plagiat merupakan tindakan tidak terpuji
advertisement
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI UJI SITOTOKSISITAS EKSTRAK ETANOLIK DAUN SIRIH MERAH (Piper crocatum Ruiz & Pav.) TERHADAP KULTUR SEL MIELOMA SKRIPSI Diajukan Untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.) Program Studi Ilmu Farmasi Oleh: Meri NIM : 048114141 FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA 2008 i PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI UJI SITOTOKSISITAS EKSTRAK ETANOLIK DAUN SIRIH MERAH (Piper crocatum Ruiz & Pav.) TERHADAP KULTUR SEL MIELOMA SKRIPSI Diajukan Untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.) Program Studi Ilmu Farmasi Oleh: Meri NIM : 048114141 FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA 2008 ii PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI iii PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI iv PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI HALAMAN PERSEMBAHAN Untuk berguna bagi orang lain, pikiran harus terwujud dalam tindakan.. Tidak ada tempat bagi kemalasan, yang ada hanyalah karya yang baik tanpa henti (At The Feet of Master) Kupersembahkan karya ini untuk Papa dan mamaku tercinta, atas kasih sayang, doa dan dukungan yang terus menyertaiku. Kakak-kakakku terkasih, Edy, Lina dan Hendry Teman-teman dan Almamaterku v PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI KARYA ILMIAH UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIS Yang bertanda tangan di bawah ini, saya mahasiswa Universitas Sanata Dharma : Nama : Meri Nomor Mahasiswa : 048114141 Demi pengembangan ilmu pengetahuan, saya memberikan kepada Perpustakaan Universitas Sanata Dharma karya ilmiah saya yang berjudul : “Uji Sitotoksisitas Ekstrak Etanolik Daun Sirih Merah (Piper Crocatum Ruiz & Pav) terhadap Kultur Sel Mieloma” beserta perangkat yang diperlukan (bila ada). Dengan demikian saya memberikan kepada Perpustakaan Universitas Sanata Dharma hak untuk menyimpan, mengalihkan dalam bentuk media lain, mengelolanya dalam bentuk pangkalan data, mendistribusikan secara terbatas, dan mempublikasikannya di Internet atau media lain untuk kepentingan akademis tanpa perlu meminta ijin dari saya maupun memberikan royalti kepada saya selama tetap mencantumkan nama saya sebagai penulis. Demikian pernyataan ini yang saya buat dengan sebenarnya. Dibuat di Yogyakarta Pada tanggal : 21 Juli 2008 Yang menyatakan, ( Meri) vi PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PRAKATA Puji syukur kepada Tuhan Yang Maha Esa atas segala anugerah-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi dengan judul “Uji Sitotoksisitas Ekstrak Etanolik Daun Sirih Merah (Piper crocatum Ruiz & Pav.) terhadap Kultur Sel Mieloma”. Skripsi ini dibuat untuk memenuhi salah satu syarat memperoleh gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.) pada Program Studi Farmasi di Universitas Sanata Dharma. Penulisan skripsi ini tidak mungkin terselesaikan tanpa adanya bimbingan, bantuan dan dukungan dari berbagai pihak, maka pada kesempatan ini, penulis mengucapkan terima kasih kepada: 1. Rita Suhadi, M.Si., Apt., selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma yang telah banyak meluangkan waktu, tenaga dan atas segala masukan serta sarannya dalam penyusunan skripsi ini. 2. Drs. A. Yuswanto S.U., Ph.D., Apt., selaku dosen pembimbing yang telah banyak meluangkan waktu, tenaga dan atas segala masukan serta sarannya dalam penyusunan skripsi ini. 3. Drs. Mulyono, Apt., selaku dosen penguji yang telah berkenan menguji dan memberikan banyak masukan dan saran. 4. Yohanes Dwiatmaka, M.Si., selaku dosen penguji yang telah berkenan menguji dan memberikan banyak masukan dan saran. 5. Ign. Y Kristyo B, M.Si., yang telah memberikan banyak masukan dalam identifikasi dan determinasi tumbuhan. vii PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 6. Drs. P. Sunu Hardiyanta, S.J., M.Sc., yang telah memberikan masukan dan saran dalam pengolahan statistik. 7. Jeffry Julianus, M.Si., yang telah memberikan banyak masukan dalam uji sitotoksisitas. 8. Segenap dosen dan karyawan di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma, terima kasih atas bantuannya selama ini. 9. Mbak Yuli dan segenap karyawan Laboratorium Hayati UGM yang telah banyak membantu dalam penelitian skripsi ini. 10. Orang tua dan kakak-kakakku tercinta, atas segala dukungan dan doa yang selalu menyertaiku. 11. Chong, kekasihku tercinta, atas segala dukungan dan kasih sayang yang diberikan selama penyusunan skripsi ini. 12. Siska, Nur’aniyah, Ririt dan Eva, atas kerjasama, canda tawa, dan keluh kesah selama penyusunan skripsi ini. 13. Limdrawati, Fenny Octarina dan semua teman-teman angkatan 2004, terima kasih atas segala semangat dan kebersamaan kita yang indah. 14. Semua pihak yang telah banyak membantu penyusunan skripsi ini. Atas segala bantuan yang telah diberikan selama ini, penulis mengucapkan banyak terima kasih. Penulis juga menyadari bahwa penulisan skripsi ini tidak terlepas dari kekurangan-kekurangan. Oleh karena itu, penulis mengharapkan kritik dan saran yang bersifat konstruktif demi penyempurnaan skripsi ini. Skripsi ini diharapkan dapat bermanfaat bagi perkembangan ilmu pengetahuan. Penulis viii PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PERNYATAAN KEASLIAN KARYA Saya menyatakan dengan sesungguhnya bahwa skripsi yang saya tulis ini tidak memuat karya atau bagian karya orang lain, kecuali yang telah disebutkan dalam kutipan dan daftar pustaka, sebagaimana layaknya karya ilmiah. Yogyakarta, 09 Mei 2008 Penulis, Meri ix PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI INTISARI Penggunaan obat tradisional di masyarakat telah berkembang semakin pesat. Daun sirih merah secara empiris memiliki banyak khasiat, salah satunya sebagai antikanker. Akan tetapi, belum ada penelitian yang membuktikan bahwa daun sirih merah memiliki aktivitas sebagai antikanker. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui apakah ekstrak etanolik daun sirih merah memiliki efek sitotoksik terhadap kultur sel mieloma. Penelitian ini termasuk penelitian eksperimental murni dengan rancangan acak lengkap pola searah. Uji sitotoksisitas dilakukan dengan menghitung jumlah kultur sel mieloma pada kelompok kontrol dan kelompok perlakuan yang diberi ekstrak etanolik daun sirih merah. Metode uji sitotoksisitas yang digunakan adalah metode perhitungan langsung dengan pewarna trypan blue. Data yang diperoleh berupa persen kematian kultur sel mieloma. Efek sitotoksisitas ekstrak etanolik daun sirih merah terhadap kultur sel mieloma dianalisis secara statistik dengan Anova satu arah dan harga LC50 dihitung dengan analisis probit. Hasil penelitian menunjukkan bahwa ekstrak etanolik daun sirih merah memiliki efek sitotoksik terhadap kultur sel mieloma dengan harga LC50 sebesar 434,1 μg/ml. Kata kunci : daun sirih merah, kultur sel mieloma, sitotoksisitas, harga LC50 x PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI ABSTRACT Nowadays, the use of traditional drugs in society has expanded rapidly. Empirically, celebes pepper leaves has a lot of medicinal actions, one of them is anticancer. However, there are still no research that claim celebes pepper leaves have an anticancer activity. This study aims to determine whether extract ethanolic had cytotoxic effect or not. The study was pure experimental research with random complete and one way design. Myeloma cell cultures in control group and group with ethanolic extract of celebes pepper leaves is counted. The cytotoxicity effect was determined by using direct counting method with trypan blue stain. Data were collected by counting the percentage of death cells. Cyotoxicity effect of the ethanolic extract of celebes pepper leaves were analyzed using one way Anova and the LC50 value were analyzed using probit statistic. The result showed that ethanolic extract of celebes pepper leaves had cytotoxic effect to myeloma cell cultures with LC50 value of 434.1 μg/ml. keywords : celebes pepper leaves, myeloma cell cultures, cytotoxicity, LC50 value xi PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI DAFTAR ISI Halaman HALAMAN JUDUL ..................................................................................... ii HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING .......................................... . iii HALAMAN PENGESAHAN ...................................................................... iv HALAMAN PERSEMBAHAN .................................................................. v PRAKATA ................................................................................................... vi PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ....................................................... viii INTISARI ..................................................................................................... ix ABSTRACT ................................................................................................... x DAFTAR ISI ................................................................................................ xi DAFTAR TABEL ........................................................................................ xv DAFTAR GAMBAR ................................................................................... xvi DAFTAR LAMPIRAN ................................................................................ xvii BAB I PENGANTAR ................................................................................. 1 A. Latar Belakang ........................................................................................ 1 1. Rumusan masalah ......................................................................... 2 2. Keaslian penelitian ........................................................................ 3 3. Manfaat penelitian ......................................................................... 3 B. Tujuan .................................................................................................... 3 1. Tujuan umum ............... ................................................................. 3 2. Tujuan khusus ........... ................................................................... 4 xii PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI BAB II PENELAAHAN PUSTAKA .......................................................... 5 A. Tanaman Sirih Merah .............................................................................. 5 1. Keterangan botani ......................................................................... 5 2. Uraian tanaman ............................................................................. 5 3. Kandungan kimia .......................................................................... 6 4. Khasiat dan penggunaan ............................................................... 6 5. Penelitian ....................................................................................... 7 Kanker ................................................................................................. 7 1. Karsinogenesis ............................................................................... 8 2. Kanker sel plasma ......................................................................... 9 3. Sel mieloma ................................................................................... 9 C. Ekstraksi ……………. ............................................................................ 10 D. Uji Sitotoksisitas ..................................................................................... 11 E. Landasan Teori ....................................................................................... 12 F. Hipotesis ................................................................................................. 13 BAB III METODOLOGI PENELITIAN ................................................... 14 A. Jenis dan Rancangan Penelitian ............................................................. 14 B. Variabel Penelitian dan Definisi Operasional ........................................ 14 1. Variabel bebas ............................................................................... 14 2. Variabel tergantung ....................................................................... 14 3. Variabel pengacau terkendali ........................................................ 14 4. Definisi operasional ...................................................................... 15 B. xiii PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI C. Alat dan Bahan .................................................................................... 15 1. Alat .... ............................................................................................ 15 2. Bahan .. .......................................................................................... 16 Tata Cara Penelitian ............................................................................. 16 1. Determinasi tanaman ................................................................... 16 2. Pengumpulan daun sirih merah ................................................... 17 3. Preparasi ekstrak etanolik daun sirih merah ............................... 17 4. Pembuatan larutan uji ................................................................. 18 5. Pembuatan medium pencuci ....................................................... 18 6. Pembuatan medium penumbuh ................................................... 18 7. Propagasi sel mieloma ............................................................... 18 8. Panen sel mieloma ..................................................................... 19 7. Uji sitotoksisitas ekstrak etanolik daun sirih merah .................. 20 Analisis Hasil ....................................................................................... 20 BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ..................................................... 22 A. Determinasi Tanaman ............................................................................. 22 B. Pengumpulan Daun Sirih Merah ............................................................ 22 C. Preparasi Ekstrak Etanolik Daun Sirih Merah ........................................ 24 D. Pembuatan Medium Pencuci dan Medium Penumbuh .......................... 25 E. Propagasi dan Panen Sel Mieloma ......................................................... 26 F. Uji Sitotoksisitas Ekstrak Etanolik Daun Sirih Merah ............................ 27 D. E. xiv PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI BAB V. KESIMPULAN DAN SARAN....................................................... 36 A. Kesimpulan .......................................................................................... 36 B. Saran..................................................................................................... 36 DAFTAR PUSTAKA ................................................................................... 37 LAMPIRAN .................................................................................................. 41 BIOGRAFI PENULIS .................................................................................. 57 xv PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI DAFTAR TABEL Halaman Tabel I. Data perhitungan jumlah kultur sel mieloma dengan perhitungan langsung ....................................................................................... 44 Tabel II. Data persentase kematian kultur sel mieloma .............................. 29 Tabel III. Data log konsentrasi, % kematian dan harga probit pada replikasi I ..................................................................................... 51 Tabel IV. Data log konsentrasi, % kematian dan harga probit pada replikasi II .................................................................................... 51 Tabel V. Data log konsentrasi, % kematian dan harga probit pada replikasi III .................................................................................. 52 Tabel VI. Nilai r (koefisien korelasi) pada level signifikansi 5% dan 1%... 53 Tabel VII. Tabel probit.................................................................................. 55 xvi PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI DAFTAR GAMBAR Halaman Gambar 1. Foto kultur sel mieloma di sumuran kontrol .................................. 27 Gambar 2. Kultur sel mieloma di haemocytometer ...................................... 28 Gambar 3. Grafik konsentrasi (µg/ml) terhadap persen kematian kultur sel mieloma ..................................................................................... … 29 Gambar 4. Kultur sel mieloma di sumuran perlakuan ...................................... 31 Gambar 5. Grafik log konsentrasi terhadap harga probit pada replikasi I …... 33 Gambar 6. Grafik log konsentrasi terhadap harga probit pada replikasi II ..... 33 Gambar 7. Grafik log konsentrasi terhadap harga probit pada replikasi III … 34 Gambar 8. Tanaman sirih merah …………………………………................. 41 Gambar 9. Daun sirih merah ……………………………….......................... 42 Gambar 10. Medium pencuci dan medium penumbuh .................................. 42 Gambar 11. Sentrifuge ................................................................................... 42 Gambar 12. Mikroskop .................................................................................. 42 Gambar 13. Haemocytometer dan cell count ................................................ 42 Gambar 14. Tabung conical steril dan 96-well plate .................................... 42 Gambar 15. Kultur sel mieloma dalam tissue culture flask ......................... 42 xvii PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI DAFTAR LAMPIRAN Halaman Lampiran 1. Foto tanaman sirih merah ………………………………......... 41 Lampiran 2. Foto medium dan peralatan uji sitotoksisitas............................ 42 Lampiran 3. Perhitungan jumlah kultur sel mieloma tiap sumuran .............. 43 Lampiran 4. Perhitungan jumlah kultur sel mieloma yang hidup................. 44 Lampiran 5. Perhitungan persentase kematian kultur sel mieloma.............. 48 Lampiran 6. Perhitungan LC50 dengan analisis probit dan uji linearitas ………………………………................................... 51 Lampiran 7. Analisis statistik dengan Anova satu arah ............................... 54 Lampiran 8. Tabel probit .............................................................................. 55 Lampiran 9. Hasil determinasi tanaman sirih merah ................................... 56 xviii PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 1 BAB I PENGANTAR A. Latar Belakang Kanker merupakan salah satu penyakit yang menyebabkan kematian di seluruh dunia. Data Organisasi Kesehatan Dunia (WHO) yang diterbitkan pada tahun 2007 menyebutkan, sebanyak 7,6 juta jiwa meninggal pada tahun 2005 dan 84 juta orang lainnya akan mati dalam jangka waktu 10 tahun ke depan, jika tidak ada tindakan nyata untuk menanggulangi penyakit ini. Di Indonesia, kanker menduduki peringkat keenam sebagai penyebab kematian utama. Sekitar 800.000 orang Indonesia terserang kanker tiap tahunnya (Anonim, 2007a). Pada kasus kanker sel plasma, American Cancer Society memperkirakan 19.900 kasus baru akan terjadi pada tahun 2007. Jumlah kematian akibat penyakit ini sekitar 10.790 jiwa, terdiri dari 5.550 pria dan 5.240 wanita. Dari 10,5 miliar pasien kanker diperkirakan jumlah pasien multiple myeloma sebanyak 63.000 jiwa (Rados, 2007). Pengobatan kanker sangat bervariasi dan tergantung pada faktor jenis, lokasi, kuantitas penyakit serta status kesehatan pasien. Beberapa jenis pengobatan kanker yang dapat dilakukan adalah pembedahan, radiasi, kemoterapi, terapi hormon, inhibitor spesifik, antibodi, dan vaksin (Anonim, 2002). Akan tetapi, berbagai pengobatan tersebut memiliki banyak efek yang merugikan pasien dan membutuhkan biaya yang mahal. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 2 Penggunaan obat tradisional di masyarakat telah berkembang semakin pesat. Obat tradisional merupakan obat dari bahan-bahan alam yang memiliki khasiat untuk menyembuhkan penyakit. Pada umumnya, harga obat tradisional lebih murah dibandingkan dengan obat modern. Oleh karena itu, masyarakat mulai beralih menggunakan obat tradisional yang memiliki efek terapi sama dengan obat modern. Sirih merah (Piper crocatum Ruiz & Pav.) merupakan salah satu tanaman yang memiliki berbagai khasiat. Secara empiris, daun sirih merah digunakan untuk mengobati kanker, kencing manis, ambeien, peradangan, asam urat, hepatitis, maag, peradangan akut pada organ tubuh tertentu, luka yang sulit sembuh, TBC, lemah sahwat, jantung koroner, darah tinggi, dan asam urat (Sudewo, 2005). Untuk membuktikan klaim antikanker yang beredar di masyarakat, maka diperlukan penelitian terhadap daun sirih merah. Dalam penelitian ini, digunakan kultur sel mieloma untuk mengetahui apakah ekstrak etanolik daun sirih merah bersifat sitotoksik terhadap sel kanker. Hasil penelitian ini diharapkan dapat digunakan sebagai dasar pengembangan senyawa antikanker dari tanaman sirih merah untuk pengobatan kanker sel plasma. 1. Rumusan masalah Berdasarkan latar belakang yang telah dipaparkan, maka dapat dirumuskan permasalahan sebagai berikut: a. apakah ekstrak etanolik daun sirih merah bersifat sitotoksik ? PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 3 b. seberapa besar harga LC50 dari ekstrak etanolik daun sirih merah terhadap kultur sel mieloma? 2. Keaslian penelitian Sejauh yang diketahui penulis, penelitian mengenai uji sitotoksisitas ekstrak etanolik daun sirih merah terhadap kultur sel mieloma belum pernah dilakukan. 3. Manfaat penelitian Penelitian mengenai uji sitotoksisitas ekstrak etanolik daun sirih merah ini diharapkan memiliki beberapa manfaat, antara lain: a. manfaat teoritis yang dapat diperoleh ialah untuk melengkapi dan memperkaya teori yang telah ada mengenai khasiat daun sirih merah serta memberikan informasi tentang efek sitotoksisitas ekstrak etanolik daun sirih merah terhadap kultur sel mieloma. b. manfaat praktis yang dapat diperoleh ialah sebagai bukti ilmiah mengenai klaim khasiat daun sirih merah sebagai antikanker. B. Tujuan 1. Tujuan umum Untuk mengetahui apakah ekstrak etanolik daun sirih merah bersifat sitotoksik. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 4 2. Tujuan khusus : a. untuk mengetahui apakah ekstrak etanolik daun sirih merah bersifat sitotoksik terhadap kultur sel mieloma. b. untuk mengetahui seberapa besar harga LC50 ekstrak etanolik daun sirih merah terhadap kultur sel mieloma. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 5 BAB II PENELAAHAN PUSTAKA A. Tanaman Sirih Merah 1. Keterangan botani Tanaman sirih merah (Piper crocatum Ruiz & Pav.) termasuk dalam famili : Piperaceae (Anonim, 2007b), memiliki sinonim Piper ornatum N.E. Br. (Anonim, 2006a). Di daerah Sulawesi, tanaman ini dikenal dengan nama Celebes pepper (Anonim, 2007c). 2. Uraian tanaman Menurut Sudewo (2005), tanaman sirih merah tumbuh menjalar seperti halnya sirih hijau. Batangnya bulat berwarna hijau keunguan dan tidak berbunga. Daunnya bertangkai membentuk jantung dengan bagian atas meruncing, bertepi rata, dan permukaannya mengkilap atau tidak berbulu. Panjang daunnya bisa mencapai 15-20 cm. Warna daun bagian atas hijau bercorak warna putih keabu-abuan. Bagian bawah daun berwarna merah hati cerah. Daunnya berlendir, berasa sangat pahit, dan beraroma wangi khas sirih. Batangnya beruas dengan jarak buku 5-10 cm dan di setiap buku tumbuh bakal akar. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 6 3. Kandungan kimia Kandungan kimia tanaman ini belum diteliti secara detil. Dari hasil kromatogram diketahui daun sirih merah mengandung flavonoid, alkaloid, senyawa polifenolat, tanin, dan minyak atsiri (Sudewo, 2005). Beberapa penelitian menunjukkan adanya efek sitotoksisitas dari senyawa flavonoid dan alkaloid. Menurut Devie (2007), kematian 50% sel mieloma terjadi akibat pemberian fraksi alkaloid daun jarong (Achyrantes aspera Linn) terjadi pada dosis 1 µg/ml. Kematian sel mieloma diduga akibat proses degenerasi, nekrosis, dan apoptosis. Kunci pepet (Kaempferia rotunda Linn) mengandung senyawa alkaloid, flavonoid, dan polifenol memberikan efek sitotoksitas pada sel mieloma dengan LC50 sebesar 7,36 g/ml (Wahyuningsih, 2004). Suatu penelitian menunjukkan efek sitotoksisitas ekstrak etanol kalus mahkota dewa (Phaleria macrocarpa (Scheff) Boerl.) terhadap sel mieloma dengan LC50 sebesar 12,53 µg/ml. Hasil analisis menunjukkan bahwa ekstrak etanol kalus mahkota dewa mengandung senyawa golongan alkaloid, terpenoid, dan flavonoid (Setyaningsih, 2005). 4. Khasiat dan penggunaan Secara empiris, ekstrak daun sirih merah dalam pemakaian secara tunggal atau diformulasikan dengan tanaman obat lainnya mampu membasmi aneka penyakit, seperti kanker payudara, kanker rahim, leukemia, diabetes melitus, peradangan akut pada organ tubuh tertentu, luka yang sulit sembuh, TBC, radang pada lever, lemah sahwat, ambeien, jantung koroner, darah tinggi, dan asam urat (Sudewo, 2005). PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 7 5. Penelitian Sepengetahuan penulis, belum ada penelitian mengenai uji sitotoksisitas daun sirih merah terhadap kultur sel mieloma. Beberapa penelitian yang pernah dilakukan pada daun sirih merah adalah : a. Toksisitas ekstrak air daun sirih merah dan kemampuannya dalam menurunkan kadar glukosa darah tikus. Hasil penelitian menunjukkan ekstrak daun sirih merah dosis 20 g/kg BB dapat menurunkan glukosa darah tikus sebesar 34,3 %. Penurunan lebih tinggi dibandingkan dengan obat anti DM komersial Daonil 3,22 ml/kg yang hanya menurunkan 27 % glukosa darah tikus (Diek, 2005). b. Skrining fitokimia daun sirih merah. Hasil penelitian menunjukkan sirih merah mengandung flavonoid, senyawa polifenolat, alkaloid, tanin dan minyak atsiri (Sudewo, 2005). B. Kanker Kanker merupakan penyakit yang ditandai dengan proliferasi sel yang tidak terkontrol dan mengarah pada invasi jaringan di sekitarnya serta menyebar ke bagian lain dalam tubuh (metastasis) (King, 2000). Kanker disebabkan oleh mutagen, yaitu substansi yang dapat menyebabkan mutasi DNA. Mutagen yang menyebabkan kanker adalah karsinogen. Berdasarkan jenisnya, karsinogen terbagi menjadi 3 yaitu: karsinogen kimia, fisik dan biologi. Karsinogen kimia berasal dari zat-zat kimia seperti nitrosamina, kadmium, dan aflatoksin. Karsinogen fisik berasal dari pemaparan sinar X dan ultraviolet, sedangkan karsinogen biologi berasal dari berbagai mikroorganisme, seperti virus PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 8 papiloma, virus hepatitis B, dan bakteri helikobakter pylori (Yuswanto dan Sinardi, 2000). Menurut jaringan asal pertumbuhannya, kanker dapat diklasifikasikan menjadi 3 kelompok, yaitu (1) karsinoma, merupakan kanker yang tumbuh dari jaringan epitel, meliputi membran mukosa dan kelenjar (seperti kanker payudara, paru-paru dan ovarium); (2) sarkoma, merupakan kanker yang berasal dari jaringan mesodermal yang terdiri dari jaringan ikat, tulang atau sel otot; dan (3) blastoma, berasal dari hemopoetik dan jaringan darah, meliputi jaringan limfosit yang berasal dari leukosit dan mungkin juga berasal dari limfatik atau monositik (Bosman, 1999). 1. Karsinogenesis Karsinogenesis merupakan proses transformasi sel normal menjadi sel kanker. Karsinogenesis disebabkan oleh mutasi sel normal yang merusak keseimbangan antara proliferasi dan kematian sel normal. Hal ini menghasilkan pembelahan sel yang tidak terkontrol dan pembentukan tumor. Proliferasi sel yang tidak terkontrol dan cepat, mempermudah terbentuknya tumor jinak, beberapa tipe tumor tersebut dapat berubah menjadi tumor ganas (kanker). Tumor jinak tidak dapat menyebar ke bagian lain dalam tubuh atau menyerang jaringan lain, dan jarang mengancam jiwa kecuali mereka menekan struktur utama atau fisiologi aktif seperti produksi hormon. Tumor ganas dapat menyerang organ lain, menyebar ke lokasi yang jauh (metastasis) dan mengancam jiwa (Anonim, 2008a). PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 9 2. Kanker sel plasma Kanker sel plasma merupakan tipe kanker yang berkembang dari sel dalam sumsum tulang yang disebut sel plasma. Kanker ini dapat berkembang di tempattempat yang terdapat sumsum tulang, termasuk tulang pinggul, tulang belakang dan tulang rusuk (Anonim, 2007d). Penyebab kanker sel plasma tidak diketahui secara pasti (Anonim, 2006b). Akan tetapi, penelitian menunjukkan bahwa terjadi perubahan DNA pada sel mieloma. Kebanyakan sel mieloma kehilangan semua atau satu bagian pada kromosom 13. Sel yang kehilangan kromosom 13 cenderung lebih agresif dibandingkan sel yang memiliki kromosom 13 normal (Fronseca, 2008). Dalam keadaan normal, ketika antigen masuk ke dalam tubuh, limfosit B akan berkembang menjadi sel plasma dan menghasilkan antibodi untuk melawan antigen tersebut. Pada kanker sel plasma, limfosit B mengalami kerusakan secara genetik sehingga terjadi peningkatan jumlah sel plasma dan antibodi yang berlebihan (Lonial, 2005). Ketika sel plasma tumbuh tak terkontrol, mereka dapat menghasilkan tumor. Tumor ini umumnya berkembang di dalam sumsum tulang. Apabila, hanya terdapat satu tumor, maka disebut plasmacytoma. Biasanya, tumor sel plasma menyebar melewati sumsum tulang dan terdapat di beberapa tempat, yang disebut sebagai multiple myeloma (Anonim, 2006c). 3. Sel mieloma Sel mieloma pertama kali diambil dari Marwin Plasma Cell Tumour-11 (MPC-11) yang diisolasi dari mencit Balb/c koleksi Fahei (1967) oleh Laskov dan PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 10 Scharff. Sel tumor ini diadaptasi ke dalam kultur secara terus menerus sampai 6 kali dan dipelihara dalam erlenmeyer yang berisi media Dulbecco’s-Eagle’s dengan asam amino essensial dan 20% serum kuda yang inaktif. Sel mieloma menyerupai sel tumor induk yang dapat memproduksi gamaglobulin (IgG2b), 5-6ug IgG2b per sel per menit. Waktu pembelahan sel kurang lebih 17 jam. Kultur sel mieloma memiliki karakteristik yaitu bentuk selnya hampir bulat sempurna, bergerombol, melekat di dasar flask dan akan terlepas dari dasar flask dengan agitasi ringan (Irawati, 2005). C. Ekstraksi Ekstraksi merupakan kegiatan penarikan kandungan kimia yang dapat larut sehingga terpisah dari bahan yang tidak larut dengan pelarut cair. Simplisia yang diekstrak mengandung senyawa aktif yang dapat larut dan senyyawa tidak dapat larut seperti serat, karbohidrat, protein dan lain-lain. Senyawa aktif yang dapat larut digolongkan ke dalam golongan minyak atsiri, alkaloid, flavonoid dan lain-lain (Anonim, 2000). Bahan baku tumbuhan yang diekstraksi akan menghasilkan produk, yakni ekstrak tumbuhan obat. Ekstrak adalah sediaan pekat yang diperoleh dengan mengekstraksi zat aktif dari simplisia nabati atau simplisia hewani menggunakan pelarut yang sesuai, kemudian pelarut diuapkan dari massa atau serbuk yang memenuhi baku tertentu yang telah ditetapkan (Anonim, 2000). Salah satu cara ekstraksi yang sering dilakukan adalah metode maserasi. Maserasi merupakan proses perendaman sampel dengan pelarut organik yang digunakan pada temperatur ruangan. Proses ini sangat menguntungkan dalam isolasi PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 11 senyawa bahan alam karena dengan perendaman sampel tumbuhan akan terjadi pemecahan dinding dan membran sel akibat perbedaan tekanan antara di dalam dan di luar sel sehingga metabolit sekunder yang ada dalam sitoplasma akan terlarut dalam pelarut organik dan ekstraksi senyawa akan sempurna karena dapat diatur lama perendaman yang dilakukan. Pemilihan pelarut untuk proses maserasi akan memberikan efektifitas yang tinggi dengan memperhatikan kelarutan senyawa bahan alam pelarut tersebut (Lenny, 2006). Keuntungan metode maserasi adalah cara pengerjaan dan alat yang digunakan sederhana dan mudah diusahakan. Akan tetapi, metode ini memiliki kelemahan, yakni waktu pengerjaannya lama (Mustofa, 2007). Pelarut cair yang sering digunakan pada pembuatan ekstrak adalah air dan campuran etanol air. Bila digunakan cairan penyari air maka untuk mencegah tumbuhnya jamur dapat ditambahkan bahan pengawet yang diberikan pada awal penyarian (Anonim, 2000). D. Uji Sitotoksisitas Sitotoksisitas adalah sifat toksis atau beracun suatu senyawa terhadap sel yang hidup. Uji sitotoksisitas adalah uji in vitro dengan menggunakan kultur sel yang digunakan dalam evaluasi keamanan obat, kosmetika, zat tambahan makanan, pestisida, dan digunakan juga untuk mendeteksi adanya aktivitas sitotoksik dari suatu senyawa. Sistem ini merupakan uji kualitatif dan kuantitatif dengan cara menetapkan kematian sel (Freshney, 2000). Salah metode uji sitotoksisitas yang sering digunakan adalah metode perhitungan langsung menggunakan haemocytometer. Metode yang banyak PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 12 digunakan untuk menghitung sel secara efisien dan akurat adalah menggunakan haemocytometer. Alat ini berupa counting chamber yang memiliki ketebalan 0,1 mm dan squared graduation untuk memudahkan perhitungan. Ketika suspensi sel diisikan ke dalam chamber, sel dapat diamati di bawah mikroskop dan dihitung dalam ruled square yang dipilih. Dari perhitungan ini, jumlah sel per ml suspensi dapat dihitung secara langsung (Doyle and Griffiths, 2000). Trypan blue biasa digunakan untuk membedakan sel hidup dari sel mati. Sel hidup tidak terwarnai, bulat dan relatif kecil dibandingkan dengan sel mati. Sedangkan sel mati membengkak dan berwarna biru (Doyle and Griffiths, 2000). Dalam beberapa hal, penggunaan trypan blue dihindari karena menyebabkan lapangan pandang berwarna gelap sehingga sulit membedakan sel hidup dan sel mati (Elly, 2002). Pemaparan trypan blue yang lebih dari 15 menit juga akan mewarnai sel hidup (Anonim, 1999). E. Landasan Teori Saat ini banyak bahan-bahan alam yang digunakan dalam pengobatan kanker, seperti daun sirih merah. Akan tetapi, belum ada penelitian yang mendukung klaim khasiat daun sirih merah sebagai antikanker. Dari hasil skrining fitokimia, diketahui bahwa daun sirih merah mengandung flavonoid, alkaloid, senyawa polifenolat, tanin, dan minyak atsiri. Flavonoid terbagi menjadi 6 subkelas, yaitu : flavon (apigenin, luteolin), flavonol (kuersetin, mirisetin), flavanon (naringenin dan hesperidin), flavanol (epikatekin dan galokatekin), antosianidin (sianidin dan pelargonidin), dan isoflavon PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 13 (genistein dan daidezin) (Ross and Kasum, 2002). Beberapa jenis flavonoid yang memiliki efek antikanker adalah kuersetin, genistein, daidezin, dan antosianin (Grotewold, 2006). Kebanyakan senyawa golongan ini larut dalam air dan pelarut organik lainnya seperti metanol, etanol dan aseton. Flavonoid berperan sebagai inhibitor enzim DNA topoisomerase sel kanker. Enzim tersebut merupakan enzim yang berperan dalam proses replikasi, transkripsi dan rekombinasi DNA serta proses proliferasi dan diferensiasi sel kanker (Sukardiman, 1999). Alkaloid merupakan salah satu senyawa organik terbanyak di alam dan tersebar pada tumbuhan. Alkaloid terdiri dari golongan piridin, pirolidin, tropan, kuinolin, isokuinolin, penetilamin, indol, purin, terpenoid, dan vinka. Senyawa golongan ini tidak larut dalam air, tetapi larut dalam pelarut organik, seperti etanol, metanol, kloroform dan eter. Golongan alkaloid vinka telah diketahui memiliki aktivitas sebagai antikanker, misalnya vinkristin dan vinblastin yang dapat menghambat pembelahan sel kanker (Anonim, 2008b). Penelitian dari beberapa tanaman menujukkan bahwa senyawa alkaloid dan flavonoid memiliki efek sitotoksisitas terhadap sel mieloma. Hal tersebut mendasari penelitian uji sitotoksisitas ekstrak etanolik daun sirih merah terhadap kultur sel mieloma ini, untuk melihat apakah ekstrak etanolik daun sirih merah bersifat sitotoksik terhadap kultur sel mieloma. F. Hipotesis Ekstrak etanolik daun sirih merah bersifat sitotoksik terhadap kultur sel mieloma. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 14 BAB III METODOLOGI PENELITIAN A. Jenis dan Rancangan Penelitian Penelitian uji sitotoksisitas ekstrak etanolik daun sirih merah terhadap kultur sel mieloma ini termasuk penelitian eksperimental murni dengan rancangan acak lengkap pola satu arah. B. Variabel Penelitian dan Definisi Operasional 1. Variabel utama a. Variabel bebas Kadar ekstrak etanolik daun sirih merah, yaitu : 250 µg/ml, 500 µg/ml, 750 µg/ml, 1000 µg/ml, 1250 µg/ml, 1500 µg/ml, 1750 µg/ml, dan 2000 µg/ml. b. Variabel tergantung Persentase kematian kultur sel mieloma. 2. Variabel pengacau terkendali a. Medium tumbuh sel dikendalikan dengan menggunakan medium RPMI-1640 serum. b. Tempat tumbuh dan waktu pemanenan daun sirih merah dikendalikan dengan memanen daun pada tempat dan waktu yang sama PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 15 c. Kematian alami sel mieloma dikendalikan dengan adanya kontrol kultur sel mieloma. 3. Definisi operasional a. Sitotoksisitas ialah sifat toksik atau beracun dari ekstrak etanolik daun sirih merah terhadap kultur sel mieloma. b. Ekstrak etanolik ialah ekstrak yang diperoleh dengan cara mengekstraksi daun sirih merah secara maserasi menggunakan larutan penyari etanol 70%. c. LC50 ialah konsentrasi ekstrak etanolik daun sirih merah yang mampu membunuh atau menyebabkan kematian sejumlah 50% kultur sel mieloma dan dinyatakan dalam µg/ml. C. Alat dan Bahan 1. Alat Peralatan yang digunakan dalam penelitian ini terdiri atas : alat-alat gelas, oven, blender, ayakan, kertas saring, filter polietilensulfon, timbangan analitik (Mettler Toledo), alumunium foil, autoklaf, tissue culture flask (Nunc), tabung conical (Nunc), swing rotor sentrifuge (Centrifuge), inkubator (Memmer), mikropipet, lemari pendingin (Sharp), cell counter (Rogoshiseiki), 96-well plate (NunclonTM), laminar air flow (LabconcoR), mikroskop (Olympus), haemocytometer (Neubauer Improved), yellowtip, bluetip, tabung effendrof, tisu, sarung tangan dan masker. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 16 2. Bahan Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini ialah : a. Daun sirih merah segar b. Kultur sel mieloma yang diambil dari stok di Laboratorium Hayati Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta. c. Larutan penyari yang digunakan dalam preparasi ekstrak etanolik daun sirih merah, yakni etanol 70% d. Medium pencuci : RPMI-1640, Natrium bikarbonat, Hepes e. Medium penumbuh : RPMI-1640, FBS (Foetal Bovine Serum) 10%, PenisilinStreptomisin 1%, dan Fungison 0,5%. f. Reagen pewarna : Trypan Blue g. Aquabidest h. Dimethyl Sulfoxide (DMSO) D. Tata Cara Penelitian 1. Determinasi tanaman Bahan utama yang akan digunakan dalam penelitian, yaitu daun sirih merah, dideterminasi terlebih dahulu di laboratorium Biologi Farmasi, Fakultas Farmasi Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta dan dipastikan juga kebenarannya menggunakan kunci determinasi. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 17 2. Pengumpulan daun sirih merah Daun sirih merah yang digunakan diambil dari tanaman daun sirih merah yang tumbuh di desa Mantenan, kecamatan Mertoyudan, kabupaten Magelang, Jawa Tengah, pada bulan September 2007. 3. Preparasi ekstrak etanolik daun sirih merah Daun sirih merah dipetik, disortir, dicuci dengan air mengalir dan ditiriskan. Setelah itu, daun sirih merah dikeringkan dengan menggunakan oven pada suhu 60700C dan diserbuk dengan blender sampai halus serta diayak dengan menggunakan ayakan 0,75 mm. Selanjutnya, dilakukan ekstraksi daun sirih merah dengan metode maserasi. Serbuk daun sirih merah ditimbang dan diekstraksi dengan larutan penyari etanol 70%. Untuk tiap 10 bagian (100 g) serbuk digunakan 75 bagian (750 ml) etanol 70%, ditutup dan dibiarkan selama 24 jam terlindung dari cahaya matahari. Setelah 24 jam sari diserkai, disaring, ampas diperas, ampas ditambah cairan penyari secukupnya, diaduk dan diserkai sehingga diperoleh seluruh sari sebanyak 100 bagian. Bejana ditutup, dibiarkan di tempat sejuk, terlindung dari cahaya, selama 2 hari kemudian endapan dipisahkan. Rendaman harus dikocok berulang-ulang (kirakira 3 kali sehari). Setelah 2 hari maserat disaring dengan kertas saring, kemudian ditampung. Maserat yang terkumpul kemudian dipekatkan di atas waterbath dengan suhu 60-65oC, dibantu dengan kipas angin sampai kental. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 18 4. Pembuatan larutan uji Ekstrak etanolik daun sirih merah ditimbang sebanyak 0,1 g, dilarutkan dengan DMSO dan diaduk sampai homogen untuk mendapatkan sediaan ekstrak induk dengan konsentrasi 100 mg/ml. Dari sediaan ekstrak induk tersebut, dibuat sediaan uji, dengan konsentrasi sebesar 250 µg/ml, 500 µg/ml, 750 µg/ml, 1000 µg/ml, 1250 µg/ml, 1500 µg/ml, 1750 µg/ml, dan 2000 µg/ml. 5. Pembuatan medium pencuci RPMI-1640 dilarutkan dalam aquabidest kurang lebih 80 ml, ditambah 2,3 g natrium bikarbonat, 2 g Hepes, diencerkan sampai 100 ml, pH dibuat 7,2, lalu disterilkan dengan filter polietilensulfon yang berdiameter 0,22 μm secara aseptis. Medium disimpan dalam lemari pendingin pada suhu 4oC (Freshney, 1986; Jacoby and Pastan, 1979; Sambrook, Fritsch and Maniatis, 1989). 6. Pembuatan medium penumbuh Untuk medium RPMI-1640 serum, ditambahkan FBS (Foetal Bovine Serum) 10%, penisilin-streptomisin 1% dan fungison 0,5% dalam medium RPMI1640 dan disterilkan dengan filter polietilensulfon yang berdiameter 0,22 μm secara aseptis. Medium disimpan dalam lemari pendingin pada suhu 4oC (Freshney, 1986; Jacoby and Pastan, 1979; Sambrook et al, 1989). 7. Propagasi sel mieloma Sel diambil dari tangki nitrogen cair, kemudian segera dicairkan dalam penangas air 37oC, kemudian ampul disemprot dengan etanol 70%. Ampul dibuka PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 19 dan sel mieloma dipindahkan dalam tabung conical steril yang berisi medium RPMI1640. Suspensi sel disentrifugasi selama 5 menit, supernatan dibuang, diganti dengan medium RPMI-1640 yang baru, kemudian disuspensikan perlahan. Suspensi sel lalu disentrifugasi kembali selama 5 menit kemudian dicuci ulang sekali lagi. Supernatan dibuang, pelet ditambahkan 1 ml medium penumbuh yang mengandung 10% FBS. Resuspensikan secara perlahan sampai homogen, kemudian sel ditumbuhkan dalam tissue culture flask kecil dan diinkubasikan dalam inkubator dengan suhu 37oC dan aliran 5% CO2. Setelah 24 jam, medium penumbuh diganti dan sel ditumbuhkan hingga konfluen dan jumlahnya cukup untuk penelitian (Freshney, 1986; Jacoby and Pastan, 1979; Sambrook et al, 1989). 8. Panen sel mieloma Setelah jumlah sel cukup (kurang lebih setelah berumur 7 hari), medium diganti dengan RPMI-1640 baru sebanyak 5 ml kemudian sel dilepaskan dari dinding flask dengan cara diresuspensikan menggunakan pipet Pasteur. Sel dipindahkan dalam tabung conical steril dan ditambahkan medium RPMI-1640 sampai volum 10 ml dan disentrifugasi dengan kecepatan 3000 rpm selama 5 menit. Supernatan dibuang dan pelet sel diresuspensikan perlahan dengan 1 ml medium. Sel kemudian dihitung menggunakan haemocytometer. Suspensi sel ditambah sejumlah medium sehingga memperoleh konsentrasi sel sebesar 2x104/100 μl dan siap dipakai untuk penelitian (Freshney, 1986; Jacoby and Pastan, 1979; Sambrook et al, 1989). PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 20 9. Uji sitotoksisitas ekstrak etanolik daun sirih merah Suspensi kultur sel mieloma dengan kepadatan 2 x 104 sel / 100 μl medium diambil sebanyak 100 μl dan dimasukkan ke dalam sumuran 96-well plate bersama dengan ekstrak uji sesuai seri konsentrasi yang dibuat, yaitu 250 µg/ml, 500 µg/ml, 750 µg/ml, 1000 μg/ml, 1250 μg/ml, 1500 μg/ml, 1750 μg/ml, dan 2000 μg/ml. Untuk kontrol, digunakan 100 μl suspensi sel dan ditambahkan medium. Setelah itu, plate diinkubasi dalam inkubator dengan suhu 370C dan aliran 5% CO2 selama 24 jam. Pada akhir masa inkubasi, tiap sumuran sel diresuspensi, kemudian ditambahkan 50 μl trypan blue. Tiap sumuran diambil 10 μl dan masukkan dalam haemocytometer. Setelah itu, dilakukan perhitungan jumlah sel hidup pada control dan tiap konsentrasi di bawah mikroskop. Sel yang hidup akan tampak relatif bulat transparan. Sedangkan sel yang mati akan tampak gelap dan tidak cemerlang. E. Analisis Hasil Analisis hasil dilakukan dengan perhitungan persentase kematian kultur sel mieloma dengan rumus : % kematian = A−B x 100 % A Keterangan : A= Jumlah kultur sel mieloma yang hidup pada sumuran kontrol media B= Jumlah kultur sel mieloma yang hidup pada sumuran yang telah diberi perlakuan ekstrak etanolik daun sirih merah PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 21 Efek sitotoksisitas ekstrak etanolik daun sirih merah diketahui dengan analisis statistik Anova satu arah, sedangkan perhitungan LC50 dilakukan dengan menggunakan analisis probit. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 22 BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN A. Determinasi tanaman Determinasi tanaman dilakukan untuk memastikan identitas tanaman uji dan menghindari terjadinya kesalahan dalam pengambilan tanaman uji. Determinasi dilakukan dengan cara mencocokkan tanaman dengan kunci determinasi (Backer, 1965). Determinasi dilakukan pada bulan September 2007 di Laboratorium Biologi Farmasi, Fakultas Farmasi, Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta. Hasil determinasi menunjukkan bahwa tanaman yang teliti adalah benar tanaman sirih merah (Piper crocatum Ruiz & Pav.) B. Pengumpulan daun sirih merah Daun sirih merah yang digunakan diambil dari tanaman daun sirih merah yang tumbuh di desa Mantenan, kecamatan Mertoyudan, kabupaten Magelang, Jawa Tengah, pada bulan September 2007. Pengumpulan daun sirih merah harus diketahui asalnya karena perbedaan lingkungan tempat tumbuh mengakibatkan perbedaan kadar kandungan senyawa aktif. Setelah dipetik, daun disortir dengan standar mutu : bersih, segar, tebal, dan mengkilap. Penyortiran daun perlu dilakukan untuk memisahkan daun yang layak dipakai untuk bahan obat dan daun yang harus dibuang (Sudewo, 2005). Daun sirih PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 23 merah merah perlu dicuci dengan air mengalir untuk membersihkan kotoran dan debu yang menempel pada permukaan daun. Dalam pembuatan simplisia daun sirih merah, dilakukan pengeringan dengan menggunakan oven pada suhu 600C-700C. Pengeringan bertujuan untuk mencegah kerusakan sampel oleh mikroorganisme. Bila kadar air dalam simplisia terlalu tinggi, maka simplisia dapat berkapang. Kerusakan yang terjadi tidak hanya terbatas pada jaringan simplisia, tetapi juga akan merusak susunan kimia zat yang terkandung di dalam simplisia. Selain itu, kapang juga dapat menghasilkan toksin yang dapat mengganggu kesehatan (Sirait, 1985). Keuntungan pengeringan dengan oven adalah perngeringan lebih merata, suhu dapat dikontrol dan waktu pengeringan lebih cepat karena tidak tergantung pada cuaca, bila dibandingkan dengan pengeringan yang menggunakan sinar matahari. Penyerbukan simplisia perlu dilakukan karena dapat memperluas area kontak antara daun dengan cairan penyarinya sehingga zat aktif yang terekstraksi akan semakin banyak. Penyerbukan dipengaruhi oleh derajat kehalusan simplisia, yakni semakin halus serbuk simplisia, proses ekstraksi semakin efektif dan efisien. Akan tetapi, apabila serbuk terlalu halus dapat mempersulit proses filtrasi. Oleh karena itu, dalam penelitian ini digunakan pengayak berdiameter 0,75 mm untuk menghasilkan ekstrak dengan kandungan zat aktif yang optimum. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 24 C. Preparasi ekstrak etanolik daun sirih merah Dalam penelitian ini, ekstraksi dilakukan secara maserasi dengan larutan penyari etanol 70%. Prinsip metode ini adalah perendamanan sampel dalam larutan penyari pada suhu ruangan. Perendaman menyebabkan terjadinya penembusan larutan penyari ke dalam dinding sel sehingga zat aktif akan terlarut. Perbedaan konsentrasi zat aktif di dalam dan di luar sel menyebabkan zat aktif di dalam sel akan terdesak ke luar sel. Keadaan ini akan terjadi terus-menerus hingga terjadi kesetimbangan konsentrasi di dalam dan di luar sel. Waktu perendaman dilakukan selama 2 hari sehingga ekstraksi zat aktif lebih sempurna. Kemudian ekstrak cair diuapkan dengan waterbath pada suhu 600C-650C sehingga larutan penyari menguap dan dihasilkan ekstrak kental. Larutan penyari harus memiliki selektifitas yang tinggi untuk senyawa yang akan diekstraksi, tidak bereaksi dengan senyawa yang terkandung di dalam simplisia, ekonomis, mudah menguap dan tidak berbahaya bagi manusia dan lingkungan (Samuelsson, 1999). Hal ini mendasari pemilihan etanol 70% sebagai larutan penyari karena dapat mengekstraksi senyawa flavonoid dan alkaloid. Flavonoid merupakan senyawa polar sehingga flavonoid cukup larut dalam pelarut polar seperti air, etanol, metanol, butanol, aseton, DMSO, dimetilformamida, dan lain-lain (Markham, 1988). Senyawa alkaloid tidak larut dalam air tetapi dapat larut dalam pelarut organik seperti etanol, eter, kloroform dan sebagainya (Anonim, 2008b). PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 25 Keuntungan metode maserasi adalah cara pengerjaan dan peralatan yang digunakan sederhana. Selain itu, metode ini tidak menggunakan panas, sehingga zat aktif yang termolabil tidak mudah rusak dan dapat terekstraksi. Kekurangan metode ini adalah waktu pengerjaan lama tergantung waktu perendaman dan membutuhkan jumlah pelarut yang banyak. D. Pembuatan medium pencuci dan medium penumbuh Dalam penelitian ini, digunakan 2 jenis medium, yakni : medium pencuci dan medium penumbuh. Medium pencuci mengandung RPMI-1640, natrium bikarbonat dan Hepes. Natrium bikarbonat berfungsi sebagai buffer sintetik, sedangkan Hepes sebagai bahan buffer organik. Kedua buffer ini digunakan untuk menjaga pH pertumbuhan agar tetap konstan. Medium penumbuh berfungsi sebagai media pertumbuhan bagi kultur sel mieloma. Medium ini mengandung RPMI-1640, FBS (Foetal Bovine Serum) 10%, penisilin-streptomisin 0,5%, dan fungison 0,5%. Dalam media ini, FBS digunakan sebagai suplemen pertumbuhan karena mampu mendukung nutrisi pertumbuhan pada kultur sel mieloma. Kondisi medium kultur harus bebas dari kontaminan. Hal ini dapat menyebabkan persaingan untuk mendapatkan nutrisi sehingga pertumbuhan kultur sel mieloma dapat terhambat. Oleh karena itu, dalam medium penumbuh digunakan kombinasi antibiotik penisilin-streptomisin untuk menghindari kontaminan bakteri, baik gram positif maupun negatif. Selain itu, digunakan fungison untuk menjaga agar medium bebas dari kontaminan jamur. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 26 E. Propagasi dan panen sel mieloma Untuk menghindari perubahan genetik, sel mieloma perlu dibekukan dalam tangki nitrogen cair sehingga kondisi sel mieloma tetap normal. Kemudian suspensi sel mieloma perlu disentrifugasi sehingga pelet sel terpisah dari medium dan mengendap di dasar tabung conical. Sentrifugasi dilakukan pada kecepatan 3000 rpm, sebagai kecepatan optimum untuk menghasilkan pelet sel mieloma yang padat, tidak rusak dan mudah diresuspensikan. Setelah berumur 7 hari, populasi kultur sel mieloma telah menempati seluruh permukaan area tumbuh dan jumlahnya telah mencukupi untuk penelitian. Oleh karena itu, kultur sel mieloma siap dipanen dan digunakan untuk penelitian. Sel yang siap panen merupakan sel yang fase pertumbuhannya menurun/berhenti karena kehabisan nutrisi sehingga dilakukan penggantian medium kultur. Kultur sel mieloma yang melekat pada flask dilepaskan dengan resuspensi secara perlahan dan dipindahkan ke dalam tabung conical untuk disentrifugasi. Tujuannya adalah untuk memisahkan pelet sel mieloma dan mediumnya sehingga dapat dihitung jumlah sel total dengan menggunakan haemocytometer. Setelah dipanen, dilakukan pengamatan morfologi sel mieloma. Kultur sel mieloma hidup berbentuk hampir bulat sempurna, bening cemerlang, tidak keruh pada bagian inti, dan berada pada dasar flask. Kultur sel mieloma mati terlihat mengapung pada media, keruh pada bagian intinya (Doyle and Griffiths, 2000). PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 27 Morfologi kultur sel mieloma tampak pada gambar berikut: Gambar 1. Foto kultur sel mieloma di sumuran kontrol (perbesaran 100x) Ket. : semua kultur sel mieloma hidup F. Uji sitotoksisitas ekstrak etanolik daun sirih merah Dalam penelitian ini, uji sitotoksitas dilakukan untuk mengetahui potensi ketoksikan ekstrak etanolik daun sirih merah terhadap kultur sel mieloma. Pengujian dilakukan dengan metode perhitungan langsung menggunakan pewarna trypan blue untuk mengamati morfologi dan menetapkan persen kematian kultur sel mieloma. Dari hasil uji sitotoksisitas dapat ditentukan harga LC50, yaitu konsentrasi ekstrak etanolik daun sirih merah yang mampu mematikan 50 % populasi kultur sel mieloma. Prinsip metode perhitungan langsung adalah pengamatan dan perhitungan jumlah kultur sel mieloma yang mati dan hidup dengan menggunakan haemocytometer. Dalam metode ini, trypan blue digunakan untuk membantu pengamatan dan perhitungan jumlah kultur sel mieloma. Kultur sel mieloma mati akan kehilangan integritas membrannya, sehingga trypan blue dapat masuk ke dalam dan mewarnai inti sel, sedangkan pada kultur sel mieloma hidup, trypan blue tidak PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 28 dapat masuk dan mewarnai inti sel karena adanya selektifitas membran selnya. Pada kultur sel mieloma yang mati, sel akan tampak berwarna biru, bentuknya lebih besar dan membengkak. Sedangkan pada kultur sel mieloma yang hidup, sel akan tampak bersinar, bentuknya kecil (gambar 2). i ii Gambar 2. Kultur sel mieloma di haemocytometer (perbesaran 100x) Ket. : i = sel mieloma hidup dan ii = sel mieloma mati Dalam metode ini, dilakukan perhitungan jumlah sel mieloma hidup dan direpresentasikan dalam bentuk persen kematian sel. Persentase kematian kultur sel mieloma merupakan persentase hasil pengurangan jumlah sel mieloma hidup pada kelompok kontrol dengan jumlah sel mieloma hidup pada kelompok perlakuan dibagi dengan jumlah sel mieloma hidup pada kelompok kontrol. Hasil persentase kematian kultur sel mieloma menunjukkan bahwa semakin tinggi konsentrasi maka persen kematian kultur sel semakin meningkat (gambar 3). Hal ini terlihat pada konsentrasi 2000 dan 1750 µg/ml, persentase kematian kultur sel mieloma sebesar 100 %. Persentase kematian 50 % diprediksikan berada disekitar konsentrasi 500 µg/ml yang menghasilkan persentase kematian sebesar 50,69; 49,32; dan 49,32 %. (tabel II). PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 29 Tabel II. Data persentase kematian kultur sel mieloma Konsentrasi (µg/ml) 2000 1750 1500 1250 1000 750 500 250 I 100,00 100,00 95,89 84,93 75,34 63,01 50,69 36,99 % pada penetapan II 100,00 100,00 94,52 84,93 73,97 63,01 49,32 36,99 III 100,00 100,00 94,52 84,93 73,97 63,01 49,32 36,99 Gambar 3. Grafik konsentrasi (µg/ml) terhadap % kematian kultur sel mieloma Kematian kultur sel mieloma juga dapat diketahui dengan pengamatan morfologi sel pada setiap konsentrasi ekstrak etanolik daun sirih merah. Pada konsentrasi 250, 500 dan 750 µg/ml, sel yang hidup dan mati terlihat secara jelas. Kultur sel mieloma hidup berbentuk hampir bulat sempurna dan bercahaya. Sedangkan pada kultur sel mieloma yang mati, bentuk sel berubah dan sel terlihat PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 30 keruh. Perbedaan yang signifikan ini dapat dilihat pada kadar 1750 dan 2000 µg/ml, sel mieloma mengalami kematian (gambar 4). ii ii i i (konsentrasi 250 µg/ml) (konsentrasi 500 µg/ml) i i ii ii (konsentrasi 750 µg/ml) (konsentrasi 1000 µg/ml) i ii ii (konsentrasi 1250 µg/ml) i (konsentrasi 1500 µg/ml) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 31 ii (konsentrasi 1750 µg/ml) ii (konsentrasi 2000 µg/ml) Gambar 4. Kultur sel mieloma di sumuran perlakuan (perbesaran 100x) Ket. : i = sel mieloma hidup dan ii = sel mieloma mati Kekurangan metode perhitungan langsung menggunakan pewarna trypan blue adalah perhitungan sel membutuhkan waktu yang lama dan subjektifitasnya tinggi. Untuk mengatasi hal ini, maka perhitungan sel dilakukan minimal 3 kali oleh orang yang sama untuk mengurangi tingkat kesalahan. Selain itu, setelah pemaparan trypan blue, kultur sel mieloma harus segera dihitung karena dapat menyebabkan toksisitas pada sel hidup sehingga mengurangi keakuratan perhitungan. Kelebihan metode ini adalah mudah dilakukan/sederhana, ekonomis, dan dapat mengamati sel yang hidup dan mati secara langsung. Untuk mengetahui efek sitotoksisitas ekstrak etanolik daun sirih merah terhadap kultur sel mieloma, maka dalam penelitian ini digunakan kontrol kultur sel mieloma. Hasil penelitian dianalisis secara statistik dengan metode Anova satu arah untuk mengetahui apakah jumlah kematian sel pada kelompok kontrol dan kelompok perlakuan berbeda secara signifikan atau tidak. Analisis statistik Anova satu arah dapat dilakukan apabila data yang dikaji memiliki distribusi normal, sampel bersifat independen/tidak terikat sampel yang lain PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 32 dan memiliki nilai varian yang sama (Harinaldi, 2005). Oleh karena itu, dilakukan uji Kolmogorov-Smirnov. Hasil pengolahan data dengan SPSS menunjukkan bahwa data yang dikaji memiliki distribusi yang normal (α > 0,05) dan nilai varian yang sama sehingga data dapat dianalisis dengan Anova satu arah. Hasil analisis menunjukkan jumlah kematian sel pada kelompok kontrol dan kelompok perlakuan berbeda secara signifikan, artinya ekstrak etanolik daun sirih merah bersifat sitotoksik terhadap kultur sel mieloma. Untuk mengetahui potensi ketoksikan ekstrak etanolik daun sirih merah, dilakukan analisis probit. Analisis probit merupakan salah satu analisis regresi untuk mengetahui hubungan konsentrasi-respon (persentase kematian sel) agar diperoleh persamaan garis lurus yang dapat digunakan untuk menentukan LC50 dengan lebih akurat (Nurrochmad, 2001). Analisis probit merupakan analisis regresi antara log konsentrasi dengan harga probit. Harga probit didapatkan dari tabel probit (lampiran 8) yang disesuaikan dengan persentase kematian kultur sel mieloma. Dalam analisis probit, perlu dilakukan uji linearitas pada setiap penetapan. Hasil uji linearitas menunjukkan bahwa r hitung > r [4, 0,05] (lampiran 6), artinya grafik pada penetapan I, II, dan III bersifat linear (gambar 5, 6 dan 7). Grafik yang linear menggambarkan bahwa log konsentrasi ekstrak etanolik daun sirih merah berbanding lurus dengan harga probit, sehingga LC50 dapat dihitung secara akurat. Dari hasil analisis probit didapatkan harga LC50 rata-rata sebesar 434,1 µg/ml. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI Gambar 5. Grafik log konsentrasi terhadap harga probit pada penetapan I Gambar 6. Grafik log konsentrasi terhadap harga probit pada penetapan II 33 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 34 Gambar 7. Grafik log konsentrasi terhadap harga probit pada penetapan III Semakin kecil LC50 suatu senyawa maka semakin toksik senyawa tersebut (Doyle and Griffiths, 2000). Ekstrak etanolik daun sirih merah memiliki LC50 > 20 µg/ml terhadap kultur sel mieloma. Penelitian sitotoksisitas ekstrak etanolik daun sirih merah juga dilakukan terhadap kultur sel kanker yang lain dengan nilai LC50 sebesar 1.143,1 µg/ml pada sel HeLa (Atmaningsih, 2008), nilai LC50 sebesar 587,7 µg/ml pada sel T47D (Neritika, 2008), nilai LC50 sebesar 200,7 µg/ml pada sel SiHa (Nur’aniyah, 2008), dan nilai LC50 sebesar 395,5 µg/ml pada sel Raji (Kusumaningtyas, 2008). Perbedaan harga LC50 pada sel HeLa, SiHa, T47D, raji dan mieloma disebabkan oleh perbedaan karakteristik sel yang berpengaruh terhadap sitotoksisitas pada sel tersebut. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 35 Berdasarkan kriteria National Cancer Institute (NCI), suatu senyawa yang dapat dikembangkan sebagai antikanker adalah senyawa dengan LC50 ≤ 20 µg/ml (Swanson and Pezzuto, Devie, 2007). Dalam penelitian ini, digunakan ekstrak etanolik daun sirih merah mengandung banyak senyawa yang kemungkinan berpotensi sebagai antikanker. Oleh karena itu, daun sirih merah dapat dikembangkan sebagai antikanker apabila ditemukan senyawa tunggal yang bertanggung jawab atas aktivitas antikanker tersebut dan memiliki LC50 ≤ 20 µg/ml. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 36 BAB V KESIMPULAN DAN SARAN A. Kesimpulan 1. Ekstrak etanolik daun sirih merah bersifat sitotoksik. 2. Harga LC50 dari ekstrak etanolik daun sirih merah terhadap kultur sel mieloma sebesar 434,1 µg/ml. B. Saran 1. Penelitian lebih lanjut mengenai sitotoksisitas fraksi etanolik daun sirih merah. 2. Penelitian lebih lanjut mengenai mekanisme kematian sel mieloma oleh ekstrak etanolik daun sirih merah. 3. Penelitian lebih lanjut mengenai sitotoksisitas ekstrak etanolik daun sirih merah terhadap sel normal. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 37 DAFTAR PUSTAKA Anonim, 1999, Biochemicals and Reagent for Life Science Research, Sigma_aldrich co.Singapura, 723, 1873 Anonim, 2000, Parameter Standar Umum Ekstrak Tumbuhan Obat, Cetakan I, Departemen Kesehatan RI, Jakarta Anonim, 2002, An Introduction to Cancer Treatments, http://cancerquest.emory. edu/index.cfm?page=183, November 2007 Anonim, 2006a, Celebes Pepper, http://davesgarden.com, Mei 2008 Anonim, 2006b, Understanding Myeloma, http://www.leukaemia.org.au, Maret 2008 Anonim, 2006c, Multiple Myeloma, http://documents.cancer.org/175.00/175.00.pdf, Maret 2008 Anonim, 2007a, 800.000 Orang Indonesia Terserang Kanker Tiap Tahun, http://www.suarapembaruan.com/News/2007/05/14/Utama/ut01.htm, Maret 2008 Anonim, 2007b, Piper crocatum, http://zipcodezoo.com/Plants/P/Piper_crocatum .asp, Mei 2007 Anonim, 2007c, Piper ornatum, http:/toptropicals.com/catalog/uid/piper_ornatum .htm, Mei 2007 Anonim, 2007d, Types of Myeloma, http://CancerHelp.UK.com, September 2007 Anonim, 2008a, Carcinogenesis, http://en.wikipedia.org/wiki/Carcinogenesis, Maret 2008 Anonim, 2008b, Alkaloid, http://en.wikipedia.org/wiki/Alkaloid, Maret 2008 Atmaningsih, F. R., 2008, Uji Sitotoksisitas Ekstrak Etanolik Daun Sirih Merah (Piper crocatum Ruiz & Pav.) Terhadap Kultur Sel HeLa, Skripsi, Fakultas Farmasi USD, Yogyakarta. Backer, C. A., dan Backuizen van den Brink, R. C.,1965, Flora of Java, Volume I dan II, N. V. Noordhoff, Graningen. Bosman, F. T., 1999, Aspek-aspek Fundamental Kanker, diterjemahkan oleh Arjuno, Edisi V, Panitia kanker RSUP Dr. Sardjito, Yogyakarta PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 38 De Muth, J. E., 1999, Basic Statistics And Pharmaceutical Statistical Applications, 585, Marcel Dekker, Inc., New York Devie, K., A., 2007, Efek Fraksi Alkaloid Daun jarong (Achyrantes aspera Linn.) Pada Viabilitas Kultur Sel Mieloma Mencit, Skripsi, Fakultas Kedokteran Hewan UNAIR, Surabaya Diek, 2005, Daun Sirih Merah Obat Tradisional Kencing Manis, http://www.bogoronline.com/index.php?ar_id=108&catid=9, November 2007 Doyle, A., and Griffiths, J.B., 2000, Cell and Tissue Culture for Medical Research, John Willey and Sons Ltd, New York Elly, K., W., 2002, Efek Fraksi Protein yang Diisolasi dari Daun Mirabilis jalapa L. Terhadap Proses Apoptosis pada Sel HeLa, Skripsi, Fakultas Farmasi UGM, Yogyakarta Freshney, R.I., 1986, Animal Cell Culture : A Practical Approach, 1st Edition, 7173, IRL Press, Washington DC Freshney, R. I., 2000, Culture f Animal Cells : A Manual of Basic Technique, 14th Edition, 336-338, John Wiley and Sons Inc., New York Fronseca, R., 2008, The Genome of Myeloma Cells, www.medcape.com, April 2008 Grotewold, E., 2006, The Science of Flavonoids, Springer Science_Business Media Inc., USA Harinaldi, 2005, Prinsip-Prinsip Statistik Untuk Teknik dan Sains, Penerbit Erlangga, Jakarta Irawati, M., 2005, Uji Sitotoksisitas Senyawa Chalcone dan (2E)-3-(4’-hidroksi-3’metoksifenil)-1(4’-metoksifenil)propan-2-en-1-on Terhadap Sel Mieloma dan Sel Vero, Skripsi, Fakultas Farmasi UGM, Yogyakarta Jacoby, W.B., and Pastan, I.H., 1979, Methods in Enzymology Cell Culture, Volume VIII, Academia Press Inc, New York King, R. J. B., 2000, Cancer Biology, 2nd Edition, Pearson Education Limited, London Kusumaningtyas, E. D., 2008, Uji Sitotoksisitas Ekstrak Etanolik Daun Sirih Merah (Piper crocatum Ruiz & Pav.) Terhadap Kultur Sel Raji, Skripsi, Fakultas Farmasi USD, Yogyakarta. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 39 Lenny, S., 2006, Isolasi dan Uji Bioaktifitas Kandungan Kimia Utama Puding Merah dengan Metoda Uji Brine Shrimp, USU Repository, Sumatera Utara Lonial, S., 2005, Intro to Myeloma, about_myeloma/, November 2007 Markham, K.R., 1988, Cara Identifikasi Padmawinata, ITB Bandung http://www.multiplemyeloma.org/ Flavonoid, diterjemahkan oleh Mursyidi, A., 1985, Statistika Farmasi dan Biologi, Ghalia Indonesia, Jakarta Mustofa, 2007, Fitofarmaka, Bagian Farmakologi/Pusat Kedokteran Tropis, Fakultas Kedokteran UGM, Yogyakarta Neritika, K., 2008, Uji Sitotoksisitas Ekstrak Etanolik Daun Sirih Merah (Piper crocatum Ruiz & Pav.) Terhadap Kultur Sel T47D, Skripsi, Fakultas Farmasi USD, Yogyakarta. Nur’aniyah, 2008, Uji Sitotoksisitas Ekstrak Etanolik Daun Sirih Merah (Piper crocatum Ruiz & Pav.) Terhadap Kultur Sel SiHa, Skripsi, Fakultas Farmasi USD, Yogyakarta. Nurrochmad, A., 2001, Sintesis kurkumin, bisdemetoksikurkumin, bisdemetoksihidroksikurkumin dan pentagamavunon-0 serta uji ketoksikannya terhadap sel mononuklear normal secara in vitro, Tesis S2, Program pasca sarjana, universitas gadjah mada, yogyakarta. Rados, C., 2007, Multiple Myeloma Statistics, Myeloma Breakdown, http://media.www.thehurricaneonline.com/media/paper479/sections/200710 11News.html, Maret 2008 Ross, J. A., and Kasum, C. M., 2002, Dietary flavonoids: bioavailability, metabolic effects, and safety, Annu Rev Nutr, 22: 19-34 Sambrook, Fritsch, E.F., Maniatis, T., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Coldspring Harbor Laboratory Press. Samuelsson, G., 1999, Drugs of Natural Origin, Swedish Pharmaceutical Press, Sweden Setyaningsih, N., 2005, Uji Sitotoksisitas Ekstrak Etanol Kalus Phaleria macrocarpa (Scheff) Boerl. Terhadap Sel Mieloma, Skripsi, Fakultas Farmasi UMS, Solo Sirait, M., 1985, Cara Pembuatan Simplisia, DepKes RI, Jakarta PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 40 Sudewo, B., 2006. Basmi Penyakit dengan Sirih Merah, AgroMedia Pustaka, Yogyakarta Sukardiman, R., 1999, Efek Antikanker Isolat dari Herba Benalu Mangga, Cermin Dunia Kedokteran 122: 6-8 Swanson, S.M. and Pezzuto J.M., 1990. Bioscreening Tecnique for Cytotoxic Potential and Ability to Inhibit Macromolecule Biosynthesis in : Thomson, E. B. Drug Bio Screening : Drug Evaluation Tecnique in Pharmacology. VCH publishers Inc. New York. p. 273- 295 Wahyuningsih, T., 2004, Uji Sitotoksisitas Ekstrak Gubal Rimpang Kunci Pepet (Kaempferia rotunda Linn.) Terhadap Sel Mieloma, Skripsi, Fakultas Farmasi UMS, Solo Yuswanto, A., dan Sinardi, F., 2000, Kanker, Penerbitan Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI Lampiran 1. Foto tanaman sirih merah Gambar 8. Tanaman Sirih Merah Gambar 9. Daun Sirih Merah 41 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI Lampiran 2. Foto medium dan peralatan uji sitotoksisitas Gambar 10. Medium pencuci (i) dan medium penumbuh (ii) Gambar 12. Mikroskop Gambar 14. Tabung conical steril (i) dan 96-well plate (ii) Gambar 11. Sentrifuge Gambar 13. Haemocytometer (i) dan cell counter (ii) Gambar 15. Kultur sel mieloma dalam Tissue Culture Flask 42 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI Lampiran 3. Perhitungan jumlah kultur sel mieloma tiap sumuran Jumlah kultur sel mieloma terhitung Jumlah kultur sel mieloma sebenarnya = 150 sel = x 1 x x 106 4 10 = 150 1 x x 106 4 10 = 3.750.000 sel/ml = 375.000 sel/100 µl Jumlah kultur sel mieloma yang dibutuhkan = 9 sumuran x 3 replikasi x kepadatan sel = 9 x 3 x 20.000 = 540.000 sel Jumlah media pengenceran = 9 sumuran x 3 replikasi x 100 µl (tiap sumuran) = 2700 µl Sehingga jumlah sel yang harus diambil dan diencerkan dengan 2700 µl adalah : 540.000 . 1 = 375.000 . x x= 540.000 = 1,4 ml 375.000 43 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 44 Lampiran 4. Perhitungan jumlah kultur sel mieloma yang hidup Tabel 1. Data perhitungan jumlah kultur sel mieloma dengan perhitungan langsung Konsentrasi (µg/ml) Kontrol 2000 1750 1500 1250 1000 750 500 250 I Hidup 73 0 0 3 11 18 27 36 46 Mati 0 35 42 41 36 30 27 22 15 Penetapan II Hidup Mati 73 0 0 36 0 43 4 41 11 36 19 31 27 27 37 22 46 15 III Hidup 73 0 0 4 11 19 27 37 46 Mati 0 36 43 41 35 31 27 21 14 Jumlah kultur sel mieloma yang hidup dan mati dari tiap sumuran hasil dapat dihitung dengan rumus : Jumlah sel/sumuran = X x 10 x 200 4 Keterangan : X = jumlah sel hasil perhitungan langsung pada haemocytometer 4 = jumlah bilik dalam haemocytometer 10 = jumlah volume yang masuk dalam bilik haemocytometer (10 µl) 200 = jumlah volume total (200 µl) Perhitungan jumlah sel mieloma dilakukan sebanyak tiga kali dengan hasil sebagai berikut : 1. Kontrol I = 73 x 10 x 200 = 36.500 sel 4 II = 73 x 10 x 200 = 36.500 sel 4 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI III = 73 x 10 x 200 = 36.500 sel 4 Rata-rata kontrol = 36.500 + 36.500 + 36.500 = 36.500 sel 3 2. Konsentrasi 250 µg/ml I = 46 x 10 x 200 = 23.000 sel 4 II = 46 x 10 x 200 = 23.000 sel 4 III = 46 x 10 x 200 = 23.000 sel 4 3. Konsentrasi 500 µg/ml I = 36 x 10 x 200 = 18.000 sel 4 II = 37 x 10 x 200 = 18.500 sel 4 III = 37 x 10 x 200 = 18.500 sel 4 4. Konsentrasi 750 µg/ml I = 27 x 10 x 200 = 13.500 sel 4 II = 27 x 10 x 200 = 13.500 sel 4 III = 27 x 10 x 200 = 13.500 sel 4 45 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 5. Konsentrasi 1000 µg/ml I = 18 x 10 x 200 = 9.000 sel 4 II = 19 x 10 x 200 = 9.500 sel 4 III = 19 x 10 x 200 = 9.500 sel 4 6. Konsentrasi 1250 µg/ml I = 11 x 10 x 200 = 5.500 sel 4 II = 11 x 10 x 200 = 5.500 sel 4 III = 11 x 10 x 200 = 5.500 sel 4 7. Konsentrasi 1500 µg/ml I = 3 x 10 x 200 = 1.500 sel 4 II = 4 x 10 x 200 = 2.000 sel 4 III = 4 x 10 x 200 = 2.000 sel 4 8. Konsentrasi 1750 µg/ml I = 0 x 10 x 200 = 0 sel 4 46 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI II = 0 x 10 x 200 = 0 sel 4 III = 0 x 10 x 200 = 0 sel 4 9. Konsentrasi 2000 µg/ml I = 0 x 10 x 200 = 0 sel 4 II = 0 x 10 x 200 = 0 sel 4 III = 0 x 10 x 200 = 0 sel 4 47 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 48 Lampiran 5. Perhitungan persentase kematian kultur sel mieloma Persentase kematian kultur sel mieloma dihitung dengan rumus : % kematian sel = A−B x 100 % A Keterangan : A = jumlah sel hidup pada sumuran kontrol B = jumlah sel hidup pada sumuran yang telah diberi perlakuan ekstrak etanolik daun sirih merah 1. Konsentrasi 250 µg/ml I = 36.500 − 23.000 x 100 % = 36,99 % 36.500 II = 36.500 − 23.000 x 100 % = 36,99 % 36.500 III = 36.500 − 23.000 x 100 % = 36,99 % 36.500 2. Konsentrasi 500 µg/ml I = 36.500 −18.000 x 100 % = 50,69 % 36.500 II = 36.500 −18.500 x 100 % = 49,32 % 36.500 III = 36.500 −18.500 x 100 % = 49,32 % 36.500 3. Konsentrasi 750 µg/ml I = 36.500 −13.500 x 100 % = 63,01 % 36.500 II = 36.500 −13.500 x 100 % = 63,01 % 36.500 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI III = 36.500 −13.500 x 100 % = 63,01 % 36.500 4. Konsentrasi 1000 µg/ml I = 36.500 − 9.000 x 100 % = 75,34 % 36.500 II = 36.500 − 9.500 x 100 % = 73,97 % 36.500 III = 36.500 − 9.500 x 100 % = 73,97 % 36.500 5. Konsentrasi 1250 µg/ml I = 36.500 − 5.500 x 100 % = 84,93 % 36.500 II = 36.500 − 5.500 x 100 % = 84,93 % 36.500 III = 36.500 − 5.500 x 100 % = 84,93 % 36.500 6. Konsentrasi 1500 µg/ml I = 36.500 − 1.500 x 100 % = 95,89 % 36.500 II = 36.500 − 2.000 x 100 % = 94,52 % 36.500 III = 36.500 − 2.000 x 100 % = 94,52 % 36.500 7. Konsentrasi 1750 µg/ml I = 36.500 − 0 x 100 % = 100 % 36.500 49 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI II = 36.500 − 0 x 100 % = 100 % 36.500 III = 36.500 − 0 x 100 % = 100 % 36.500 8. Konsentrasi 2000 µg/ml I = 36.500 − 0 x 100 % = 100 % 36.500 II = 36.500 − 0 x 100 % = 100 % 36.500 III = 36.500 − 0 x 100 % = 100 % 36.500 50 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 51 Lampiran 6. Perhitungan LC50 dengan analisis probit dan uji linearitas Penetapan I Tabel III. Data log konsentrasi, % kematian dan harga probit pada penetapan I Konsentrasi (µg/ml) 250 500 750 1000 1250 1500 Log konsentrasi % kematian Harga probit 2,39794 2,69897 2,87506 3,00000 3,09691 3,17609 36,99 50,69 63,01 75,34 84,93 95,89 4,67 5,03 5,33 5,67 6,04 6,75 Dengan Regresi Linear log konsentrasi ekstrak etanolik daun sirih merah terhadap harga probit didapatkan nilai : A = -1,33517, B = 2,40656 dan r hitung = 0,92852 Sehingga persamaannnya : y = Bx + A y = 2,40656x – 1,33517 5 = 2,40656x – 1,33517 x = 2,63246 Penetapan II Tabel IV. Data log konsentrasi, % kematian dan harga probit pada penetapan II Konsentrasi (µg/ml) 250 500 750 1000 1250 1500 Log konsentrasi % kematian Harga probit 2,39794 2,69897 2,87506 3,00000 3,09691 3,17609 36,99 49,32 63,01 73,97 84,93 94,52 4,67 4,97 5,33 5,64 6,04 6,64 Dengan Regresi Linear log konsentrasi ekstrak etanolik daun sirih merah terhadap harga probit didapatkan nilai : A = -1,18474, B = 0,93571 2,34262, dan r hitung = PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 52 Sehingga persamaannya : y = Bx + A y = 2,34262x – 1,18474 5 = 2,34262x – 1,18474 x = 2,64009 Penetapan III Tabel V. Data log konsentrasi, % kematian dan harga probit pada penetapan III Konsentrasi (µg/ml) 250 500 750 1000 1250 1500 Log konsentrasi % kematian Angka probit 2,39794 2,69897 2,87506 3,00000 3,09691 3,17609 36,99 49,32 63,01 73,97 84,93 94,52 4,67 4,97 5,33 5,64 6,04 6,64 Dengan Regresi Linear log konsentrasi ekstrak etanolik daun sirih merah terhadap harga probit didapatkan nilai : A = -1,18474, B = 2,34262, dan r hitung = 0,93571 Sehingga persamaannya : y = Bx + A y = 2,34262x – 1,18474 5 = 2,34262x – 1,18474 x = 2,64009 Rata-rata LC50 = anti log ( 2,63246 + 2,64009 + 2,64009 ) = anti log 2,63755 3 = 434,1 µg/ml PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 53 Uji Linearitas Tabel VI. Nilai r (koefisien korelasi) pada level signifikansi 5% dan 1% Degrees of Freedom (DF) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 5% 1% .997 .950 .878 .811 .754 .707 .666 .632 .602 .576 .553 .532 1.000 .990 .959 .917 .874 .831 .798 .765 .735 .708 .684 .661 Degrees of Freedom (DF) 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 5% 1% .514 .497 .482 .468 .456 444 .433 .423 .413 .404 .396 .641 .623 .606 .590 .575 .561 .549 .537 .526 .515 .505 (De Muth, 1999) Jumlah n = 6 DF = n-2 = 6-2 = 4 r tabel (DF = 4, α = 0,05) = 0,811 Apabila : r hitung > r [4, 0,05], maka linear r hitung < r [4, 0,05], maka tidak linear Penetapan I : r hitung > r [4, 0,05] 0,92852 > 0,811 (linear) Penetapan II : r hitung > r [4, 0,05] 0,93571 > 0,811 (linear) Penetapan III : r hitung > r [4, 0,05] 0,93571 > 0,811 (linear) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI Lampiran 7. Analisis statistik dengan Anova satu arah NPar Tests One-Sample Kolmogorov-Smirnov Test N Normal Parameters(a,b) Jumlah Sel Hidup 27 12000.00 00 11789.01 053 .154 .154 -.154 .802 .541 Mean Std. Deviation Most Extreme Differences Absolute Positive Negative Kolmogorov-Smirnov Z Asymp. Sig. (2-tailed) a Test distribution is Normal. b Calculated from data. Oneway ANOVA Jumlah Sel Hidup Between Groups Within Groups Total Sum of Squares 3613000 000.000 500000.0 00 3613500 000.000 Df Mean Square 451625000. 8 000 18 26 27777.778 F 16258.5 00 Sig. .000 54 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 55 Lampiran 8. Tabel probit Tabel VII. Tabel probit Persentase 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 99 0 3,72 4,16 4,48 4,75 5,00 5,25 5,52 5,84 6,28 0,0 7,33 1 2,67 3,77 4,19 4,50 4,77 5,03 5,28 5,55 5,88 6,34 0,1 7,37 2 2,95 3,82 4,23 4,53 4,80 5,05 5,31 5,58 5,92 6,41 0,2 7,41 3 3,12 3,87 4,26 4,56 4,82 5,08 5,33 5,61 5,95 6,48 0,3 7,46 Probit 4 5 3,25 3,36 3,92 3,96 4,29 4,33 4,59 4,61 4,85 4,87 5,10 5,13 5,36 5,39 5,64 5,67 5,99 6,04 6,55 6,64 0,4 0,5 7,51 7,58 6 3,45 4,01 4,36 4,64 4,90 5,15 5,41 5,71 6,08 6,75 0,6 7,65 7 3,52 4,05 4,39 4,67 4,92 5,18 5,44 5,74 6,13 6,88 0,7 7,75 8 3,59 4,08 4,42 4,69 4,95 5,20 5,47 5,77 6,18 7,05 0,8 7,88 9 3,66 4,12 4,45 4,72 4,97 5,23 5,50 5,81 6,23 7,33 0,9 8,09 (Mursyidi, 1985) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI Lampiran 9. Determinasi tanaman sirih merah 56 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 57 BIOGRAFI PENULIS Penulis skripsi dengan judul “Uji Sitotoksisitas Ekstrak Etanolik Daun Sirih Merah (Piper crocatum Ruiz & Pav.) Terhadap Kultur Sel Mieloma” bernama Meri. Penulis dilahirkan di Selat Panjang pada tanggal 15 Februari 1987. Penulis merupakan putri kedua dari pasangan Setiawan Muksen dan Cindy Tieneke. Penulis mengawali pendidikan formalnya di Taman Kanak-kanak Murni Padang pada tahun 1991. Penulis melanjutkan pendidikan dasar di SD YPPK Gembala Baik Jayapura pada tahun 1992-1998. Kemudian dilanjutkan di SLTP YPPK Santo Paulus Jayapura pada tahun 1998-2001. Penulis melanjutkan pendidikan di SMU Negeri 4 Jayapura pada tahun 2001-2002 dan melanjutkan pendidikan di SMU Stella Duce I Yogyakarta pada tahun 20022004. Penulis melanjutkan pendidikan ke Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta pada tahun 2004.
