Prosiding KIMIA FMIPA - ITS - Digilib ITS

Prosiding Skripsi Semester Genap 2008 / 2 0 09
SK - 34
HIDROLISIS SUKROSA DENGAN ENZIM INVERTASE UNTUK PRODUKSI ETANOL
MENGGUNAKAN Zymo m o n a s mobilis
Nuzula Awwalurrizki*, Surya Rosa Putra 1
Jurusan Kimia
Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahua n Alam
Institut Teknologi Sepuluh Nopember
ABSTRAK
Produksi etanol langsung dari substrat sukrosa oleh bakteri Zymo mo nas mobilis , menunjukkan
konversi etanol yang lebih rendah daripada menggunakan campuran glukosa dan fruktosa.
Pembent uka n hasil samping (sorbitol dan levan) dapat turun secara signifikan ketika
menggunaka n sumber karbon campura n antara glukosa dan fruktosa. Untuk itu perlu
dilakukan hidrolisa terhada p substrat sukrosa menggunakan enzim invertase sebelum
fermenta si. Enzim invertase didapatka n dari ekstrak kasar ragi roti (Saccharom ycer cerevisiae )
yang di inkubasi selama 24 jam pada suhu 40 o C. Proses hidrolisis dengan enzim invertase
dilakukan pada keadaan dimana aktivitas enzim mencapai maksimu m, yaitu pada pH 4,5
dengan inkubasi pada suhu 30 o C dan waktu inkubasi selama 5 jam. Besarnya gula reduksi hasil
hidrolisis sebanyak 10,22 gram. Sumber karbon hasil hidrolisis inilah yang akan digunakan
dalam ferment asi etanol pada pH 5,5. Fermentasi berjalan efektif selama 120 jam dengan
jumlah sel bakteri awal sebanyak 2,6 x 10 10. . Pada kondisi tersebut, kadar etanol maksimu m
yang dihasilkan adalah sebanyak 4,87 gram / 1 0 0 mL dengan yield etanol sebesar 92,89% jika
dibandingkan dengan hasil teoritis.
Kata kunci : Zymo mo n as mobilis , enzim invertase , yield etanol, ferment a si etanol
ABSTRACT
Ethanol production from sucrose by Zymomonas mobilis shows lower conversion into ethanol
than from glucose and fructose. By- product formation (sorbitol and levan) was greatly reduced
when an equimolar mixture of glucose and fructose was used as carbon source in culture.
Cause of that sucrose needs to be hydrolized using invertase before ferment ation. Invertase
enzymes obtained from yeast (Saccarom yces cerevisiae ) with incubation at temperat ure 30 o C
for about 24 hours. Hydrolysis process using invertase were be done when the enzyme activity
reached maximum at pH 4,5 with temperatur e incubation at 30 o C and incubation time for 5
hours. The amount of reduction sugar fron hydrolysis is 10,22 grams. This fraction will be
used as carbon source in ethanol ferment ation at pH 5,5. Fermentation runs effefctively for
120 hours with initial bacterial cell as 2,6 x 10 10 (cell / mL). In this case, highest value of ethanol
is 4,87 g/ 100 mL with 92,89% ethanol yield when compared in theoretical.
Keywords : Zymo mo n as mobilis , invertase , ethanol yield, etanol ferment ation.
PENDAHULUAN
Akses
masyarakat
Indonesia
terhada p energi masih terbatas. Meskipun
variasi sumberdaya energi dalam negeri
beraga m
dan
cadangan
minyak
diperkirakan hanya mamp u mensu plai 18
tahun lagi, namun kenyataan nya, pangsa
konsum si bahan bakar minyak mencapai
proporsi tertinggi sekitar 63%. Tingkat
konsum si yang tidak sebanding dengan
tingkat
pembent uka n
menyebabka n
kelangkaan terhada p bahan bakar tersebut.
Prosiding KIMIA FMIPA - ITS
Sumber bahan bakar merupaka n produk
yang renewable sehingga tingkat recovery
nya membut uh ka n waktu yang sangat lama
(Mukhtasor, 2009).
Selain itu pembakaran bahan bakar
fosil telah memberikan dam pak negatif
terhada p lingkungan. Kualitas udara yang
semakin menur un ditambah adanya efek
gas rumah kaca, indikasi ini sebagai
penyebab peruba ha n iklim di muka bumi
(Sri Utami, 2007). Sumber energi terbar uka n
yang berpotensi besar untuk dikemba ngka n
adalah sumber daya hayati atau biofuel .
Salah satu teknologi yang dilakukan untuk
menduku ng pengadaan energi ini yaitu
produksi bietanol .
Bakteri Zymo mo n as mobilis diyakini
sebagai
mikroorganis m e
paling
ideal
penghasil etanol karena mem pro d u ksi
etanol terbanyak, toleran terhada p etanol
konsent ra si
tinggi
dan
pH
rendah.
Zymo mo nas mobilis merupaka n bakteri
anaerob fakultatif yang memanfaatkan
glukosa, sukrosa dan fruktosa untuk
menghasilkan
etanol
dengan
jalur
metabolisme
Enter - deudor off
Pathway
(Tano dan Bozato, 2003).
Selama ini, penggunaa n substrat
gula
yang
sering
digunakan
untuk
fermenta si yaitu glukosa atau sukrosa.
Sukrosa lebih mudah didapatkan daripada
glukosa karena sukrosa merupakan gula
meja
yang
dikonsu m si
sehari - hari.
Berdasarkan penelitian yang dilakukan oleh
Hani, 2009, produksi
etanol
dengan
substrat sukrosa menghasilkan produk
etanol sebanyak 61,18%. Rendahnya nilai ini
disebabkan akibat adanya produk samping
yang
ikut
dihasilkan
selama
proses
fermenta si, contohnya levan dan sorbitol
(Swing and Deley, 1977). Pembent uka n
levan dan sorbitol, dapat menurunk a n
ethanol yield sampai 80% dari teoritisnya
(E. Favela, 1987). Berangkat dari masalah
ini, sukrosa perlu dipecah terlebih dahulu
menjadi
gula
sederhan a
sebelum
difermenta sikan.
Enzim invertase merupaka n enzim
yang memiliki efisiensi tinggi yang spesifik
dalam menguba h sukrosa menjadi glukosa
dan fruktosa (dikenal dengan gula invert).
Enzim invertase dapat diambil dari ekstrak
kasar ragi roti (Saccharo m yces cerevisiae ).
Khamir ini memiliki aktivitas invertase yang
tinggi sehingga sukrosa dengan cepat
diubah menjadi glukosa dan fruktosa untuk
keperluan metabolisme nya. Dengan adanya
enzim invertase, penggunaa n sukrosa akan
lebih efektif dan diharapka n
mam pu
menur unka n
produk
samping
yang
terbent uk sehingga dapat meningkatkan
kadar etanolnya.
METODOLOGI PENELITIAN
Alat dan Bahan
Prosiding KIMIA FMIPA - ITS
Alat
Peralatan yang digunakan dalam
penelitian ini adalah fermentor sistem
batch
yaitu
menggunaka n
erlenmeyer
untuk fermenta si, ultrasonikator, cawan
petri, tabung reaksi, laminar y air flow ,
autoclave ,
inkubat or,
rotary
shaker ,
centrifuge Thermo IEC CL40R, kromat ografi
gas Shimadzu GC- 14B, spektronik Genesys
20, termom e ter, neraca analitik mettler AE
200, pH meter 510, homogenizer, penangas
serta peralatan gelas lain.
Bahan
Mikroorganism e
yang digunakan
dalam
penelitian
ini
adalah
biakan
Zymo mo n as mobilis dari Jepang.
Media Zymo mo nas mobilis yang
digunakan
untuk
regenerasi
dan
penum b u h a n (agar miring) adalah Nutrient
Agar (NA) 5%. Media untuk starter terdiri
atas KH2 PO 4 1,0 g/L, (NH 4 )2 SO4 1,0 g/L,
MgSO 4 .7H 2 O 0,5 g/L, yeast extract 5g/L, dan
glukosa 100g /L.
Media untuk fermentasi terdiri atas
sukrosa 100g /L, yeast extract 5g/L, KH2 PO 4
1,0g /L, (NH 4 )2 SO4 1,0g /L, MgSO 4 .7H 2 O 0,5
g/L.
Crude invertase dibuat dari ragi roti
(Saccharo m yces cereviciae ). Reagen lain
yang dibutuhka n diantaranya ; NaHCO 3 ,
asam sitrat dan na- sitrat untuk buffer
sitrat,
reagen
bradfod,
BSA, reagen
Somogy - nelson A dan B, reagen arseno molybdad.
PROSEDUR KERJA
Isolasi Ekstrak Kasar Invertase dari Ragi
Roti (Saccharo m y c es cerevisiae)
Ragi
roti
sebanyak
55
gram
ditimbang, dimas ukkan kedalam beaker
gelas kemudian ditambahkan 150 ml
NaHCO 3 dan diaduk sampai menjadi bubur.
Bubur ragi yang didapat dimas ukkan ke
dalam homogenizer dan diputar pada 7500
rms selama 5 menit. Bubur yang telah di
homogenizer dituang ke dalam erlenmeyer.
Mulut erlenmeyer ditutup dengan kapas
yang sudah dibalut kasa - aluminium foil.
Selanjut nya diinkubasi pada suhu 40 o C
selama 24 jam. Hasil inkubasi diautolisis
dengan menggunaka n ultrasonifikator pada
16 rms selama 20 menit. Setelah proses
autolisa ini, campura n disentrifuge selama
15 menit pada suhu 10 o C dengan kecepatan
3500 rms. Proses ini terbent uk filtrate dan
residu, filtrat yang terbent uk didekanta si
dan diperoleh super nata n nya. Supernat a n
yang diperoleh merupakan preparat enzim
invertase.
Penentuan Kurva Standar Gula Invert
secara Spektrofotom etri
Penentua n
gula
invert
secara
spektrofoto m e t ri
dilakukan
dengan
pembuat a n kurva standart gula invert yang
menghub u ngka n antara konsentra si dengan
absorbansi. Standart gula invert dibuat
dengan cara: Larutan gula invert 0,0025M
dibuat variasi konsentr asi yaitu 1; 1,25; 1,5;
1,75; 2; 2,25 dan 2,5 (x10 - 3 M) dengan
pelarut
aquades.
Selanjutnya
masing masing dimas ukkan dalam tabung reaksi
sebanyak 0,5 ml. Kadar gula reduksinya
ditentuka n dengan menggunakan metode
Somogy - Nelson.
Pengukura n
secara
spektrofoto m e t ri dilakukan pada panjang
gelomba ng 540 nm.
Penentuan Kandungan Protein Invertase
Penentuan
Panjang
Gelombang
Maksimum Bradford
Panjang
gelombang
maksimu m
(λ maks) ditentuka n dengan menggunaka n
larutan standart Bovine Serum Albumine
(BSA) yang ditambah
dengan
reagen
Bradford kemudian ditentuka n serapannya
menggunaka n spektrofoto me t er. Larutan
Bradfod dibuat dengan cara: 25 mg coomise
brilliant blue G- 250 dilarutkan dalam 12,5
ml etanol 95% (v/v dan ditambahka n
dengan 25 ml asam fosfat 85%(w/v).
Larutan yang di dapat diencerkan dengan
aquadest sampai 250 ml. Larutan stok BSA
2000 ppm (dibuat dari 100 mg BSA dalam
25 ml aquades,
diaduk perlahan - lahan,
setelah itu diencerkan sam pai 50 ml).
Selanjutnya diambil sebanyak 5 ml dan
ditambahka n 3 ml reagen Bradford dan
diencerkan sampai 10 ml. Larutan ini
diaduk dan diinkubasi selama 5 menit pada
temperat ur 37 0 C. Larutan standart BSA
diukur
absorbansinya
menggunakan
spektrofoto m e t er pada panjang gelombang
560 - 620 nm dengan
interval 5 nm
sebanyak tiga kali untuk masing - masing
panjang gelombang, kurva dibuat antara
panjang gelomb ang (λ) terhada p absorba nsi
(A) sehingga diperoleh λ maks .
Pembuatan Kurva Standar BSA
Kurva standart BSA dibuat dengan
membua t beberapa konsentr asi yaitu: 100
ppm, 200 ppm, 300 ppm, 400 ppm, 500
ppm,
600
ppm,
700
ppm.
Variasi
konsent ra si larutan tersebut dibuat dengan
menggunaka n larutan standart BSA 2000
Prosiding KIMIA FMIPA - ITS
ppm dengan cara diambil sebanyak 0,5; 1;
1,5; 2; 2,5; 3; 3,5 ml lalu diencerkan dengan
aquades t
sampai
10 ml. Selanjutnya
diambil 7 ml dan ditambahka n 3 ml reagen
bradfod. Larutan diaduk dan diinkubasi
selama
5
menit
pada
suhu
37 0 C.
Pengukura n absorba nsi dilakukan dengan
menggunaka n
spektrofot o m e ter
pada
panjang gelombang maksimu m yang telah
didapatkan pada prosed ur sebelum nya.
Blanko dibuat dengan 7 ml aquades yang
ditam ba h 3 ml reagen Bradford.
Penentuan Kandungan Protein Invertase
Penent ua n kandunga n protein pada
crude
invertase
dilakukan
dengan
mengencerkan
1 ml enzim
invertase
dengan aquadet sam pai 10 ml. Hasil
pengenceran
diambil
7
ml
dan
ditam ba hka n 3 ml reagen Bradfod, lalu
diinkubasi selama 5 menit. Setelah waktu
inkubasi,
adsorba nsi
larutan
enzim
invertase
ditentukan
pada
panjang
gelombeng maksim um dan diukur secara
duplo. Hasil adsorbansi yang diperoleh
dikonversikan pada persam aa n garis dari
kurva standar t BSA yang telah dibuat
sehingga didapatka n konsentra si enzim
invertase.
Penentuan Kondisi Optimum Invertase
Kondisi optimu m
reaksi enzim
meliputi suhu, pH dan lama inkubasi.
Kondisi ini di tentuka n melalui serangkaian
percobaan yang kondisinya divariasikan.
Penent ua n suhu optimu m dilakukan
dengan cara sebagai berikut : Larutan
sukrosa 0,25 M sebanyak 2 mL dengan pH
4,5 dimas ukkan kedalam 6 tabung reaksi.
Masing- masing tabung diatur suhunya
(20 o C, 25 o C, 37 o C, 60 o C, 80 o C, 100 o C).
Selanjutnya ditamba hka n 1 mL enzim
invertase pada tiap tabung dan diinkubasi
selama 20 menit (selama inkubasi suhu
tetap dalam keadaan terjaga). Tabung tabung tersebut dipanaskan dalam air
mendidih selama 10 menit. Setelah dingin,
gula
reduksi
yang
terbent uk
diukur
menggunaka n
metode
Somogy- Nelson.
Sebelum
diukur
perlu
dilakukan
pengenceran
agar
serapannya
dapat
terbaca.
Penent ua n pH optim um dilakukan
dengan cara sebagai berikut : larutan
sukrosa 0,25 M sebanyak 2 mL dalam
tabung reaksi dibuat dengan variasi pH (3;
4; 4,5; 5; 5,5; 6 dan 7). Masing- masing
fraksi ditambahkan 1 mL enzim invertase
dan diinkubasi selama 20 menit pada suhu
ruang. Kemudian dipanaskan dalam air
mendidih selama 10 menit.
Selanjut nya
didinginkan. Gula reduksi yang terbent uk
diukur menggunakan metode Somogy Nelson. Sebelum diukur perlu dilakukan
pengenceran
agar
serapannya
dapat
terbaca.
Lama inkubasi reaksi enzimatis
ditentuka n dengan cara sebagai berikut :
disediakan
beberapa
labu
erlenmeyer.
Masing - masing
diisi
dengan
larutan
sukrosa 10% sebanyak 100 mL dalam buffer
sitrat dengan pH 4,5. Ke dalam masing masing erlenmeyer ditambahka n 5 mL
enzim.
Perbandi ngan
enzim
dengan
substrat
sukrosa 10 % adalah 1:20.
Kemudian diinkubasi pada suhu optimu m
selama beberapa jam dengan kecepatan 60
rpm. Setiap interval waktu 1 jam reaksi
dihentikan dengan pemana sa n dalam air
mendidih selama 10 menit. Kadar gula
reduksi
ditentukan
dengan
metode
Somogy - Nelson. Sebelum diukur perlu
dilakukan pengenceran agar serapannya
dapat terbaca.
ditransfer lagi ke dalam 900 media
kompleks dan diinkubasi pada suhu 30 o C
dan di shaker 120 rpm. Selama inkubasi,
pertam bah a n
biomas sa
setiap
jam
dimonitor dengan pengukur an turbiditas
menggunaka n Spektronik Genesys 20 pada
540 nm.
Regenerasi Zymo m on a s mobilis
Biakan murni Zymo mo nas mobilis
diremajakan pada agar miring (media NA)
pH 5,5 yang telah disterilisasi pada suhu
121 o C dan tekanan 1 atm selama 30 menit,
selanjut nya diinkubasi pada suhu 30 o C
selama 24 jam. Zymo mo n as mobilis pada
agar miring (media NA) ini menjadi stok
kultur yang diregenerasi pada media NA
yang baru sebelum digunakan.
Kultur baru diinokulasikan pada 10
ml media kompleks pH 5,5 sebagai starter
awal dan diinkubasi dengan shaker selama
20 jam suhu 30 o C yang selanjutnya akan
ditransfer ke media yang lebih besar yaitu
90 ml media kompleks dengan perlakuan
dan inkubasi yang sama setelah media
menunj ukkan
keadaan
yang
keruh
menandaka n bakteri mem perba nyak diri.
Sebanyak 100 ml starter selanjut nya
ditransfer dengan perlakuan yang sama
sampai volume 1000 ml.
Penentuan Pola Fermentasi
Fermentasi menggunakan bakteri
Zymomonas mobilis dilakukan dalam 8
labu erlenmeyer yang diisi dengan 100 mL
media ferment asi yang telah dihidrolisis
oleh enzim invertase dalam kondisi suhu,
pH dan lama inkubasi optim u m (hidrolisat)
ditam ba h biomas sa hasil sentrifuse 200 mL
inokulum. Fermentasi ini dilakukan pada
inkubator shaker 50 rpm. Hasil ferment a si
diambil setiap 15 jam sekali sampai 120
jam untuk disentrifuse (memisahkan filtrat
dengan biomass a) sehingga filtratnya dapat
diuji kualitatif etanol, residu glukosa dan
kadar etanolnya.
Penentuan
Kurva
Petumbuhan
Zymo m on a s mobilis
.
Sebanyak satu ose Zymo mo n as
mobilis dari media padat (NA) agar miring
diinokulasi pada 10 mL media dan
diinkubasi pada suhu 30 o C selama 20 jam
dengan di shaker 120 rpm. Setelah 20 jam,
starter ini ditransfer ke 90 mL media
kompleks dan diinkubasi pada kondisi yang
sama. 100 mL starter ini selanjut nya
Prosiding KIMIA FMIPA - ITS
Pembuatan Media Fermentasi (Hidrolisat)
Media Fermentasi dibuat sebanyak
800 mL untuk 8 proses fermentasi. Enzim
invertase
yang
ditambahka n
dengan
perban dingan 20 : 1. Sukrosa 10 %
dilarutkan dalam larutan buffer dengan pH
optimu m yang akan dicari. Kemudian
ditam ba hka n 5 mL enzim dalam 100 mL
larutan substrat. Selanjutnya diinkubasi
berdasarkan waktu optimu m. Enzim yang
ada dimatikan dengan cara dipanaskan
pada air mendidih selama 10 menit.
Larutan yang terbent uk disentrifuse. Filtrat
yang didapat diuji kadar gula invertnya
menggunaka n
metode
Somogy- Nelson.
Filtrat ini yang akan digunakan sebagai
media ferment asi.
HASIL DAN DISKUSI
Isolasi Ekstrak Kasar Invertase dari Ragi
Roti (Saccharo m y c e s cerevisiae )
Ragi
roti
sebanyak
55
gram
dilarutkan kedalam larutan NaHCO 3 0,1 M
sebanyak 150 mL. NaHCO 3 ini berfungsi
untuk melarutkan sel ragi sehingga pada
akhirnya enzim invertase akan berada pada
filtratnya. Selanjutnya larutan ini diaduk
sampai menjadi bubur. Buburan ragi
dimasukka n ke dalam homogenizer pada
7500 rpm selama 5 menit. Homogenizer
berfungsi untuk menghom oge nk an larutan
dengan ragi. Bubur yang didapat dituang
dalam 3 erlenmeyer 250 mL. Penutup
erlenmeyer dibuat dari kapas yang dibalut
kasa - aluminium foil. Pada penutu p ini
diberi beberapa lubang kecil yang berfungsi
untuk
mengura ngi
tekanan
udara
didalam nya
apabila
adonan
mulai
mengem bang. Bubur ragi dalam erlenmeyer
diinkubasi pada suhu 40 o C selama 24 jam.
Inkubasi
ini
diperlukan
untuk
mengeluarkan enzim dari ragi. Setelah
inkubasi, pada bubur dilakukan pemecahan
sel menggunakan ultrasonifikator pada
kecepatan 16 rms selama 20 menit. Larutan
hasil autolisa selanjutnya disentrifuge pada
suhu 10 o C dengan kecepatan 3500 rpm.
Filtrat yang terbent uk didekanta si dan
diperoleh supernata n nya. Supernata n inilah
yang disebut sebagai “crude invertase”
yang berwarna kuning. Ekstrak kasar
invertase
dapat
dilihat pada
gambar
berikut:
Penentuan Kurva Standar Gula Invert
Secara Spektrofotom etri
Penentua n
kurva standart
gula
invert ini bertujuan untuk menent u ka n
persa m aa n yang nantinya akan digunakan
untuk menghitung konsent ra si gula reduksi
(gula invert) yang terbent uk dari hasil
hidrolisis sukrosa oleh enzim invertase.
Standart gula invert dibuat dengan cara
membua t larutan gula invert 0,0025 M yang
kemudian
diencerkan
dalam
pelarut
aquades sehingga didapatkan beberapa
variasi konsentra si 1; 1,25; 1,5; 2; 2,25 dan
2,5 (x 10 - 3 M). Masing - masing larutan
dimasukka n dalam tabung reaksi sebanyak
0,5 mL. Karena fruktosa dan glukosa
merupakan gula reduksi sehingga analisa
gula invert dilakukan dengan menggunaka n
metode Somogy- Nelson.
Kurva standar guls invert dibuat
dengan
mengalurkan
nilai absorban si
terhada p
konsentr asi
larutan.
Dari
hubunga n keduanya, didapatkan grafik
sebagai berikut:
Gambar
1
Kurva
grafik
diatas
standart
bahwa
nilai
absorbansi
mengalami
kenaikan sejalan dengan semakin besarnya
konsentra si gula invert dalam larutan,
sehingga didapatkan persa m a an kurva yang
memenu hi hukum Lambert - Beer
y = 977.231 x
Nilai R2 dari kurva diatas adalah 0,998, hal
ini menunjukkan bahwa kelinearan kurva
standart baik karena hampir mendekati +1,
yang mana titik- titik pada kurva standart
melewati garis lerengnya.
Penentuan Kandungan Protein Ekstrak
Kasar Invertase
Penentuan Panjang Gelombang
Maksimum Bradford
Larutan stok BSA 2000 ppm dapat
dibuat dengan cara: 100 mg BSA dilarutkan
dalam 25 mL aquades kemudian diaduk
perlahan
sampai
larut
setelah
itu
diencerkan dengan aquades sampai 50 mL.
Larutan ini diambil sebanyak 5 mL dan
ditam ba hka n 3 mL reagen Bradford lalu
diencerkan dengan aquades sampai volume
10 mL. Larutan ini dibiarkan selama 5
menit
pada
suhu
ruang
untuk
menyem p u r n a kan reaksi antara Bradford
dengan
protein
pada
enzim. Reagen
Bradford dibuat dengan cara : coomise
brilliant blue G- 250 sebanyak 25 mg
dilarutkan dalam 1,5 mL etanol 95 % (v/v)
dan ditamba hka n asam fosfat 85 % (w/v).
Larutan ini diencerkan sampai volume 250
mL. Setelah dicampur dengan reagen
Bradford, larutan diukur absorban si nya
menggunaka n
spektrofot o m e ter
pada
kisaran panjang gelomba ng 560 - 620 nm
karena warna yang diserap oleh larutan
adalah biru sedangkan warna biru memiliki
panjang
gelombang
antara
580 - 595
(Khopkar, 1995). Untuk larutan blanko yang
digunakan dibuat dengan menam b ahka n 3
mL reagen Bradford dan 7 mL aquades.
Dari
nilai
pengukuran
absorbansi
didapatkan grafik sebagai berikut.
gula
invert
Dari
dapat
Prosiding KIMIA FMIPA - ITS
dilihat
Gambar 2 Kurva Absorban si dalam Variasi
Gelombang (λ)
Gambar 2 menunj ukkan bahwa
puncak absorbansi tertinggi dicapai pada
panjang gelombang 595 nm. Setelah itu
turun seiring menjauhnya puncak serapan.
Serapan ini dihasilkan karena terjadi
absorbsi sinar tampak oleh kompleks
com m assie
brilliant
blue- kasein
pada
panjang gelombang maksi mu m nya akan
diperoleh kepekaan analitis yang tinggi.
Hasil yang didapat ini didukung oleh
penelitian yang dilakukan AA. Bradford
(1976), yaitu serapan maksim um terletak
pada 595 nm.
Panjang
4.1.1
Pembuatan Kurva Standar BSA
Kurva standart BSA dibuat dengan
membua t
beberapa
pengenceran
dari
larutan induk BSA 2000 ppm menjadi
beberapa konsent ra si yaitu: 100 ppm, 200
ppm, 300 ppm, 400 ppm, 500 ppm, 600
ppm, 700 ppm. Variasi konsentra si larutan
tersebut
dibuat
dengan
menggunaka n
larutan standart BSA 2000 ppm, larutan
tersebut diambil sebanyak 0,5; 1; 1,5; 2; 2,5;
3; 3,5 mL lalu diencerkan dengan aquades
sampai 10 ml. Selanjut nya diambil 7 ml dan
ditambahka n 3 ml reagen bradfod. Masing masing larutan diaduk dan diinkubasi
selama 5 menit pada suhu ruang. Kemudian
pengukura n absorba nsi dilakukan dengan
menggunaka n
spektrofoto m e t er
pada
panjang gelombang maksi mu m yang telah
ditentuka n sebelum nya yaitu pada λ = 595
nm . Blanko yang digunakan adalah 7 ml
aquades yang ditam ba h dengan 3 ml
reagen Bradfod.
Kurva
standar
dibuat
dengan
mengalurkan absorbansi sebagai ordinat
(sumbu y) dan konsent rasi sebagai absis
(sumbu x).
Gambar 3 Kurva Standart Larutan
BSA
Nilai absorbansi
mengalami
kenaikan
seiring bertam bah nya konsentr asi BSA
Prosiding KIMIA FMIPA - ITS
hingga diperoleh persa maa n garis antara
konsentra si BSA dan absorba nsi yaitu:
y = 0,001339x
Koefisien
korelasi
dari
kurva
pengama t a n adalah R2 = 0,998
hasil
Penentuan Kandungan Protein Ekstrak
kasar Invertase
Crude diambil sebanyak 1 mL
kemudian diencerkan menjadi 10 mL,
setelah itu hasil pengenceran tersebut
diambil sebanyak 7 mL dan ditam ba hka n 3
mL reagen Bradford. Larutan ini dibiarkan
selama 5 menit untuk menyem p ur na ka n
reaksi yang terjadi. Larutan yang telah
diinkubasi
diukur
serapan nya
menggunaka n
spektrofot o m e ter
pada
panjang
gelombang
maksimu m
yang
didapat, yaitu 595 nm. Absorbansi yang
dihasilkan adalah sebesar 1,112 dan 1,114
sehingga diambil rata - ratanya sebesar
1,113. Hasil absorbansi ini dimas ukka n
kedalam persa ma a n reaksi y= 0,001339 x.
Dari perhitungan diperoleh konsent rasi
crude invertase yang terukur sebesar
831,217 ppm sedangkan konsent ra si crude
invertase
sebenarnya
yaitu
sebesar
11.874,533 ppm didapatkan dengan cara
mengalikan konsentr asi terukur dengan
faktor kali 100 / 7 (10/1 x 10/ 7), dimana
pengenceran dengan aquades (10/1) dan
pengenceran akibat penam ba ha n reagen
Bradford
(10/7). Hasil ini kemudian
dikonversikan
dalam
mg
sehingga
diketahui dalam 1 mL crude invertase
mengand u n g 11,87 mg protein.
Penentuan Kondisi Optimum Ekstrak
Kasar Enzim Invertase
Perbedaan pH berpengaru h
terhada p 2 jenis, yaitu struktur enzim dan
gugus fungsional enzim. Suatu enzim dapat
menghasilkan produk yang maksimal pada
pH optim u m nya. Dari hasil penentua n pH
optimu m crude invertase diperoleh gambar
4. 7
Gambar 4 Pengaruh pH terhada p Aktivitas
Enzim Invertase
Gambar
diatas
menunjukkan
aktivitas maksimu m crude invertase yaitu
pada pH 4,5 dengan aktivitas sebesar 49,63
unit. Unit aktivitas enzim didefinisikan
sebagai,
sebanyak
49,63
μmol
gula
dihasilkan oleh setiap mL enzim per
menitnya.
Hasil pH optimu m ini sesuai
dengan penelitian yang dilakukan oleh
(Bergamasco et al, 2000; Akgol et al., 2001;
Bayramolu et al., 2003), yang melaporka n
bahwa aktifitas enzim terjadi pada range
pH 3,0 - 5,0 dengan aktivitas maksim u m
terjadi disekitar pH 4,5. Diatas skala
tersebut
aktivitas
enzim
mengalami
penur una n. Semakin basa kondisi hidrolisis
menyebabka n semakin rendahnya harga
aktivitas enzim crude invertase. Perubahan
pH dapat menyebabkan turunnya aktivitas
enzim akibat perubaha n ionisasi gugus gugus fungsionilnya karena gugus ionik
berperan
penting
dalam
menjaga
konform a si sisi aktif enzim untuk mengikat
dan mengubah substrat menjadi produk.
Perubaha n pH juga dapat menyebabkan
enzim
terdenat ura si
sehingga
menyebabka n penuruna n katalitik enzim.
Denaturasi
enzim
dakibatkan
karena
terjadinya pemutu s a n
ikatan penstabil
struktur (seperti ikatan ionik, hidrogen,
hidrofobik) yang menghub ungka n antar
polimer protein. Pemutus an tersebut dapat
terjadi pada protein kwartener, tersier
ataup u n sekunder. Pada protein kwartener
terjadi pemut u sa n ikatan penstabil struktur
karena
bentuknya
yang
merupakan
gabungan antara globular satu dengan
globular lainyya sehingga dapat terjadi
pemut us an ikatan tersebut pada protein
tersier satu dengan protein tersier lainnya
dan terjadi seterus nya, pada protein tersier
membent uk protein sekunder.
Penentua n
suhu
optimu m
juga
ditentuka n berdasarka n data yang telah
didapatka n. Variasi suhu yang dibuat yaitu
20 o C, 25 o C, 30 o C, 60 o C, 80 o C dan 100 o C.
Pengaturan ini dengan cara dipanaskan
dalam air mendidih ataupu n di inkubasi
dalam penangas es. Ketiga optimasi baik
pH, suhu serta lama inkubasi, kadar gula
reduksinya dianalisa menggunakan metode
Somogy - Nelson. Metode tersebut khusus
untuk
penent uan
gula
reduksi.
Dari
perhitunga n diperoleh gambar 5
Prosiding KIMIA FMIPA - ITS
Gambar 5 Pengaruh Suhu Terhadap
Aktivitas Enzim
Invertase
Enzim
memiliki
temperat ur
optimu m
dalam melakukan
fungsinya,
sehingga
diperoleh
aktivitas
enzim
maksim u m.
Gambar 4.8 menunjukkan
bahwa aktivitas optimu m crude invertase
dicapai pada suhu 30 o C dengan aktivitas
sebesar 46,66 unit. Hasil suhu optim u m ini
sedikit berbeda dengan hasil penelitian
yang dilakukan oleh
(Bergamasco et al,
2000; Akgol et al., 2001; Bayramolu et al.,
2003), yang menyatakan
suhu optim um
enzim invertase dicapai pada 40 - 60 o C.
Perbedaan ini kemungkinan disebabkan
ketidakm urnian enzim invertase sehingga
lebih
tidak
tahan
terhada p
panas.
Meningkatnya suhu menyebabka n aktivitas
enzim meningkat. Hal ini disebabka n
karena ketika suhu naik, energi kinetik juga
meningkat sehingga mena mba h intensitas
tumbukan antara substrat dan enzim.
Tumbukan
yang
sering
terjadi
akan
memper m u d a h
pembent ukan
kompleks
enzim - substrat, sehingga produk yang
terbent uk makin banyak. Sedangkan suhu
yang terlalu tinggi akan mem pe ngar u hi
perubaha n konform a si substrat sehingga
sisi reaktif substrat mengalami hambatan
untuk memas uki sisi aktif enzim dan hal ini
menyebabkan aktivitas enzim akan rendah.
Selain
itu,
tingginya
suhu
akan
menyebabkan
rusaknya
interaksi
nonkovalen (ikatan hidrogen, vander waals,
hidrofobik dan elektrostatik) yang menjaga
strukt ur tiga dimensi enzim sehingga
enzim
akan
terdenatu ra si. Dari data
tersebut,
hidrolisis
sukrosa
dilakukan
dalam pH 4,5 dan pada suhu 30 o C.
Untuk mengetah ui waktu inkubasi
atau hidrolisis yang optimu m dapat dilihat
dari gambar berikut :
Gambar 4.9 Pengaruh Waktu Hidrolisis
Terhada p
Kadar Gula Reduksi
Waktu inkubasi merupaka n waktu
yang
dibutuhka n
oleh
enzim
untuk
berikatan dengan substratnya. Penentua n
waktu inkubasi optimu m
pada crude
invertase dilakukan pada pH optim u m nya
yaitu 4,5 dan suhu optimu m 30 o C. Dari
gambar
diatas,
menunj ukka n
bahwa
penam ba ha n
waktu
inkubasi
akan
meningkat kan
jumlah
produk
yang
terbent uk. Dengan kata lain aktivitasnya
juga meningkat sampai ia mencapai waktu
optim u m yaitu pada jam ke 5 setelah
inkubasi.Saat inkubasi optimu m ini, sisi
aktif enzim akan terikat secara optimal.
Apabila waktu yang dikondisikan pada
enzim dan substrat kurang dari cukup,
maka sisi aktif enzim belum optimal dalam
mengikat substrat sehingga menyebabkan
produk yang terbent uk masih sedikit ketika
reaksi dihentikan. Pada jam ke 5 sampai 7,
tidak terlihat adanya perbedaa n yang besar,
ini menand aka n bahwa kemungkinan sisi
aktif enzim telah jenuh oleh substrat
sehingga produk yang dihasilkan hanya
mengalami
peningkata n
ataupu n
penur una n yang relatif kecil.
Penentuan Kurva Pertumbuhan
Zymo m on a s mobilis
Pengukuran jumlah bakteri dapat
ditentuka n secara tidak langsung dengan
mengukur
turbiditas
cairan
medium
tumbu h menggunaka n spektrofoto me t e r
(Optical Density atau absorba nsi). Unit OD
ini akan propor sional atau sebanding
dengan massa sel dan jumlah bakteri.
Meningkatnya turbidimet ri dalam media
adalah indeks lain dari pertu m bu ha n
bakteri serta jumlah biomassa bakteri.
Apabila sinar yang ditrans mi sikan atau
diteruska n itu menurun artinya terjadi
peningkat an populasi pada media tersebut.
Dengan kata lain absorbansi yang tebaca
dari sinar yang dihambur kan oleh partikel partikel bakteri akan memberikan nilai
yang besar.
Prosiding KIMIA FMIPA - ITS
Gambar 6 Kurva pertum b u h a n Zymo mo n as
mobilis
dalam media pH 5,5
Dari
kurva
pertu m b u h a n
Zymo m o n as mobilis dalam media dengan
pH 5,5 diatas, dapat dilihat bahwa bakteri
Zymo m o n as mobilis melakukan adaptasi
pada fasa lag selama ± 4 jam pertam a.
Pada fase ini, bakteri tidak mengalami
pertu m b u h a n yang signifikan, jumlahnya
cenderung tetap karena belum mengalami
pembelaha n. Bakteri memerlukan waktu
untuk beradapt a si, selnya akan mengalami
perubaha n komposisi kimiawi dan ukuran
serta berta mba h nya substan si intraseluler
sehingga siap untuk membelah diri. Waktu
adaptasi ini tergolong singkat. Hal ini
dikarenaka n sebelum nya telah dilakukan
transfer dari starter 20 mL ke starter 200
mL dengan waktu inkubasi yang sama. Fase
log berakhir setelah 18 jam inkubasi.
Jumlah sel yang hidup pada fase ini
merupakan jumlah sel yang hidup optimal
dan memiliki aktivitas yang sangat aktif
dalam mengkonversi substrat
menjadi
etanol. Oleh karena itu pemane na n bakteri
dilakukan sekitar waktu tersebut. Diatas 20
jam, bakteri sudah masuk fase stasioner.
Berdasarkan teori, jumlah sel yang mati
pada fase stasioner sama dengan jumlah
sel hidup yang membelah sehingga seolah olah pertu m b u ha n nya adalah nol. Apabila
waktu pengama t an
diperpanja ng
akan
didapatkan penuruna n jumlah bakteri yang
dapat
mencapai maksimal disebabkan
berkurangnya
nutrisi
yang
tersedia
sehingga jumlah sel yang mati lebih
banyak. Pada waktu ini disebut sebagai fase
kematian.
Penentuan Pola Fermentasi
Dari 100 mL larutan sukrosa 10%
yang dihidrolisis dengan 5 mL enzim
invertase selama 5 jam pada pH 4,5 dan
suhu inkubasi 30 o C menghasilkan gula
invert dengan konsentra si 0,2906 M atau
sebanyak 10,46 gram. Sebelum dilakukan
hidrolisis, sukrosa memiliki absorban si
awal sebesar 0,067, artinya dalam larutan
sukrosa tersebut terdapa t 0,247 gram gula
reduksi (gula invert). Hal ini menand aka n
bahwa sukrosa yang digunakan tidak
murni. Dengan melakukan penguranga n,
didapatka n massa gula hasil hidrolisis
sebesar 10,22 gram. Apabila hasil tersebut
dikonversikan dengan sejumlah sukrosa
melalui persa m aa n stoikiomet rinya dapat
diketahui
banyaknya
sukrosa
yang
terhidrolisis, yaitu sekitar 9,712 gram.
Enzim yang digunakan mengandu ng 11,87
mg protein / mL dan menghasilkan aktivitas
sebesar 18,91 unit.
Hidrolisat yang didapatka n dari
hasil hidrolisis akan
digunakan sebagai
media fermentasi, dimana gula reduksinya
akan
diubah
menjadi
etanol
oleh
Zymomonas mobilis melalui jalur Entner Doudoroff.
Data dari penelitian sebelum nya,
hasil
etanol
optimu m
terjadi
pada
fermenta si
dengan
pH 5,5 sehingga
fermenta si kali ini dilakukan pada pH
tersebut dan dalam kondisi anaerob yang
diletakkan pada shaker dengan kecepatan
50 rpm. Karena semakin anaerob keadaan
fermenta si maka semakin maksimal pula
glukosa
atau
fruktosa
yang
dapat
terferm e nta si.
Pola produk si etanol serta konsu m si
gula selama fermenta si oleh sel bebas
Zymomonas
mobilis diperoleh dengan
melakukan monitoring terhada p
kadar
etanol dan kadar gula invert sisa terhada p
fungsi waktu selama 120 jam setiap 15 jam
sekali. Jumlah awal sel Zymo mo nas mobilis
yang digunakan sebesar 2,6 x 10 10 sel/ mL.
Zymo mo nas
mobilis
memp u nyai
laju
pertum b u h a n
yang tinggi dan
tahan
terhada p konsent ra si etanol sekitar 10%.
Bakteri ini dapat memferm en t asikan gula
menjadi etanol dan CO 2 melalui jalur
glikolitik
Entner - Doudoroff,
dimana
oksigen tidak ikut serta dalam proses
fermenta si.
Oksigen
akan
menekan
fermenta si dan mengunt u ngkan respirasi
(Schlegel, 1994). Dibawah ini disajikan
grafik
pola
produksi
etanol
beserta
konsum si gula selama 120 jam.
Prosiding KIMIA FMIPA - ITS
Gambar 7 Pola Produksi Etanol dan Gula
Residu pada pH 5,5
Dari gambar diatas, dapat dilihat
bahwa
semakin
lama
jumlah
etanol
mengalami peningkat an sedangkan jumlah
gula residu semakin berkurang dari gula
awalnya, ini menand aka n adanya konsu m si
gula oleh bakteri. Jumlah etanol dan
konsu m si gula mengalami perubaha n yang
signifikan setelah ferment asi selama 75
jam. Hal ini dimungkinkan karena sudah
tidak
ada
pertum b u h a n
bakteri
Zymo m o n as mobilis sehingga kondisinya
dioptimalkan
untuk
berlangsu ngnya
pembent uka n etanol. Menurut Mc Gill
(1965) , Zymo mo n as mobilis lebih menyukai
glukosa daripada fruktosa. Sehingga bakteri
ini akan memakai glukosa sebagai subst rat
untuk fermentasi pertam a kali. Setelah
glukosa habis, maka bakteri ini akan
memakai
fruktosa.
Indikasi terjadinya
ferment asi adalah terdapat nya gelembung
busa pada perm ukaa n media. Jumlah etanol
terbesar dihasilkan pada 120 jam sebesar
6,17 % (v/v) atau 4,87 gram etanol dengan
yield etanol 92,89%. Nilai ini lebih besar
apabila
dibandingkan
dengan
hasil
penelitian yang dilakukan Hani (2009) yaitu
mengenai
fermenta si
menggunakan
substrat sukrosa yang hanya menghasilkan
etanol sebesar 0,412 gram, yield etanol
yang dicapai 61,18%. Nilai yield yang
rendah ini, diakibatkan karena dengan
menggunaka n
substrat
sukrosa
akan
terbent uk 2 jenis hasil samping yang utama
yaitu levan dan sorbitol. Levan terbent uk
akibat adanya enzim levan sukrase yang
dihasilkan oleh bakteri Zymo mo nas mobilis
hanya pada substrat sukrosa sedangkan
sorbitol terbent uk akibat adanya reduksi
oleh
enzim
glukose - fructose
oxidareduktase. Dimana hasil samping
keduanya dapat menur unka n jumlah etanol
yang terbent uk sampai 80% secara teori (E,
favela, 1987). Akan
berbeda
apabila
substrat yang digunakan merupakan hasil
hidrolisis sukrosa, kemungkinan produk
mayor yang terbent uk hanya sorbitol.
Yield etanol yang terukur dihitung
berdasarkan akum ulasi etanol pada setiap
waktu pengukuran. Yield etanol dari hasil
ferment asi dapat dilihat pada gambar 8
reactive
film
composed
of
2hydroxyethyl
methacrylate
and
glycidyl methacrylate”, Biochemical
Engineering Journal , 14:117 - 126
Gambar 8 Yield Etanol Terhadap Waktu
Pengukuran
Pada fermenta si selama 60 jam
terlihat adanya penurun a n yield etanol
menjadi 79,81%. Hal ini disebabka n karena
sejumlah
gula dipakai bakteri untuk
regenerasi sehingga etanol yang dihasilkan
tidak sebanding dengan banyaknya gula
yang terkons u m si.
KESIMPULAN
Berdasarkan hasil penelitian,
diperoleh
kesim pulan
bahwa
aktifitas
optim u m
crude
invertase
dalam
mendegrada si sukrosa menjadi gula invert
didapatka n pada kondisi pH 4,5 dengan
temperat ur 30 o C dan waktu inkubasi
selama 5 jam. Inkubasi selama 5 jam pada
kondisi optimum mampu mnghidrolisis
sukrosa
sebanyak
9,712
gram
dan
menghasilkan campura n
glukosa serta
fruktosa sebanyak 10,22 gram. Aktivitas
enzimnya sebesar 18,91 unit. Selain itu,
pada
fermenta si
dengan
pH
5,5,
Zymo mo nas mobilis mam p u menghasilkan
etanol sebesar 4,87 g/100 mL dengan yield
etanol mencapai 92,89%.
UCAPAN TERIMA KASIH
1. Bapak Surya Rosa Putra, selaku
dosen pembim bing atas segala
diskusi, bimbingan, arahan dan
semua ilmu yang bermanfaat.
2.
3.
4.
Bapak dan Ibu selaku orang tua
terbaik di dunia atas segala doa,
dorongan materiil dan spiritualnya.
Rekan - rekan tugas akhir dan thesis
S1 dan S2 Kimia ITS serta para
analis khusus nya di Laboratorium
Biokimia
Serta pihak - pihak lain yang tidak
dapat disebutkan satu persatu.
DAFTAR PUSTAKA
Bergamasco, G., Akgol, S., Bulut, A., Denizli,
A. And Yakub, A.M. (2003), “Covalent
immobilization of inverase onto a
Prosiding KIMIA FMIPA - ITS
Favela, E Torres, (1987), “Continuous
Ethanol Production by Zymo mo n as
mobilis from an Equimolar Mixture of
Glucose and Fructose”, France
Mukhtasor,
(2009),
“Agenda
Energi
Terbaruka n dalam Konteks Kebijakan
Energi Berkelanjuta n”, ITS Press,
Surabaya
Swing, J. Dan De Ley, J.,(1977), “The Biology
of
Zymomona s”,
Laboratory
of
Microbiology and Microbial Genetic,
Faculty of Science, USA
Tano, M. S. & Buzato, J. B., (2003), “Effect of
The Presence of Initial Ethanol on
Ethanol Production in Sugar Cane
Juice Fermente d
by Zymo mo nas
mobilis”. Braz. J. Microbiol. 34: 242 244
Utami, Sri, (2007), “Pengelolaan Energi
Nasional
2005 - 2025”,
Staf
Ahli
Menteri
Bidang
Ekonomi
dan
Keuangan, Departe me n Energi dan
Sumberdaya Mineral,Jakarta
BIOGRAFI PENULIS
Penulis dilahirkan di Surabaya pada tanggal 3
Desembe r 1987, sebagai anak perta ma dari dua
bersa u da r a. Penulis adalah alumnu s dari TK
Aisyah, SD Muham m a diyah V, SLTP Negeri 1
Porong dan SMA Negeri 3 Sidoarjo. Setelah lulus
mene m p u h Pendidikan Menengah atas, penulis
melanjutka n Pendidikan Tinggi di Jurusa n
Kimia Fakultas MIPA Institut Teknologi Sepuluh
Nopembe r (ITS) Surabaya melalui jalur SPMB
(Seleksi Penerima an Mahasiswa Baru) pada
bulan
Agustus
2005.
Selama
mene m p u h
pendidikan tinggi di ITS, penulis perna h aktif
dan berpartisipa si dalam organisa si pada
HIMKA- ITS. Penulis juga aktif mengikuti
bebera pa
pelatiha n,
seminar
dan
Study
Lapangan. Penulis sempa t mene m p u h Kerja
Praktek
di PT. Nestle - Kejayan, Pasurua n.
Penulis mena m a tk a n studi S1 di Jurusa n Kimia
MIPA dengan menga m bil Tugas Akhir pada
bidang Biokimia dan berhasil lulus dengan
predikat yang Memuaska n.