam tabung Durham merupakan campuran gas N2
dan CO2.
o Gas N2 berasal dari penguraian sempurna nitrat, sedangkan CO2 berasal dari
siklus Krebs.
o Penambahan asam sulfamat dalam media biakan yang mengandung nitrit
akan menyebabkan pembentukan gelembung gas (N2) sebagai hasil reduksi
(NO2-) menjadi N2.
5. Uji Indol
 Gugus indol merupakan bagian dari asam amino triptofan. Dalam media
biakan, indol menumpuk sebagai produk buangan, sedangkan bagian lain
dari molekul triptofan digunakan untuk memenuhi kebutuhan zat hara
bakteri.
 Penumpukan indol dalam media biakan dapat diketahui dengan
penambahan reagens (Kovacs, Gore, Ehrlich dan Ehrlich-Bohme) yang
mengandung para-dimetil-aminobenzaldehida. Reagens akan bereaksi
dengan indol dan menghasilkan senyawa yang tidak larut dalam air dan
berwarna merah pada permukaan media biakan.
 Media yang digunakan bersifat semipadat, oleh karena itu dapat digunakan
juga untuk melihat pergerakan bakteri. Jika bakteri bergerak akan terlihat
pertumbuhan di sekitar tusukan dan juga pada permukaan media.
HANDBOOK OF TA HAYATI
46
6. Uji IMViC
 Uji untuk membedakan Enterobacter aerogenes dan E. coli.
 Uji IMViC terdiri dari Uji Indol-Metil Merah-Voges Proskauer-Citrat.
TABEL UJI IMViC
I
M
Vi
C
E. coli
+
+
-
-
A. aerogenes
-
-
+
+
7. Uji Hidrogen Sulfida
 Asam amino sistein dan metionin dihasilkan saat protein dihidrolisis untuk
memenuhi kebutuhan zat hara bakteri.
 Sistein dan metionin mengandung sulfur.
 Bakteri yang menghasilkan desulfurase sewaktu dibiakkan dalam media yang
kaya dengan asam amino yang mengandung sulfur akan membentuk H2S. Fe++
dalam biakan bereaksi dengan H2S dan menghasilkan senyawa FeS yang
berwarna hitam dan tidak larut dalam air.
8. Uji Dekarboksilase Lisin
 Dekarboksilasi merupakan proses penguraian gugus karboksil dari suatu
molekul organik.
 Proses dekarboksilasi asam amino menghasilkan CO2.
HANDBOOK OF TA HAYATI
47
 Proses dekarboksilasi lisin dapat diketahui dengan menumbuhkan bakteri
dalam biakan yang mengandung lisin, karbohidrat yang dapat difermentasikan
(glukosa) dan indikator pH untuk melihat perubahan pH. Indikator yang
digunakan adalah brom cresol purple (BCP).
 Asam yang dihasilkan dalam proses fermentasi glukosa akan menurunkan pH
media biakan dan menyebabkan perubahan warna dari ungu menjadi kuning.
 Dalam suasana asam, proses dekarboksilasi lisin dapat berlangsung sehingga
terjadi pembentukan amin yang menetralisasi suasana asam.
 Proses netralisasi asam ini terlihat sebagai perubahan warna dari kuning
menjadi ungu seperti sebelumnya.
 Perubahan
warna
ungu
ini
menunjukkan
bahwa
lisin
mengalami
dekarboksilasi.
 Uji dekarboksilasi lisin merupakan salah satu uji yang digunakan dalam
pencirian bakteri, terutama yang menempati saluran pencernaan.
9. Uji Deaminase Fenilalanin
 Deaminase mengkatalisasi pemindahan gugus amino (NH2) dari asam amino
dan molekul lainnya yang mengandung –NH.
 Asam organik yang dihasilkan dapat digunakan bakteri untuk biosintesis.
 Proses deaminasi menetralisasi amin yang menghambat pertumbuhan.
 Uji deaminasi fenilalanin dapat digunakan dalam identifikasi bakteri saluran
pencernaan.
HANDBOOK OF TA HAYATI
48
 Proses deaminasi fenilalanin menghasilkan asam fenilpiruvat. Reaksi asam
fenilpiruvat dengan ferri klorida (FeCl3) menghasilkan senyawa berwarna
hijau.
 Aktivitas enzim deaminase fenilalanin ditentukan dengan cara menumbuhkan
bakteri dalam media biakan yang mengandung fenilalanin dan menambahkan
beberapa tetes larutan FeCl3. Warna hijau setelah penambahan reagens
menunjukkan bahwa fenilalanin telah dideaminasikan.
10. Uji Sitrat
 Uji sitrat digunakan untuk melihat kemampuan bakteri menggunakan sitrat
sebagai satu-satunya sumber karbon dan energi.
 Digunakan media sitrat-Koser (cair) atau sitrat-Simmon (padat).
 Sitrat-Simmon mengandung Na sitrat (sumber karbon), NH4+ sebagai sumber
N dan biru bromtimol sebagai indikator.
 Pada media sitrat-Koser, tidak terkandung indikator.
 Bila bakteri mampu menggunakan sitrat yang terkandung pada media sitratSimmon, maka asam akan dihilangkan dari media biakan, terjadi peningkatan
pH dan mengubah warna media dari hijau menjadi biru.
 Pada media sitrat-Koser, kemampuan menggunakan sitrat ditunjukkan oleh
kekeruhan yang menandakan adanya pertumbuhan.
HANDBOOK OF TA HAYATI
49
BAB VI
UJI MIKROORGANISME KUANTITATIF
Uji Kuantitatif Bakteri
Untuk menentukan jumlah bakteri dapat digunakan beberapa cara, antara lain :
 Jumlah bakteri secara keseluruhan (total cell count); dihitung semua bakteri
baik yang hidup maupun yang mati.
 Jumlah bakteri yang hidup (viable count); dihitung bakteri yang hidup saja.
A. Perhitungan Jumlah Bakteri secara Keseluruhan
a. Menghitung langsung secara mikroskopik
Digunakan object glass khusus (Petroff-Hauser) berbentuk persegi. Jumlah
cairan yang terdapat antara object glass dan kaca penutup memiliki volume
tertentu, sehingga satuan isi yang terdapat dalam persegi juga tertentu.
Hanya cairan yang mengandung bakteri dalam jumlah tinggi yang dapat
menggunakan cara ini. Perhitungan langsung dengan menggunakan mata
atau alat bantu hitung.
b. Menghitung dengan cara kekeruhan
Cara ini menggunakan spektrofotometer atau nefelometer. Cahaya yang
diabsorbsi ~ banyaknya sel bakteri.
HANDBOOK OF TA HAYATI
50
B. Perhitungan Jumlah Bakteri Hidup
1. standard plate count/hitungan cawan/angka lempeng total.
 Setiap satu sel bakteri dalam suspensi diasumsikan akan tumbuh menjadi satu
koloni setelah diinkubasikan dalam media dan lingkungan yang sesuai.
 Metode hitungan cawan merupakan cara yang paling sensitif untuk
menghitung jumlah bakteri karena :
1. Hanya sel bakteri yang masih hidup yang dihitung.
2. Beberapa jenis bakteri dapat dihitung sekaligus.
3. Dapat digunakan untuk isolasi dan identifikasi bakteri karena koloni
yang terbentuk mungkin berasal dari satu sel bakteri dengan
penampakan pertumbuhan spesifik.
 Kelemahan metode hitungan cawan :
1. Hasil perhitungan tidak menunjukkan jumlah sel bakteri yang
sebenarnya karena beberapa sel yang berdekatan mungkin membentuk
satu koloni.
2. Media dan kondisi yang berbeda menghasilkan nilai yang berbeda.
3. Bakteri yang ditumbuhkan harus dapat tumbuh pada media padat dan
membentuk koloni yang jelas.
4. Memerlukan persiapan dan waktu inkubasi beberapa hari sehingga
pertumbuhan koloni dapat dihitung.
HANDBOOK OF TA HAYATI
51
 Metode hitungan cawan :
Metode Tuang (Pour Plate)
Cara :
1. Dari pengenceran yang dikehendaki, sebanyak 1 ml dipipet ke dalam cawan
petri.
2. Kemudian ke dalam cawan petri tersebut, masukkan agar cair yang telah
didinginkan hingga 500C ± 15 ml.
3. Cawan petri digerakkan dengan gerakan melingkar untuk menyebarkan sel-sel
bakteri secara merata.
4. Setelah agar memadat, cawan petri tersebut diinkubasi dalam inkubator dengan
posisi terbalik.
5. Koloni yang terbentuk dihitung.
Metode Permukaan (Surface/Pour Plate)
Cara :
1. Agar steril dituang ke dalam cawan petri steril, biarkan membeku.
2. Setelah membeku sempurna, kemudian sebanyak 0,1 ml sampel yang telah
diencerkan dipipet pada permukaan agar tersebut, ratakan.
3. Inkubasi.
4. Hitung koloni yang terbentuk.
HANDBOOK OF TA HAYATI
52
 Cara menghitung koloni :
Contoh. Penetapan jumlah bakteri dalam susu.
 Pengenceran awal 1:10 (=10-1) dibuat dengan cara mengencerkan 1 ml susu
ke dalam 9 ml larutan pengencer, dilanjutkan dengan pengenceran yang
lebih tinggi, misalnya hingga 10-5 atau 10-6, tergantung pada mutu susu.
Semakin tinggi jumlah bakteri yang terdapat di dalam susu, semakin tinggi
pengenceran yang harus dilakukan.
 Jika setelah inkubasi misal didapat 60 dan 64 koloni masing-masing pada
cawan duplo yang mengandung pengenceran 10-4, maka jumlah koloni
dapat dihitung sebagai berikut :
Faktor pengenceran (fp) = Pengenceran x jumlah yang ditumbuhkan.
= 10-4 x 1.0
= 10-4
Jumlah koloni
= Jumlah koloni x 1/fp per cawan
= (60+64)/2 x 1/10-4
= 6.2 x 105
HANDBOOK OF TA HAYATI
53
Gambar contoh pengenceran
 Standar perhitungan (Standard Plate Count)
Cara menghitung koloni pada cawan adalah sebagai berikut :
1. Cawan yang dipilih dan dihitung adalah yang mengandung jumlah
koloni antara 30 dan 300. Cawan dengan jumlah koloni yang tinggi
(>300 koloni) sulit untuk dihitung sehingga kemungkinan kesalahan
perhitungan sangat besar. Pengenceran membantu untuk memperoleh
perhitungan yang tepat, tetapi pengenceran yang terlalu tinggi akan
menghasilkan cawan dengan jumlah koloni yang rendah (<30 koloni).
2. Beberapa koloni yang bergabung menjadi satu merupakan suatu
kumpulan koloni yang besar dimana jumlah koloninya diragukan, dapat
dihitung sebagai satu koloni.
3. Suatu deretan (rantai) koloni yang terlihat sebagai suatu garis tebal
dihitung sebagai satu koloni.
HANDBOOK OF TA HAYATI
54
Data yang dilaporkan harus mengikuti peraturan sebagai berikut :
1. Hasil yang dilaporkan hanya terdiri dari dua angka, yaitu angka pertama di
depan koma dan angka kedua di belakang koma. Jika angka yang ketiga sama
dengan atau lebih besar dari 5, harus dibulatkan satu angka lebih tinggi pada
angka yang kedua.
Jumlah koloni per pengenceran
Standard
Plate
10-2
10-3
10-4
Ket
Count
234
28
1
2.3 x 104
28 dan 1 <30
700
125
10
1.3 x 105
700>300;10<30
TBUD
TBUD
197
2.0 x 106
TBUD >300
* TBUD = Terlalu banyak untuk dihitung
2. Jika semua pengenceran yang dibuat menghasilkan angka kurang dari 30
koloni pada cawan petri, hanya jumlah koloni pada pengenceran terendah yang
dihitung. Hasilnya dilaporkan sebagai kurang dari 30 dikalikan dengan
besarnya pengenceran, tetapi jumlah yang sebenarnya harus dicantumkan
dalam tanda kurung.
HANDBOOK OF TA HAYATI
55
Jumlah koloni per pengenceran
Standard
Ket
Plate
10-2
10-3
1
16
10-4
Count
<3.0 x 103 Hit.
0
(1.6 x 103)
pengenceran
pada 10-2
3. Jika semua pengenceran yang dibuat menghasilkan lebih dari 300 koloni pada
cawan petri, hanya jumlah koloni pada pengenceran tertinggi yang dihitung,
misal dengan cara menghitung jumlahnya pada ¼ bagian cawan petri,
kemudian hasilnya dikalikan empat. Hasilnya dilaporkan sebagai lebih dari 300
dikalikan dengan besarnya pengenceran, tetapi jumlah yang sebenarnya harus
dicantumkan dalam tanda kurung.
Jumlah koloni per pengenceran
Standard
Ket
Plate
10-2
TBUD
10-3
TBUD
10-4
355
Count
> 3.0 x 106 Hit.
(3.6 x 106)
pengenceran
pada 10-4
TBUD
325
20
> 3.0 x 105 Hit.
(3.3 x 105)
pengenceran
pada 10-3
HANDBOOK OF TA HAYATI
56
4. Jika cawan dari dua tingkat pengenceran menghasilkan koloni dengan jumlah
antara 30 dan 300, dan perbandingan antara hasil tertinggi dan terendah dari
kedua pengenceran tersebut adalah lebih kecil atau sama dengan 2, tentukan
rata-rata dari kedua nilai tersebut dengan memperhitungkan pengencerannya.
Jika perbandingan antara hasil tertinggi dan terendah lebih besar dari 2, yang
dilaporkan hanya hasil terkecil.
Jumlah koloni per pengenceran
Standard
Plate
10-2
293
10-3
41
10-4
4
Ket
Count
3.5 x 104
Hit.
rata-
ratanya
karena
41000/29300
= 1.4 (<2)
140
32
2
1.4 x 104
Hit.
pengenceran
pada
10-2
karena
32000/14000
= 2.3 (>2)
HANDBOOK OF TA HAYATI
57
5. Jika digunakan dua cawan petri (duplo) per pengenceran, data yang diambil
harus dari kedua cawan tersebut, tidak boleh diambil salah satu, meskipun
salah satu dari cawan duplo tersebut tidak memenuhi syarat diantara 30 dan
300.
Jumlah koloni per pengenceran
Standard
Plate
10-2
10-3
10-4
175
16
1
208
17
0
Ket
Count
1.9 x 104
Rata-rata dari
pengenceran
10-2
138
42
2
162
43
4
1.5 x 104
Rata-rata dari
pengenceran
10-2
karena
perbandingan
antara
pengenceran
10-3 dan 10-2
adalah
2.8
(>2)
290
36
4
280
32
1
3.1 x 104
Rata-rata dari
pengenceran
10-2 dan 10-3
HANDBOOK OF TA HAYATI
58
karena
perbandingan
antara kedua
pengenceran
adalah
1.2
(<2)
291
25
3
305
27
0
3.0 x 104
Rata-rata dari
pengenceran
10-2
meskipun
305>300
(angka yang
lain <30)
Koliform adalah sekelompok bakteri yang digunakan sebagai indikator adanya
polusi atau kotoran dan kondisi sanitasi yang tidak baik terhadap air, makanan, susu
dan produk susu.
Koliform dibedakan atas : 1) Koliform fekal, misalnya E.coli dan 2) Koliform
non-fekal, misalnya Enterobacter aerogenes.
Untuk mengetahui jumlah koliform, digunakan metode MPN dan metode
membran filter. Kedua metode tersebut lebih sensitif dibandingkan metode hitungan
cawan karena dapat mendeteksi dan menghitung koliform dalam jumlah kecil.
HANDBOOK OF TA HAYATI
59
Uji kualitatif koliform terbagi atas uji penduga, uji penguat, uji lengkap. Uji
penduga merupakan uji kuantitatif koliform menggunakan metode MPN.
2. Metode MPN (Most Probable Number)
 Dikenal dengan metode Jumlah Perkiraan Terdekat.
 Dalam metode MPN digunakan media cair di dalam tabung reaksi, dimana
perhitungan dilakukan berdasarkan jumlah tabung yang positif, yaitu yang
ditumbuhi oleh bakteri tertentu setelah inkubasi pada suhu dan waktu tertentu.
 Pengamatan tabung yang positif dilihat dari timbulnya kekeruhan, atau
terbentuknya gas dalam tabung Durham untuk bakteri pembentuk gas.
 Pada umumnya untuk setiap pengenceran digunakan tiga atau lima seri tabung.
 Metode MPN biasanya dilakukan untuk menghitung jumlah bakteri dalam
sampel yang berbentuk cair, meskipun dapat pula digunakan untuk sampel
berbentuk padat dengan terlebih dahulu membuat suspensi 1 : 10 dari sampel
tersebut.
 Pengenceran harus lebih tinggi dibandingkan metode hitungan cawan.
 Cara kerja :
1. Buat seri pengenceran (minimal 3).
2. Inokulasikan tiap pengenceran pada 3 atau 5 seri tabung media MPN, yaitu
Lactosa Broth kemudian dilanjutkan dengan media Brilliant Green Lactose
Bile Broth.
3. Inkubasi dan diamati hasilnya.
4. Uji positif jika keruh atau terbentuk gas.
5. Gas dapat terlihat dari adanya rongga kosong pada tabung Durham.
HANDBOOK OF TA HAYATI
60
6. Sesuaikan dengan tabel MPN.
7. Hitung jumlah bakteri.
Rumus :
Jumlah bakteri = Indeks MPN x 1/Pengenceran tabung yang di tengah.
o Kombinasi : 3-2-1
o Nilai MPN dari tabel MPN 3 seri : 1.50
o MPN Bakteri
= Indeks MPN x 1/pengenceran tabung yang di tengah
= 1.50 x 1/10-3
= 1.5 x 103
 Uji Penduga
1. Buat seri media laktosa cair (Lactosa Broth) dengan suatu takaran air
tertentu (10 ml, 1 ml, 0.1 ml).
2. Inkubasi 24 jam, 370C.
3. Amati terjadinya gas.
 Uji Penguat
1. Dari tabung yang memberi hasil positif  timbul gas, ditanam ke dalam
media agar Endo atau EMB (Eosin Metilen Blue) atau BGLBB (Brilliant
Green Lactose Bile Broth).
2. Inkubasi pada suhu 370C selama 18-24 jam.
3. Amati terdapar E.coli bila :
o Pada Endo Agar  warna merah mengkilap logam
o Pada EMB  warna biru tua mengkilap logam
o Pada BGLBB  gas positif
HANDBOOK OF TA HAYATI
61
 Uji Lengkap
1. Dari koloni yang timbul (positif/meragukan) ditanam ke dalam media
laktosa dan agar miring.
2. Inkubasi pada suhu 370C selama 24-48 jam.
3. Amati pada :
o Laktosa  timbul gas.
o Koloni khas pada agar miring.
o Pewarnaan Gram-negatif  bentuk batang dan tidak berspora.
4. Untuk menentukan antara E.coli dengan golongan bentuk E.coli lainnya,
maka dari pemeriksaan uji lengkap diteruskan uji IMViC.
3. Metode Membran Filter
 Sebanyak 25-100 ml sampel (misal air atau susu) disaring melalui membran
filter steril dengan pori-pori 0.22 – 0.45 mikron dan diameter sekitar 5 cm.
 Membran filter diletakkan diatas agar cawan EMB atau Endo Agar dan
diinkubasikan pada suhu 350C – 370C. Jumlah koliform dinyatakan dalam
jumlah koliform per 100 ml sampel.
 Pada EMB :
1. Koloni koliform fekal  diameter 0.5-1.5 mm dan berwarna gelap
dengan sinar hijau metalik (keemasan).
2. Koloni koliform non-fekal  diameter 1.0-3.0 mm berwarna merah
muda dan bagian tengah berwarna gelap seperti mata ikan.
HANDBOOK OF TA HAYATI
62
 Pada Agar (mengandung laktosa) :
1. Koloni yang memfermentasikan laktosa (e.g. koliform)  membentuk
warna merah pada bagian atas koloni dan sekelilingnya.
2. Koloni bakteri yang tidak memfermentasikan laktosa (e.g. Salmonella
dan Shigella)  akan membentuk koloni yang tidak berwarna.
Uji Angka Kapang
1. Media PDA steril yang telah dicairkan dan didinginkan pada temperatur 40ºC
ditambahkan kloramfenikol sebesar 1ml/L, dan dituang ke dalam piring petri
hingga membeku.
2. Sebanyak 1 ml suspensi hasil pengenceran sampel dituang pada permukaan
media PDA yang telah beku dalam piring petri, yang mengandung
kloramfenikol, dan diratakan dengan bantuan spreader glass.
3. Piring petri selanjutnya diinkubasi pada temperatur 20-25ºC selama 3-5 hari.
Perhitungan jumlah koloni kapang/khamir yang tumbuh pada media dilakukan
sesuai cara perhitungan angka lempeng total (ALT) pada bakteri.
 Syarat jumlah bakteri dalam suatu sediaan <106 CFU (Colony Forming Unit)
per ml untuk bakteri.
 Syarat jumlah kapang/khamir dalam suatu sediaan <104 CFU/ml untuk
kapang/khamir.
HANDBOOK OF TA HAYATI
63
BAB VII
DESINFEKTAN
1817, Joseph Lister menggunakan desinfektan yang mengandung fenol untuk
mendesinfeksi peralatan bedahnya. Hingga sekarang, fenol digunakan sebagai larutan
baku penentu kekuatan desinfektan.
 Desinfektan adalah zat yang digunakan untuk mencegah atau mengendalikan
penularan dengan cara membasmi mikroorganisme patogen, apabila digunakan
pada objek yang tidak hidup/benda mati, misalnya desinfeksi pada alat kesehatan,
alat bedah dsb.
 Antiseptik adalah zat yang mampu membunuh/menghambat pertumbuhan
mikroorganisme dan digunakan pada jaringan hidup, misalnya kulit, gigi, mata.
 Desinfektan yang ideal :
1. Cepat membasmi mikroorganisme yang patogen dan potensial termasuk spora.
2. Penetran yang baik ke dalam bahan organik, misal kapas, karet.
3. Dapat bercampur dengan bahan-bahan organik, misal sabun, deterjen.
4. Tidak menjadi inaktif oleh jaringan hidup.
5. Tidak bersifat korosif.
HANDBOOK OF TA HAYATI
64
 Pengendalian = mereduksi jumlah kegiatan suatu mikroorganisme.
Tujuan pengendalian :
1. Mencegah transmisi penyakit dan infeksi.
2. Mencegah pencemaran/pertumbuhan mikroorganisme yang tidak diinginkan.
3. Mencegah peruraian/pembusukan bahan tertentu oleh mikroorganisme.
 Faktor-faktor yang mempengaruhi potensi desinfektan :
1. Konsentrasi
2. Waktu
3. pH
4. Suhu
5. Sifat mikroorganisme
6. Kehadiran bahan extraneus
 Berdasarkan mekanisme kerja, desinfektan terbagi atas :
1. Bahan yang merusak membran sel
oSurface active  bahan kationik, bahan anionik, bahan non-ionik.
oSenyawa fenol  fenol dan kresol.
oAlkohol
2. Bahan yang mendenaturasi protein
o Protein merupakan molekul organik yang sangat banyak terdapat di dalam sel.
Tiap protein memiliki konformasi karakteristik yang diperlukan. Jika terdapat
bahan yang dapat mengubah konformasi dari protein dengan denaturasi, maka
akan terjadi pembukaan rantai polipeptida hingga rantai menjadi melipat atau
memutar tidak beraturan.
HANDBOOK OF TA HAYATI
65
o Contoh bahan kimia yang mendenaturasi protein :
1. Asam
2. Alkali
3. Alkohol
4. Aseton
o Asam dan alkali
 Bahan asam dan alkali menunjukkan daya antibakterinya melalui ion H+
atau OH- bebas, yaitu melalui molekul yang tidak terdisosiasi.
 Asam kuat dan alkali kuat mempunyai kandungan desinfektan sebanding
dengan disosiasinya dalam cairan.
3. Bahan yang memodifikasi kelompok fungsional dari protein dan asam
nukleat.
Bagian katalitik dari enzim menjadi kelompok fungsional khas yang akan
mengikat substrat dan memulai proses katalisis. Inhibisi kegiatan enzim
berhasil jika satu atau lebih dari kelompok fungsional diubah atau dirusak.
Kelompok fungsional penting dari dinding sel, membran sel dan asam nukleat
adalah peka terhadap inaktivasi.
a. Logam berat : misal Hg  fenil merkuri : untuk membunuh bakteri Grampositif dan Gram-negatif, kapang, khamir. Ag  AgNO3 :
untuk membunuh gonococcus.
HANDBOOK OF TA HAYATI
66
b. Bahan pengoksidasi :
 Halogen; misal klorin (sebagai desinfektan air), iodin (sebagai
desinfektan kulit).
 Hidrogen peroksida (H2O2); merupakan desinfektan yang banyak
digunakan untuk desinfeksi yang tidak hidup, seperti peralatan bedah
dan lensa kontak.
c. Pewarna; beberapa jenis pewarna tidak hanya mewarnai bakteri, tetapi juga
menghambat pertumbuhannya pada enceran sangat tinggi. Misal :
 Pewarna trifenilmetan (pewarna anilin), derivatnya : hijau berlian, hijau
malakit, violet kristal. Ketiga derivatnya bersifat selektif terhadap Grampositif.
 Pewarna akridin (disebut juga flavin), misal : proflavina, akriflavina.
Keduanya bersifat sebagai antiseptik luka.
 Berbeda dengan pewarna anilin, pewarna akridin tidak terpengaruh daya
antimikrobanya dengan kehadiran serum atau nanah.
d. Bahan pengalkil; inhibisi yang dihasilkan bahan pengalkil adalah
irreversible sehingga terjadi modifikasi enzim dan inhibisi kegiatan enzim.
Misal :
1. Aldehida ;

Formaldehida; digunakan sebagai pengawet jaringan segar dan bangkai.
Dalam konsentrasi tinggi merusak semua jenis mikroorganisme, termasuk
HANDBOOK OF TA HAYATI
67
spora. Formaldehida dalam bentuk gas digunakan untuk mendesinfeksi
ruangan, bahan tekstil dan instrumen.

Glutaraldehida; memiliki kemampuan 10 x dari formaldehida. Digunakan
sebagai bahan sterilisasi dingin untuk alat bedah.
2. Etilen oksida; merupakan bahan dalam bentuk gas, untuk sterilisasi materi
yang rusak karena panas, misalnya peralatan elektronik, kedokteran, biologik
dan obat. Selain bereaksi dengan protein juga bereaksi dengan ADN dan ARN.
 Untuk membandingkan kekuatan desinfektan dalam menghambat pertumbuhan
bakteri dapat digunakan cakram kertas.
 Pada cakram kertas dibasahi dengan desinfektan, kemudian diletakkan pada
lempengan agar yang telah diinokulasi.
 Lempengan agar kemudian dierami selama 48 jam. Jika desinfektan menghambat
pertumbuhan bakteri, maka akan terlihat daerah jernih sekeliling cakram kertas.
Luas daerah terang ini menjadi ukuran kekuatan daya kerja desinfektan.
HANDBOOK OF TA HAYATI
68
BAB VIII
ANTIBIOTIKA
 Antibiotika adalah :
Senyawa kimia yang dihasilkan oleh mikroorganisme atau senyawa sejenis
yang seluruhnya atau sebagian diproduksi secara sintesis kimia yang dalam
konsentrasi rendah dapat menghambat pertumbuhan mikroorganisme lainnya.
 Persyaratan antibiotika :
1. Dapat merusak atau menghambat mikroorganisme patogen tanpa
merusak tuan rumah.
2. Mikroorganisme yang peka terhadapnya tidak menjadi resisten.
3. Tidak menimbulkan alergi dan efek samping yang tidak diinginkan jika
digunakan secara berkesinambungan dengan dosis tinggi.
4. Harus tetap aktif dalam plasma, cairan tubuh atau eksudat.
5. Larut dalam air dan stabil serta tingkat membunuh atau menghambat
pertumbuhan mikroorganisme cepat tercapai dan dapat dipertahankan
untuk waktu yang diperpanjang.
 Mekanisme kerja antibiotika :
1. Inhibitor dinding sel
2. Inhibitor membran sel
3. Inhibitor fungsi ADN
4. Inhibitor terhadap sintesis protein
HANDBOOK OF TA HAYATI
69
I. Inhibitor Dinding Sel
 Dinding sel yang kaku melindungi membran sitoplasma terhadap pengaruh
tekanan osmotik.
 Zat yang merusak dinding sel atau mencegah sintesis polimer dinding pada sel
yang tumbuh akan mengembangkan sel yang peka terhadap osmosis dan akan
mati.
a. Antibiotika ß-laktam
1. Penicillin
 Dapat menimbulkan reaksi hipersensitif pada kelompok kecil manusia.
 Nukleus penicillin  Asam-6-aminopenisilinat yang merupakan persyaratan
struktur bagi aktivitas biologis. Efektif terhadap bakteri Gram-positif dan
Gram-negatif.
 Kekurangan penicillin :
1. Dapat diinaktivasi oleh pH asam dari cairan lambung.
2. Dirusak oleh penisilinase, yaitu enzim bakteri yang memecah cincin ßlaktam.
3. Penicillin yang banyak digunakan adalah yang resisten terhadap
penisilinase, antara lain metisilina, nafsilina, kloksasilina, dikloklasilina,
oksasilina.
2. Sefalosporina
 Dihasilkan oleh jamur Cephalosporium acremonium.
HANDBOOK OF TA HAYATI
70
 Efektif terhadap Gram-positif dan Gram-negatif, mempunyai daya kerja
hampir sama dengan penicillin semisintetik.
b. Sikloserina
 Antibiotika spektrum luas hanya digunakan terhadap penyakit TBC.
c. Fosfomisina
 Dihasilkan oleh Streptomyces fradiae, merupakan antibiotika spektrum luas
sebagai inhibitor terhadap sintesis peptidoglikan dan kegiatan enzim.
d. Vankomisin
 Antibiotika spektrum sempit, dihasilkan oleh Streptomyces orientalis. Efektif
terhadap banyak spesies dan Gram-positif, bekerja dengan menghambat
biosintesis peptidoglikan.
II. Inhibitor Membran Sel
 Membran sel mempunyai peranan penting di dalam sel, yaitu merupakan
pembatas osmotik terhadap difusi bebas antara lingkungan dalam dan luar.
 Membran sel berdaya terhadap konsentrasi metabolit dan nutrien di dalam sel
dan merupakan bagian untuk pernapasan dan beberapa kegiatan biosintesis.
 Beberapa jenis antibiotika menunjukkan kemampuan menurunkan satu atau
lebih dari fungsi membran di atas dan hal tersebut mengakibatkan keburukan
bagi kehidupan sel.
HANDBOOK OF TA HAYATI
71
a. Polimiksina
1. Terdiri atas polimiksina A,B,C,D dan E.
2. Polimiksina B yang banyak digunakan sebagai obat.
3. Antibiotika ini mengikat permukaan luar dari membran sel serta
mengubah struktur dan kandungan osmosis dari sel.
4. Dihasilkan oleh Bacillus polymixa.
5. Efektif terhadap Gram-positif dan Gram-negatif.
b. Antibiotika poliena
 Merupakan antibiotika antifungal, yaitu :
1. Nistatin; dihasilkan oleh Streptomyces noursei; tidak digunakan dalam
bentuk
injeksi
karena
toksik.
Digunakan
di
kulit
untuk
menyembuhkan penyakit karena Candida.
2. Amfoterisina; umumnya digunakan amfoterisina-B yang dihasilkan oleh
Streptomyces niveus, digunakan terhadap penyakit yang diakibatkan
oleh fungi.
III. Inhibitor Fungsi ADN
 Fungsi ADN yaitu duplikasi dan replikasi (sandi genetik).
 Beberapa jenis antibiotika secara khas dapat mengganggu struktur dan fungsi
ADN, tetapi sedikit yang digunakan sebagai obat karena toksisitasnya.
HANDBOOK OF TA HAYATI
72
 Tiap bahan yang dapat mengganggu struktur dan fungsi ADN, maka mampu
menimbulkan efek yang mendalam dalam semua fase pertumbuhan dan
mikroorganisme yang bersangkutan.
Novobiosina
 Efektif terhadap Gram-positif, dihasilkan oleh Streptomyces niveus, yang
memiliki daya kerja menghambat replikasi DNA.
IV. Inhibitor Terhadap Sintesis Protein
 Sintesis protein merupakan hasil akhir dari 2 proses, yaitu :
1. Transkripsi : sintesis RNA yang tergantung pada DNA.
2. Translasi : Sintesis protein yang tergantung pada RNA.
 Antibiotika yang menghambat salah satu dari proses di bawah ini, berarti
menghambat sintesis protein.
a. Inhibitor dari transkripsi
1. Aktinomisin; dihasilkan oleh Streptomyces, efektif menghambat sintesis
ADN dan ARN, bersifat toksik.
2. Rifampin; merupakan derivat semisintetik dari Streptomyces mediterranei,
yang paling berguna dari kelompok ini adalah rifampisin. Efektif terhadap
Gram-positif dan Mycobacterium seperti penyebab penyakit TBC dan lepra.
Rifampisin menghambat sintesis protein secara selektif menginaktivasi
polimerase ADN.
HANDBOOK OF TA HAYATI
73
b. Inhibitor dari translasi
1. Streptomisin
 Dihasilkan oleh Streptomyces griseus, efektif terhadap Gram-negatif dan M.
tuberculosis.
 Streptomisin digunakan terhadap mikroorganisme yang tidak mempan
terhadap penicillin.
2. Tetrasiklin
 Merupakan antibiotika spektrum luas, efektif terhadap Gram-positif dan Gramnegatif, mikoplasma, riketsia dan klamidia.
 Kelompok tetrasiklin :
1. Oksitetrasiklin
2. Khlortetrasiklin
3. Dimetilkhlortetrasiklin
4. Doksisiklin
5. Minosiklin
 Daya kerja tetrasiklin lebih luas dibandingkan penicillin, streptomisin dan
kloramfenikol.
 Tetrasiklin menghambat hanya mikroorganisme yang berkembang biak secara
cepat dan bersifat bakteriostatik.
 Penggunaan tetrasiklin terutama terhadap mikroorganisme yang resisten
terhadap ampicillin dan sefalosporina.
HANDBOOK OF TA HAYATI
74
3. Nitrofuran
 Misal : Nitrofurantoin, efektif terhadap infeksi saluran genitourinaria pada
penderita yang tidak tahan terhadap sulfonamida.
4. Kloramfenikol
 Dihasilkan oleh Streptomyces venezuelae, bersifat bakteriostatik terhadap
Gram-positif dan Gram-negatif, riketsia dan klamidia.
 Menghambat pertumbuhan bakteri dengan mengganggu sintesis protein.
5. Eritromisin
 Bersifat bakteriostatik dan dalam kadar tinggi sebagai bakterisida.
 Dihasilkan oleh Streptomyces erytherus.
 Efektif untuk infeksi pneumonia, atau diberikan pada penderita yang alergi
terhadap penicillin dan yang menderita infeksi akibat streptococcus dan
pneumococcus.
6. Linkomisin dan klindamisin
 Dihasilkan oleh Streptomyces linkolensis.
 Klindamisin adalah derivat khloro dari linkomisin yang dibuat secara
semisintesis. Spektrum kerjanya sama dengan eritromisin walaupun secara
kimia tidak ada hubungannya. Efektif terhadap streptococcus, pneumococcus
dan staphylococcus.
HANDBOOK OF TA HAYATI
75
7. Griseofulvin
 Dihasilkan oleh Penicillium griseofulvum, merupakan fungistatik dan
mengganggu proses tubulin menjadi mikrotubula  griseofulvin mengikat
protein di dalam perakitan tubulina. Jadi proses sel yang terkandung pada
fungsi mikrotubula seperti pergerakan kromosom selama mitosis akan
terhambat oleh griseofulvin.
HANDBOOK OF TA HAYATI
76
BAB IX
UJI SENSITIVITAS
1. Desinfektan
 Daya kerja antimikroba (desinfektan) bahan kimia seringkali disetarakan dengan
fenol.
 Kemampuan bahan kimia dibandingkan dengan fenol disebut koefisien fenol.
 Koefisien fenol adalah angka yang menunjukkan ratio/perbandingan dari
pengenceran tertinggi desinfektan yang diuji dengan pengenceran tertinggi dari
fenol yang dapat membunuh mikroorganisme penguji dalam 10 menit, tetapi tidak
bisa membunuh dalam 5 menit.
 Bahan kimia yang memiliki koefisien fenol lebih dari 1, mempunyai daya kerja
antimikroba yang lebih baik dibandingkan dengan fenol.
 Macam-macam desinfektan antara lain Lysol, Creolin, Denol, Dettol, SOS dll.
 Bila larutan desinfektan uji dengan pengenceran 1 : 250 dapat membunuh populasi
S. aureus, sedangkan hasil yang sama ditunjukkan oleh fenol pada pengenceran 1 :
60, maka koefisien fenol sebagai desinfektan uji adalah 250/60 atau 4.2. Hasil ini
menunjukkan bahwa desinfektan uji 4.2 kali lebih efektif dibandingkan fenol
dalam membunuh S. aureus secara in vitro.
HANDBOOK OF TA HAYATI
77
 Rumus :
Koefisien fenol (KF) = (a/b + c/d)/2
Ket :
a  Faktor pengenceran tertinggi larutan uji desinfektan masa kontak 5’.
b  Faktor pengenceran tertinggi larutan baku fenol masa kontak 5’.
c  Faktor pengenceran tertinggi larutan uji desinfektan masa kontak 10’.
d  Faktor pengenceran tertinggi larutan baku fenol masa kontak 10’.

Contoh :
Pengenceran
Desinfektan Waktu
1/50 1/60 1/70 1/80 1/90 1/100 1/110 1/120 1/130 1/140
Fenol
Lysol
5’
-
-
-
-
-
-
-
-(b)
+
+
10’
-
-
-
-
-
-
-
-
-(d)
+
5’
-
-
-
-
-
-
-
-
-(a)
+
10’
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-(c)
HANDBOOK OF TA HAYATI
78
Kf = (a/b + c/d)/2
= (130/120 + 140/130)/2
= 1.080
Ket :
Kf > 1 : bahan antimikroba/desinfektan efektif
Kf < 1 : bahan antimikroba/desinfektan kurang efektif
Cara kerja :
1. Baku fenol 5%
 Buat pengenceran menggunakan aquadest steril (tiap tabung hanya diperlukan
5 ml fenol).
 Pengenceran dibuat dengan 2 bagian waktu, yaitu 5’ dan 10’  tiap bagian
waktu terdiri dari 10 tabung pengenceran.
2. Inokulasi bakteri uji untuk fenol 5%.
 Masukkan 0.5 ml biakan bakteri pada masing-masing tabung pengenceran
dimulai dari tabung pengenceran 5’.
 Ketika pertama kali memasukkan bakteri uji pada tabung pengenceran yang
pertama, waktu dicatat sebagai 0 (nol) menit. Interval waktu antar tabung
adalah 30 detik.
 Perlakuan sama terhadap pengenceran 10’.
HANDBOOK OF TA HAYATI
79
3. Inokulasi pada media Nutrient Broth
 5 menit setelah pengisian tabung untuk waktu 5 menit tersebut, tabung pertama
dikocok, kemudian isinya diambil satu masa ose dan diinokulasikan ke dalam
tabung pertama pada media Nutrient Broth.
 Dilanjutkan hingga tabung pengenceran terakhir untuk waktu 5’.
 Perlakuan sama terhadap 10 tabung pengenceran untuk waktu 10’.
 Inkubasi pada suhu 370C selama 24-48 jam.
 Amati pertumbuhan mikroorganisme.
2. Antibiotika
Cara yang umum digunakan untuk mengetahui kekuatan antibiotika adalah uji
kepekaan (sensitivitas) antibiotika terhadap mikroorganisme patogen penyebab
penyakit. Adapun cara dibawah ini tidak terbatas pada antibiotika saja, tetapi juga
agen antimikroba lainnya.
A. Metode Minimum Inhibitory Concentration (MIC)
 Bahan antimikroba bersifat menghambat bila digunakan dalam konsentrasi
kecil, dan mematikan mikroorganisme bila digunakan dalam konsentrasi
tinggi.
 Oleh karena itu, perlu diketahui Minimum Inhibitory Concentration (MIC) dan
Minimum Killing Concentration) bahan antimikroba tersebut terhadap
mikroorganisme.
 Dalam uji ini diperlukan suspensi baku dari mikroorganisme patogen yang
ditumbuhkan dalam kaldu.
HANDBOOK OF TA HAYATI
80
 Suspensi baku tersebut dimasukkan dalam kaldu yang berisi berbagai
konsentrasi antibiotika.
 Konsentrasi terendah yang menghambat pertumbuhan mikroorganisme dalam
kaldu dapat ditentukan dengan mengukur kekeruhan setelah diinkubasikan.
 Tabung kaldu yang berisi konsentrasi antibiotika yang mampu menghambat
pertumbuhan mikroorganisme patogen terlihat bening, sedangkan tabung
dengan konsentrasi antibiotika yang tidak menghambat pertumbuhan
mikroorganisme patogen terlihat keruh.
 Uji juga dapat menggunakan media agar-agar (lempengan).
 Kekuatan antibiotika dapat ditentukan dengan melihat konsentrasi terendah
antibiotika
yang mampu
mematikan
atau
menghambat
pertumbuhan
mikroorganisme patogen.
 MIC merupakan petunjuk konsentrasi antibiotika yang mampu menghambat
mikroorganisme dan juga memberikan petunjuk mengenai dosis yang
diperlukan dalam pengobatan penyakit.
 Dengan mengetahui MIC dan sifat cairan tubuh seperti darah dan urin, dapat
ditentukan jenis antibiotik yang ampuh untuk pengobatan, besarnya dosis yang
diperlukan.
 Umumnya, batas keamanan penggunaan antiibiotika untuk pengobatan
penyakit adalah sepuluh kali dosis MIC.
 MIC dapat ditentukan dengan menggunakan cairan tubuh tanpa harus
mengisolasi ataupun mengidentifkasi mikroorganisme penyebab penyakit.
HANDBOOK OF TA HAYATI
81
Misal : darah atau cairan serebrospinal yang mengandung mikroorganisme
infeksius ditambahkan pada berbagai konsentrasi antibiotika.
 Kekeruhan pada tabung setelah waktu inkubasi menunjukkan bahwa
konsentrasi antibiotika dalam tabung tidak mampu menghambat pertumbuhan
mikroorganisme. Sebaliknya, tidak adanya kekeruhan menunjukkan bahwa
mikroorganisme peka terhadap konsentrasi antibiotika dalam tabung.
B. Metode Antibiogram-Kirby-Bauer
 Uji ini diperkenalkan oleh William Kirby dan Alfred Bauer pada tahun 1966.
 Pada uji ini, lempengan agar ditaburi dengan mikroorganisme penguji.
 Cakram kertas (disc) yang berisi berbagai antibiotika diletakkan diatas
lempengan agar tersebut.
 Penghambatan pertumbuhan mikroorganisme oleh antibiotika terlihat sebagai
wilayah jernih sekitar pertumbuhan mikroorganisme (zona hambat).
 Luasnya wilayah jernih merupakan petunjuk kepekaan mikroorganisme
terhadap antibiotika dan juga berkaitan dengan kecepatan berdifusi antibiotika
dalam media.
 Faktor-faktor yang mempengaruhi ukuran diameter zona hambat :
o Kekeruhan suspensi bakteri :
Kurang keruh  diameter zona hambatan lebih lebar.
Lebih keruh  diameter zona hambatan lebih sempit.
o Kekeruhan suspensi bakteri harus distandardisasi terlebih dahulu.
HANDBOOK OF TA HAYATI
82
o Standar kekeruhan dibuat dari 0.5 ml 1.75% Barium Chloride Dihydrat
ditambah 1% asam sulfat.
 Waktu peresapan suspensi bakteri ke dalam lempengan agar.
Setelah suspensi bakteri digoreskan pada agar dengan menggunakan lidi kapas
steril, diamkan 5’-15’. Pendiaman tidak boleh melebihi batas waktu yang
ditentukan karena dapat mempersempit diameter zona hambat, sensitif (S)
dilaporkan resisten (R).
 Temperatur inkubasi
o Inkubasi dilakukan pada 350C.
o < 350C  diameter zona hambatan lebih lebar sehingga R dilaporkan S
 terjadi pada lempengan yang ditumpuk-tumpuk lebih dari 2
lempengan pada saat inkubasi  lempengan yang di tengah suhunya
kurang dari 350C.
o 350C  ada bakteri yang kurang subur dalam pertumbuhannya, ada pula
obat yang difusinya kurang baik.
 Waktu inkubasi
16-18 jam. Kurang dari 16 jam, pertumbuhan bakteri belum sempurna
sehingga sukar dibaca atau diameter zona hambatan lebih lebar. Lebih dari 18
jam, pertumbuhan lebih sempurna sehingga diameter zona hambatan lebih
sempit.
HANDBOOK OF TA HAYATI
83
 Tebal agar-agar
Ketebalan agar-agar sekitar 4 mm.
< 4 mm  difusi obat lebih cepat.
> 4 mm  difusi obat lebih lambat.
 Jarak antar disc obat
Jarak yang dianjurkan minimum 15 mm, untuk menghindari terjadinya zona
hambatan yang tumpang tindih. Cawan petri dengan diameter 9-10 cm,
maksimum dapat memuat 7 disc obat. Penempelan disc obat dapat
menggunakan pinset.
 Potensi disc obat
Tiap jenis disc obat memiliki diameter yang sama, tetapi potensinya berbeda.
 Komposisi media
Berpengaruh terhadap pertumbuhan bakteri, difusi obat, aktivitas obat dsb.
Gambar pengujian antibiotika
HANDBOOK OF TA HAYATI
84
Pembacaan pengukuran diameter zona hambat
Dengan menggunakan kertas berwarna gelap atau dengan latar belakang sedikit
gelap, bisa dengan menggunakan jangka.
Diameter zona hambat yang diukur adalah daerah jernih sekitar disc obat (tidak
ada pertumbuhan bakteri), diukur dari ujung yang satu ke ujung yang lain
melalui tengah-tengah disc obat.
Hasil pengukuran diameter zona hambat dibandingkan dengan standar (resisten
(R), sensitif (S) atau intermediate (I)).
HANDBOOK OF TA HAYATI
85
HANDBOOK OF TA HAYATI
86
Kontrol Kualitas
o Adalah usaha yang dilakukan untuk menetralisasi faktor-faktor yang
berpengaruh terhadap diameter zona hambat.
o Memeriksa mutu media dan disc obat dengan menggunakan bakteri standar:
S. aureus ATCC 25923, E. coli ATCC 25922 dan P. aeruginosa ATCC
27853.
HANDBOOK OF TA HAYATI
87
BAB X
UJI PRODUK FARMASI
1. Uji Pirogen
 Pirogen adalah reaksi demam pada tingkat yang dapat diterima oleh pasien pada
pemberian sediaan injeksi.
 Tujuan Uji Pirogen :
Membatasi resiko reaksi demam.
 Pengujian meliputi : pengukuran kenaikan suhu kelinci setelah penyuntikan
larutan uji secara intravena dan ditujukan untuk sediaan yang dapat ditoleransi
dengan uji kelinci dengan dosis penyuntikan tidak lebih dari 10 ml per kg bobot
badan dalam jangka waktu tidak lebih dari 10 menit.
 Alat dan Pengencer
Alat :
1. Alat suntik
2. Jarum
3. Alat kaca bebas pirogen
Pengencer : Sesuai monografi
Misal : apabila digunakan injeksi Natrium Klorida sebagai pengencer, gunakan
injeksi yang mengandung larutan Natrium Klorida P 0.9 %.
HANDBOOK OF TA HAYATI
88
 Rekaman suhu
Termometer yang telah dikalibrasi untuk menjamin ketelitian skala ± 0.10C dan
telah diuji bahwa pembacaan suhu maksimum tercapai ± 5 menit.
Cara :
Masukkan alat pengukur suhu ke dalam anus kelinci dengan kedalaman tidak
kurang dari 7.5 cm.
 Hewan Uji
1. Kelinci dewasa yang sehat
2. Tempatkan satu ekor dalam satu kandang dengan suhu 20-230C dan bebas dari
gangguan yang menimbulkan kegelisahan.
3. Untuk kelinci yang belum pernah digunakan untuk uji pirogen adaptasikan
tidak lebih dari 7 hari dengan uji pendahuluan.
4. Kelinci tidak boleh digunakan untuk uji pirogen lebih dari sekali dalam waktu
48 jam atau sebelum 2 minggu setelah digunakan untuk uji pirogen bila
menunjukkan kenaikan suhu maksimum 0.600C atau lebih, atau digunakan
untuk sediaan yang mengandung pirogen.
Prosedur :
 Pengujian dalam ruang terpisah dengan kondisi lingkungan yang sama dengan
ruang pemeliharaan, bebas dari keributan yang menyebabkan kegelisahan.
 Kelinci tidak diberi makan selama waktu pengujian.
 Minum dibolehkan setiap saat, tetapi dibatasi pada saat pengujian.
HANDBOOK OF TA HAYATI
89
 Tidak lebih 30 menit sebelum penyuntikan larutan uji, tentukan suhu. Suhu
awal setiap kelinci tidak boleh lebih dari 39.80C.
 Beda suhu setiap kelinci tidak boleh lebih dari 10.
 Kecuali dinyatakan lain, suntikan 10 ml/kg BB melalui vena tepi telinga 3 ekor
kelinci dan penyuntikan dilakukan dalam waktu 10 menit.
 Semua larutan harus bebas dari kontaminasi, dengan cara menghangatkan pada
suhu 370 ± 2 sebelum penyuntikan.
 Penafsiran Hasil :
1. Setiap penurunan suhu dianggap nol, sediaan memenuhi syarat apabila tak
seekor kelinci pun menunjukkan kenaikan suhu 0.50 atau lebih.
2. Jika ada kelinci yang menunjukkan kenaikan 0.50 atau lebih lanjutkan
pengujian menggunakan 5 ekor kelinci. Jika tidak lebih dari 3 ekor dari 8
kelinci masing-masing menunjukkan suhu 0.50 atau lebih dan jumlah
kenaikan suhu maksimum 8 ekor kelinci tidak lebih dari 3.30, sediaan
dinyatakan memenuhi syarat bebas pirogen.
2. Uji Sterilitas
Media yang digunakan untuk uji sterilitas :
 Media tioglikolat cair
 Media tioglikolat alternatif
 Soybean-casein digest medium
HANDBOOK OF TA HAYATI
90
Prosedur umum
Prosedur pengujian terdiri atas :
a. Inokulasi langsung ke dalam media uji
CAIRAN
1. Pindahkan cairan dari wadah uji (ampul atau vial) menggunakan pipet atau
jarum suntik steril.
2. Secara aseptik inokulasikan sejumlah tertentu bahan dari tiap wadah uji ke
dalam tabung media.
3. Campur cairan dengan media.
4. Inkubasi selama 14 hari.
5. Amati pertumbuhan pada media secara visual sesering mungkin sekurangnya
pada hari ke-3, ke-4 dan ke-5 atau ke-7 dan ke-8 pada hari terakhir masa uji.
ZAT PADAT
1. Ambil sejumlah tertentu produk dalam bentuk padat kering (atau yang terlebih
dahulu dibuat larutan atau suspensi dalam cairan pengencer steril) dengan tidak
kurang dari 300 mg tiap wadah atau seluruh isi wadah jika tiap isi kurang dari
300 mg.
2. Inokulasikan ke dalam masing-masing tidak kurang dari 40 ml media
tioglikolat cair dan soybean-casein digest medium.
3. Langkah selanjutnya sama seperti langkah pada CAIRAN.
HANDBOOK OF TA HAYATI
91
KAPAS MURNI, PERBAN, PEMBALUT, BENANG BEDAH DAN BAHAN
SEJENISNYA
1. Dari setiap kemasan kapas, perban gulung atau pembalut perban yang diuji
ambil secara aseptik dua bagian atau lebih masing-masing 100-500 mg dari
bagian paling dalam. Dari individu contoh bentuk kemasan tunggal seperti
bantalan perban, ambil secara aseptik sejumlah 250-500 mg atau keseluruhan
contoh bila ukurannya kecil, seperti pembalut serap berperekat 25 mm x 75
mm atau lebih kecil, atau benang bedah.
2. Langkah selanjutnya sama seperti langkah pada CAIRAN.
ALAT KESEHATAN STERIL
 Untuk alat yang bentuk dan ukurannya memungkinkan dicelupkan keseluruhan
ke dalam ± 1000 ml media, uji alat utuh menggunakan media yang sesuai,
inkubasi. Langkah selanjutnya sama seperti langkah pada CAIRAN.
 Untuk alat yang mempunyai pipa/saluran berlubang seperti alat transfusi atau
infus atau yang ukurannya menyebabkan pencelupan tidak dapat dilakukan dan
hanya saluran cairannya yang harus steril, bilas lumen masing-masing dari 20
unit dengan sejumlah secukupnya media tioglikolat cair dan soybean-casein
digest medium.
 Untuk alat yang bentuk dan ukurannya tidak dapat dicelup, maka uji bagian
alat yang paling sulit disterilisasi, dan jika mungkin lepaskan dua atau lebih
bagian yang penting dari alat. Secara aseptik pindahkan bagian tersebut ke
dalam 1000 ml media.
HANDBOOK OF TA HAYATI
92
ALAT SUNTIK KOSONG ATAU TERISI
 Untuk alat suntik terisi yang dilengkapi jarum steril, keluarkan isi produk
melalui lumen. Pengujian sama seperti pada cairan dalam ampul atau vial.
 Untuk alat suntik kosong steril, masukkan media atau pengencer steril ke
dalam alat suntik melalui jarum yang disertakan atau jika tidak disertakan
melalui jarum steril yang dipasang untuk tujuan pengujian.
 Contoh :
OBAT-OBATAN ANTIBIOTIKA/KIMIA
Secara aseptik diambil setengah dari jumlah spesimen yang ada di dalam
ampul, dilarutkan di dalam air garam, aquadest atau pelarut lain yang steril,
sebanyak mungkin dengan tujuan meniadakan potensi obat tersebut. Kemudian
lakukan penyaringan.
VITAMIN, AQUADEST, AIR GARAM
Diambil beberapa spesimen ampul, tutupnya atau bagian yang akan dibuka
dibersihkan dengan kapas alkohol. Ampul dipatahkan ujungnya, sedangkan
vial dibuka tutup aluminiumnya yang di tengah, isinya diambil dengan syringe
steril disposable.
KAIN KASA
Bungkus kain kasa dibuka secara steril, kain kasa diambil diletakkan di dalam
cawan petri steril, digunting-gunting dengan gunting steril menjadi bagian
kecil-kecil.
 Media yang digunakan :
 BHI broth/Tryptose Soy Broth/Blood Broth  untuk bakteri aerob.
 Cooked meat medium  untuk bakteri aerob.
HANDBOOK OF TA HAYATI
93
 Media tioglikolat  untuk bakteri aerob/anaerob.
 Potato dextroseagar  untuk kapang dan khamir.
b. Teknik penyaringan membran
Membran yang sesuai umumnya memiliki porositas 0.45 m, dengan diameter
lebih kurang 47 mm, dan kecepatan penyaringan air 55 ml hingga 75 ml per
menit pada tekanan 70 cmHg.
3. Uji Koefisien Fenol
Contoh hasil pengamatan baku fenol
Lama kontak
5’
10’
+
+
+
15’
-
Contoh hasil pengamatan desinfektan
Desinfektan X
Lama kontak
Pengenceran
5’
10’
1 : 100
1 : 150
1 : 200
1 : 250
+
1 : 300
+
+
1 : 350
+
+
1 : 400
+
+
15’
+
+
Baku
Pengenceran
1 : 80
1 : 90
1 : 100
Hitung koefisien fenol (KF).
Tabel hasil uji baku fenol yang memenuhi syarat
Lama kontak
Pengenceran
5’
10’
1 : 80
+/1 : 90
+/+/1 : 100
+
+
15’
+/-
Bila dari dua pengenceran pertama dari baku fenol yang diuji tidak ada satupun
tabung pengenceran yang memberikan hasil positif dalam masa kontak 5’ dan
HANDBOOK OF TA HAYATI
94
memberikan hasil pertumbuhan negatif dalam masa kontak 10’, maka diperkirakan
bahwa pengenceran yang diharapkan berada diantara pengenceran kedua (1 : 90) dan
pengenceran ketiga (1 : 100). Lihat tabel di bawah.
Contoh hasil perkiraan uji baku fenol
Pengenceran
5’
+
1 : 80
1 : 90
1 : 100
Lama kontak
10’
+
15’
-
Contoh hasil perkiraan uji desinfektan
Pengenceran
1 : 300
1 : 350
1 : 400
5’
+
Lama kontak
10’
+
15’
-
Jadi angka perkiraan untuk baku fenol antara 90-100, untuk desinfektan antara 350400.
Hitung koefisien fenol (KF).
HANDBOOK OF TA HAYATI
95
BAB XI
FUNGI
Terbagi atas dua golongan yaitu kapang dan khamir.
Kapang
 Membentuk filamen panjang yang disebut hifa dan merupakan ciri utama
fungi.
 Kumpulan hifa disebut miselium.
 Hifa memiliki dua struktur yaitu bersepta dan tidak bersepta.
 Septa menyekat sel sehingga filamen yang panjang terlihat sebagai rangkaian
sel.
 Hifa yang tidak bersepta disebut hifa konositik.
 Dinding sel fungi mengandung khitin yang merupakan komponen utama
dinding sel. Hifa mengabsorbsi zat hara dari sekelilingnya dan memanjang
dengan cara membelah diri.
 Hifa dapat membentuk struktur reproduksi yang disebut spora.
 Metode untuk melihat struktur fungi dengan jelas adalah dengan slide culture.
 Identifikasi kapang berdasarkan ciri morfologi hifa, warna (pigmen) hifa,
jenis hifa (ada septa/tidak), ukuran, bentuk, warna serta penataan spora.
HANDBOOK OF TA HAYATI
96
 Kelompok kapang diklasifikasikan berdasarkan spora seksualnya;
Klasifikasi
Zygomycetes
Ciri
Hifa konositik.
Spora seksual : zygospora.
Spora aseksual : sporangiospora
dalam sporangium.
Contoh : Rhizopus dan Mucor.
Ascomycetes
Hifa bersepta.
Spora seksual : askuspora dalam
askus.
Spora aksesual : konidium.
Contoh
:
Neurospora,
Saccharomyces.
Deuteromycetes
Bentuk seperti khamir.
Hifa seperti Ascomycetes.
Tidak mempunyai stadium seksual.
Spora aseksual : konidium.
Contoh : Penicillium, Aspergillus,
Candida.
HANDBOOK OF TA HAYATI
97
Slide Culture
Cara :
1. Letakkan kertas saring pada dasar cawan petri.
2. Letakkan batang gelas steril berbentuk “U” diatas kertas saring.
3. Kertas saring dibasahi dengan air, sehingga suasana dalam cawan petri menjadi
lembab.
4. Letakkan object glass diatas batang gelas berbentuk “U”.
5. Potong agar Saboraud berbentuk persegi dan letakkan diatas object glass.
6. Sisi dari agar ini diinokulasi dengan kapang.
7. Letakkan kaca penutup diatas potongan agar, kemudian tutup cawan petri.
HANDBOOK OF TA HAYATI
98
8. Diamkan dalam suhu kamar selama 48 jam.
Khamir (Ragi)
 Merupakan fungi yang tidak berfilamen dan bereproduksi melalui pertunasan
atau pembelahan sel.
 Pertunasan dapat terjadi melalui satu ujung (pertunasan polar) atau melalui
beberapa tunas di sekeliling sel (pertunasan multilateral).
 Jenis pertunasan, bentuk dan jumlah askuspora merupakan ciri yang
banyak digunakan dalam identifikasi khamir.
 Khamir digunakan dalam pembuatan roti dan anggur, namun ada khamir yang
bersifat patogen, contoh : Candida dan Cryptococcus.
HANDBOOK OF TA HAYATI
99
 Klasifikasi khamir sebagai berikut berdasarkan morfologinya :
Genus
Torulopsis,
Ciri
Cryptococcus, Hanya ada pertunasan
Rhodotorula
Candida
Tunas dan pseudomiselium
Trichosporon
Tunas,
pseudomiselium
dan
arthrospora
Geotrichum
Miselium dan arthrospora
Saccharomyces
Tunas dan askuspora
 Torulopsis
Kecil, berbentuk oval, seringkali menyebabkan pencemaran dalam industri
minuman.
 Cryptococcus
Besar, berbentuk bulat, mempunyai kapsel dan sering ditemukan pada buah,
C. neoformans bersifat patogen terhadap manusia.
 Rhodotorula
Khamir berwarna merah atau merah muda. Bila biakan dibiarkan tumbuh
pada lempengan agar maltosa terlihat pertumbuhan koloni bayangan pada
bagian tutup cawan petri.
HANDBOOK OF TA HAYATI
100
 Candida
Candida penting dalam bidang kesehatan, terutama C. albicans. Semua
candida membentuk koloni kekuningan dan licin pada agar, terkecuali C.
krusei yang berpenampilan seperti serpihan kaca. C. utilis sering digunakan
pada industri makanan sehingga sering disebut khamir pangan.
 Trichosporon
T. cutaneum sering ditemukan pada permukaan kulit. Bila ditumbuhkan
pada agar maltosa akan terlihat sebagai koloni yang menyebar dan basah.
 Geotrichum
Pencemar dalam industri makanan dan acar.
 Saccharomyces
S. cereviseae digunakan dalam industri minuman dan roti.
HANDBOOK OF TA HAYATI
101
Bahan yang diperlukan :
 Biakan khamir
 Media : agar V-8
 Potongan wortel
Cara mengerjakan :
 Buat preparat basah dari biakan khamir yang disediakan.
 Periksa preparat dengan menggunakan perbesaran 45x dan 100x. Amati
morfologi khamir dan penampilan tunas. Cari sel yang memiliki askuspora.
Amati bentuk dan hitung jumlah askuspora.
HANDBOOK OF TA HAYATI
102
 Bila askuspora tidak ditemukan, biakkan khamir pada agar V-8 atau sepotong
wortel. Khamir seringkali membentuk askuspora pada media biakan yang kaya
seperti agar V-8.
 Bandingkan dengan tabel di bawah ini.
TABEL CIRI BIOKIMIA BEBERAPA KHAMIR
HANDBOOK OF TA HAYATI
103
Daftar Pustaka
Anonim, 1995, Farmakope Indonesia Ed. IV, Jakarta : DEPKES RI.
Benson, Microbiological Applications, e-book.
Fardiaz, S., 1993, Analisis Mikrobiologi Pangan, Jakarta : PT RajaGrafindo Persada.
Irianto, K., 2006, Mikrobiologi Menguak Dunia Mikroorganisme, Bandung : CV
Yrama Widya.
Lay, B.W., 1994, Analisis Mikroba di Laboratorium, Jakarta : PT RajaGrafindo
Persada.
HANDBOOK OF TA HAYATI
104