Acyloxylation and hydroxylation of alpha

VOLUME 9 NO.1, FEBRUARI
rssN 1410-s71
2OO5
3
ffiNATUML
\ry
JURNAL FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS BRAWIJAYA
DAFTAR ISI
I
.
Potensial
Seleksi Strain Bact!ius litirlr;slcr-s;-s Iso!at Sumenep ) ang Paling
.\lant:ati)
L'
tZ
P
Ganta.
aeg'ptt
.lecles
\1amuk
Lana
Pengendali
Agen
sebagai
Produk
2.
Reaksi Asiloksilasi Hidroksilasi terhadap Alfa-Pinena: Pemanfaatan
3.
Pembuatan Kristal
Pemanfaatan Limbah Kalsium Hasil Pengolahan Nira untuk
12
4.
di BangkongPenentuan Struktur Zona Mineralisasi Emas dan/atau Pengikutnya
(Sunaryo'
Diri
Potensial
Gadjahrejo Gedangan Malang Berdasarkan Parameter
17
aureus dan
Reaksinya sebagai Penghambat Pertumbuhan Bakteri Staphllococctts
(il'lasruri,
Srihardl'astuti)
A.
Escherichia coli
frrgg"f Kalsium Tartrat Tetrahidrat sebagai Bahan Dasar Alat Optik
filutrofin, Darjito, M lv{ Khuw)
A.
(S'
Susilo, \fi. Djamil)
5.
(lstiroyah)
Studi Sifat Listrik dan Sifat Optik Film Tipis GaN (Galium Nitrida)
23
6.
pengendalian Pemakaian Daya Pancar pada Sistem Komunikasi Bergerak dengan
Implementasi Jaringan Syaraf Tiruan (.1. l{ustofa)
26
7.
pada
Kekuatan Uji dari Statistik Uji Goldfeld & Quandt dan Korelasi Spearman
(A'B'
Astuti)
Pengujian Kehomogenan Ragam Galat untuk l!{odel Regresi
JJ
8.
di
Pengaruh Gangguan Pengukuran pada Estimasi Gelombang Pantul
(1.
Darti,
Pengukuran
'4'
Titik
Dua
Hiirodinamiki Menggunakan
39
Laboratorium
Suryanto)
9.
10.
Estimasi Bangkitan Perialanan oleh Keluarsa-Keluarga di Kawasan Pemukiman:
Studi Kasus Ka$asan Perumahan Sarvojajar N',lalang (1.\' Purwanlo, s. ,lbnsinL
K. .4ndnsaningnus\
46
Aplikasi Basis Grobner pada \{ekanisme Reaksi Kimia (Trisilotvctti, ,4. .'lndari\
54
Alamat Redaksi
:
FMIPA Unibraw Jl. Mayjen Haryono 169 Malang 65145
Telp. (0341) ss l6l I s/d 551615 Pes. 217 dan (0341) 554403 Fax. (0341) 554403
E-mail : natural@brawij
aYa. ac.
id
REAKSI ASILOKSILASI-HIDROKSILASI TERI{ADAP ALFA-PINENA :
PEMANFAATAI\ PRODTIK REAKSINYA SEBAGAI PENGHAMBAT
PERTUMBUHAN BAIffERI ^Slaphylococcus aarezs DAN Escherichia coli
Masruri dan A. Srihardyastuti
Kimia, FMIPA, Universitas Brawijaya, Malang 65145
Masuk 3 Nopember 2004; diterima untuk diterbitkan l9 Januari 2005
Abstrak
Ketersediaan bahan alam organik golongan monoterpena alfa-pinena di Indonesia sangat melimpah. Salah
satunya dari tanaman pinus, namun masih sangat sedikit tingkat pemanfaatannya. Modifikasi struktur molekul yang
diarahkan pada pemanfaatan sebagai batran dasar antibakteri dimungkinkan dari stnrktur alfa-pinena ini, salah
satunya aAUan bintgk ester dan hidroksilnya. Penelitian ini bertujuan melakukan modifikasi struktur alfa-pinena
meniaAi bentuk ester dan hidroksilny4 serta melakukan uji terhadap kemampuannya dalam menghambat
pertumbuhan terhadap bakteri Staphylococcus aureus dan Escherichia coli sebagai bakteri uji. Metode yang
digunakan dalam modifikasi struktur membentuk produk ester adalah reaksi asiloksilasi menggunakan asam asetat
glasial dengan katalis asam sulfat pekat. Sedangkan metode untu! mendapatkan produk hidroksilnya dengan cara
ieaksi hidroksilasi atau hidrolisis terhadap produk ester asetat yang diperoleh menggunakan larutan potasium
hidroksida dalam pelanrt etanol-air. Metode ide,lrtifikasi terhadap produk yang diperoleh dilakukan dengan cara
kromatografi gas, spektroskopi massa dan spektroskopi ultraviolet-visible. Hasil penelitian menunjukkan bahwa
produk reaLti-asitoksilasi aaitatr senyawa ester 2-(1,7,7-trimetil bisiklo l2.2.ll) heptil asetat dengan kemurnian
iO,ZgN. Sedangkan produk hidroksilnya adalatr senyawa alkohol 1,7,7-trimetil bisiklo l2.2.ll-2-heptanol dengan
kemurnian sebesar 89,57o/o. Kemampuan menghambat pertumbuhan bakteri S. aureus untuk produk ester rata-rata
dibanding batran dasar alfa-pinena meningkat 9 kali dan meningkat 6 kali untuk bakteri E. colli. Sedangkan untuk
produk alkohotnya meningkatkan rata-rata penghambatan pertumbuhan 3 kali lebih terhadap kedua bakteri uji.
Kata kunci: Alfa-pinena; Esteri/ilcasi; Hidrolisis; Anti bakteri
Abstract
The source of organic monoterpene alpha-pinene natural products in Indonesia is abundan! especially found in
pine. However, it is not well utilised. Structural modification of alpha-pinene becomes ester and its hydroxilated
structures are promising due to their functions as antibacterial substances. The research was aimed to modiff alphapinene
to produce ester and its hydroxilated structures, as well as to study their capabilities on inhibiting
'staphylocoitut
orreut and Escherichia coli growths. The method used in the alpha-pinene structural modification
to yieta ester was acyloxylation reaction using glacial acetic acid with saturated sulphuric acid as the catalyst.
Meanwhile, the hydroxilated stmcture of alpha-pinene was carried out by means of hydrolysis toward the ester
product in previous step using potassium hydroxide solution in ethanoVwater. Product identifications were carried
but using fas chromatography, mass and ultraviolet-visible spectoscopies. The results showed that 70.29o/o of 2'
(1,7,7-trimithyl bicyclo l2.2.lD heptyl acetic was formed at acyloxylation reaction step. The hydroxylated 1,7,7'
trimethyl bicyclo l2.2.ll hept-2-ol was produced with 89.57% degree of purities. The bacterial growth inhibition
capability increased more 9 folds for the ester product toward S. aureus and 6 folds towad E. colli than alphapinene, iespectively. Meanwhile, the hydroxylated products were increased 3 times in both S. aureus and E colli
than alpha-pinene.
Keywords : Atpha-pinene; Esterilication (acybrylation); Hydrolysis (hydroxylation); Antibacterial
Masntri dan A. Srihardyastuti I
l.
amatm
banyak dikAemukan pada
tenrrrr4 Indmie Eruha dei tanarnan pinus
dcngp k dr So{/trya Satroamidjojo [], Masruri
dr Rtua e- [3] rneagidcntifikasi s€nyawa
ii &h du dm hmgu Elaman Cosmos caudatus,
ew*
fu Pokia speciosa dengan
e**
&
Sc0mgkm Vudar-Unlu l4I
'l0}L scn)xawa ini dari teneman Tlrytrts
t Ldi-fnrlei
Fbch d€ngm kadr seldtar 37o. Senyawa
W
t tcrdft nm-polar (hidrofobik) dan secara umum
EEn &s atom hidrogen dan karbon dengan
irhh ffi karbon l0 buah [5].
Ihi hasil uji pendahuluan diketatrui bahwa
slD*a alfa-pinena ini ternyata aktif menghambat
t2L
pcrm+unan bakteri uji Staphylococcus aureu f6l.
IIn1a saja tingkat penghambatannya relatif rendatr.
ffrcmtrut Sikkema dkk. Ul golongan senyawa
hkhokarbon yang hidrofobik mekanisme anti-
l*
baltcrinya terpusat pada akumulasi senyawa pada
mernbran sel yang tersusun atas lipida bilayer,
sehingga menghalangi mekanisme transportasi ion
dari luar dan dalam sel, dan juga
menurunkan
kesatuan struktur membran. Sehingga mekanisme
transport sel kacau dan membran sel akan rusak.
Sedangkan menurut Ultee dkk. [8] adanya gugus
kaya elektron seperti ester ataupuri hidroksil pada
senyawa hidrokarbon siklik, bisiklik' analog dengan
fenol ataupun ester fenol meningkatkan aktivitas anti-
bakterialnya. Mekanisme aksinya
adalatr
mendestabili-sasi membran sitoplasma dan sebagai
proton exchang-er, sehingga menurunkan secara
bergradien pH membran sitoplasma dan akibatnya
gaya gerak proton melemah. Dengan merujuk metode
Sikkema-Ultee
Asiloksilasi-Hidrolsilasi
,l
Pendehuluu
Scnyara
Reaksi
t7-81 dimungkinkan
untuk
meningkatkan aktivitas anti bakterial dari senyawa
alfa-pinena dengan mengubah strukturnya menjadi
senyawa hidroksi dan ester bisiklik.
Reaksi organik yang mentransformasi gugus fungsi
hidrokarbon takjenuh, terutama struktur seperti alfapinena menjadi struktur ester, dapat dilakukan
dengan reaksi asiloksilasi menggunakan asam asetat,
sedang-kan untuk mendapatkan struktur alfa-pinena
hidroksil melalui hidrolisis terhadap ester hasil reaksi
asiloksilasi t9]. Para peneliti melakukan reaksi ini
aa
Metode Penelitian
2.1
Pros
edur Reaksi
...
As ilol<silas i
20 ml (0,1I mol; 14,58 g) alfa-pinena dimasukkan
ke dalam labu leher tiga yang telatr dilengkapi dengan
kondensor bola, pengaduk magnet dan corong
penetes yang telah diisi 16,39 ml (25,73 g; 0,44 mol)
asam asetat glasial. Pengaduk magnet dihidupkan dan
'asam asetat diteteskan dari corong penetes dengan
kecepatan 6 tetes per menit. Setelatr semua Ersam
asetat dihmbattkan, dilakukan refluks selama 6 jam
di atas penangas minyak. Selanjutnya setelatr 6 jam
produk dicuci dengan larutan NaHCO3 jenuh sampai
pH netral, kemudian dieksfaksi dengan 30 ml dietil
eter sebanyak 3 kali. Lapisan dietil eter dikumpulkan
dan dikeringkan dengan NazSOl anhidrat. Larutan
dietil eter dipisatrkan dengan penyaringan
dan
selanjutnya dipekatkan dengan evaporator Buchii.
Ekstak pekat didistitasi fraksionasi dan distilat
sebagai ester dari alfa-pinena. Selanjutrya dianalisis
dengan metode kromatografi gas-spekfios-kopi massa
(GC-MS merk Shimadzu QP-5000, kolom CBP-5
fussed silica, panjang 50m, electrone inpact EI 70
eV) dan spektroskopi ultraviolet-visible (UV-Vis).
2.2
Prosedur Reaksi Hidroluilasi
Larutan KOH dibuat dengan melarutkan
l0
g
potasium hidroksida ke dalam t0 ml aquades dan l0
ml etanol dan dimasukkan dalam labu reaksi yang
dileng-kapi pengaduk magnet dan kondensor bola
I U. Pengaduk magnet dihidupkan, ester produk
reaksi asi-loksilasi sebanyak l7 g (0,09 mol)
diambahkan pada lanrtan KOH. Reaksi dilakukan
pada suhu kamar selarna 2 jam. Selanjutnya
ditambahkan larutan HzSOI ke dalam labu sampai
terbentuk dua lapisan sempurna dan dilakukan
ekstraksi 3 kali dengan 30 ml dietil eter. Lapisan
dietil eter dikumpulkan dan dikeringkan dengan
NazSOr anhidrat. Lanrtan dietil eter dipisahkan
dengan penyaringan kemudian dipekatkan dengan
eva-porator Buchii. Residu dianalisis dengan GC-MS
dan spektrometer UV-Vis.
terhadap norbor-nena dengan asam karboksilat
diperoleh produk ester norbornil karboksilat dengan
hasil 98%, serta hidrolisis dari produk ini dengan
snsana basa dihasilkan produk alkohol atau hidroksil
norbornena
[0].
2.3
Prosedur Uji Anti Bakteri
Bakteri yang digunakan untuk uji adalah
^S.
qureus dan E coli. Medium lempeng dari nutrient
agar diolesi biakan murni bakteri dengan cotton bud
secara merata. Paper drhlr (diameter 6mm) yang telatr
direndam dalam senyawa produk reaksi asiloksilasi
dan hidroksilasi, serta alfa-pinena diletakkan pada
media biakan bakteri dan diinkubasi pada
30oC
24 jam. Setelatr itu diukur diameter
zona
selama
Naural
( 1),
9
Februari 2005
hambatan yang terbentuk. Dia-meter hambatan ini
merupakan daerah yang tidak ditumbuhi bakteri
disekitar paper dlslc. Besarnya zona penghambatan
produk ieaksi asilosilasi dan hidroksilasi ini
Produk ester
aiUandingtan dengan alfa-pinena sebagai batran dasar
u2-131.
3.
cG
c
o
Hasil dan Pembahasan
CL
.E
o,
Y
persentase beberapa produk reaksi
asiloksilasi alfa-pinena dengan asam asetat hasil
Data
20
analisis dengan GCA'IS, yaitu senyawa dengan waktu
retensi 19,225 menit (18,337o), waktu retensi 19,758
menit (11,38%), serta pada waktu retensi 20,408
menit (70,29%) (Tabel
22
(Menit)
l).
Gambar
1
Kromatogram GCA{S Produk
reaksi asiloksilasi.
Tabel
I Tabulasi
persentase
produk
reaksi
Pencacahan spekra massa (scanning of mass
spectra) dari senyawa pada waktu retensi 20,408
asiloksilasi hasil analisis GC/MS.
tx
Produk
(menit)
19,225
19,758
20,408
Persentase
Luas area
menit (kadar 70,29%) dihasilkan data spektra massa
(Gambar 2). Pola kesamaan spektra massa dari
senyawa ini dengan spektra massa library standart
il/,Sf (National Indq of Standard and Technologt)
(satu
s0970890
18,33
195439898
70,29
31636508
11,38
mempunyai indeks kerniripan (similarity indu)
sebeJar 96Vo dengan senyaw a
2'(1,7,7-trimetil bisiklo
t2.2.lD heptil asetat dengan berat molekul
Dari kromatogram (Gambar l) dapat dikatakan
bahwa minimal ada} produk samping selain produk
(Gambar 3).
utama ester (ditunjukkan dengan jumlah puncak
kroma-togram).
tFcttrr
'&*rwr
o.t t i^8ilIl .Dol
trt. Tln s 20.{0C
IretP.rtlt6
I l6t0 !.o.tcmlttl'U
tcn,
ln2m)
i
c
6
.C
I
t?l
b:tt
rio
.E
a
Y
rle
(mlzl
Gambar 2 Spekfia
massa produk ester alfa-pinena
rO
t5o
196
Masruri dan A. Srihardyastuti I Real<si Asiloluilasi-Hidroksilasi ...
9
Tabel2 Tabulasi luas srea dan persentase dari
puncak-puncak kromatogram senyawa
hasil
hidrolisis.
rr Produk
(menit)
16,952
18,542
G* 3 ffir molekul ester 2-(1,7,7ffibitro t22.lD heptil asetat.
hI aalisis spekbometri UV-Vis (spekrum
Fdr Gmbil 4) juga mendukung kebera-daan
ryrya
cstcr ini. Hal ini ditunjukkan adanya serapan
pda pmjang
gelombang 195,5 nm karena adanya
&ri el&on ikatan n+n* pada gugus karbonil
dm scrapan pada panjang gelombang}4l,S nm untuk
cksitasi
n+r*
dari non-bonding electrone
atom
olsigco ke orbital anti-ikatan n.
Luas area
(satuan
luas)
44972234
386158753
Persentase
(%)
10,43
89.57
Proses reaksi hidroksilasi dilakukan dengan cara
melakukan reaksi hidrolisis terhadap produk ester 2(1,7,7-trimetil bisiklo l2.2.lD heptil asetat dengan
larutan potasium hidroksida dalam pelarut campuran
etanol-air. Hasil analisis produk hidrolisis dengan
GC/MS diperoleh data berupa kromatogram (Gambar
5) dan spekta massa. Senyawa produk reaksi
hidrolisis, yaitu senyawa dengan waktu retensi
16,952 menit (10A3%) dan senyawa pada waktu
retensi 18,542 menit (89,57o/o) (Tabel2).
Pencacahan spektra massa diperoleh bahwa
senyawa dengan waktu retensi 18,542 menit
(89,57%) adalah bentuk hidroksi dari alfa-pinena
(Gambar 6). Analisis pola kesamaan spektra senyawa
pada waktu retcnsi 18,542 menit dengan spektra
senyawa standart dari llbrary stqndart NIST
mempunyai nilai indeks kemiripan (similarity index)
sebesar
97% dengan senyawa
1,7,7-trimetil
bisiklo[2.2.1J 2-heptanol dengan berat molekul 154
(Gambar 7).
Spektra serapan UV-Vis (Gambar 8) juga menegaskan keberadaan jenis eksitasi untuk struktur
[r,0ill.
molekul
Gambar
4
Spektrum
UV produk ester
Pinena
alfa-
ini.
Adanya serapan pada
panjang
gelombang 195,5 nm yang dihasilkan karena ada
serapan energi untuk eksitasi elektron dari n+o*
(non-bonding electrone ke orbital anti-ikatan o).
Uji kemampuan menghambat pertum-buhan
bakteri S. aureus dan E colli dart produk reaksi
esterifikasi (1,7,7-rimetil bisiklo[2.2. l] heptil asetat)
dengan kemurnian 70,29oh serta produk reaksi
hidroksi lasi ( 1,7, 7-timeti I bisiklo 12.2. t1:2-yreptanol)
dengan ke-murnian 89,57o/o (Tabel 3). Uji juga
c
Eo
o
o
dilaktrkan terhadap sampel alfa-pinena sebagai batran
dasar dengan kemur-nian di atas 99%.
Modifikasi stuktur alfa-pinena menjadi struktur
E
o
Y
ester asetat meningkatkan kemampuan penghambatan
pertumbuhan terhadap bakteri S. aureus sekitar 9 kali
dengan rata-rata kemampuan penghambatan sebesar
9,93 mm.
(menit)
Gambar
5
Kromatogram
Uji
hasil
analisis
dengan GCA,IS produk reaksi hidrosilasi.
pada bakteri
E
colli produk
ester asetat
meningkatkan penghambatan pertumbuhan sekitar 6
kali, dengan tingkat penghambatan rata-rata sebesar
11,03 mm. Pada produk alkohol meningkatkan
kemampuan penghambatan pertumbuhan 3 kali, baik
terhadap bakteri S. aureus maupun E. colli dengan
tingkat penghambatan rata-rata sebesar 3,10 dan 3,45
mm (Tabel 3).
l0
Natural
t{*rlr
9
( I ),
Febntari
200 5
lpactn
Drtr r ttiltta.00l
mn.tl!fl
t t. Iln r tt,l{l
tcr!,
: ll(6 !.0.3crr1r tlll
tx. Prri r 9.10
Gambar 6 Spekha massa produk hidroksil alfa-pinena.
0, [04
{
0.
100
/div)
Gambar 7 Struktur molekul borneol
atau 1,7,7-trimetil bisiklo 12.2.11-2-
I}.00A
I
heptanol.
Gambar
8
Spektrum UV produk hidroksilasi
alfa-pinena
Tabol3 Tabutasi data kernampuan penghambatan pertumbuhan bakteri uji oleh produk reaksi dan bahan
dasar serta pembanding.
Diameter hambatan pertumbuhen (mm)
Sampel
uji
Alfa-pinara
Produk ester
Produk hidroksil
E colli
S. arteus
I,l0 I,l0 l,l0 9,80 10,5 10,5 g,g0
3,10 3,20 3,20 2,gO
l,l0
2,20 2,00
g,g3
I1,4 I1,4
3,90 3,90
3,10
1,00
2,40
1,90
10,4
10,9
I 1,03
2,90
3,10
3,45
,,ffi
ri
Masruri dan A. srihardyastuti / Realcsi Asilol<silasi-Hidroluilasi ...
4. Kerimprlu
t3l
Dengan mcn{u& terhadap data serta pembahasan
basil pcaclitim di aas dapat disimpulkan batrwa
eoLqi esiloL:ihsi tcrhadap alfa-pinena dengan asam
ssctr tertalbis oleh asam sulfat dapat dihasilkan 2(1,7,7-uimil bisiklo [2.2.1])-heptil asetat dengan
kcrnrnizr 70)9/o, sedangkan reaksi hidroksilasi
dFrotdr produk 1,7,7-trimetil bisiklo ll.2.ll-Zhpool dengan tingkat kemurnian 89,57yo. Hasil uji
E h.d+ kernampuan menghambat pertumbuhan
b&cri S. anreus dan E colli menunjukkan bahwa
poerk ester dan hidroksilasi mempunyai
dibanding dengan alfa-pinena sebagai bahan
dasamya. Produk ester meningkatkan kemam-puan
penghunbatan pertumbuhan 9 kali terhadap bakteri
^S.
aureus dan 6 kali terhadap bakteri E. colli,sedangkan
produk hidroksilasi meningkatkan kemam-puan
menghambat pertumbuhan terhadap kedua bakteri
naik sekitar 3 kalinya.
M.F. Rahman, Z.P. Gama, dan E.D. Iftitah,
(2003), Pemanfuatan Senyawo Volatil Hasil
Isolasi dari Tumbuhan Gulma Sebagai
Pengendali Hama Tanaman Budidaya Secara
Hayati, Laporan LitMud, Fakultas MIPA,
Universitas Brawij aya, Malang.
t4I
G. Vardar-Unlu, F. Candan, A. Sokmen, D.
Dafera, M. Polissiou dan M. Sokmen, (2003),
Journal of Agriculture and Food Cheruistry Sl:
tsl
S.H. Pine, J.B. Hendriekson, D.J. Cram, dan
G.S. Hammond, (1980), Kimia Organik,Jilid 2,
63.
Terjemah: Roehyati dan Sasanti, Penerbit ITB,
Bandung.
kcmampuan penghambatan pertumbuhan lebih besar
jilo
1l
t6l
N. Luluk dan
Masruri, (2003), Uji Akti/itas
Antib akteri S enyaw a alfa- P inena ( 1, 7, 7 +rimet
bisiklo
il
[3.1.1]-2-heptena
terhadap
Staphylococcus aureus, Laporan Penelitian
Laboratorium Kimia Organik., Universitas
Brawijaya.
UI
J. Sikkema, J.A. de Bont dan B.
Poolman,
(1995), Miuobiologlt Review 59: I9.
Ucapan Terima Kasih
Terimakasih banyak atas fasilitasi pendanaan
penelitian
t8I
A.
teI
(1992), Microbiololog 68: 1 56 1 .
T.W.G. Solomons, (1986), Fundamental
Organic Chemistry.
ini
kepada P3M FMIPA dari dana
DPP/SPP Universitas Brawijaya, serta Laboratorium
Kimia Organik dan Biokimia Jurusan Kimia yang
untuk proses sintesis dan
uji antibakteri. Tak
juga terimakasih kepada Laboratorium
Organik Universitas Gadjah Mada dalam analisis
2d edition,
Chapman
of
&
Hall Ltd., New York.
tl0I D.C. Kleinfelter, dan R.S. Paulvon,
(1973),
Organic Syntesis: Collective Volume 5, John
lupa
Kimia
Ultee, M.H.J. Bennik dan R. Moezelaar,
ll
ll
Wiley & Sons Inc., New York.
M.F. Rahman, (2001), Sintesis 1,3-Dimetil-6,7-
Dimetolrsi-1,2,3-Tetrahidroisoquinolina dari
kromatografi gas dan spektra massa (GC/I,IS).
Metileugenol melalui Reaksi
Ritter,
Siklodehidrasi dan Reduksi, Thesis 52, Jurusan
Kimia Universitas Gadjatr Mada, yogyakarta.
Daftar Pustaka
u2l
tll H.
Van den Berghe dan Vlientick, (1991),
t l3l
Screening Methods for Antimicrobial and
Antiviral Agents from higher plants, In
Sastrohamidjojo, (1981), A Study of
Indonesian Essential O/s, Disertasi, Jurusan
t?l
Kimia, Universitas Gadjah Mada, yogyakarta.
Masruli, (2001), A Study Reaction alfa-pinene
and Aquaregia, Thesis 52, Jurusan Kimia"
Universitas Gadjah Mada, yogyakarta.
Bailey dan Scot! (1974), Diagnostic Microbiologt, The C.V, Mosby Co., London, UK.
Methods in Plant Biochemistry,yol.6., Assay
for Bioactivity, Academic press, London,
United Kingdom.