UJI SITOTOKSISITAS DAN EFEK EKSTRAK SPONS

UJI SITOTOKSISITAS DAN EFEK EKSTRAK SPONS LAUT Aaptos suberitoides
TERHADAP SEL KANKER SERVIKS (HeLa) SECARA IN VITRO
CYTOTOXICITY TEST AND EFFECT OF Aaptos suberitoides EXTRACT ON
CERVICAL CANCER CELL LINE HeLa IN VITRO
Awik Puji D.N1, Sukardiman2, Hani Tenia Fadjri3
1.
Department of Biology, Faculty of Mathematic and Natural Science,Sepuluh Nopember Institute of
Technology
2. Pharmaceutical Facult, Airlangga University Surabaya
3. Alumni of Department of Biology, Faculty of Mathematic and Natural Science,Sepuluh Nopember
Institute of Technology
ABSTRACT
The main purpose of this reseach is to determine the effect of A.suberitoides extract on cervical
cancer cell line HeLa in vitro, that using cytotoxicity test. The activity of A.suberitoides extract to inhibit
the growth of cancer cell was determined by MTT assay. After the LC50 calculated, the cell proliferation
kinetic profiles were observed by doubling time test at 24th, 48th, and 72th hours and the IC50 calculated.
Apoptosis studies were done by double staining test using acridine orange and ethidium bromide. The
study was used Completely Randomized Design with 5 treatment group, there are group I (treatment), II (
control cell ), III ( positive control), IV (medium control) and V ( cosolven control ), with three times
duplication. The concentration of extract that use 7.5 ; 15 ; 30 ; 60 ; 120 ; 240 ; 480 ; 960 and 1920
µg/mL. The concentration of cisplatin, medicine cancer that use 2, 4, 8 dan 16 µg/mL. The data was
analyzed with ANOVA and be continued by LSD test.
The result of this research shows that A.suberitoides extract have not cytotoxic activity on
cervical cancer cell line HeLa with LC50 = 133,968 µg/mL at cytotoxicity test with MTT assay based NCI
(National Cancer Institut) criterion, that a compound was said to have sitotoksisitas's effect that poten if
that compound have point LC50 ≤ 20 πg/mL. At doubling time test, A. suberitoides extract are not able to
inhibit proliferation of cervical cancer cell line HeLa with IC50 = 153, 007µg/mL based criterion of
Kamuhabwa et al. (2000), that extract has to assess IC 50 = 100 µg / ml can say to have antiproliferasi's
potencies. And A.suberitoides can induction apoptotic on cervical cancer cell line HeLa with activity as
big as 16,650 %.
Key Words: A.suberitoides, HELA cervical cancer cell, Cytotoxicity test
PENDAHULUAN
Indonesia merupakan salah satu negara
megadiversity yang dilimpahi kekayaan hayati
tertinggi di dunia terutama perairannya karena
sebagian besar wilayah Indonesia berupa perairan.
Kondisi tersebut menjadikan Indonesia memiliki
keunggulan komparatif dari segi sumber daya
alam untuk dikelola bagi kesejahteraan manusia.
Kekayaan hayati perairan Indonesia terdiri dari
ikan baik pelagik dan demersal, alga, terumbu
karang, plankton, spons dan masih banyak
lainnya. Sumber daya alam tersebut sampai saat
ini belum banyak dimanfaatkan secara optimal,
salah satunya adalah organisme bentik sesil yang
mempunyai aktivitas farmakologis sebagai
antimikroba,
antivirus,
antiinflamasi
dan
antikanker (Suryati dan Ahmad, 1996).
Salah satu organisme bentik yang
mempunyai kadar bioaktif tinggi adalah spons.
Spons memiliki kemampuan menghasilkan
metabolit sekunder yang tinggi serta mensintesis
bermacam-macam komponen organik seperti
polyketida, alkaloid, peptid dan terpene (Sjorgen,
2006). Komponen organik tersebut dapat
digunakan sebagai bahan obat-obatan (Amir dan
Budiyanto, 1996). Telah dilaporkan pula bahwa
sebagian senyawa yang diisolasi dari spons
mempunyai aktivitas toksik yang tinggi terhadap
antibakteri , antikanker dan antiparasit (Amir dan
Budiyanto, 1996).
1
Sebelas spesies spons yang diambil dari
daerah perairan Pantai Pasir Putih Situbondo
memiliki senyawa bioaktif yang berpotensi
sebagai antikanker (Nurhayati et al., 2008).
Senyawa bioaktif antikanker yang akan digunakan
sebagai produk farmasi antikanker harus diujikan
terlebih dahulu dengan uji sitotoksik. Uji
sitotoksik merupakan salah satu pengembangan
metode untuk memprediksi keberadaan senyawa
yang bersifat toksik pada sel (Kurnijasanti et al.,
2008). Salah satu metode uji sitotosisitas adalah
Brine Shrimp Test (BST) yang dapat digunakan
untuk praskrining terhadap senyawa- senyawa
yang diduga berkhasiat sebagai anti tumor
(Sukardiman, et al., 2004 dalam Widyastuti,
2008). Hasil uji sitotoksisitas BST pada 11 spesies
spons yang diambil dari perairan Pasir Putih
tersebut menunjukkan tingkat toksisitas yang
paling tinggi pada spesies Aaptos suberitoides
dengan nilai LC50 134.14 ± 36.61 ppm sehingga
spesies ini merupakan kandidat yang paling baik
untuk antikanker (Nurhayati et al, 2008). Setelah
tahap praskrining terhadap senyawa antikanker
dengan metode BST, maka perlu dilanjutkan
dengan uji sitotoksisitas menggunakan sel kanker
secara in vitro.
Uji sitotoksisisitas secara in vitro pernah
dilakukan oleh Shaari, et al. tahun 2008 dengan
menggunakan ekstrak methanol spons jenis A.
aaptos pada beberapa sel kanker. Hasil pengujian
tersebut signifikan pada beberapa jenis sel kanker
yaitu HL-60 (leukemia promyelositik), CEM-SS
(leukemia T-lympoblastik), MCF-7 (kanker payu
dara), HeLa (kanker serviks), HT-29 (kanker usus
besar) dan L929 (murine fibrosarcoma from
mouse) dengan nilai CD50 3.2 - 24.1 µg/ml.
Diantara kanker tersebut, kanker serviks (leher
rahim) merupakan kanker yang menempati posisi
pertama diantara sepuluh kanker primer yang
melanda wanita di Indonesia dengan prosentase
yang besar yaitu 28.66 % (Tjindarbumi dan
Mangunkusumo, 2002 dalam Heti, 2008).
Sel kanker leher rahim (sel HeLa) terjadi
akibat infeksi Human Papillomavirus (HPV 18)
sehingga mempunyai sifat yang berbeda dengan
sel leher rahim normal. Sel kanker leher rahim
yang diinfeksi HPV diketahui mengeekspresikan 2
onkogen, yaitu E6 dan E7. Kedua onkogen
tersebut merupakan protein yang dapat
menghambat ekspresi gen p53 sebagai gen
penekan kanker. Pada peristiwa ini onkogen lebih
tinggi dibandingkan p53 sehingga proliferasi sel
kanker menjadi tidak terkendali (Prayitno, 2005;
Goodwin dan DiMaio, 2000).
Berbagai
macam
senyawa
telah
dikembangkan melawan kanker yang meliputi
senyawa-senyawa pengalkilasi, antimetabolit,
obat-obat radiomimetik, hormon dan senyawa
antagonis. Akan tetapi tak satupun jenis
senyawasenyawa ini menghasilkan efek yang
memuaskan dan tanpa efek samping yang
merugikan (Cram et al., 1992; Calabresi and
Chabner, 1991; Green et al., 1982; Herzig et al.,
1987; Hoppe et al., 1992; Lorgan et al., 1996
dalam Astuti, 2005). Obat antikanker yang ideal
seharusnya cepat membunuh sel kanker tanpa
membahayakan jaringan normal. Sampai sekarang
belum ditemukan obat-obatan yang memenuhi
kriteria sehingga perlu dikembangkan obat baru
yang mempunyai efek terapi yang baik (Katzung,
1995 dalam Heti, 2009).
A. suberitoides adalah salah satu spesies
spons laut yang memiliki keistimewaan karena
dapat menghasilkan senyawa alkaloid aaptamin
(benzo 1,6-naphthyridin) (Coutinho, 2002).
Senyawa aaptamin berpotensi sebagai senyawa
antikanker (Aoki et al., 2006), yang bekerja
dengan mekanisme apoptosis (Mayer, 2008) dan
antioksidan (Makarchenko, 2004). Apoptosis
merupakan mekanisme kematian sel sehingga
proliferasi sel yang mengalami kerusakan DNA
dapat dicegah (Tadjudin, 2006). Dengan kondisi
tersebut diharapkan aktivitas antikenker spons A.
suberitoides dapat menghambat proliferasi sel
HeLa. Penelitian ini sebagai dasar pengembangan
dalam bidang kesehatan dan sebagai produk
farmasi untuk antikanker dan imunostimulan.
METODE PENELITIAN
Spons A.suberitoides diperoleh dari
perairan Pecaron, Pantai Pasir Putih Situbondo,
Jawa Timur. Sel HeLa yang diujikan merupakan
koleksi dari LPPT UGM.
Ekstraksi Spons Laut
Ekstraksi spons dilakukan dengan metode
yang dilakukan oleh Harada dan Kamei (1997)
dan Horikawa et al (1999). Spons diambil ,
dipotong-potong menggunakan pisau selanjutnya
ditambahkan alkohol pada potongan spons untuk
mencegah tumbuhnya jamur. Potongan spons
dikeringanginkan selama 1 minggu hingga kering.
Selanjutnya potongan spons yang telah kering
dihaluskan
dengan
menggunakan
blender
sehingga terbentuk ekstrak kasar. Ekstrak kasar
yang telah didapat kemudian dimaserasi. Ekstrak
kasar spons dimasukkan ke dalam maserator
dengan kapasitas 2,5 kg. Ekstrak kasar spons
2
direndam dalam etanol sampai seluruh ekstrak
spon terendam, campuran disaring dan dihasilkan
ekstrak spons. Filtrat spons yang telah didapat
dievaporasi. Proses selanjutnya yaitu pengadukan
filtrat dengan stiring magnetic mulai dari pelarut
polar hingga pelarut non polar. Filtrat diaduk
dengan pelarut kloroform dengan perbandingan
1:5. pengadukan dilakukan dengan replikasi 3 kali
selama 2 jam untuk tiap kali replikasi. Dari proses
tersebut akan didapatkan filtrat dan supernatan.
Filtrat yang diperoleh dievaporasi untuk
menghilangkan etanol. Hasil yang diperoleh
merupakan ekstrak kloroform yang selanjutnya
digunakan dalam uji sitotoksisitas.
Uji Sitotoksisitas Metode MTT assay
Suspensi sel kanker serviks (HeLa)
sebanyak 100 µL dengan kepadatan 3 x 104
sel/100 µL media didistribusikan ke dalam
sumuran- sumuran pada 96-well plate dan
diinkubasikan selama 24 jam. Setelah diinkubasi,
ke dalam sumuran dimasukkan 100 µL larutan uji
pada berbagai seri konsentrasi. Sebagai kontrol
positif ditambahkan 100 µL medium kultur,
kemudian 100 µL cisplatin pada berbagai seri
konsentrasi ke dalam sumuran yang telah berisi
100 µL suspensi sel. Sebagai kontrol sel
ditambahkan 100 µL medium kultur ke dalam
sumuran yang berisi 100 µL suspensi sel dan
sebagai kontrol pelarut ditambahkan 100 µL
DMSO ke dalam sumuran yang berisi 100 µL
medium kultur dan 100 µL suspensi sel dengan
delusi yang sesuai dengan delusi konsentrasi
larutan uji, kemudian diinkubasi selama 24 jam
dalam inkubator dengan aliran 5% CO2 dan 95%
O2. Pada akhir inkubasi, media kultur dibuang lalu
ditambahkan 10 µL larutan MTT (5 mg/mL PBS),
dan medium diganti dengan 190 µL medium
RPMI 1640 komplit. Kemudian sel diinkubasi
selama 3-4 jam. Reaksi MTT dihentikan dengan
penambahan reagen stopper SDS (100 µL).
Microplate kemudian dibungkus dengan tissue
dan diinkubasi selama 1 malam pada suhu kamar
dan ruangan gelap. Sel yang hidup bereaksi
dengan MTT membentuk warna ungu. Hasil
pengujian dibaca dengan ELISA reader pada
panjang gelombang 595 nm (Ola at al., 2008; Mae
et al., 2000 dalam Dheta, 2009).
Pengamatan Kinetika Proliferasi Sel ( Uji
Doubling Time)
Suspensi sel kanker serviks (HeLa)
sebanyak 100 µL dengan kepadatan 3 x 104
sel/100 µl media didistribusikan ke dalam
sumuran-sumuran pada 96-well plate dan
diinkubasi selama 24 jam dalam incubator dalam
suhu 37°C dan dialiri 5% CO2. Selanjutnya
ditambahkan 100 µL larutan uji dengan 3 variasi
konsentrasi yaitu pada LC50 dan 2 konsentrasi
dibawah LC50 pada uji sitotoksisitas tersebut di
atas, kemudian inkubasi dilanjutkan dengan
variasi waktu 24, 48 dan 72 jam. Pada setiap akhir
inkubasi, medium kultur dibuang dan ke dalam
masing- masing sumuran ditambahkan 10 µL
larutan MTT (5 mg/mL PBS) dan medium diganti
dengan menambahkan 190 µL medium RPMI
1640 komplit kedalamnya. Kemudian sel
diinkubasi selama 3-4 jam sampai terbentuk
formazon. Reaksi MTT dihentikan dengan
penambahan reagen stopper SDS (100 µL).
Microplate yang berisi suspensi sel diseker ± 5
menit kemudian dibungkus dengan tissue dan
diinkubasi selama 1 malam pada suhu kamar dan
ruangan gelap. Sel yang hidup bereaksi dengan
MTT membentuk warna ungu. Hasil pengujian
dibaca dengan ELISA reader pada panjang
gelombang 595 nm. Hasil absorbansi yang terbaca
dikonversi ke dalam % (persentase) kehidupan
(viabilitas) sel (Dhiani et al., 2006 dalam Dheta,
2009).
Uji Apopotosis dengan Metode Double Staining
Sel yang telah dipanen dipuasakan
sebelum perlakuan menyamakan umur sel seperti
pada uji aktifitas proliferasi. Sel kanker yang akan
dipuasakan dimasukkan ke dalam plate 24 well
yang berisi coverslip, masing-masing sebanyak
500 µL dengan kepadatan 3x104 sel/100 µL
media, kemudian sel diinkubasi selama 24 jam
dalam inkubator CO2 370C. Selanjutnya sel diberi
perlakuan dengan 500 µL ekstrak spons laut A.
suberitoides dengan 3 variasi konsentrasi yaitu
pada LC50 dan 2 konsentrasi dibawah LC50 pada
uji sitoktoksisitas tersebut di atas. Sebagai kontrol
sel, ditambahkan 500 µL media kultur RPMI,
kontrol positif ditambah 500 µL cisplatin pada
konsentrasi LC50 dan 2 konsentrasi dibawah LC50
dan kontrol pelarut ditambah 500 µL DMSO pada
konsentrasi LC50 dan 2 konsentrasi dibawah LC50,
kemudian sel diinkubasi selama 24 jam dalam
incubator. Pada akhir inkubasi, medium dibuang
dan coverslip dikeluarkan dari sumuran,
diletakkan pada gelas benda Poly-L-Lysine secara
merata dan dibuat rangkap dua. Sebanyal 5 µL
larutan staining ditambahkan pada permukaan
coverslip tersebut, kemudian didiamkan ± 2 menit
agar larutan berinteraksi dengan sel. Sel segera
diamati di bawah mikroskop flouresen dengan
perbesaran dengan perbesaran 100 x dan hasil
3
pengamatan difoto dengan kamera digital. Sel
yang hidup akan berflurosen hijau dengan
acridine orange dan sel yang mati akan
berflurosen oranye dengan ethidium bromide
(Dhiani et al., 2006; Nururlita & Mahdalena, 2006
dalam Dheta 2009). Jumlah sel yang mengalami
apoptosis dihitung untuk tiap lapang pandang
dengan jumlah minimal 100 sel (Spector, 1998
dalam Sukardiman, 2005).
Analisis Data
Uji Sitotoksisitas dengan Metode MTT assay
Data yang diperoleh dari hasil pembacaan
ELISA reader (λ = 595 nm) berupa absorbansi
masing-masing sumuran dikonversikan dalam %
kematian sel dengan rumus:
Keterangan :
Abs
= Absorbansi
Kemudian dianalisis dengan program
SPSS Windows 16.0 menggunakan uji One Way
ANOVA. Analisis statistik ditentukan hipotesis
statistik sebagai berikut :
Ho = Tidak ada pengaruh penambahan ekstrak
spons A.suberitoides pada sel HELA
dibandingkan dengan kontrol negatif pelarut
DMSO
Ha = Ada pengaruh penambahan ekstrak spons
A.suberitoides pada sel HELA dibandingkan
dengan kontrol negatif pelarut DMSO
Pengambilan kesim-pulan jika harga Fhitung
> Ftabel maka Ho ditolak, sedangkan jika harga
Fhitung < Ftabel maka Ho diterima dengan derajad
kepercayaan 0,95 (α = 0,05). Jika ada perbedaan
bermakna, perhitungan dilanjutkan dengan uji
LSD.
Untuk mengetahui harga LC50 ditentukan
dengan menggunakan analisis persen probit pada
program SPSS Windows 16.0. Prinsip pengolahan
data pada program ini adalah mengkorelasi antara
persen kematian sel dengan konsentrasi ekstrak.
Pengamatan Kinetika Proliferasi Sel
Data yang diperoleh dari hasil pembacaan
ELISA reader berupa absorbansi masing-masing
sumuran dikonversikan dalam % kehidupan sel
(viabilitas) dengan rumus:
Berdasarkan data tersebut dibuat profil
hubungan antara persentase sel hidup dan waktu
inkubasi, kemudian dibuat persamaan regresi
linier. Slope dari persamaan ini menggambarkan
kinetika pertumbuhan sel. Data absorbansi dan
persentase sel hidup selanjutnya dilakukan analisis
varian satu arah (ANOVA) (α = 0,05) untuk
mengetahui adanya perbedaan yang signifikan
antar kelompok perlakuan pada setiap waktu
inkubasi, dimana hasil uji bermakna jika diperoleh
harga p ≤ 0.05. Jika terdapat perbedaan yang
nyata, dilanjutkan dengan uji Least Significant
Difference (LSD). Kedua uji tersebut dilakukan
pada taraf kepercayaan 95% dengan menggunakan
program SPSS Windows 16.0.
Pengamatan Apoptosis
Data apoptosis berupa data kualitatif yang
diperoleh dari hasil pengamatan morfologi sel
menggunakan mikroskop flouresens. Sel yang
hidup akan berflouresen hijau dengan acridine
orange dan sel yang mati akan berflouresens
orange dengan ethidium-bromide.
Perhitungan
sel
yang
mengalami
apoptosis dihitung dengan rumus:
% Apoptosis =
Jumlah sel apoptosis x 100%
∑ Total sel
HASIL
Uji Sitotoksisitas Ekstrak Spons Laut
A.suberitoides Terhadap Sel Kanker Serviks
(HeLa) dengan Metode MTT assay
Hasil pengukuran dengan menggunakan
ELISA reader menunjukkan bahwa persentase
kematian sel HELA terus meningkat sebanding
dengan kenaikan konsentrasi ekstrak yang
diberikan. Kematian sel terbesar terdapat pada
pemberian konsentrasi ekstrak 480 µg/ml yaitu
sebesar 97,649 % (Tabel 1).
4
Tabel 1. Persentase kematian sel HELA dengan perlakuan ekstrak spons laut A.suberitoides
Seri ekstrak
ke1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Konsentrasi
(µg/ml)
7,5
15
30
60
120
240
480
960
1440
1920
Persen Kematian Sel
(%)
17,940
18,056
18,866
21,219
26,852
34,298
58,102
96,836
97,338
90,664
Gambar 1. Hasil uji sitotoksisitas ekstrak A.suberitoides terhadap sel HELA dengan metode MTT assay
Sitotoksisitas Ekstrak Terhadap Sel HeLa
probit
8
7
y = 1.229x + 2.388
6
R = 0.782
2
5
4
3
2
1
0
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
log konsentrasi
Tabel 2. Persentase kematian sel HELA dengan perlakuan cisplatin
Konsentrasi Cisplatin (µg/mL)
2
4
8
16
Persen Kematian Sel Hela (%)
13,321
19,476
26,263
63,131
Tabel 3 Persentase kematian sel HeLa dengan perlakuan DMSO
Seri Ekstrak Ke-
Konsentrasi DMSO (%)
Persen Kematian Sel HeLa (Metode MTT)
10
9
8
0.960
0.72
0.480
23.187
15.548
5.324
Adapun persentase kematian dari sediaan
kontrol negatif DMSO adalah 5,324 % (Tabel 3)
dan pada kontrol positif obat kanker cisplatin
dimulai pada konsentrasi 2 µg/mL dengan
persentase kematian sebesar 13,321 %. Persentase
kematian sel HELA terus meningkat sampai
dengan konsentrasi tertinggi yaitu 16 µg/mL
sebesar 63,121 %, sejalan dengan kenaikan
konsentrasi cisplatin (Tabel 2). Nilai LC50 pada uji
sitotoksisitas ekstrak spons laut A.suberitoides
terhadap sel HELA adalah 133,968 µg/mL
(Gambar 1), sedangkan pada obat kanker cisplatin
sebesar 16.818 µg/mL (Gambar 2).
5
Efek Ekstrak Spons Laut A.suberitoides
Terhadap Proliferasi Sel Kanker Serviks
(HeLa)
Pengaruh Ekstrak Spons Laut A.suberitoides
Terhadap Apoptosis Sel Kanker Serviks
(HELA)
Hasil pengamatan dibawah mikroskop
flourosen memperlihatkan bahwa sel HELA yang
hidup akan berflouresen hijau dengan Acridine
orange dan sel yang mati berflouresen orange
dengan Ethidium bromide (Gambar 3). Hasil uji
apoptosis sel HELA, cisplatin menunjukkan
persentase apoptosis yang paling tinggi
dibandingkan dengan ekstrak, DMSO serta
kontrol (Gambar 4). Ekstrak spons laut
A.suberitoides mampu menginduksi apoptosis
pada sel kanker HELA dengan aktifitas sebesar
19.23 %.
Tabel 4. Persentase kehidupan sel HeLa dengan perlakuan ekstrak spons laut A.suberitoides pada uji
Doubling time
Persentase Sel HeLa Hidup (%)
Konsentrasi Ekstrak (µg/mL)
Waktu Inkubasi (jam)
24
48
72
133,967 µg/ml
52,551
38,306
36,613
66,983 µg/ml
55,486
52,502
51,980
33,491 µg/ml
62,579
55,250
52,541
Tabel 5. Persentase kehidupan sel HeLa dengan perlakuan cisplatin pada uji Doubling time
Jumlah Sel Hidup %
Konsentrasi sample (µg/mL)
Waktu Inkubasi (jam)
24
48
72
13,062
52,551
59,201
36,613
6,531
55,486
61,354
51,980
3,265
62,579
61,493
52,541
c
b
e
d
a
Gambar 3. Sel HeLa dengan perlakuan ekstrak spons A.suberitoides pada konsentrasi LC50 setelah
diwarnai dengan acridine orange-ethidium bromide (florescent microscope perbesaran 100 x), a)
sel mulai mengalami apoptosis dengan kondensasi kromatin, b) sel yang mengalami blebbing, c)
merupakan tahap akhir apoptosis d) sel yang mengalami nekrosis dan e) sel HeLa normal
6
% a p o p to s i s
45
40
35
30
25
20
15
10
5
0
38.869
16.650
0.922
0.000
kontrol
LC50 ekstrak (134
µg/mL)
LC50 cisplatin (134.062
µg/mL)
DMSO (0.670 %)
jenis perlakuan
Gambar 4. Perbandingan persentase apoptosis sel HeLa oleh perlakuan Kontrol, LC50 ekstrak, LC50
cisplatin dan DMSO
PEMBAHASAN
Hasil pengamatan dengan menggunakan mikroskop menunjukkan sel HELA yang hidup tampak
seperti berserabut berwarna gelap dan saling berdempet dengan sel lain yang berada disekitarnya,
ditunjukkan oleh panah berwarna kuning. Warna gelap dan berserabut yang nampak pada pengamatan
merupakan kristal formazon. Kristal-kristal formazon tersebut dapat menembus membran sel dan
terakumulasi di dalam sel sehat. Jumlah produk formazan secara langsung proposional dengan jumlah sel
hidup. Semakin banyak sel hidup maka semakin banyak sel yang aktif melakukan metabolisme sehingga
jumlah produk formazan yang terbentuk juga semakin banyak. Semakin banyak produk formazan yang
terakumulaasi ini menyebabakan intensitas warna ungu meningkat dalam plate.
SPSS Windows 16.0. LC50 digunakan sebagai parameter untuk mengevaluasi potensi
sitotoksisitas ekstrak spons laut A.suberitoides terhadap sel HELA. Untuk melakukan uji sitotoksisitas
terhadap ekstrak, NCI (National Cancer Institute) menetapkan suatu standar bahwa harga LC50 adalah ≤
20 µg/mL (Suffness, 1991). Karena harga LC50 dari ekstrak A.suberitoides diperoleh pada konsentrasi
133,968 µg/mL, maka dapat dikatakan bahwa ekstrak spons A.suberitoides tidak mempunyai aktivitas
sitotoksik terhadap sel kanker serviks (HELA) berdasarkan kriteria yang ditetapkan oleh NCI (National
Cancer Institut).
Berdasarkan hasil pengukuran nilai LC50 atas dapat dikatakan bahwa ekstrak spons A.
suberitoides bersifat toksik terhadap sel kanker HeLa. Senyawa alkaloid aaptamin yang terkandung dalan
spons A. suberitoides (Coutinho, 2002; Larghi, et al., 2008) diduga bertanggungjawab terhadap aktivitas
sitotoksisitas terhadap sel kanker HeLa.
Sebagai kontrol positif digunakan cisplatin (cisplatinum atau cis diamminedichloroplatinum (II))
yang merupakan obat kemoterapi kanker yang berbasis logam platinum. Cisplatin bekerja sebagai anti
kanker dengan cara menempelkan diri pada DNA (deoxyribonucleic acid) sel kanker dan mencegah
pertumbuhannya. Jika senyawa ini terlarut dalam air, ligan kloro pada cisplatin diganti satu persatu oleh
ligan air (aqua) melalui reaksi hidrolisis. Selanjutnya ikatan Pt-OH2 yang terdapat dalam senyawa
kompleks monoaquaplatina dan diaquaplatina yang terbentuk akan jauh lebih reaktif, sehingga kompleks
tersebut akan lebih mudah bereaksi dengan ligan donor beratom nitrogen pada basa DNA (Putra, 2008)
Cisplatin bekerja sangat efektif dalam mengobati kanker serviks (Rose, 2006) sehingga dapat
digunakan sebagai pembanding aktivitas ekstrak spons A. suberitoides dalam menghambat pertumbuhan
sel kanker serviks (HeLa). Penggunaan kontrol positif berguna untuk mengevaluasi keberhasilan uji
sitotoksisitas sebagai bukti terjadinya efek sitotoksik
Pada hasil penelitian, cisplatin dapat menyebabkan kematian sel HeLa yang dimulai pada
konsentrasi 2 µg/mL dengan persentase kematian sebesar 13,321 %. Persentase kematian sel HeLa terus
meningkat sampai dengan konsentrasi tertinggi yaitu 16 µg/mL sebesar 63,131 %, sejalan dengan
kenaikan konsentrasi cisplatin. Hasil uji One Way ANOVA (α = 0.05) adalah signifikan, menunjukkan
harga Fhitung
7
(Fhitung
=30.626
dan
Ftabel
adanya beda nyata antara kelompok perlakuan.
Hingga inkubasi 72 jam, persentase sel yang
hidup menurun. Hal ini menunjukkan bahwa
cisplatin mempunyai kemampuan menghambat
proliferasi sel HeLa dengan peningkatan
konsentrasi obat dan penambahan waktu inkubasi.
Nilai IC50 merupakan patokan untuk
melakukan uji pengamatan kinetika sel. Nilai IC50
dalam penelitian ini menunjukkan nilai
konsentrasi ekstrak spons A. suberitoides yang
menghasilkan hambatan pertumbuhan sel HeLa
sebesar 50 % dari populasi. Nilai tersebut juga
menunjukkan apakah ekstrak spons tersebut
bersifat antiproliferatif terhadap sel HeLa.
180.00
160.00
140.00
120.00
100.00
80.00
60.00
40.00
20.00
0.00
153.007
I C 5 0 (µ g /m L ) )
lebih
besar
daripada
harga
Ftabel = 3.48) berarti terdapat pengaruh
penambahan
cisplatin
pada
sel
HeLAadibandingkan dengan kontrol negatif
pelarut DMSO.
Untuk mengetahui perbedaan bermakna
dilanjutkan dengan analisis LSD (Least
Significant Difference). Dari hasil perhitungan
diperoleh nilai LSD sebesar 9.825 . karena nilai
LSD lebih besar daripada nilai LSD hitung, maka
terdapat perbedaan bermakna dari masing-masing
kelompok dengan metode MTT assay.
Efek Ekstrak Spons Laut A.suberitoides
Terhadap Proliferasi Sel Kanker Serviks
(HELA)
Uji doubling time dilakukan untuk
mengetahui pengaruh pemberian ekstrak spons
A.suberitoides terhadap proliferasi sel HeLa.
Konsentrasi yang digunakan adalah pada LC50
dan 2 konsentrasi dibawah LC50 yaitu 134, 67 dan
33,5 µg/ml dari hasil uji sitotoksisitas dengan
waktu inkubasi 24, 48, dan 72 jam. Uji ini
dilakukan dengan metode MTT, kemudian
dihitung prosentase sel yang hidup (viabel).
Pada tabel di atas tampak bahwa setelah
pemberian ekstrak dan penginkubasian selama 24
jam terjadi penurunan persentase sel yang hidup
pada berbagai konsentrasi ekstrak dengan IC50
sebesar 153 µg/ml. Akan tetapi hasil uji LSD (α
=0,05) menunjukkan tidak ada beda nyata antara
konsentrasi 134 dengan 67 µg/ml. Perbedaan
yang nyata terlihat antara konsentrasi 134 dengan
33,5 µg/ml serta 67 dengan 33,5 µg/ml. Hal ini
menunjukkan
bahwa
ekstrak
spons
A.
suberitoides telah berinteraksi dengan sel HeLa
untuk menghambat pertumbuhan sel terebut.
Uji doubling time juga dilakukan pada
kontrol positif untuk melihat pengaruh
antiproliferatif obat kanker cisplatin terhadap
pertumbuhan sel kanker HeLa. Konsentrasi yang
digunakan juga merupakan konsentrasi LC50 dan
2 konsentrasi dibawah LC50 yaitu 13,062; 6,531;
dan 3,2655 µg/ml dari hasil uji sitotoksisitas
dengan waktu inkubasi 24, 48, dan 72 jam.
Pemberian cisplatin pada sel HeLa pada uji
doubling time juga memberikan hasil yang
signifikan terhadap persentase kehidupan sel
HeLa selama periode inkubasi
Proses penghambatan pertumbuhan sel oleh
cisplatin terjadi selama periode inkubasi 48 jam
hingga 72 jam. hasil uji LSD menunjukkan
33.424
ekstrak spons A.suberitoides
cisplatin
Jenis Perlakuan
Gambar 5.
Perbandingan nilai IC50 ekstrak
dan cisplatin pada sel HeLa
Nilai IC50 ekstrak spons A. suberitoides
lebih tinggi dibandingkan nilai IC cisplatin. Hal
tersebut menunjukkan bahwa cisplatin memiliki
aktivitas yang lebih tinggi dalam menghambat
proliferasi sel HeLa. Menurut Kamuhabwa et al.
(2000), jika ekstrak memiliki nilai IC50 ≤ 100
µg/ml dapat dikatakan memiliki potensi
antiproliferasi. Sedangkan menurut Mans et al.
(2000) batas ambang yang ditetapkan untuk
bahan alam yang dapat dikembangkan sebagai
antikanker yaitu ≤ 50 µg/ml ( Mans et al., 2000).
Berdasarkan kedua acuan diatas, dapat dikatakan
bahwa ekstrak etanol spons A. suberitoides
dengan nilai IC50 sebesar 153,007 µg/ml belum
signifikan dalam menghambat proliferasi sel
HeLa sehingga perlu upaya fraksinasi dan isolasi
bahan bioaktifnya.
Beberapa penelitian sebelumnya tentang
sitotoksisitas ekstrak maupun yang berupa fraksi
8
spons dari genus Aaptos menunjukkan hasil yang
berbeda-beda. Menurut penelitian Shaari, et al.
(2008), ekstrak methanol spons jenis A. aaptos
mampu menghambat pertumbuhan sel HeLa
dengan nilai CD50 22,8 µg/ml. Penelitian tersebut
dilakukan terhadap ekstrak methanol A. aaptos
yang belum di fraksinasi seperti yang dilakukan
pada ekstrak etanol A. suberitoides pada
penelitian ini sehingga aktivitasnya dapat
dibandingkan. Ekstrak etanol A. suberitoides pada
penelitian ini dapat dikatakan kurang toksik jika
dibandingkan dengan ekstrak methanol A. aaptos
karena hanya memiliki nilai IC50 sebesar 153,007
µg/ml. Penelitian terbaru mengenai aktivitas
sitotoksisitas A. suberitoides yang dilakukan oleh
Tsukamoto (2010) diperoleh bahwa ekstrak etanol
A. suberitoides yang difraksinasi menjadi 3
senyawa
aaptamin,
yaitu
aaptamine,
isoaaptamine,
dan
demethylaaptamine
memberikan aktivitas sitotoksik yang signifikan
terhadap sel HeLa dengan nilai IC50 berturut-turut
sebesar 15; 3,1 dan 1,4 µg/ml. Spesies A.
suberitoides yang digunakan oleh Tsukamoto ini
dikoleksi dari perairan Sulawesi Utara, Indonesia
pada Desember 2006. Dimungkinkan bahwa jika
ekstrak spongs A. suberitoides yang dikoleksi dari
perairan Pantai Pasir Putih Situbondo yang
digunakan dalam penelitian ini di fraksinasi,dapat
memberikan hasil sitotoksisitas yang signifikan
terhadap sel kanker HeLa sehingga dapat dipakai
sebagai bahan alternative pengobatan kanker
serviks.
Perbedaan respon sel Hela terhadap berbagai
jenis spons genus Aaptos dari berbagai daerah
mungkin disebabkan karena perbedaan bahan
aktif yang terkandung dalam spons genus Aaptos
yang tentunya akan mempengaruhi mekanisme
kerjanya terhadap sel HeLa. Menurut Channel
(1998) bahan kimia yang dihasilkan dari asosiasi
antar mikroorganisme maupun antar inang dan
mikroorgtanisme laut dapat dipengaruhi oleh
kondisi habitat laut seperti faktor geografis dan
musim. Karena perbedaan kondisi habitat inilah,
bahan hasil alam laut memiliki golongan bahan
kimia yang beragam seperti terpenoid, polyketida,
peptida, asetogenin, alkaloid dengan berbagai
macam struktur dan beberapa komponen
kompleks yang merupakan gabungan hasil
biosintesis.
Belum diketahui senyawa manakah dari
A. suberitoides yang berperan sebagai
antiproliferasi sel HeLa. Namun, selain senyawa
aaptamin yang diduga berperan sebagai
antiproliferasi kanker, ternyata telah diketahui
pula bahwa dalam spesies spons A. suberitoides
terkandung senyawa indolamine-2,3-dioksigenase
(IDO) dimana senyawa ini sangat berperan
penting terhadap regulasi T-cell yang memediasi
respon pertahanan. Saat ini IDO banyak dipakai
sebagai obat kemoterapi tradisional yang efektif
untuk melawan sistem kanker (Dewi, 2004)
Pada grafik 4.8 di atas juga menunjukkan
bahwa IC50 cisplatin jauh lebih kecil
dibandingkan IC50 ekstrak. Nilai IC50 yang rendah
menunjukkan aktivitas penghambatan proliferasi
sel yang baik karena dengan ekstrak yang sangat
sedikit sudah dapat menghambat proliferasi sel
sebesar 50%. Hal ini disebabkan karena cisplatin
bekerja sebagai anti kanker dengan cara
menempel diri pada DNA (deoxyribonucleic acid)
sel kanker dan mencegah pertumbuhan sel
kanker. Oleh karena itu nilai IC50 nya lebih kecil
dibandingkan ekstrak karena cisplatin cenderung
menyembuhkan kanker melalui penghambatan
proliferasi sel kanker.
Pengaruh Ekstrak Spons Laut A.suberitoides
Terhadap Apoptosis Sel Kanker Serviks
(HELA)
Kematian sel HeLa akibat perlakuan ekstrak
spons A.suberitoides dapat diketahui juga melalui
uji apoptosis. Konsentrasi yang digunakan untuk
uji apoptosis adalah 134, 67, 33,5 µg/mL
(ekstrak) serta 13,062, 6,531 dan 3,2655 µg/mL
(cisplatin). Ketiga konsentrasi tersebut adalah
konsentrasi pada LC50 dan dua konsentrasi di
bawah LC50 dari uji sitotoksisitas dengan metode
MTT, sehingga pada saat pengamatan
memperoleh sel yang mati dan sel yang hidup
untuk dibandingkan perbedaanya.
Metode
yang
digunakan
adalah
doublestaining DNA dengan menggunakan
ethidium bromide-acridine orange. Kedua macam
zat warna ini digunakan secara bersamaan karena
dapat menghasilkan warna kontras, sehingga
mempermudah pengamatan dibawah mikroskop
fluorosen. Pengamatan terhadap morfologi sel
harus dilakukan dengan segera karena jika larutan
doublestaining terlalu lama berinteraksi dengan
sel, maka sel yang hidup akan mati. Hal ini
disebabkan karena etidium bromide bersifat
toksik, sehingga dalam penelitian hanya
digunakan konsentrasi yang sangat kecil 5 µL.
Ethidium bromide dalam konsentrasi kecil akan
dilawan oleh antibodi sel hidup.
Ethidium
bromide-acridine
orange
mampu menembus membran sel dan berinteraksi
9
dengan DNA sel. Hasil pengamatan di bawah
mikroskop fluorosen memperlihatkan bahwa sel
HeLa yang hidup akan berfluoresen hijau
(Gambar 4.8 a ) dengan acridine orange
sedangkan sel yang mati berfluoresen oranye
(Gambar 4.8 b ) dengan ethidium bromide.
Ethidium bromide hanya dapat menembus
membran sel mati karena terjadi penurunan
integritas membran sel mati sehingga tidak
permeabel terhadap senyawa yang masuk,
sedangkan acridine orange mengandung gugus
kation sehingga dapat berinteraksi dengan DNA
sel hidup yang bersifat anionik membentuk garam
terdisosiasi (Nurulita & Mahdalena, 2006 dalam
Meye, 2009).
Acridine orange dapat memasuki sel dan
mewarnai inti sel menjadi hijau. Ethidium
bromide hanya dapat memasuki sel yang
mengalami kerusakan membran dan mewarnai
inti sel menjadi merah. Pewarnaan dengan metode
double staining menggunakan acridine orange
dan ethidium bromide dapat membedakan sel
yang hidup, sel apoptosis, dan sel nekrosis. Sel
hidup akan tampak memiliki inti sel dengan
bentuk normal hijau. Sel yang mengalami
apoptosis akan memiliki inti sel berwarna orange
dengan
bentuk
inti
terkondensasi
dan
terfragmentasi. Sel yang mengalami nekrosis
akan tampak memiliki inti sel berwarna oranye
namun bentuk inti sel normal (Rible et al., 2005
dalam Nugrahaningsih, 2009).
Pada uji apoptosis ini diketahui bahwa
senyawa yang terkandung dalam ekstrak spons A.
suberitoides dapat memacu apoptosis pada sel
kanker HeLa. Pada penelitian ini diperoleh
persentase apoptosis yang disebabkan oleh
ekstrak, cisplatin, dan DMSO berturut-turut
16,65; 38,87; dan 0,92 %. Pada uji ANOVA (α =
0,05) dinyatakan terdapat perbedaan signifikan
antar setiap perlakuan. Jumlah apoptosis dengan
perlakuan ekstrak terhitung lebih kecil dari
cisplatin karena senyawa dalam cisplatin telah
terbukti menghambat proliferasi sel dengan cara
apoptosis. Sedangkan ekstrak masih mengandung
senyawa-senyawa yang dapat bekerja sinergis
membentuk apoptosis atau bahkan menghambat
apoptosis. Uji apoptosis yang digunakan dalam
penelitian ini belum dapat mendeteksi apoptosis
pada tahap yang lengkap (kondensasi kromatin,
pembentukan apoptotic bodies, dst.) sehingga
jumlah sel yang terdeteksi mengalami apoptosis
labih sedikit daripada jumlah apoptosis
sebenarnya. Selain itu, sel dalam satu sumuran
tidak berada dalam stadium apoptosis yang
bersamaan dan salah satu kekurangan dari metode
ini adalah ketidakmampuan mengenali apoptosis
pada sel yang berada pada fase G2 yang
mempuyai kandungan DNA rendah, maka
perhitungan sel yang apoptosis dapat menjadi
lebih rendah dari sebenarnya (Eisel et al., 2003).
KESIMPULAN
Kesimpulan dari penelitian ini adalah:
1.
bahwaekstraketanolsponsA.
suberitoidesbelumsignifikanuntukmenghambatper
tumbuhanselHeLa
(bersifatantiproliferatif)
dengannilai IC50 sebesar 153,007 µg/ml.
2.
EkstraketanolsponsA.
suberitoidesjugamampumenginduksi
apoptosis
padaselHeLadenganaktifitassebesar 16,65 %.
SARAN
1. Perlu dilakukan fraksinasi dan isolasi pada
ekstrak spons laut A.suberitoides
2. Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut dengan
uji in vivo untuk menambah informasi ilmiah
tentang efek toksisitas ekstrak spons laut
A.suberitoides terhadap hewan uji, sehingga
komponen kimiawi yang terkandung di
dalamnya dapat dijadikan sebagai salah satu
agen antikanker.
UCAPAN TERIMA KASIH
Pada
kesempatan
ini
penulis
mengucapkan terimakasih kepada Ibu Awik
Puji Dyah Nurhayati, S.Si, M.Si beserta Prof. Dr.
Drs. Sukardiman, Apt, MS selaku dosen
pembimbing yang bersedia meluangkan waktu
untuk bimbingan. Ibu Dra. Dian Saptarini, M.Sc,
Ibu Dra. Nurlita Abdulgani, M.Si beserta Ibu
Ir.Sri Nurhatika, MP sebagai Dosen Penguji dan
Ibu Dra. Dian Saptarini, M. Sc. selaku Ketua
Jurusan Biologi FMIPA ITS. Bapak M. Muryono,
M.Si selaku Koordinator Tugas Akhir Jurusan
Biologi FMIPA ITS. Ibunda dan ayahanda
tercinta, adikku tersayang serta seluruh sahabat
yang selalu memberikan motivasi, do’a dan
dukungan baik material maupun spiritual selama
ini.
KEPUSTAKAAN
Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J., Raff, M.,
Roberts, K., and Walter, P. 2002.
Molecular Biology of the Cell.Edisi ke4. Garland Science: New York.
Anggrianti,
Padmi.
2008.
UjiSitotoksikEkastrakEtanol
70%
10
BuahKemukus(Piper
cubeba
L.)TerhadapSelHeLa.FakultasFarmasi
UNMUH Surakarta
Anonim,
2003,
BahayaKanker
Rahim
BagiWanita,
http://situs.kesrepro.info/aging
/mar/2003/ag03.htm, diakses 2006.
Anonim,2003 a, it develops, http://www
.cancerbacup.org.
uk/Cancertype/Cervix/General/How.Diak
sesMaret2010
Anonim.2006.
Apoptosis
Extrinsic
and
Intrinsic
Pathways,http://www.upstate.com/featur
es/apop_pathway.asp.Diaksespadatanggal
3 April 2010
Anonim.2009.
HewanSpons,
Porifera.
http://kamuspengetahuan.blogspot.com/2
009/
03/hewan-sponsporifera.html.www.google.com.
Diaksespadatanggal 2 Februari 2010
Aoki, S., Dexin K., Hideaki S., Yoshihiro S.,
Toshiyuki S., Andi S., and Motomasa K.
2006. “ Aaptamin, a Spongean Alkaloid,
Activates p21 Promoter in a p53Independent Manner.”Biochemical and
Biophysical Research Communications
342 (2006)101-106
Astuti, Pujidkk.“Ujisitotoksiksenyawa alkaloid
darisponsPetrosiasp:
potensialpengembangansebagaiAntikanke
r”. MajalahFarmasi Indonesia, 16 (1),
58 – 62, 2005
Ben Best. 2006. Cancer Death Causes &
Prevention.
<Http://benzo/Hasil%20Penelusuran%20
Gambar%20Google%20untuk%20httpw
ww_benbest_comhealthBenzoPyr_gif_fil
es/cancer.htm>
Badisa,,R.B. et.al. 2006. “ Selective Anticancer
Activity of Pure Licamichauxiioic-B
Acid
in
Cultured
Cell
Lines”.Pharmaceutical Biology.Vol. 44,
No. 2, Pages 141-145
Canavan, T. P. danDoshi, N. R.. 2000. Cervical
Cancer. <http://www.aafp.org>diakses
Mei 2010.
Clarke, A., 1992. “ Is there a latitudinal diversity
cline in the sea?”. Trends Ecol.
Evol.,Vol. 7, pp. 286-287.
Cotran RS, et al. 1999.Robbins patologic basis
th
of disease.6 ed. WB Saunders Company.
Tokyo-London-Sydney: 18-25
Coutinho, A., Chanas, B., Souza, T. Frugrulhetti,
I., danEpifanio. 2002. “ Anti HSV-1
Alkaloids from a Feeding Deterrent
Marine Spongse of The Genus Aaptos “.
Heterocycles, Vol. 57. 2002. Pp. 12651272
Dheta,
ErmelindaMeye.
2009.
SitotoksisitasdanEfekEkstrakEtanolKu
litBuahJambuMente
(Anacardiumoccidentale
L.)
TerhadapSelMieloma. FakultasBiologi
UGM. Yogyakarta
Faried,
Ahmad.
2007.
BagaimanaSelKankerBerjalan.
Graduate School of Medicine, Gunma
University: Japan
Freshney, R.I. 1986. Animal Cell Culture, A
Practical Approach 1st Ed.IRL Press;
Washington D.C.
Gewies,
Andreas.
2003.
ApoReview
Introduction to Apoptosis
Gilbertson, Shai White, David T., and Christina
V.2009.“ The Role of Protein Synthesis
in Cell Cycling and Cancer”. Molecular
Oncology XXX (2009) 1-7
Goodwin, E.C., DiMaio, D. 2000. “Repression of
Human Papillomavirus Oncogenes in
Hela Cervical Carcinoma Cells Causes
the Orderly Reactivation of Dormant
Tumor
Suppressor
Pathways”.
Biochemistry, Vol.97, no.23.
Goepel, JR. 1996.Responses to Celluler
Injury.In : Underwood JCE. General and
nd
systematic pathology. 2 ed. Churchill
livingstone. NewYork-London-Madrid;
117-119
Hanani, E., Mun’im, A. danSekarini. 2005.
“IdentifikasiSenyawaAntioksidandalamS
ponsCallyspongiaspdariKepulauanSeribu
”. MajalahIlmuKefarmasian, Vol. II,
No.3, Desember 2005, 127 - 133
Heti, Dany.2008. UjiSitotoksikEkstrakEtanol
70% HerbaSisik Naga (Drymoglossum
piloselloides Presl.)TerhadapSel T47D.
FakultasFarmasiUniversitasMuhamadiya
h Surakarta: Surakarta
Jasin, Maskuri. 1992. ZoologiInvertebrata.
SinarWijaya: Surabaya
JuwonodanJuniarto.
2003.
Biologi
Sel.
PenerbitBukuKedokteran EGC: Jakarta
Kamuhabwa, A., Nshimo, C. & de Witte, P.
2000.“Cytotoxicity of Some Medicinal
Plant Extracts Used in Tanzanian
11
Tradisional
Medicine”.J.
Ethnopharmacol.70: 143-149
Kresno
SB.
2001.
IlmuOnkologiDasar.
Bagianpatologiklinik FKUI; 13-15
Labwork Study Guideand Lecture Notes. 2000.
Henrietta
Lacks.www.micro.msb.le.ac.uk/Labwork
/Lack 1.htm.Diaksespadatanggal 3 April
2010
Larghi, E., Obrist, B., dan Kaufman, T. 2008.“A
Formal Total Synthesis of The Marine
Alkaloid
aaptamine”.
Tetrahedron.Volume 64, Issue 22
Makarchaenko,
A.
danUtkina,
N.
2004.Antiradical Activity of Alkaloids
from Marine Sponges.International
Conference on Natural Products and
Physiologically
Active
Substances
(ICNPAS-2004) September 12-17,
2004, Novosibirsk, Russia
Mayer, A., Gustafson, K. 2008. “Marine
Pharmacology in 2005–2006: Antitumour
and Cytotoxic Compounds”. European
Journal Of Cancer 44 ( 2008 ) 2357–
2387
Meiyanto, EdydanEndah P. Septisetyani. 2005.
“EfekAntiproliferatifdan
Apoptosis
FraksiFenolikEkstrakEtanolikDaunGynur
aprocumbens(Lour.)
Merr.TerhadapSelHeLa”.
Artocarpus,
(5) 2: 74-80
Murray, Robert K, dkk. 2003. Biokimia Harper.
Penerbit Buku Kedokteran EGC: Jakarta
Neal, Michael J. 2006. Medical Pharmacology
At A Glance Fifth Edition. Erlangga:
Jakarta
Nurlaila, Ika dan Hadi, Miftachul. 2009. Kanker:
Pertumbuhan, TerapidanNanomedis.
Biophysics Group, Physics Research
Centre LIPI. Nanotech Indonesia
Nurhayati, AwikPujiDyah. 2009. Skrining,
Isolasi,
danEvaluasiIn
Vivo
AntikankerdariSponsLaut. LPPM ITS
Prayitno, Adi, dkk. 2005. ” Ekspresi Protein p53,
Rb, danc-mycpadaKankerServiks Uteri
denganPengecatanImmunohistokimia”.
Volume 6, Nomor 3 Halaman: 157-159
Sanif R. 2001. SinopsisOnkologiGinekologi.
Sub
bagianOnkologiGinekologiBagianObstetr
idanGinekologi
FKUI/RSUPN
dr.
CiptoMangunkusumo. Jakarta; 45-63
Shaari
,Khozirah,
et
al.
2008.“
CytotoxicAaptamines from Malaysian
Aaptosaaptos”.
Mar
Drugs.2009
March; 7(1): 1–8.
Sjamsuddin,
S.,
2001.“PencegahandanDeteksiDiniKanker
Serviks”,
CerminDuniaKedokteran.133: 8-13.
Sukardiman, Wiwied E., dan Pharmasinta P.
H.2006. “Aktivitas Antikanker dan
Induksi Apoptosis Fraksi Kloroform
Daun Pepaya (Carica papaya L) terhadap
Kultur Sel Kanker Mieloma”.Media
Kedokteran Hewan Vol. 22, No. 2, Mei
2006
Sukardiman, Abdul Rahman, WiwiedEkasari,
danSismindari. 2005. “ Induksi Apoptosis
SenyawaAndrografolidadariSambiloto
(AndrographispaniculataNees)
TerhadapKulturSelKanker”.
Media
KedokteranHewanVol. 21, No. 3
Suparno. 2005. Kajian Bioaktif Spons Laut
(Porifera:
Demospongiae)
Suatu
Peluang
Alternatif
Pemanfaatan
Ekosistem Karang Indonesia Dalam
Bidang Farmasi. IPB: Bogor
Suryati E, Parenrengi A, danRosmiati. 2000. “
Penapisan
Serta
AnalisisKandunganBioaktif
Sponge
Clathriasp.
yang
efektifsebagaiAntibiofoulingpadateritif
(Balanusamphitrit)”.JurnalPenelitianPe
rikanan Indonesia Vol.V No. 3 Tahun
1999.
Syaifudin, Mukh. 2007. “ GenPenekan Tumor
p53KankerdanRadiasiPengion”.
BuletinAlara, Volume 8 Nomor 3, April
2007,119 – 128
Tadjudin,
M.K.
2006.Apoptosis
PadaGliomaOtak.Simposium:
Apoptosis Charming to Death FK UI
Tsukamoto Sachiko; Yamanokuchi Rumi;
Yoshitomi Makiko; Sato Kohei; Ikeda
Tsuyoshi; Rotinsulu Henki; Mangindaan
Remy E P; de Voogd Nicole J; van Soest
R W M; Yokosawa Hideyoshi. 2010.
“Aaptamine, an Alkaloid From The
Sponge Aaptos suberitoides , Fungtions
as a Proteasome Inhibitor”. Bioorganic
Medicinal Chemistry Letters 20 , 11 :
3341-3
Van Soest, R.M.W. 1989. “ The Indonesian
Sponge Fauna: Status Report “.
12
Netherland
Journal
of
Sea
Research.Volume 23 issue 2: 223-230
Zakaria, Fransiska R. 2001. ” Pangan dan
Pencegahan Kanker”. Jurnal Teknologi
dan Industri Pangan.Vol. XII, No. 2 Th.
2001
Widodo, Nanang. 2007. Isolasi dan
Karakterisasi Senyawa Alkaloid yang
Terkandung dalam Jamur Tiram Putih
(Pleurotus ostreotus). Jurusan Kimia
FMIPA Universitas Negeri Semarang.
Semarang
Widyastuti, Shanti. 2008. Uji Toksisitas
Ekstrak Daun Iprih (Ficus glabella
Blume) terhadap Artemia salina Leach
dan Profil Kromatografi Lapis Tipis.
Jurusan
Farmasi
Universitas
Muhamadiyah Surakarta
Yuwono,
Triwibowo.
2005.
Biologi
Molekular. Erlangga, Jakarta
Zakaria, Fransiska R. 2001. ”Pangan dan
Pencegahan Kanker”. Jurnal Teknologi
dan Industri Pangan
13
14
15