PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI PENGARUH EKSTRAK ETANOLIK BUAH LABU AIR (Lagenaria siceraria (Mol.) Standley) SEBAGAI IMUNOMODULATOR MELALUI PENGAMATAN PROLIFERASI LIMFOSIT PADA TIKUS JANTAN Sprague Dawley YANG DIPEJANI DOKSORUBISIN SKRIPSI Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.) Program Studi Farmasi Oleh: Joseph Singgih Dwilaksono 098114077 FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA 2013 PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI PENGARUH EKSTRAK ETANOLIK BUAH LABU AIR (Lagenaria siceraria (Mol.) Standley) SEBAGAI IMUNOMODULATOR MELALUI PENGAMATAN PROLIFERASI LIMFOSIT PADA TIKUS JANTAN Sprague Dawley YANG DIPEJANI DOKSORUBISIN SKRIPSI Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.) Program Studi Farmasi Oleh: Joseph Singgih Dwilaksono 098114077 FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA 2013 i PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI ii PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI iii PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI iv PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI v PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI HALAMAN PERSEMBAHAN “Tuhan merangkai hidup, mungkin tidak seindah yang kau bayangkan, tetapi tidak sesulit yang kita khawatirkan” Sebuah karya kecil kupersembahkan kepada : TUHAN YESUS KRISTUS sebagai wujud rasa syukurku. Ibu Supriyati dan Bapak Margito , wujud sayang dan cintaku, Kakakku Rosalia Prita dan Bayu Adikku, sebagai tanda sayangku, I Dewa Ayu Dwi Komaladewi yang selalu menghadirkan senyuman dan semangat dalam hidupku. Semua teman Farmasi USD 2009 dan almamater tersayang vi PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI PRAKATA Puji syukur dan terima kasih penulis panjatkan kepada Sang Maha Kasih Tuhan Yesus Kristus, atas segala berkat dan anugerah-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi yang berjudul “Pengaruh Ekstrak Etanolik Buah Labu Air (Lagenaria siceraria (Mol.) Standley) sebagai Imunomodulator Melalui Pengamatan Proliferasi Limfosit pada Tikus Jantan Sparague Dawley yang Dipejani Doksorubisin”. Skripsi ini disusun untuk memenuhi syarat memperoleh gelar Sarjana Farmasi di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. Penulis mengucapkan terima kasih kepada semua pihak yang telah ikut membantu, memberikan dukungan, bimbingan, kritik, dan saran selama proses penyelesaian skripsi ini. Dalam kesempatan ini, penulis hendak mengucapkan terima kasih kepada : 1. Bapak Ipang Djunarko, M.Sc., Apt. selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma. 2. Bapak Prof. Dr. C.J. Soegihardjo, Apt. selaku Dosen Pembimbing dan Dosen Penguji yang telah banyak memberi bimbingan, arahan, dan masukan dalam penyusunan skripsi ini sehingga dapat menjadi lebih baik. 3. Ibu Agustina Setiawati, S. Farm., Apt., M.Sc. selaku Dosen Pembimbing dan Dosen Penguji yang telah banyak memberi bimbingan, arahan, dan masukan dalam penyusunan skripsi ini sehingga dapat menjadi lebih baik. 4. Ibu Yunita Linawati, M.Sc. Apt selaku Dosen Penguji yang telah memberikan masukan yang berarti terhadap skripsi ini. vii PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 5. Ibu Phebe Hendra, M. Si., Ph. D., Apt. selaku Dosen Penguji yang telah memberikan masukan yang berarti terhadap skripsi ini. 6. Pimpinan dan staff LPPT UGM : Ibu Istini yang telah mengijinkan penulis untuk melakukan penelitian serta membantu selama masa penelitian. 7. Bapak Heru, Bapak Parjiman, Bapak Kayat, Bapak Wagiran selaku laboran laboratorium Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Kampus III yang telah banyak memberikan bantuan selama proses pelaksanaan penelitian. 8. Rekan-rekan tim skripsi, Vincentia Adelina H., Maria Larizza, Reza Eka Putra atas segala kerjasama, bantuan dan dukungan dalam pengerjaan skripsi. 9. Sahabat-sahabatku Jati Panantya, Felix Pradana A. N., Johanes Baptista Yunio R., atas motivasi, kebersamaan dan persahabatannya. 10. Seluruh dosen dan teman-teman FSM B 09, FST B 09 serta seluruh angkatan 2009 Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma. 11. Semua pihak yang penulis tidak dapat menyebutkan satu-persatu yang telah ikut membantu selama penyusunan skripsi ini. Penulis menyadari bahwa skripsi ini jauh dari sempurna, oleh karena itu, segala kritik dan saran yang membangun sangat penulis harapkan demi sempurnanya skripsi ini. Semoga skripsi ini dapat bermanfaat dan memberi informasi bagi pembaca. Penulis viii PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI DAFTAR ISI Halaman HALAMAN JUDUL .................................................................................. i HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ....................................... ii HALAMAN PENGESAHAN .................................................................. iii PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ................................................. iv LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIAKSI KARYA ILMIAH UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIS ................................. v HALAMAN PERSEMBAHAN .............................................................. vi PRAKATA .............................................................................................. vii DAFTAR ISI ............................................................................................ ix DAFTAR TABEL .................................................................................. xiii DAFTAR GAMBAR ............................................................................. xiv DAFTAR LAMPIRAN ........................................................................... xv INTISARI ............................................................................................... xvi ABSTRACT ............................................................................................ xvii BAB I. PENGANTAR .............................................................................. 1 A. Latar Belakang .................................................................................... 1 1. Perumusan masalah ....................................................................... 3 2. Keaslian penelitian ........................................................................ 3 3. Manfat penelitian ........................................................................... 4 B. Tujuan Penelitian ................................................................................. 4 1. Tujuan umum ................................................................................ 4 2. Tujuan khusus ................................................................................ 4 ix PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI BAB II. PENELAAHAN PUSTAKA ...................................................... 5 A. Kanker ................................................................................................. 5 B. Doksorubisin ....................................................................................... 6 C. Kemoterapi dan Kemoterapi Kombinasi ............................................. 7 D. Imunomodulator .................................................................................. 9 E. Limfosit ............................................................................................. 10 F. Labu Air ............................................................................................ 13 G. Landasan Teori .................................................................................. 15 H. Hipotesis ............................................................................................ 15 BAB III. METODE PENELITIAN ........................................................ 16 A. Jenis dan Rancangan Penelitian ........................................................ 16 B. Variabel dan Definisi Operasional .................................................... 16 1. Variabel penelitan ........................................................................ 16 2. Definisi operasional ..................................................................... 17 C. Bahan Penelitian ................................................................................ 17 1. Bahan utama ................................................................................ 17 2. Hewan uji .................................................................................... 17 3. Bahan uji jumlah sel limfosit ........................................................ 17 D. Alat Penelitian ................................................................................... 18 1. Alat pembuatan serbuk buah L. siceraria ................................... 18 2. Alat untuk ekstraksi bahan .......................................................... 18 3. Alat untuk perlakuan hewan uji ................................................... 18 4. Alat untuk penetapan jumlah limfosit ......................................... 18 x PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI E. Tata Cara Penelitian .......................................................................... 19 1. Determinasi buah L. siceraria ..................................................... 19 2. Penetapan kadar air simplisia serbuk kering buah L. siceraria .... 19 3. Pembuatan ekstrak etanol buah L. siceraria ................................ 19 4. Pembuatan sediaan ekstrak etanol buah L. siceraria 15% ........... 20 5. Penyiapan dan perlakuan hewan uji ............................................. 20 6. Isolasi organ limpa tikus ............................................................... 21 7. Pengujian jumlah limfosit ............................................................ 21 8. Perhitungan statistik .................................................................... 22 BAB IV. HASIL DAN PEMBAHASAN ............................................... 23 A. Penyiapan Bahan Uji .......................................................................... 23 1. Determinasi tanaman ................................................................... 23 2. Penetapan kadar air serbuk kering buah L. siceraria .................. 24 3. Pembuatan ekstrak etanol buah L. siceraria ............................... 25 4. Pembuatan sediaan ekstrak etanol buah L. siceraria .................. 26 B. Perlakuan Ekstrak Etanol Buah Lagenaria siceraira dan Doksorubisin pada Hewan Uji ........................................................... 27 C. Pengujian Proliferasi Limfosit ............................................................ 28 D. Hasil Uji Efek Imunomodulator Ekstrak Etanol Buah L. siceraria dengan Kajian Proliferasi Limfosit .................................................... 30 BAB V. KESIMPULAN DAN SARAN ................................................. 35 A. Kesimpulan ......................................................................................... 35 B. Saran ................................................................................................... 35 xi PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI DAFTAR PUSTAKA ............................................................................. 36 LAMPIRAN ............................................................................................ 41 BIOGRAFI PENULIS ............................................................................ 48 xii PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI DAFTAR TABEL Halaman Tabel I. Perlakuan Terhadap Hewan Uji ............................................. 20 Tabel II. Purata OD + SD Proliferasi Limfosit Praperlakuan Pemberian Ekstrak Etanol Buah Lagenaria siceraria ........... 30 Tabel III. Hasil Analisis Uji Post-hoc Scheffe Proliferasi Limfosit Setelah Praperlakuan Pemberian Ekstrak Etanol Buah Lagenaria siceraria ................................................................ 31 xiii PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI DAFTAR GAMBAR Halaman Gambar 1. Struktur Doksorubisin .............................................................. 6 Gambar 2. Buah Labu Air ........................................................................ 14 Gambar 3. Diagram Batang Purata OD + SD Proliferasi Limfosit Praperlakuan Pemberian Ekstrak Etanol Buah Lagenaria siceraria ................................................................................. 31 xiv PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI DAFTAR LAMPIRAN Lampiran 1. Foto Ekstrak Buah L. siceraria dalam CMC Na 1% ............. 41 Lampiran 2. Foto Buah L. siceraria .......................................................... 41 Lampiran 3. Komposisi Media Tumbuh Limfosit ..................................... 42 Lampiran 4. Data Orientasi Proliferasi Limfosit tiap Kelompok Kontrol . 43 Lampiran 5. Data Rasio Proliferasi Limfosit Tahap Pengujian ................. 43 Lampiran 6. Analisis Statistik Proliferasi Limfosit Pengaruh Ekstrak Etanol Buah Labu Air (Lagenaria siceraria) pada Berbagai Variasi Dosis Terhadap Imunosupresan Doksorubisin ......................................................................... 44 Lampiran 7. Surat Ethical Clearence Penelitian ....................................... 47 xv PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI INTISARI Doksorubisin merupakan salah satu obat sitotoksik yang digunakan sebagai agen kemoterapi. Doksorubisin dapat menimbulkan efek merugikan yaitu supresi sumsum tulang belakang, sitotoksik pada sel hematopoietic sehingga dapat menurunkan jumlah sel limfosit yang merupakan sel penting dalam pertahanan imunitas tubuh. Oleh karena itu perlu dikembangkan agen ko-kemoterapi untuk mengurangi efek merugikan doksorubisin. Salah satu tanaman yang berpotensi sebagai ko-kemoterapi adalah buah Lagenaria siceraria yang bersifat sebagai imunomodulator. Tujuan penelitian adalah memperoleh informasi mengenai pengaruh pemberian ekstrak etanolik buah Lagenaria siceraria terhadap proliferasi sel limfosit tikus galur Sprague Dawley yang dipejani doksorubisin. Sebanyak 25 ekor tikus Sprague Dawley dibagi menjadi 5 kelompok : Kelompok I sebagai kelompok kontrol pelarut. Kelompok II sebagai kelompok kontrol doksorubisin. Kelompok III diberikan doksorubisin dan ekstrak buah Lagenaria siceraria dosis 1000 mg/kg BB secara p.o. Kelompok IV diberikan doksorubisin dan ekstrak buah Lagenaria siceraria dosis 750 mg/kg BB secara p.o. Kelompok V diberikan doksorubisin dan ekstrak buah Lagenaria siceraria dosis 500 mg/kg BB secara p.o. Perlakuan dilakukan selama 15 hari terusmenerus kemudian diamati proliferasi limfosit. Data dianalisis dengan uji one way ANOVA taraf kepercayaan 95% yang dilanjutkan dengan uji Scheffe. Hasil penelitian menunjukkan bahwa pemberian ekstrak etanolik buah Lagenaria siceraria berpengaruh terhadap proliferasi limfosit pada tikus galur Sprague Dawley yang dipejani doksorubisin. Dosis pemberian ekstrak etanolik buah L. sicearia yang paling efektif untuk meningkatkan proliferasi limfosit yaitu 500 mg/KgBB. Kata kunci : Lagenaria siceraria, doksorubisin, imunomodulator, proliferasi limfosit xvi PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI ABSTRACT Doxorubicin is a cytotoxic drug that is used as a chemotherapeutic agent. Doxorubicin has adverse effects such as suppression of bone marrow, cytotoxic to hematopoietic cells that could reduce the number of lymphocytes that are important cells in the immune defense. Therefore, it is necessary to develop cochemotherapy agent to reduce adverse effects of doxorubicin, one of which is Lagenaria siceraria fruit’s which can be as immunomodulators. The aim of this research was to obtain information of the effect of ethanolic extract of Lagenaria siceraria fruit’s on lymphocytes proliferation on Sprague Dawley rats induced doksorubisin. A total of 25 Sprague-Dawley rats were divided into 5 groups: Group I as a negative control group was given CMC Na 1%. Group II as a doxorubicin control group was given doxorubicin 4,5 mg/kg BW. Group III was given doxorubicin 4,5 mg/Kg BW + 1000 mg/Kg BW ethanolic extract of Lagenaria siceraria fruit’s. Group IV was given doxorubicin 4,5 mg/Kg BW + 750 mg/Kg BW ethanolic extract of Lagenaria siceraria fruit’s. Group V was given doxorubicin 4,5 mg/Kg BW + 500 mg/Kg BW ethanolic extract of Lagenaria siceraria fruit’s. Treatment was given for 15 days continuously then observed lymphocyte proliferation. The data were analyzed by one-way ANOVA test with confidence level of 95%, followed by Scheffe's test. The results showed that the ethanolic extract of Lagenaria siceraria fruit’s has an effect on lymphocyte proliferation in Sprague-Dawley rats induced doksorubisin with effective dose 500 mg/Kg BW to increase lymphocyte proliferation. Key words : Lagenaria siceraria, doxorubicin, immunomodulator, lymphocyte proliferation. xvii PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI BAB I PENGANTAR A. Latar Belakang Kanker merupakan suatu penyakit yang disebabkan oleh pertumbuhan sel-sel jaringan secara cepat dan terus membelah diri, selanjutnya menyebar ke jaringan sekitarnya (Mangan, 2009). Penyakit ini menjadi menjadi berbahaya karena pertumbuhan yang tidak terkontrol sehingga membuat jaringan disekitarnya tersebut rusak (Maria, 2008). Hal ini menyebabkan kanker dikenal sebagai penyakit yang membahayakan, sehingga perlu mendapat perhatian khusus dalam pencegahan maupun pengobatannya. Terapi pengobatan kanker yang biasa dilakukan selama ini, yaitu dengan cara pembedahan, radioterapi dan kemoterapi (sitostatika). Salah satu terapi yang sering digunakan untuk pengobatan kanker adalah kemoterapi. Kemoterapi merupakan suatu bentuk terapi kanker dengan menggunakan obat-obat sitotoksik (Gruendemann dan Fernsebner, 2005). Banyak pilihan penggunaan obat sitotoksik untuk kemoterapi. Doksorubisin merupakan salah satu obat sitotoksik yang sering digunakan sebagai agen kemoterapi dalam pengobatan kanker. Saat ini penggunaan doksorubisin mulai dibatasi karena menimbulkan efek yang merugikan. Menurut Zhang, Li, Wu, dan Gao, (2005), doksorubisin dapat menyebabkan supresi pada jumlah sel darah putih. Rendahnya sel darah putih dapat menyebabkan penurunan sistem imun tubuh, hal ini disebabkan karena salah satu dari komponen penyusun sel darah putih, yaitu limfosit yang berperan dalam sistem pertahanan imun tubuh jumlahnya juga rendah. Limfosit dapat berikatan 1 PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 2 dengan antigen dan menghasilkan respon imun berupa pengaktifan sel limfosit tersebut untuk berproliferasi (Ronald dan Richard, 2004). Alternatif baru yang dapat digunakan untuk mengatasi efek merugikan doksorubisin tersebut yaitu penggunaan ko-kemoterapi dalam terapi pengobatan kanker. Ko-kemoterapi merupakan kombinasi terapi kanker menggunakan senyawa kemoprevensi yang bersifat tidak toksik dikombinasikan dengan agen kemoterapi (Jenie dan Meiyanto, 2009). Dalam penelitian ini, ko-kemoterapi bertujuan untuk mengurangi efek merugikan dari doksorubisin, sehingga tingkat imunitas tubuh pasien yang sedang menjalani kemoterapi tetap baik. Penelitian ini menggunakan ekstrak etanol buah labu air (L. siceraria) sebagai agen ko-kemoterapi dari doksorubisin. Pemilihan buah labu air (L. siceraria) sebagai agen ko-kemoterapi ini didasarkan bahwa kandungan dari buah ini mempunyai aktivitas sebagai imunomodulator (Gangwal, Panmar, Gupta, Rana dan Sheth, 2008). Imunomodulator merupakan suatu senyawa yang dapat memodulasi sistem imun dengan cara merangsang (imunostimulan) atau sebaliknya dengan cara menekan sistem imun (imunosupresan). Penelitian ini meneliti aktivitas imunomodulator dari buah L. siceraria dengan mekanisme imunostimulan yang dilihat dari proliferasi limfosit setelah dipejani doksorubisin. Proliferasi limfosit merupakan penanda adanya fase aktivasi dari respon imun tubuh. Proliferasi limfosit ini ditunjukkan dengan terjadinya peningkatan produksi limfoblas yang kemudian akan menjadi limfosit (Khasanah, 2009). Penelitian ini menggunakan alat ELISA reader untuk PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 3 mengetahui proliferasi limfosit yang digunakan sebagai parameter aktivitas imunomodulatornya. 1. Perumusan masalah a. Apakah ekstrak etanol buah L. siceraria berpengaruh terhadap proliferasi limfosit pada tikus jantan galur Sprague Dawley yang dipejani doksorubisin? b. Berapakah dosis paling efektif dari ekstrak etanol buah L. siceraria yang memberikan pengaruh terhadap proliferasi limfosit pada tikus jantan galur Sprague Dawley yang dipejani doksorubisin? 2. Keaslian penelitian Penelitian yang mirip adalah penelitian yang dilakukan oleh Deshpande, Choudhari, Mishra, Meghre, Wadodkar dan Dorle (2008), dengan judul “Efek Menguntungkan Buah Lagenaria siceraria ((Mol.) Standley) pada Hewan Uji”. Perbedaan penelitian ini terletak pada larutan pengekstrak buah dan penginduksi efek imunosupresan yang digunakan. Penelitian oleh Deshpande dkk. (2008) menggunakan metanol sebagai larutan pengekstrak dan penginduksi efek imunosupresan yang digunakan adalah pyrogallol, sedangkan penelitian ini menggunakan etanol sebagai larutan pengekstrak dan penginduksi efek imunosupresan yang digunakan adalah doksorubisin. PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 4 3. Manfaat penelitian a. Manfaat praktis, memberikan informasi kepada masyarakat tentang pengaruh ekstrak etanol buah L. siceraria sebagai agen ko-kemoterapi dalam pengobatan kanker. b. Manfaat teoritis, hasil penelitian ini diharapkan dapat menambah informasi dalam bidang kefarmasian tentang pengujian ekstrak etanol buah L. siceraria sebagai sebagai agen ko-kemoterapi dalam pengobatan kanker. B. Tujuan Penelitian 1. Tujuan umum Tujuan umum penelitian ini adalah untuk menemukan alternatif agen kokemoterapi yang aman digunakan dalam terapi kanker. 2. Tujuan khusus a. Mengetahui pengaruh pemberian ekstrak etanol buah L. siceraria terhadap proliferasi sel limfosit pada tikus galur Sprague Dawley yang dipejani doksorubisin. b. Mengetahui dosis paling efektif ekstrak etanol buah L. siceraria yang memberikan pengaruh terhadap proliferasi limfosit pada tikus jantan galur Sprague Dawley yang dipejani doksorubisin. PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI BAB II PENELAAHAN PUSTAKA A. Kanker Kanker adalah suatu penyakit yang ditandai dengan adanya sel tubuh yang tumbuh secara tidak terkendali sehingga menyerang jaringan di sekitarnya. Penyebab kanker tidak dapat dirumuskan secara pasti, karena biasanya penyebab kanker merupakan gabungan dari berbagai faktor. Beberapa faktor risiko pemicu kanker adalah faktor genetis (keturunan) dan faktor lingkungan. Sebagian besar pemicu kanker pada manusia merupakan hasil dari interaksi antara faktor lingkungan hidup dan lingkungan kerja. Contoh penyebab kanker adalah : 1) Karsinogen kimia, seperti nikotin dan tar dari rokok, zat pengawet, pewarna makanan, nitrosamine, asbes, merkuri dan alkohol 2) Karsinogen fisika, seperti sinar X, sinar ultraviolet, dan radiasi dari bom atom, 3) Karsinogen biologi, seperti infeksi virus (papilloma dan herpes yang merupakan salah satu faktor risiko kanker serviks) dan jamur (misalnya jamur Aspergillus flavus yang merupakan salah satu penyebab kanker hati) (Wijayakusuma, 2008). Sel-sel kanker tumbuh melewati dinding pembuluh darah dan limfe, kemudian terlepas dan memaksa masuk ke tempat-tempat lain dalam tubuh dan sel-sel tersebut dapat bersarang dan tumbuh. Sel kanker tumbuh dan masuk ke dalam jaringan sehat di sekitarnya dan menghancurkannya, menyebar lewat pembuluh limfe dan darah ke tempat-tempat lain (Jong, 2004). 5 PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 6 Proses terjadinya kanker berlangsung secara bertahap dan dalam waktu yang cukup lama. Sel-sel kanker dapat timbul di setiap tempat pada tubuh, pada setiap waktu. Proses terjadinya kanker ini disebabkan oleh beberapa faktor, antara lain faktor lingkungan, kimia, fisika, radiasi, ionisasi, dan virus. Penyebab lain datang dari dalam tubuh (faktor endogen) misalnya karena terganggu sistem imunologi, genetik, hormon, dan asam glutamat (Haryanto, 2009). Salah satu sifat yang dimiliki oleh sel kanker adalah kemampuan untuk metastasis. Metastasis merupakan proses invasi tumor pada sistem limfatik, pembuluh darah, atau rongga tubuh yang diikuti oleh transportasi dan pertumbuhan massa sel tumor sekunder yang tidak berhubungan dengan tumor primer (Robbins dan Cotran, 2008). B. Doksorubisin Gambar 1. Struktur Doksorubisin (Long, Hai dan Xian, 2005). Doksorubisin (Gambar 1) merupakan salah satu obat golongan antibiotik antrasiklin yang digunakan untuk kemoterapi. Menurut Stepankova, Malina, Kasparkova, Brabec (2010), senyawa ini bersifat sitotoksik dengan mekanisme berinteraksi dengan DNA dan berinterkalasi non kovalen antara pasangan basa, yang menyebabkan penghambatan sintesis biomakromolekul. Berbagai penelitian PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 7 mengenai mekanisme kerja doksorubisin telah dilakukan. Antibiotik antrasiklin seperti doksorubisin memiliki mekanisme aksi sitotoksik melalui empat mekanisme, yaitu sebagai berikut : 1. Penghambatan topoisomerase II, 2. pengikatan membran sel yang menyebabkan aliran dan transport ion, 3. interkalasi DNA sehingga mengakibatkan penghambatan sintesis DNA dan RNA, 4. pembentukan radikal bebas semiquinon dan radikal bebas oksigen melalui proses yang tergantung besi dan proses reduktif yang diperantarai enzim. Mekanisme radikal bebas ini telah diketahui bertanggung jawab pada kardiotoksisitas akibat antibiotik antrasiklin (Bruton, Lazo dan Parker, 2005). Penelitian Zhang dkk. (2005) menunjukkan bahwa doksorubisin dapat mengakibatkan myocardial oxidative stress, mengurangi aktivitas lactate dehydrogenase dan creatine kinase pada hati. Doksorubisin juga menyebabkan penurunan interleukin-2 (IL-2) dan produksi interferon-γ (IFN-γ), sel sitotoksik natural killer (NK), proliferasi limfosit serta ratio limfosit T CD4+/CD8+. C. Kemoterapi dan Kemoterapi Kombinasi Kemoterapi adalah suatu bentuk terapi kanker yang mengalami kemajuan cepat dan aplikasi baru. Bahan-bahan kemoterapi adalah obat sitotoksik yang bekerja dalam berbagai cara pada sel-sel spesifik selama berbagai fase siklus kehidupan sel. Kemoterapi hampir tidak pernah dilakukan bersama dengan terapi pembedahan (Gruendemann dan Fernsebner, 2005). PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 8 Dalam kemoterapi digunakan suatu obat yang merusak sel kanker. Obat antikanker dapat dibedakan menjadi dua yaitu obat konvensional dan obat dengan target molekuler yang spesifik. Obat konvensional yang dimaksud adalah obatobat sitostatika (agen kemoterapi) seperti taxol, bleomycin, doksorubisin, 5flurourasil, klorambusil, tiotepa, alkaloid indol seperti vinblastin, dan vinkristin. Obat sitostatika bekerja dengan mempengaruhi metabolisme asam nukleat terutama DNA atau biosintesis protein. Hal inilah yang menyebabkan obat sitostatika bekerja tidak selektif karena bersifat toksik baik pada sel kanker maupun sel normal, terutama sel normal yang kecepatan proliferasinya tinggi seperti pada sumsum tulang belakang (Siswandono dan Soekardjo, 2000). Penatalaksanaan efek samping kemoterapi merupakan bagian penting dari pengobatan dan perawatan pendukung pada penyakit kanker. Walaupun efek samping bisa terjadi mengikuti pemberian obat apa pun, efek samping setelah pemberian kemoterapi sitotoksik efek ini hampir selalu cukup menggangu. Hal ini diakibatkan efek non-spesifik dari obat-obat sitotoksik yang menghambat tidah hanya sel-sel tumor melainkan juga sel-sel normal. Konsekuensinya, efek samping paling sering dapat dilihat pada jaringan dengan aktivitas proliferatif yang tinggi, misalnya sumsum tulang, epitel traktus gastrointestinalis, folikel rambut (Widjanarko, 2002). Ko-kemoterapi adalah kombinasi antara agen kemopreventif dengan agen kemoterapi agar menghasilkan efek yang lebih baik dibandingkan dengan agen kemoterapi saja. Perubahan-perubahan genetik dan ekspresi protein yang semakin banyak pada proses karsiogenesis, menjadi dasar penting untuk pengembangan PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI agen kemoprevensi kanker. Agen ini diharapkan dapat 9 menghambat karsinogenesis dan dapat memacu kematian sel kanker. Kemoprevensi merupakan suatu usaha menggunakan bahan alam, sintetik, atau biologis, bahan kimia untuk membalikkan, menekan, atau mencegah perkembangan karsinogenik penyakit kanker. Keberhasilan beberapa uji klinis dalam mencegah kanker pada populasi menunjukkan kemoprevensi merupakan strategi yang rasional (Tsao, Kim dan Hong, 2004). D. Imunomodulator Imunomodulator adalah zat alami atau sintetis yang membantu mengatur atau menormalkan sistem kekebalan tubuh. Imunomodulator mengoreksi sistem kekebalan tubuh yang berada di luar keseimbangan. Imunomodulator alami cenderung menyebabkan efek samping yang kecil. Imunomodulator dapat merangsang mekanisme pertahanan alami dan adaptif, seperti sitokin (Patil, Jaydeokar dan Bandawane, 2012). Menurut Anonim (2011), senyawa yang memiliki sifat imunomodulator haruslah memenuhi persyaratan berikut : (1) Secara kimiawi murni atau dapat didefinisikan secara kimia, (2) secara biologik dapat diuraikan dengan cepat, (3) tidak bersifat kanserogenik atau ko-kanserogenik, dan (4) baik secara akut maupun kronis tidak toksik dan tidak mempunyai efek samping farmakologik yang merugikan. Imunomodulator adalah substansi atau obat yang dapat memodulasi fungsi dan aktivitas sistem imun. Imunomodulator dibagi menjadi tiga kelompok : PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 10 1. Imunostimulator ditujukan untuk perbaikan fungsi imun pada kondisi-kondisi imunosupresi. Imunostimulan merupakan agen yang dipertimbangkan untuk meningkatkan ketahanan tubuh terhadap infeksi dan meningkatkan tingkat respon imun (Patil dkk., 2012). 2. Imunoregulator, artinya dapat meregulasi sistem imun. 3. Imunosupresor yang dapat menghambat atau menekan aktivitas sistem imun. dan digunakan untuk mengontrol respon imun patologis pada penyakit autoimun, (Patil dkk., 2012). Efek terhadap sistem imun berupa perubahan jalur sel sistem imun yang sementara dan efek yang lebih persisten terhadap fungsi sel individual tergantung dari golongan imunosupresan (Baratawidjaja dan Rengganis, 2010). Kebanyakan tanaman obat yang telah diteliti membuktikan adanya kerja imunostimulator, sedangkan untuk imunosupresor masih jarang dijumpai. Pemakaian tanaman obat sebagai imunostimulator dengan maksud menekan atau mengurangi infeksi virus dan bakteri intraseluler, untuk mengatasi imunodefisiensi atau sebagai perangsang tumbuhnya sel pertahanan tubuh dalam sistem imunitas (Block dan Mead, 2003). E. Limfosit Limfosit merupakan salah satu bagian dari sel darah putih yang bersifat agranulosit. Secara umum ukuran dan penampilan limfosit bervariasi, serta memiliki inti sel yang relatif lebih besar yang dikelilingi oleh sejumlah sitoplasma. Limfosit dibentuk di kelenjar timus dan sumsum merah tulang, PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 11 umumnya banyak terdapat pada pembuluh darah dan organ limfoid, seperti limfa, kelenjar limfe, dan timus (Kimball, 1990). Limfosit merupakan leukosit kedua terbanyak di darah perifer. Sel-sel ini merupakan komponen esensial pada sistem pertahanan imun. Fungsi utamanya adalah berinteraksi dengan antigen dan menimbulkan respons imun. Respon imun ini mungkin terjadinsebagai berikut : (1) Humoral, dalam bentuk produksi antibodi, (2) seluler, diserati pengeluaran berbagai limfokin oleh limfosit, (3) sitotoksik, disertai pembentukan limfosit pembunuh sitotoksik. Terdapat dua subtipe utama, limfosit-T dan limfosit-B, yang masingmasing melakukan fungsi imunologik tersendiri. Limfosit-T berperan dalam imunitas selular dan memodulasi responsivitas imun. Limfosit-B terutama bertanggung jawab untuk imunitas humoral dan pembentuk antibodi (Ronald dan Richard, 2004). Jumlah limfosit dalam tubuh berkisar 20-25% dari jumlah leukosit total, limfosit memiliki nukleus besar bulat dengan menempati sebagian besar sel limfosit berkembang dalam jaringan limfe (Handayani, 2008). Konsentrasi limfosit yang tinggi ditemukan di kelenjar getah bening, limpa, dam mukosa saluran napas dan cerna, sedangkan secara difusi sel-sel ini ditemukan di sumsum tulang, hati, kulit, dan jaringan yang mengalami peradangan kronis (Ronald dan Richard, 2004). Melihat hal tersebut, limfosit merupakan salah satu sel kekebalan tubuh yang penting yang memainkan peran penting dalam mekanisme pertahanan tubuh. Menurut Mashitoh (2007), ketika mempertimbangkan efek samping PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 12 kemoterapi, sangat penting untuk memverifikasi apakah obat menunjukkan efek berbahaya terhadap sel-sel normal khususnya dalam berkembangnya limfosit. Kemampuan obat yang memberikan efek samping toksis dapat mempengaruhi keberlangsungan hidup sel limfosit yang berdampak pada sistem kekebalan tubuh. Proliferasi limfosit dapat diinduksi oleh adanya mitogen Mitogen adalah agen yang mampu menginduksi pembelahan sel, baik sel B maupun sel T dalam persentase yang tinggi. Sel limfosit B dan T mampu berproliferasi seiring stimulasi mitogen ke dalam kultur sel. Ada beberapa mitogen yang berasal dari produk alami telah diakui untuk merangsang proliferasi limfosit alami yang berguna dalam meningkatkan sistem kekebalan tubuh (Harris, 1991). Proliferasi limfosit merupakan suatu peningkatan produksi limfoblas yang kemudian menjadi limfosit di limpa dapat dilihat dengan adanya pembesaran organ-organ limfoid. Limpa merupakan salah satu organ limfoid perifer (Khasanah, 2009). Proliferasi limfosit yang distimulir antigen secara normal terjadi dalam jaringan limfoid. Kemampuan sel limfoid untuk berkembang biak ketika dikultur dengan mitogen tertentu merupakan parameter untuk menilai fungsi sel T dan sel B secara in vitro (Winarsi, 2010). Aktivitas proliferasi yang ditunjukkan limfosit sangat mempengaruhi tingkat imunitas tubuh. Menurut Meydani, Wu, Santos, Hoyek (1995), proliferasi sel limfosit berawal dari kontak antara membran sel dengan sutu antigen atau dengan aktivator lain. Membran sel harus dalam keadaan utuh untuk dapat memulai proliferasi sel. Proliferasi sel ini berpengaruh terhadap kemampuan PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 13 imuitas tubuh karena dapat menghasilkan sel efektor atau imunokompeten. Sel limfosit termasuk sel tunggal yang bertahan baik saat dikulturkan pada media sederhana dan secara konsisten tetap dalam tahap diam dan tidak membelah sampai ditambah mitogen ke dalamnya (Ramadhani, 2009). F. Labu Air 1. Sinonim Curcubita hispida sensu Thunb. (sensu strico), Curcubita idolatrica Willd, Curcubita siceraria Molina (Lim, 2012). 2. Nama Lain : a. India : Sorakaya b. Indonesia : Labu Air c. Jepang : Hyoutan d. Inggris : Bottle Gourd (Lim, 2012). 3. Klasifikasi taksonomi: Kingdom : Plantae Division : Magnoliophyta Class : Magnoliopsida Order : Cucurbitales Family : Cucurbitaceae Genus : Lagenaria Species : Lagenaria siceraria (Mol.) Standley (Lim, 2012). PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 14 4. Morfologi Buah labu air (Gambar 2) termasuk ke dalam varietas labu bertekstur keras. Bentuk buahnya bervariasi, mulai dari membulat hingga lonjong memanjang. Warna kulitnya kehijauan dengan daging buah berwarna putih. Tanaman ini diketahui mudah beradaptasi dengan kondisi cuaca, baik di musim penghujan ataupun kemarau (Lim, 2012). 5. Kandungan dan khasiat Deore dkk. (2009) memaparkan bahwa hasil skrining fitokimia ekstrak etanol buah Lagenaria siceraria memiliki kandungan flavonoid, glikosida saponin, dan senyawa fenolik. Menurut Gangwal dkk. (2008) ekstrak methanol fraksi n-butanol dan etil asetat buah labu air (Lagenaria siceraria) memiliki aktifitas imunomodulator karena dapat meningkatkan jumlah antibodi primer dan sekunder serta mampu menghambat reaksi hipersensitivitas pada tikus. Senyawa yang dapat diisolasi ekstrak metanol fraksi n-butanol dan etil asetat buah L. siceraria diidentifikasi merupakan asam oleanolat, campuran ß-sitosterol dan kempesterol, isokuersetin, kampeferol (Shah, Seth dan Desai, 2010). Gambar 2. Buah Labu Air (Lim, 2012). PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 15 G. Landasan Teori Salah satu pengobatan kanker dapat dilakukan dengan kemoterapi menggunakan obat-obat sitostatika, contohnya doksorubisin. Penggunaan doksorubisin mempunyai efek merugikan, salah satunya adalah penurunan jumlah sel darah putih sehingga sel limfosit juga menurun jumlahnya. Imunitas tubuh meningkat seiring dengan peningkatan jumlah limfosit, hal ini dikarenakan sel limfosit merupakan sel yang berperan dalam respon imun. Oleh karena itu, perlu dikembangkan agen ko-kemoterapi untuk mengurangi efek merugikan doksorubisin tersebut. Buah L. siceraria digunakan sebagai alternatif agen ko-kemoterapi karena mempunyai aktivitas imunomodulator. Kandungan flavonoid pada ekstrak etanol buah L. Siceraria ini dapat meningkatkan proliferasi limfosit, sehingga ekstrak etanol buah L. siceraria berpotensi untuk dikembangkan sebagai agen kokemoterapi. Penelitian ini bertujuan untuk mengamati pengaruh pemberian ekstrak etanol buah Lagenaria siceraria terhadap efek merugikan doksorubisin pada tikus Sprague Dawley yang dilihat dari aktivitas proliferasi limfosit untuk mengetahui efek imunomodulatornya. H. Hipotesis Ekstrak etanol buah labu air (Lagenaria siceraria) dapat meningkatkan proliferasi limfosit pada tikus galur Sprague Dawley yang dipejani doksorubisin. PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI BAB III METODE PENELITIAN A. Jenis dan Rancangan Penelitian Penelitian ini merupakan jenis penelitian eksperimental murni, yaitu penelitian dengan melakukan percobaan terhadap kelompok perlakuan dan dibandingkan dengan kelompok kontrol yang tidak dikenai perlakuan. Rancangan penelitian yang digunakan adalah rancangan penelitian acak pola searah, yaitu cara menetapkan sampel dalam kelompok perlakuan dan kelompok kontrol dengan pengacakan agar setiap sampel punya kesempatan yang sama untuk dapat masuk ke dalam kelompok perlakuan maupun kelompok kontrol. Pola searah ditunjukkan dengan adanya perlakuan yang sama pada kelompok perlakuan, yaitu pemberian ekstrak etanol buah L. siceraria. B. Variabel dan Definisi Operasional 1. Variabel penelitian a. Variabel utama 1) Variabel bebas : dosis ekstrak etanol buah L. siceraria. 2) Variabel tergantung : proliferasi sel limfosit. b. Variabel pengacau 1) Variabel pengacau terkendali : jenis kelamin, galur tikus, umur tikus, berat badan tikus, jenis makanan 2) Variabel pengacau tak terkendali : kondisi fisiologis tikus, asal buah L. siceraria. 16 PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 17 2. Definisi operasional a. Ekstrak etanol buah L. siceraria, merupakan hasil maserasi serbuk kering buah L. siceraria sebanyak tiga kali, ekstrak disaring dan kemudian pelarut diuapkan dengan rotary evaporator hingga didapat ekstrak kental. b. Efek imunomodulator buah L. siceraria, merupakan kemampuan buah L. siceraria untuk mengembalikan sistem imun tikus Sprague Dawley yang dipejani doksorubisin menuju keadaan normal yang dilihat dari proliferasi sel limfosit. C. Bahan Penelitian 1. Bahan utama Bahan uji yang digunakan, yaitu buah Labu Air (L. siceraria) yang didapatkan dari Pasar Beringharjo Yogyakarta. 2. Hewan uji Tikus jantan galur Sprague Dawley dengan rentang berat badan 200-300 gram dan umur 2-3 bulan yang diperoleh dari Laboratorium Imono Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. 3. Bahan uji jumlah sel limfosit Akuades, akuabides, klorofom, Roswell Park Memorial Institute Medium (RPMI 1640) (Sigma), metanol, alkohol 70%, Phosphate Buffer Saline (PBS) steril, medium komplit yang terdiri dari RPMI 1640, Fetal Bovine Serum (FBS) (Gibco) 10%, Penisilin-Streptomisin 2% (Gibco) dan fungizon 1% (Gibco). PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 18 D. Alat Penelitian 1. Alat pembuatan serbuk buah L. siceraria Seperangkat alat gelas, yaitu beaker glass, gelas ukur, cawan porselen, batang pengaduk, mesin penyerbuk, dan timbangan analitik. 2. Alat untuk ekstraksi bahan Seperangkat alat gelas, blender, cawan porselen, mikropipet, mortir, stamper, pengayak tepung, oven, gelas ukur, beaker glass, vaccum filter, vaccum rotary evaporator. 3. Alat untuk perlakuan hewan uji Peralatan bedah tikus (pisau, gunting, pinset), sarung tangan disposable, syringe, cawan petri, tabung sentrifuse, pipet tetes, pipet volumetrik, alat sentrifuse, gelas penutup, microwell plate, mikropipet. 4. Alat untuk penetapan jumlah limfosit Inkubator CO2 5%; 37oC (Heraeus), plate 96 well (Nunc), sentrifus eppendorf (Sorfall MC 12 V, Dupont), Effendorf tube, Laminar Air Flow (Labquib), hemasitometer (Nebaeur), mikropipet (Eppendorf), neraca elektronik (Sartorius), filter 0,22 μm (Sartorius), tabung sentrifus 15 mL (Nunc), spuit injeksi 10 mL (Terumo), mesin Vortex, yellow dan blue tip, Inverted Microscope (Olympus), mikroskop binokuler, lampu spiritus, pinset, gunting, tabung reaksi, dan alat-alat gelas yang telah disterilkan. PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 19 E. Tata Cara Penelitian 1. Determinasi buah L. siceraria Determinasi sampel buah L. siceraria yang digunakan berdasarkan pengamatan ciri morfologinya yang dibandingkan dengan literatur. 2. Penetapan kadar air simplisia serbuk kering buah L. siceraria Penetapan kadar air dilakukan termopan, yaitu dengan menguji jumlah air yang menguap dari simplisia serbuk buah L. siceraria. Alat yang digunakan pada uji ini adalah Moisture Balance yang terdapat di Laboratorium Kimia Analisis, Fakultas Farmasi, Universitas Sanata Dharma. Pengujian dilakukan dengan cara memasukkan 5 gram sampel dan menimbang bobot simplisia sebagai bobot sebelum pemanasan (bobot a). Kemudian alat dipanaskan pada suhu 1100C selama 15 menit, dan setelah menimbang bobot simplisia setelah pemanasan (bobot b). Selisih bobot a dan b merupakan kadar air dari simplisia yang diselidiki. 3. Pembuatan ekstrak etanol buah L. siceraria Buah labu air yang didapat dari pasar Beringharjo Yogyakarta dibersihkan dengan cara dicuci dengan air mengalir, dikupas kulitnya, dipotong kecil – kecil, dibuang bijinya kemudian diblender dan dimaserasi menggunakan pelarut etanol. Maserasi diulangi sebanyak tiga kali. Maserasi yang pertama dilakukan selama 2 x 24 jam, kemudian disaring dengan penyaring Buchner sehingga diperoleh filtrat dan ampas. Ampas dimaserasi lagi selama 1 x 24 jam. Ampas yang didapat dimaserasi kembali selama 1 x 24 jam. Kemudian pelarut diuapkan dengan rotary evaporator hingga tidak ada pelarut yang menetes lagi. PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 20 4. Pembuatan sediaan ekstrak etanol buah L. siceraria 15% Ekstrak etanol buah L. siceraria dibuat suspensi dengan melarutkan 15 gram ekstrak dalam 100 mL CMC Na sehingga didapatkan konsentrasi 15% b/v. 5. Penyiapan dan perlakuan hewan uji Hewan uji yang digunakan ditempatkan dalam kandang selama 1 minggu untuk adaptasi. Dua puluh lima ekor tikus yang telah diadaptasikan dibagi secara acak dalam 5 kelompok. Kelompok I diberikan CMC-Na 1%. Kelompok II diberikan doksorubisin dosis 4,5 mg/kg BB. Kelompok III diberikan doksorubisin dosis 4,5 mg/kg BB secara intraperitonial dan ekstrak dosis 1000 mg/kg BB secara p.o. Kelompok IV diberikan doksorubisin dosis 4,5 mg/kg BB secara intraperitonial dan ekstrak dosis 750 mg/kg BB secara p.o. Kelompok V diberikan doksorubisin dosis 4,5 mg/kg BB secara intraperitonial dan ekstrak dosis 500 mg/kg BB secara p.o. Ekstrak diberikan terlebih dahulu selama 10 hari, kemudian dipejani doksorubisin pada hari ke-11, 13, 15. Isolasi limpa dilakukan pada hari ke-19. Tabel 1. Perlakuan terhadap Hewan Uji Kelompok Hari ke1 2 3 4 5 6 7 8 9 I II III IV V Pelarut ekstrak (CMC Na 1%) p.o EELA 1000 mg/kg p.o EELA 750 mg/kg p.o EELA 500 mg/kg p.o Pelarut doksorubisin (NaCl fisiologis) Doksorubisin i.p Pengambilan organ limpa 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 21 6. Isolasi organ limpa tikus Tikus dikorbankan dengan dibius terlebih dahulu menggunakan kloroform, kemudian tikus diletakkan terlentang. Kulit perut dan selubung peritoneum dibuka. Organ limpa diambil dan dibersihkan dari lemak yang melekat kemudian diletakkan pada cawan petri dan diberi 1 mL RPMI. 7. Pengujian jumlah limfosit Organ limpa kemudian disuntik dengan RPMI, sambil ditekan menggunakan pinset sehingga didapatkan suspensi sel. Suspensi sel tersebut kemudian dimasukkan dalam tabung sentrifuge. Suspensi sel disentrifugasi 1500 rpm selama 10 menit untuk diambil peletnya. Pelet yang didapat ditambahkan 1 mL ammonium klorida kemudian diaduk. Pelet dicuci dengan cara menambahkan RPMI hingga 12 mL kemudian dilakukan sentrifugasi 3000 rpm selama 5 menit. Supernatan yang didapatkan kemudian dibuang dan pelet yang didapatkan ditambahkan 2 mL medium komplit. Sebanyak 930 µL RPMI dimasukkan dalam tabung eppendorf, kemudian ditambahkan suspensi sel dengan pengenceran 50 kali yang sebelumnya sudah divortex. Sebanyak 50 µL Triphan Blue ditambahkan kemudian divortex, dan suspensi sel dibaca dengan alat Haemocytometer. Selanjutnya dibuat suspensi sel dengan kepadatan 2x107 sel/mL. Dimasukkan sebanyak 20 µL suspensi sel tersebut ke dalam sumuran yang sebelumnya sudah ditambahkan RPMI. Sebagai pembanding yaitu suspensi sel dalam plate yang diberikan PHA. Masing-masing suspensi sel dalam plate diinkubasi selama 72 jam dalam inkubator CO2 dengan suhu 370 C dengan CO2 5% (Miksusanti, 2010). Metode yang digunakan adalah MTT assay. Setelah PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 22 diinkubasi selama 72 jam, ditambahkan dengan MTT {(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)2,5-Diphenyl-tetrazoilium-Bromide} ke dalam semua sumuran dalam plate. Plate kemudian diinkubasi selama 4 jam dan tiap sumuran ditambah dengan larutan SDS 10% dan dilakukan pengukuran menggunakan ELISA reader. 8. Perhitungan statistik Data yang diperoleh dievaluasi secara statistik dengan melakukan uji normalitas dengan metode Kolmogorov-Smirnov. Data yang terdistribusi normal (p>0,05) dilanjutkan dengan uji one way ANOVA dengan taraf kepercayaan 95%, kemudian jika data terdapat perbedaan yang bermakna dilanjutkan dengan uji Scheffe. PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN Tujuan penelitian ini adalah untuk mengetahui pengaruh pemberian ekstrak etanol buah L. siceraria terhadap proliferasi sel limfosit, serta untuk mengetahui dosis paling efektif dari ekstrak etanol buah L. siceraria yang berpengaruh terhadap peningkatan proliferasi sel limfosit. Proliferasi limfosit dapat dilihat dari Optical Density (OD) yang dihasilkan pada pengukuran menggunakan ELISA reader. Data proliferasi limfosit yang diperoleh dianalisis secara statistik menggunakan uji Kolmogorov-Smirnov untuk mengetahui normalitas data, selanjutnya dilakukan analisis one way ANOVA dengan taraf kepercayaan 95%, jika ada perbedaan yang bermakna kemudian dilanjutkan dengan uji Scheffe untuk mengetahui signifikansi antar kelompok. A. Penyiapan Bahan Uji 1. Determinasi tanaman Tanaman yang digunakan untuk penelitian ini adalah labu air (Lagenaria siceraria) dan bagian tanaman yang digunakan adalah bagian daging dan biji buah. Sebelum dilakukan penelitian lebih lanjut, dilakukan determinasi bagian tanaman tersebut untuk memastikan bagian tanaman yang digunakan untuk penelitian sudah tepat dan tidak terjadi kesalahan dalam penggunakan bahan uji. Determinasi dilakukan dengan cara mencocokkan ciri-ciri buah L. siceraria dengan literatur. Menurut literatur “Edible Medicinal and NonMedicinal Plants (Fruits), Volume 2”, buah L. siceraria berbentuk memanjang 23 PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 24 sampai dengan 1 meter, warna putih kehijauan ketika muda, daging buah tahan lama, memiliki biji berbentuk lonjong dan pipih berukuran hingga 2 cm. Dari hasil determinasi menunjukkan bahwa buah Lagenaria siceraria yang digunakan dalam penelitian memiliki kesamaan ciri-ciri dengan yang ditunjukkan literatur, sehingga dapat disimpulkan bahwa buah yang digunakan memang benar merupakan buah Lagenaria siceraria. 2. Penetapan kadar air serbuk kering buah L. siceraria Pengujian penetapan kadar air bertujuan untuk memastikan bahwa serbuk kering yang digunakan memiliki kandungan air sesuai persyaratan serbuk simplisia yang baik. Menurut Direktorat Jenderal Pengawas Obat dan Makanan (1995), persyaratan kadar air dalam serbuk simplisia yang baik adalah kurang dari 10%. Penetapan kadar air serbuk kering buah L. siceraria dilakukan dengan menghitung susut penguapan alat Moisture Balance yang terdapat di Laboratorium Kimia Analisis Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. Kadar air yang melebihi 10% dapat memicu pertumbuhan mikroba, reaksi enzimatis atau proses hidrolisis yang menyebabkan rusaknya kandungan senyawa aktif dalam serbuk buah L. siceraria. Penetapan kadar air dilakukan dengan cara memanaskan serbuk pada suhu 1100C selama 15 menit. Hal tersebut dimaksudkan agar kandungan air dalam serbuk menguap dalam waktu tersebut. Hasil pengujian didapatkan bahwa kandungan air dari serbuk kering buah L. siceraria sebesar 7,86%. Hasil pengujian ini menunjukkan bahwa serbuk kering buah L. siceraria telah memenuhi persyaratan serbuk simplisia yang baik. PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 25 3. Pembuatan ekstrak etanol buah L. siceraria Kandungan air dalam buah L. siceraria cukup tinggi, sehingga dilakukan pengeringan menggunakan oven untuk menghilangkan kandungan air, hal ini bertujuan agar potongan buah labu air tersebut mudah untuk dibuat menjadi serbuk dan tetap awet (tidak menjadi media tumbuh mikroba), karena dengan adanya kandungan air dapat memicu pertumbuh mikroba, sehingga menyebabkan buah labu air busuk dan kandungan senyawa aktif didalamnya juga rusak. Jika kandungan senyawa aktif rusak maka efek farmakologis yang ditimbulkan menjadi bias. Maserasi merupakan salah satu metode ekstraksi dengan cara merendam serbuk dengan pelarut yang sesuai pada suhu ruangan sehingga senyawa yang tidak tahan panas tidak rusak (Koirewoa, Fatimawali dan Wiyono, 2012). Menurut Deshpande dkk. (2008), ekstrak etanol buah L. siceraria menunjukkan aktivitas sebagai imunomodulator melalui pengamatan respon imun humoral dan seluler, sehingga pada penelitian ini digunakan pelarut etanol untuk membuktikan aktivitas senyawa pada buah L. siceraria sebagai imunomodulator melalui pengamatan proliferasi limfosit. Hasil skrining fitokimia ekstrak etanol buah Lagenaria siceraria memiliki kandungan flavonoid, glikosida saponin, dan senyawa fenolik (Deore dkk., 2009). Flavonoid dan senyawa-senyawa fenolik mudah teroksidasi pada suhu tinggi sehingga maserasi merupakan metode yang tepat dalam ekstraksi ekstraksi untuk mencegah oksidasi dari flavonoid (Koirewoa dkk., 2012). Serbuk yang digunakan untuk proses maserasi sebanyak 10 g dan diberi pelarut etanol 80% sebanyak 100 mL. Maserasi menggunakan etanol PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 26 dengan konsentrasi 80% karena pada konsentrasi tersebut dapat menyari senyawa aktif dalam buah L. siceraria yaitu flavonoid, glikosida saponin dan senyawasenyawa fenolik. Etanol bisa digunakan untuk menyari zat dengan kepolaran relatif tinggi sampai relatif rendah karena etanol merupakan pelarut yang universal (Voigt, 1984). Flavonoid merupakan senyawa aktif dari buah L. siceraria yang diteliti aktivitasnya sebagai imunomodulator. Maserasi dilakukan berulang sebanyak 3 kali masing-masing adalah selama 24 jam, hal ini bertujuan untuk menjamin senyawa aktif dapat tersari secara sempurna. 4. Pembuatan sediaan ekstrak etanol buah L. siceraria Sediaan ini dibuat dengan cara menambahkan 15 gram ekstrak kental buah labu air dengan 100 mL CMC Na 1% sehingga didapatkan suspensi ekstrak konsentrasi 15%. Konsentrasi ekstrak etanol buah L. siceraria tersebut ditentukan berdasarkan konsentrasi terpekat yang masih menunjukkan ekstrak kental labu air dapat terdispersi dalam CMC Na dan dapat diinjeksikan menggunakan spuit. Dalam penelitian ini digunakan CMC Na karena dapat berfungsi sebagai suspending agent sehingga ekstrak kental dapat tersuspensi dan dapat diinjeksikan. CMC Na juga larut secara baik dalam air dan bersifat non toksik dalam tubuh sehingga sering digunakan sebagai suspending agent untuk sediaan oral (Pakki, 2007). PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 27 B. Perlakuan Ekstrak Etanol Buah Lagenaria siceraira dan Doksorubisin pada Hewan Uji Penetapan dosis ekstrak etanol buah Lagenaria siceraria bertujuan untuk mengetahui dosis paling efektif yang memberikan efek yang diharapkan, yaitu sebagai imunomodulator dengan mekanisme peningkatan proliferasi limfosit. Dosis yang digunakan menggunakan tiga peringkat dosis, yaitu 1000 mg/kg BB sebagai dosis tertinggi, dosis 750 mg/kg BB sebagai dosis tengah, dan dosis 500 mg/kg BB sebagai dosis terendah. Rentang dosis ekstrak yang digunakan besar/lebar dengan tujuan agar bisa mengcover dosis efektif ekstrak etanol buah L. siceraria yang dapat memberikan efek sebagai imunomodulator (meningkatkan proliferasi limfosit) yang diduga terletak di antara rentang dosis tersebut. Pemilihan dosis yang digunakan dalam penelitian ini bersifat eksploratif karena belum didapatkan data dari penelitian sebelumnya mengenai dosis efektif ekstrak etanol buah L. siceraria dalam meningkatkan proliferasi limfosit. Doksorubisin diberikan untuk menginduksi efek imunosupresan, hepatotoksik dan kardiotoksik. Orientasi dosis doksorubisin dilakukan untuk mengetahui dosis yang mampu memberikan efek keseluruhan meliputi kardiotoksik, hepatotoksik dan imunosupresan. Menurut Herwandhani, Nagadi, dan Saktiningtyas (2011), dosis 4,5 mg/kg BB sebanyak 2 kali terbukti dapat menimbulkan efek imunosupresan. Pemberian ekstrak etanol buah L. siceraria dilakukan selama 10 hari, kemudian dilanjutkan dengan pemberian doksorubisin pada hari ke-11, 13 dan 15. Pada 2 kali pemberian doksorubisin 4,5 mg/kg BB belum dapat menimbulkan efek hepatotoksik dan kardiotoksik, sehingga frekuensi pemberian doksorubisin PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 28 ditingkatkan menjadi tiga kali. Putri (2012) melaporkan bahwa pencuplikan sampel dilakukan empat hari setelah dipejani doksorubisin terakhir, atau dengan kata lain pencuplikan sampel dilakukan pada hari ke-19. Pemberian ekstrak selama 10 hari bersifat eksploratif, dengan tujuan ekstrak buah L. siceraria mampu menaikkan sistem imun sebelum dipejani dengan doksorubisin. C. Pengujian Proliferasi Limfosit Sel limfosit yang digunakan dalam penelitian ini diisolasi dari organ limpa. Limpa merupakan organ limfoid sekunder utama yang berfungsi sebagai tempat utama produksi sel T dan B (Kartika, 2012). Baratawidjaja dan Rengganis (2009), menjelaskan bahwa organ limfoid sekunder adalah tempat sel dendritik mempresentasikan antigen yang ditangkap di bagian lain tubuh ke sel T yang memacu proliferasi dan diferensiasi limfosit. Sel limfosit didapatkan dengan cara menyuntikan medium RPMI dingin ke dalam limpa dan sel limfosit keluar dari limpa. Medium RPMI mengandung nutrisi yang dibutuhkan untuk pertumbuhan sel seperti asam amino, vitamin, dan garam-garam organik, sehingga walaupun sudah diisolasi dari limpa, sel limfosit tidak akan mati karena kebutuhan nutrsi terpenuhi. Penelitian ini menggunakan medium komplit yang mengandung medium RPMI, FBS (Fetal Bovine Serum), penisilin-streptomisin (penstrep) dan fungison. FBS berfungsi untuk memacu pertumbuhan sel dan menjaga kelangsungan hidup sel. Penisilin-streptomisin (Penstrep) berfungsi sebagai antibakteri dan fungison berfungsi sebagai anti fungi. PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 29 Kepadatan sel limfosit ditentukan sebanyak 1x106 sel/mL. Kepadatan sel tersebut dihitung dengan menggunakan alat haemocytometer dengan pengenceran 50 kali dalam medium komplit. Aktivitas proliferasi sel limfosit didapatkan dengan cara membandingkan Optical Density (OD) dua sampel, yaitu sampel yang ditambahkan fitohemaglutinin (PHA) dengan sampel yang tidak ditambahkan dengan PHA, dan keduanya sudah dikurangi OD kontrol medium. Fitohemaglutinin digunakan sebagai kontrol positif dan sebagai pembanding karena fitohemaglutinin merupakan mitogen yang digunakan untuk merangsang terjadinya proliferasi limfosit T, limfosit B, dan produksi limfokin dimana lektin PHA mampu memicu aktivitas pada sel T jika terikat pada reseptor sel T manusia (Kresno, 2001). Semakin besar rasio proliferasi maka semakin besar pula proliferasi yang ditunjukan sel limfosit. Proliferasi merupakan salah satu parameter dari suatu tingkat imunitas tubuh, yaitu menunjukkan kemampuan dasar sistem imun meliputi proses diferensiasi dan pembelahan sel. Pengukuran proliferasi limfosit menggunakan metode MTT assay dilakukan setelah inkubasi selama 72 jam dalam inkubator CO2 dengan suhu 370C dengan CO2 5%. Metode MTT assay merupakan metode pengukuran jumlah sel hidup berdasarkan prinsip kolorimetri menggunakan senyawa tetrazolium. Enzim mitokondria suksinat dehydrogenase dalam sel hidup yang dapat mereduksi garam tetrazolium dari MTT {(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyl- tetrazoilium Bromide} yang merupakan senyawa berwarna kuning sehingga membentuk kristal formazan yg berwarna ungu, kemudian dibaca oleh ELISA PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 30 reader dan jumlah kristal formazan yang terbentuk berbanding lurus dengan jumlah sel limfosit yang hidup (Wang, Cheng, Wang, Wei dan Wang, 2010). Sodium dodecyl sulfate (SDS) 10% dalam HCl 0,01N digunakan sebagai Stop Solution, untuk menghentikan aktivitas proliferasi sel limfosit sehingga stabil selama pengukuran OD (Doyle dan Griffiths, 1998). Semua sampel dalam sumuran pada plate kemudian dibaca menggunakan ELISA reader pada panjang gelombang 550 nm. Hasil dinyatakan dalam Optical Density (OD) yang menggambarkan jumlah sel limfosit. D. Hasil Uji Efek Imunomodulator Ekstrak Etanol Buah Lagenearia siceraria dengan Kajian Proliferasi Limfosit Uji yang dilakukan terlebih dahulu adalah uji normalitas data menggunakan uji Kolmogorov-Smirnov. Hasil uji menunjukkan bahwa data terdistribusi normal dengan signifikansi 0,569 (p > 0,05). Data tersebut selanjutnya diuji dengan one way ANOVA taraf kepercayaan 95%. Tabel II. Purata OD + SD Proliferasi Limfosit Praperlakuan Pemberian Ekstrak Etanol Buah Lagenaria siceraria Kelompok Purata OD + SD I 1,06 + 0,02 II 1,01 + 0,02 III 1,03 + 0,02 IV 1,06 + 0,03 V Ket : Kel. I Kel II Kel III Kel IV Kel V 1,07 + 0,03 : kelompok kontrol pelarut : kelompok doksorubisin 4,5 mg/kg BB : kelompok ekstrak dosis 1000 mg/kg BB : kelompok ekstrak dosis 750 mg/kg BB : kelompok ekstrak dosis 500 mg/kg BB PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 31 Hasil uji one way ANOVA menunjukkan nilai p = 0,002 (p < 0,05). Hal ini menunjukkan bahwa paling tidak terdapat perbedaan yang bermakna antara dua kelompok dari seluruh kelompok perlakuan dan dilanjutkan uji Scheffe. Tabel III. Hasil Analisis Uji Post-hoc Scheffe Proliferasi Limfosit Praperlakuan Pemberian Ekstrak Etanol Buah Lagenaria siceraria Kelompok I I - II BB III BTB IV BTB V BTB II BB - BTB BTB BB III BTB BTB - BTB BTB IV BTB BTB BTB - BTB V BTB BB BTB BTB - Ket : Kel. I Kel II Kel III Kel IV Kel V (*) : kelompok kontrol pelarut : kelompok doksorubisin : kelompok ekstrak dosis 1000 mg/kg BB : kelompok ekstrak dosis 750 mg/kg BB : kelompok ekstrak dosis 500 mg/kg BB : berbeda bermakna Gambar 3. Diagram Batang Purata OD + SD Proliferasi Limfosit praperlakuan pemberian ekstrak etanol buah Lagenaria siceraria PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 32 Kontrol pelarut digunakan untuk mengetahui nilai proliferasi sel limfosit normal sebelum diinduksi dengan doksorubisin. Pada tabel II diketahui rata-rata proliferasi limfosit kelompok kontrol (kelompok I) sebesar 1,06 + 0,02. Nilai proliferasi limfosit kelompok kontrol pelarut ini akan digunakan sebagai pembanding terhadap kelompok kontrol doksorubisin dan kelompok perlakuan ekstrak untuk mengetahui efek yang dihasilkan meningkatkan atau menurunkan proliferasi sel limfosit. Kontrol doksorubisin digunakan untuk mengetahui pengaruh penggunaan doksorubisin sebagai agen kemoterapi yang dapat menyebabkan penurunan sistem imun melalui pengamatan proliferasi limfosit. Rata-rata nilai proliferasi limfosit kelompok kontrol doksorubisin (kelompok II) sebesar 1,01 + 0,02. Hasil analisis statistik (Tabel III) menunjukkan bahwa terdapat perbedaan yang bermakna (p<0,05) antara kontrol doksorubisin dengan kelompok kontrol pelarut, hal ini menunjukkan bahwa pemberian doksorubisin memberikan pengaruh terhadap proliferasi sel limfosit, yaitu berupa penurunan proliferasi limfosit. Lemasters dkk. (cit., Putri, 2012) menjelaskan bahwa adanya sifat sitotoksik dari doksorubisin karena terjadinya metabolisme doksorubisin tersebut oleh sitokrom P450 yang menghasilkan metabolit radikal bebas semiquinon dan bersifat toksik. Doksorubisin menekan sumsum tulang belakang, sehingga menyebabkan penurunan semua jenis sel darah yang dihasilkan di sumsum tulang belakang termasuk penurunan jumlah limfosit (Kunjumoideen, 2010). Tabel III menunjukkan bahwa terdapat perbedaan yang bermakna antara kelompok ekstrak dosis 500 mg/kg BB dengan kontrol doksorubisin. Hal ini PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 33 menunjukan bahwa pada ekstrak dosis 500 mg/kg BB mempengaruhi proliferasi limfosit, yaitu berupa peningkatan proliferasi limfosit, sehingga dapat disimpulkan bahwa ekstrak buah L. siceraria pada dosis 500 mg/kg BB bersifat sebagai imunomodulator dengan mekanisme imunostimulan, yaitu memperbaiki fungsi imun pada kondisi-kondisi imunosupresi (di bawah kondisi normal) setelah dipejani doksorubisin, menuju keadaan yang menunjukkan jumlah limfosit pada keadaan normal kembali. Secara biokimia aktivitas imunostimulan mungkin disebabkan oleh flavonoid yang berperan sebagai antigen dan mampu dikenal oleh reseptor sel B maupun sel T dan memacu sel limfosit T maupun sel limfosit B untuk berproliferasi (Filbert, 2010). Tabel III menunjukkan bahwa terdapat perbedaan yang tidak bermakna antara kelompok ekstrak dosis 1000mg/kg BB dan dosis 750mg/kg BB dengan kontrol doksorubisin. Hal ini menunjukkan bahwa pada ekstrak dosis 1000mg/kg BB dan 750mg/kg BB terjadi penghambatan proliferasi limfosit. Peningkatan proliferasi limfosit berbanding terbalik dengan meningkatnya peringkat dosis ekstrak buah L. siceraria, yaitu pada ekstrak buah L. siceraria dosis 1000 mg/kg BB dan 750 mg/kg BB dengan rasio proliferasi sebesar 1,03 dan 1,06; dan ekstrak buah L. siceraria dosis 500 mg/kg BB dengan rasio proliferasi sebesar 1,07 (Tabel II). Terjadinya hal ini adalah dari aktivitas flavonoid yang terkandung dalam buah L. siceraria. Mc.Clure (Cit., Hernawati, 2009) menjelaskan bahwa flavonoid mempengaruhi interaksi antar sel dalam proses metabolisme baik bersifat negatif (menghambat) maupun positif (menstimulasi). Akiyama dkk., (cit., Putri, 2012) menjelaskan bahwa senyawa flavonoid dapat memberikan efek yang berbeda PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 34 tergantung jumlah dosisnya di mana pada dosis yang rendah flavonoid mampu memacu pertumbuhan sel sedangkan pada kadar tinggi justru dapat menghambat proliferasi sel. Derivat dari senyawa flavonoid, yaitu flavone dan flavonol menunjukkan efek penghambatan proliferasi limfosit yang diinduksi oleh concanavalin A (Namgoong, Son, Chang, Kang dan Kim, 1994). Aljancic, Stankovic, Tesevic, Vujisic, Vajs dan Milosavljevic (2010) menyebutkan semakin besar konsentrasi quercetin (flavonol) menyebabkan peningkatan kerusakan DNA sehingga sel mati. Dimungkinkan pada dosis 1000 mg/kg BB dan 750mg/kg BB yang merupakan dosis besar justru terjadi penghambatan proses proliferasi limfosit. Berdasarkan hasil penelitian yang diperoleh maka dapat dibuktikan bahwa pemberian ekstrak buah L. siceraria mampu memberikan pengaruh berupa peningkatan proliferasi limfosit. Peningkatan proliferasi limfosit berbanding terbalik dengan peningkatan dosis ekstrak buah L. siceraria. Proliferasi limfosit paling besar ditunjukkan oleh ekstrak dosis 500 mg/kg BB, yaitu dengan rasio proliferasi sebesar 1,07. PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI BAB V KESIMPULAN DAN SARAN A. Kesimpulan Berdasarkan hasil yang diperoleh dan analisis statistik yang telah dilakukan, maka dapat disimpulkan sebagai berikut : 1. Pemberian ekstrak etanol buah L. siceraria terbukti berpengaruh dalam meningkatkan proliferasi sel limfosit tikus jantan Sprague Dawley yang dipejani doksorubisin. 2. Dosis yang paling efektif memberikan pengaruh terhadap peningkatan proliferasi sel limfosit adalah dosis 500 mg/kg BB. B. Saran Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut mengenai : 1. Senyawa dalam buah L. siceraria yang berperan untuk meningkatkan proliferasi limfosit. 2. Pengkajian peringkat dosis ekstrak etanol buah L. siceraria dengan faktor kelipatan untuk mendapatkan dosis efektif. 3. Pengkajian lama pemberian dosis ekstrak etanol buah L. siceraria yang dapat menimbulkan efek imunomodulator. 4. Dosis doksorubisin yang dapat menimbulkan efek imunosupresan. 35 PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 36 DAFTAR PUSTAKA Akiyama, T., Ishida, J., Nakagawa, S., Ogawara, H., Watanabe, S., I toh N., Shibuya, M., and Fukami, Y., 1987, Genistein, a specific inhibitor of tyrosine specific protein kinase, J. Biol. Chem, 262, 5592-5595. Aljancic, I., Stankovic, M., Tesevic, V., Vujisic, L., Vajs, V., Milosavljevic, S., 2010, Protective effect on human lymphocytes of some flavonoids isolated from two Achillea species. Nat Prod Commun, May;5(5):729-32, PubMed PMID: 20521537. Anonim, 2011, World Health Organization, http://apps.who.int/medicinedocs /en/d/Js2200e/, diakses tanggal 23 Juni 2013. Baratawidjaja, K., dan Rengganis, I., 2009, Imunologi Dasar, Edisi ke-8, Balai Penerbit TKUI, Jakarta. Block, K., Mead, M., 2003, Immune System Effects of Echinacea, Ginseng and Astragalus : A review Integrative cancer therapies, 2(3): 247-246. Bruton, L., Lazo, J. S., dan Parker, K. L., 2005, Goodman & Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics, 11th Edition, McGrawHill, Lange. Deore, S., Khadabadi, S., Patel, Q., Deshmukh, S., Jaju, M., Junghare, N., Wane, T., Jain, R., 2009, In Vitro Antioxidant Activity and Quantitative Estimation of Phenolic Content of Lagenaria siceraria, Rasayan J. Chem., Vol.2, No.1, India. Direktorat Jenderal Pengawas Obat dan Makanan, 1995, Farmakope Indonesia, Edisi IV, Departemen Kesehatan RI, Jakarta. Deshpande, J., Choudhari, A., Mishra, M., Meghre, V., Wadodkar, S., Dorle, A.K., 2008, Beneficial Effects of Lagenaria siceraria (Mol.) Standley fruit eficarp in animal Model, Indian J. Exp Biol, 46, 234-242. Doyle, A. & Griffiths, J. B., 1998, Cell and tissue culture : laboratory procedures in biotechnology, Wiley & Sons Ltd., England, pp. 62-64. Filbert, I., 2010, Gambaran Histopatologis Limpa Mencit Galur Swiss Webster Jantan Pasca Pemberian Minyak Buah (Pandanus conoideus Lam.), Laporan Akhir Penelitian Karya Tulis Ilmiah, Fakultas Kedokteran Universitas Kristen Maranatha. Gangwal, A., Panmar, S.K., Gupta, G., Rana A., and Sheth, N., 2008, Immunomodulatory Effects of Lagenaria siceraria Fruits in rats, Pharmacognosy Mag., 4, S234-S238. Gruendemann, B., Fernsebner, B., 2005, Keperawatan Perioperatif, EGC, Jakarta, pp. 610-611. Handayani, W., 2008, Asuhan Keperawatan pada Klien dengan Gangguan Sistem Hematologi, Salemba Medika, Jakarta. Harris, J., 1991, Blood Cell Biochemistry Volume 3 : Lymphocytes and Granulocytes, Plenum Press, New York. Haryanto, S., 2009, Terapi Pengobatan Tumor-Kanker, Penerbit Kanisius, Yogyakarta, p. 11. PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 37 Hernawati, 2009, Perbaikan Kinerja Reproduksi Akibat Pemberian Isoflavon dari Tanaman Kedelai, Laporan Penelitian, FPMIPA Universitas Pendidikan Indonesia, Bandung, p. 6. Herwandhani, P., Nagadi, S.. dan Saktiningtyas, I.A., 2011, Potensi Kulit Jeruk Purut (Citrus hystrix D.C.) sebagai Agen Imunomodulator yang Prospektif pada Penekanan Efek Imunosupresi Kemoterapi, Jurnal Saintifika Gadjah Mada, III(2). Jenie, R., Meiyanto, E., 2009, Aplikasi ko-kemoterapi Fraksi Etil Asetat Ekstrak Etanolik Daun Sambung Nyawa (Gyanura Procumbens (Lour.)Merr.) Pada Sel Kanker Payudara MCF-7, Majalah Ilmu Kefarmasian, Vol. VI, No. 3, Yogyakarta. Jong, W., 2004, Kanker, Apakah itu? Pengobatan, Harapan Hidup dan Dukungan Keluarga, Arcan, Jakarta, pp. 119-121. Kartika, R., S., 2012, Isolasi Polisakarida Buah Mengkudu (Morinda citrifolia L.) dengan Metode Pengendapan Menggunakan Aseton serta Uji Aktivitasnya Terhadap Fagositosis Makrofag dan Proliferasi Limfosit secara in vitro, Skripsi, Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta, pp. 59,60. Khasanah, N., 2009, Pengaruh Pemberian Ekstrak Jintan Hitam (Nigella Sativa) Terhadap Respon Proliferasi Limfosit Limpa Mencit Balb/C Yang Diinfeksi Salmonella typhimurium, Laporan Akhir Penelitian Karya Tulis Ilmiah, Fakultas Kedokteran Universitas Diponegoro, Semarang. Kimball, J., 1990, Introduction to Immunology, 3rd Edition. Macmillan Publishing Company, Inc., New York. Kresno, S. B., 2001, Imunologi : Diagnosis dan Prosedur Labortorium, Edisi IV, Fakultas Kedokteran Umum, Universitas Indonesia, Jakarta. Kunjumoideen, K., 2010, Doxorubicin (adriamycin), http://medicineworld.org/ cancer/breast/treatment/doxorubicin.html, diakses 7 Mei 2013. Lemasters, J., Nieminen A., Qian, T., Trost L., Elmore S., Nishimura, Y., Crowe, R., Cascio, W., Bradham, C., Brenner, D., 1998, mitochondrial permeability transition in cell death : a common mechanism necrosis, apoptosis and autophagy, Biochem Biophys Acta., 1366: 177-196. Lim, T. K., 2012, Edible Medicinal and Non-Medicinal Plants, Volume 2, Fruits, Spinger Dordrecht Heidelberg, New York. Long B., Hai, Y., Xian, M., 2005, Spectroscopic and Viscosity Study of Doksorubisin Interaction with DNA, Journal of Molecular Structure, 749 (2005) 1008-113. Mangan, Y., 2009, Solusi Sehat Mencegah dan Mengatasi Kanker, Agromedia Pustaka, Jakarta, p.1. Maria, A., 2008, Bertahan Hidup Dengan Terapi Jus, Pustaka Anggrek, Yogyakarta, p. 31. Mashitoh B., 2007, Effects of Damnacanthal, Nordamnacanthal, Betulinic Acid and Zerumbone Isolated From Local Medicinal Plants on Leukemia Cell Lines and Immune Cells, Laporan Penelitian, Universiti Putra Malaysia, Malaysia. PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 38 Mc. Clure, 1986. Physiology of Flavonoids in Plants. Plant Flavonoids in Biology and Medicine: Biochemical, Pharmaceutical and Structure-Activity Relaionships. Alan R. Liss, Inc. p: 77-85. Meydani, S., Wu, D., Santos, M., Hoyek, M., 1995, Antioxidant and immune response in aged person overview of present avidience, Am. J. Clin. Nutr. 62, 1462 S- 1476. Miksusanti, 2010, Proliferasi Sel Limfosit Secara In Vitro oleh Minyak Atsiri Temu Kunci dan Film Edibel Anti Bakteri, Jurnal Penelitian Sains, 10:0607, p.2. Namgoong, S., Son, K., Chang, H., Kang, S., Kim, H., 1994, Effects of naturally occurring flavonoids on Mitogen-induced Lymphocyte Proliferation and Mixed Lymphocyte Culture, Life Science, vol. 54 issue, pp. 313-320. Pakki, E., 2007, Sediaan Bentuk Suspensi, V, DIPA Universitas Hasanudin, Makasar. Patil, U., Jaydeokar, A., Bandawane, D., 2012, Immunomodulators : Pharmacological Review, International Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, Vol 4, Suppl 1. Phillip, A. H., Garai, A.S., and Valenzuela, M.A., 2006, Reduction of Doksorubisin (Adriamycin) Bone Marrow Toxicity, Journal of Pharmaceutical Sciences, Volume 64 Issue 9, pp. 1574 – 1576. Prosecus, 2006, Biosynth : Chemistry and Biology, http://www.biosynth.com/, diakses tanggal 17 Februari 2013. Putri, H., 2012, Aktivitas Ekstrak Etanolik Kulit Jeruk Purut (Citrus hystrix D.C.) sebagai Agen Imunomodulator Terhadap Efek Imunosupresi Doksorubisin Pada Tikus Galur Sparague Dawley, Skripsi, Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta. Ramadhani, I., 2009, Efek Konsumsi Air Minum Penambah Oksigen Terhadap Proliferasi Sel Limfosit Manusia, Skripsi, 56-57, Institut Pertanian Bogor, Bogor. Robbins dan Cotran, 2008, Dasar Patologis Penyakit, EGC, Jakarta, pp. 174-178. Ronald A., dan Richard A., 2004, Tinjauan Klinis Hasil Pemeriksaan Laboratorium, EGC, Jakarta. Shah, B.N., Seth, A.K., and Desai, R.V., 2010, Phytopharmacological Prodile of Lagenaria siceraria: A Review, Asian Journal of Plant Sciences, 9 (3), 152-157. Siswandono, Soekardjo, B., 2000, Kimia Medisinal, Edisi 2, Airlangga University, Surabaya. Stepankova, J., Malina, J., Kasparkova, J., Brabec, V., 2010, DNA Modifications by Doxorubicin Activated by Hexamethylenetetramine and Processing of These Modifications by a DNA Helicase, Department of Biophysics, Faculty of Sciences, Palacky University, Czech Republic. Tsao, A., Kim, S., and Hong, W., 2004, Chemoprevention of Cancer, J. Clin: 54: 150- 180. Voigt, R., 1984, Buku Pelajaran Teknologi Farmasi, Edisi Kelima, Gadjah Mada University Press, Yogyakarta. PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 39 Wang, H., Cheng, H., Wang, F., Wei, D., dan Wang, X., 2010, An improved 3(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT) reduction assay for evaluating the viability of Escherichia coli cells, Journal of Microbiological Methods, 82 (2010) 330–333, Shanghai 200237, China. Widjanarko, A., 2002, Penatalaksanaan Kanker Payudara Terkini, Pustaka Populer Obor, Jakarta, pp. 78,79. Wijayakusuma, H., 2008 , Atasi kanker dengan tanaman obat, Puspa swara, Jakarta, pp. 2-3. Winarsi, H., 2012, Protein Kedelai dan Kecambah, Penerbit Kanisius, Yogyakarta, p. 192. Koirewoa, Y., Fatimawali, Wiyono, W., 2012, Isolasi dan Identifikasi Senyawa Flavonoid Dalam Daun Beluntas (Pluchea indica L.), Skripsi, UNSRAT, Manado. Zhang, X., Li, W., Wu, Y., and Gao, M., 2005, Amelioration of DoxorubicinInduced Myocardial Oxydative stress and imunosuppresion by Grape Seed Proanthocyanidins in tumour-bearing Mice, J Pharm Pharmacol, 57, 8, 1043-1051. PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 40 LAMPIRAN PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI Lampiran 1. Foto Ekstrak Buah L. siceraria dalam CMC Na 1% Lampiran 2. Foto Buah L. siceraria 41 PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI Lampiran 3. Komposisi Media Tumbuh Limfosit 1. Medium RPMI RPMI : 10,4 g NaHCO3 :2g Hepes : 2,6 g Aquades add 1000 mL 2. Medium Komplit Medium RPMI : 100 mL FBS : 10 mL Penstrep : 1 mL Fungison : 5 mL 42 PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 43 Lampiran 4. Data Orientasi Proliferasi Limfosit tiap Kelompok Kontrol Kelompok Rasio Proliferasi Kontrol Pelarut 1,07 Kontrol Doksorubisin 1,01 1,11 Kontrol Ekstrak Lampiran 5. Data Rasio Proliferasi Limfosit Tahap Pengujian Kelompok Kontrol Pelarut Kontrol Doksorubisin Ekstrak Dosis 1000 mg/kg BB Ekstrak Dosis 750 mg/kg BB Ekstrak Dosis 500 mg/kg BB Replikasi Rata-rata OD (+) PHA Rata-rata OD (-) PHA Rasio Proliferasi 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 0.297 0.293 0.295 0.311 0.298 0.253 0.268 0.279 0.279 0.280 0.287 0.273 0.272 0.300 0.298 0.350 0.302 0.295 0.297 0.286 0.284 0.296 0.296 0.291 0.292 0.279 0.280 0.275 0.285 0.284 0.250 0.270 0.276 0.275 0.269 0.276 0.274 0.260 0.292 0.289 0.334 0.278 0.275 0.280 0.276 0.274 0.265 0.279 0.271 0.279 1.065 1.046 1.074 1.091 1.049 1.012 0.993 1.011 1.015 1.041 1.040 0.996 1.046 1.027 1.031 1.048 1.086 1.073 1.061 1.036 1.036 1.117 1.061 1.074 1.047 PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 44 Lampiran 6. Analisis statistik proliferasi limfosit pengaruh ekstrak etanol buah labu air (Lagenaria siceraria) pada berbagai variasi dosis terhadap imunosupresan doksorubisin One-Sample Kolmogorov-Smirnov Test Kelompok Proliferasi N 25 25 3.00000 1.04704 1.443376 .029762 Absolute .156 .114 Positive .156 .114 Negative -.156 -.075 Kolmogorov-Smirnov Z .779 .569 Asymp. Sig. (2-tailed) .579 .902 Normal Parameters a Mean Std. Deviation Most Extreme Differences a. Test distribution is Normal. Oneway Descriptives Proliferasi 95% Confidence Interval for Mean N Mean Std. Deviation Std. Error Lower Bound Upper Bound Min Max Kontrol Pelarut 5 1.06500 .018534 .008289 1.04199 1.08801 1.046 1.091 Kontrol Doksorubisin 5 1.01440 .017199 .007692 .99304 1.03576 .993 1.041 Ekstrak dosis 1000 5 1.02800 .019378 .008666 1.00394 1.05206 .996 1.046 Ekstrak dosis 750 5 1.06082 .019750 .008832 1.03630 1.08534 1.036 1.086 Ekstrak dosis 500 5 1.06700 .031409 .014046 1.02800 1.10600 1.036 1.117 Total 25 1.04704 .029762 .005952 1.03476 1.05933 .993 1.117 PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 45 Test of Homogeneity of Variances Proliferasi Levene Statistic df1 .603 df2 Sig. 4 20 .665 ANOVA Proliferasi Sum of Squares Df Mean Square F Sig. Between Groups .012 4 .003 6.112 .002 Within Groups .010 20 .000 Total .021 24 Post Hoc Multiple Comparisons Proliferasi Scheffe 95% Confidence Interval (I) Kelompok (J) Kelompok Mean Difference (I-J) Std. Error K. Pelarut K. Doxorubicin .050600* .013831 .030 .00377 .09743 EELA 1000 .037000 .013831 .171 -.00983 .08383 EELA 750 .004180 .013831 .999 -.04265 .05101 EELA 500 -.002000 .013831 1.000 -.04883 .04483 K. Doxorubicin K. Pelarut * -.050600 .013831 Sig. Lower Bound Upper Bound .030 -.09743 -.00377 EELA 1000 -.013600 .013831 .911 -.06043 .03323 EELA 750 -.046420 .013831 .053 -.09325 .00041 EELA 500 -.052600 * .013831 .023 -.09943 -.00577 PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI EELA 1000 EELA 750 EELA 500 K. Pelarut -.037000 .013831 .171 -.08383 .00983 K. Doxorubicin .013600 .013831 .911 -.03323 .06043 EELA 750 -.032820 .013831 .268 -.07965 .01401 EELA 500 -.039000 .013831 .135 -.08583 .00783 K. Pelarut -.004180 .013831 .999 -.05101 .04265 K. Doxorubicin .046420 .013831 .053 -.00041 .09325 EELA 1000 .032820 .013831 .268 -.01401 .07965 EELA 500 -.006180 .013831 .995 -.05301 .04065 K. Pelarut .002000 .013831 1.000 -.04483 .04883 K. Doxorubicin .052600* .013831 .023 .00577 .09943 EELA 1000 .039000 .013831 .135 -.00783 .08583 EELA 750 .006180 .013831 .995 -.04065 .05301 *. The mean difference is significant at the 0.05 level. Homogeneous Subsets Proliferasi Scheffe Subset for alpha = 0.05 N 1 Kontrol Doxorubicin 5 1.01440 EELA 1000 mg/kg BB 5 1.02800 1.02800 EELA 750 mg/kg BB 5 1.06082 1.06082 Kontrol Pelarut 5 1.06500 EELA 500 mg/kg BB 5 1.06700 Kelompok Sig. 46 .053 Means for groups in homogeneous subsets are displayed. 2 .135 PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI Lampiran 7. Surat Ethical Clearence Penelitian 47 PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 48 BIOGRAFI PENULIS Skripsi yang berjudul ”Pengaruh Ekstrak Etanolik Buah Labu Air (Lagenaria siceraria (Mol.) Standley) sebagai Imunomodulator melalui Pengamatan Proliferasi Limfosit pada Tikus Jantan Galur Sprague Dawley yang Dipejani Doksorubisin” ini ditulis oleh Joseph Singgih Dwilaksono. Penulis merupakan anak kedua dari tiga bersaudara, yang lahir di Magelang, Jawa Tengah pada tanggal 17 Agustus 1992. Pada tahun 1997, penulis menempuh pendidikan di SD Kanisius Borobudur Magelang hingga tahun 2003. Pada tahun 2003 – 2006 penulis menempuh pendidikan menengah pertama di SMP Kanisius Borobudur Magelang. Selepas dari pendidikan menengah pertama penulis melanjutkan pendidikan di SMA Marsudirini Muntilan Magelang pada tahun 2006 – 2009. Selanjutnya mulai tahun 2009 penulis melanjutkan pendidikan di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. Pada tahun 2010 penulis pernah menjabat sebagai Sie Kesenian Titrasi (Tiga Hari Temu Akrab Farmasi). Pada tahun 2011 menjabat kembali dalam kepanitiaan Titrasi sebagai Steering committee. Pada tahun 2012 penulis lolos Program Kreativitas Mahasiswa (PKM-M) didanai DIKTI. Penulis juga menjadi Asisten Praktikum Kimia Organik (2010), Praktikum Biokimia (2010), Praktikum Farmakognosi-Fitokimia (2011), dan Praktikum Kromatografi (2011).