PDF

advertisement
Riset Informasi Kesehatan, Vol. 5, No. 2
Juni 2015
Isolasi dan penapisan aktinomiset penghasil senyawa antibakteri
dari lingkungan
1
1
Nur Antriana
Departemen Biologi, Institut Pertanian Bogor
,
ABSTRAK
Latar Belakang: : Aktinomiset merupakan bakteri Gram positif yang memiliki potensi besar untuk
dikembangkan sebagai agen hayati. Aktinomiset memiliki kemampuan menghasilkan senyawa metabolit
sekunder yang berperan sebagai antimikrob. Penelitian ini merupakan penelitian eksplorasi yang
bertujuan untuk menguji kemampuan isolat aktinomiset yang berasal dari rizosper tanaman jeruk (Citrus
aurantifolia) di sekitar pekarangan FPIK IPB Dramaga.
Metode: Metode isolasi pada penelitian ini menggunakan metode cawan sebar dan uji antagonis
dengan bakteri uji yaitu EPEC (Enterophatogenic Escherichia coli) dan Staphylococcus aureus.
Hasil: Enam isolat berhasil diisolasi, keenam isolat kemudian diidentifikasi secara morfologi dan
karakteristik pertumbuhan pada media agar. Dari enam isolat dua diantaranya memiliki kemampuan
dalam menghambat bakteri uji S. aureus dan EPEC. Kedua isolat tersebut yaitu isolat 3 memiliki
diameter zona hambat terhadap bakteri S. Aureus sebesar 1.85 cm dan isolat 1 memiliki zona hambat
terhadap EPEC sebesar 0.65 cm.
Kesimpulan: Isolat 1 dan 3 memiliki kemampuan dalam menghambat pertumbuhan bakteri uji.
Kata Kunci
: Aktinomiset, Agen hayati, Staphylococcus aureus, EPEC
PENDAHULUAN
Aktinomiset dikenal sebagai bakteri
yang bersifat saprob dan sangat umum
dijumpai di rizosfer hingga lapisan tanah
dalam. Aktinomiset merupakan kelompok
mikroorganisme dengan distribusi terbesar di
alam khususnya pada tanah1. Tanah rizosfer
adalah tanah yang menempel pada
perakaran tanaman yang banyak terdapat
bakteri, jamur, dan Aktinomiset dibanding
tanah non rizosfer. Mikrob tanah tersebut
merupakan sumber penting antibiotik2.
Aktinomiset merupakan anggota yang
dominan dari populasi mikrob tanah dan
mempunyai
kemampuan
menghasilkan
antibiotik dengan spektrum luas. Bakteri
aktinomiset dikelompokkan kedalam bakteri
Gram positif dan dibandingkan dengan
kelompok bakteri lain mempunyai perbedaan
yang istimewa yaitu mengalami pembelahan
morfologis yang kompleks.
Pengendalian
mikrob
patogen
menggunakan antibiotik sedikit demi sedikit
mulai ditinggalkan karena penggunaan
antibiotik yang berlangsung secara terus
menerus dapat menyebabkan resistensi
pada bakteri patogen. Oleh sebab itu
pengendalian mikrob patogen dengan
menggunakan agen hayati menjadi salah
satu pilihan yang sangat menjanjikan, salah
satu agen hayati yang memiliki potensi yang
sangat
besar
diantaranya
adalah
aktinomiset. Aktinomiset dapat berperan
sebagai agen pengendali hayati dengan cara
melakukan kompetisi, parasitisme, dan
menghasilkan senyawa metabolit sekunder3.
Aktinomiset merupakan kelompok mikrob
yang paling banyak menghasilkan senyawa
bioaktif antibiotik, antifungi, dan antibakteri4.
Hasil skrining Aktinomiset dari tanah
pertanian di Turki oleh diperoleh 50 isolat
Aktinomiset yang berbeda, 17 isolat
Aktinomiset diantaranya sangat potensial
sebagai antibakteri untuk bakteri Gram
positif maupun Gram negatif1. Aktinomiset
yang berasal dari tanah sawah bersifat
sebagai antibakteri terhadap Staphylococcus
aureus tetapi tidak untuk Escherichia coli5.
Namun Aktinomiset yang berasal dari
rizosper putri malu mampu menghambat
pertumbuhan E.coli.
Banyak aktinomiset yang memiliki
kemampuan untuk mensintesis metabolit
sekunder seperti enzim, herbisida, pestisida,
dan antibiotik lainnya6,7. Aktinomiset memiliki
banyak senyawa bioaktif penting yang
bernilai ekonomi tinggi dan tercatat
merupakan
mikroorganisme
yang
menghasilkan banyak senyawa bioaktif baru.
Aktinomiset
dikenal
sebagai
bakteri
115
Riset Informasi Kesehatan, Vol. 5, No. 2
Juni 2015
penghasil antibiotik, karena lebih dari 10.000
antibiotik yang telah ditemukan, dua
pertiganya dihasilkan oleh bakteri ini8.
Berdasarkan uraian di atas, eksplorasi
sumber penghasil antibiotik baru yang
berasal dari aktinomiset yang memiliki
aktivitas antimikrob perlu dilakukan.
METODE PENELITIAN
Sampel tanah berasal dari perakaran
tanaman jeruk nipis (Citrus aurantifolia) di
sekitar pekarangan FPIK IPB Dramaga.
Metode
yang
digunakan
adalah
pengenceran berderet yang dilanjutkan
dengan metode cawan sebar. Sebanyak 1 gr
sampel tanah dimasukkan ke dalam 9 mL
H2O dihomogenkan dengan vortex selama
30 menit kemudian membuat pengenceran
bertingkat dengan serial pengenceran 10 -1,
10-2, 10-3, dan 10-4 (duplo) dengan cara
disebarkan dengan batang penyebar steril
sampai benar-benar meresap kedalam
media Humic-acid Vitamin-B agar (HV)
setelah itu diinkubasi selama 7-10 hari pada
suhu ruang di dalam ruang tertutup.
Aktinomiset
hasil
isolasi
kemudian
dimurnikan menggunakan tusuk gigi steril
hingga diperoleh koloni tunggal pada media
agar-agar International Streptomyces Project
No.2 (ISP2) selanjutnya diinkubasi pada
suhu ruang selama 7-10 hari. Aktinomiset
yang telah murni kemudian diamati secara
morfologi dan mikroskopis.
Potensi
aktinomiset
sebagai
penghasil senyawa antimikrob: uji antagonis
langsung aktinomiset dilakukan dengan cara
sebanyak 0.1 mL biakan bakteri target
dicampur ke dalam media NA lunak (8%)
hangat, kemudian dihomogenkan dan
dituang pada cawan yang telah diisi dengan
media NA steril, media dibiarkan memadat.
Beberapa koloni aktinomiset berumur 7 hari
hasil pemurnian diambil menggunakan
sedotan steril, inokulasi dilakukan terbalik di
atas cawan media yang telah mengandung
media target (1 cawan bakteri berisi 3 koloni
aktinomiset) kemudian diinkubasi selama 24
jam pada suhu ruang. Pengamatan
dilakukan dengan mengukur diameter zona
hambat yang terbentuk. Bakteri target yang
digunakan adalah EPEC (Enterophatogenic
Escherichia coli) dan S. aureus yang
berumur 14 jam dalam NA. Bakteri uji yang
digunakan berasal dari koleksi IPB culture
collection Bogor.
HASIL
Hasil isolasi aktinomiset pada media
HV agar diperoleh sebanyak enam isolat.
Koloni tersebut kemudian dimurnikan pada
media ISP2 (Gambar 1). Koloni aktinomiset
yang diperoleh kemudian diamati morfologi
dan pigmentasinya serta karakteristik
pertumbuhan pada media agar.
Aktinomiset dapat dibedakan dari bakteri lain
dengan mudah dengan melihat bentuk
koloninya
di
medium
agar.
Koloni
Aktinomiset nampak keras seperti tumbuh
akar di dalam agar-agar (Gambar 1),
Pigmentasi hasil purifikasi koloni aktinomiset
disajikan pada tabel 1.
Karakteristik mikroskopis berupa hifa
aerial secara jelas tampak pada isolat-isolat
hasil purifikasi (Gambar 2) dimana isolat 1
memiliki morfologi mikroskopis berupa hifa
retinaculum apertum (RA) dimana rantai
sporanya memiliki lilitan yang terbuka,
berkait dan memiliki perpanjangan spiral
dengan diameter yang lebar; isolat 2
memiliki morfologi mikroskopis berupa
monoverticillus gelungan terdistribusi secara
vertical
pada
tangkai
hifa
tunggal
berlengkung di bagian ujung, dan berfilamen
lurus; isolat 3 memiliki morfologi mikroskopis
berupa rectus atau lurus; isolat 4 memiliki
morfologi mikroskopis berupa flexibilis atau
flexuous; isolat 5 memiliki morfologi
mikroskopis berupa spiral dimana rantai
sporanya sederhana tidak ada percabangan
dan spiralnya terbuka; dan Isolat 6 memiliki
morfologi mikroskopis berupa biverticillus
dimana rantai spora mimiliki hifa dengan
percabangan kompleks dan berbentuk spiral.
Sebanyak 6 isolat kemudian dilakukan
uji antagonis pada dua isolat uji yaitu EPEC
dan S. aureus. Isolat-isolat tersebut
ditumbuhkan pada media yang sebelumnya
telah ditambahkan dengan bakteri uji.
Setelah inkubasi selama 24 jam, dilakukan
pengukuran zona hambat (Tabel 2). Hasil
pengukuran zona hambat menunjukkan
116
Riset Informasi Kesehatan, Vol. 5, No. 2
Juni 2015
Gambar 1.
Hasil purifikasi isolat aktinomiset pada media ISP2
Gambar 2. Pengamatan mikroskopis pada koloni isolat aktinomiset perbesaran 40x
Tabel 1. Keragaman koloni isolat aktinomiset asal tanah perakaran tanaman jeruk nipis
(Citrus aurantifolia)
No Isolat
1
2
3
4
5
6
Karakteristik Warna
Miselium aerial
Putih
Abu-abu
Putih
Perak
Putih
Putih
Miselium substrat
Abu-abu
Abu-abu
Kuning
Abu-abu
Perak
Abu-abu
Bahwa isolat e memiliki ideks zona hambat
tertinggi pada bakteri uji S (Gambar 3).
Sedangkan isolat 1 memiliki zona hambat
tertinggi pada bakteri uji EPEC. Sementara
itu isolat 3 memiliki zona hambat tertinggi
pada bakteri uji S. Aureus. Isolat 2,4, 5 dan 6
menunjukkan zona hambat yang kecil pada
EPEC dan S. aureus.
PEMBAHASAN
Hasil isolasi pada media HV setelah 7
hari inkubasi pada suhu ruang menghasilkan
beberapa koloni aktinomiset. Media HV agar
merupakan media yang digunakan untuk
mengisolasi aktinomiset. Media ini biasanya
disuplementasi dengan berbagai macam
antibiotik seperti asam nalidiksat untuk
menekan pertumbuhan bakteri gram negatif
dan
sikloheksamida
untuk
menekan
pertumbuhan cendawan.
Keberadaan aktinomiset di dalam
tanah diduga mampu meregulasi komunitas
mikrob akibat berbagai senyawa aktif yang
dihasilkannya, selain pengaruh suhu, pH,
oksigen, dan air. Aktinomiset mewakili 20%
bakteri tanah yang menghasilkan senyawa
metabolit sekunder9. Aktinomiset adalah
salah satu kelas dari filum bacteria, ordo
Actinomycetales dan genusnya dapat
dibedakan
menjadi
dua
kelompok
berdasarkan ciri morfologi dan kandungan
kimiawi dalam dinding selnya yaitu
Streptomyces dan Non-Streptomyces10,11
Aktinomiset secara umum hampir
menyerupai cendawan karena mempunyai
ciri: a) miselium aktinomiset mempunyai
karakter percabangan yang luas; b) seperti
117
Riset Informasi Kesehatan, Vol. 5, No. 2
Juni 2015
.
Gambar 3. Hasil uji antagonis 6 isolat aktinomiset terhadap EPEC dan S. aureus
Tabel 2.Indeks zona hambat isolat-isolat aktinomiset terhadap bakteri uji
Bakteri Uji
S. aureus
EPEC
1
0
0.65
2
1.00
0
Diameter zona hambat (cm)
3
4
1.85
0.10
0
0.22
umumnya
cendawan,
aktinomiset
membentuk miselium udara dan konidia;
c) pertumbuhan aktinomiset pada kultur cair
jarang menghasilkan kekeruhan seperti
umumnya
bakteri
uniseluler,
tetapi
membentuk pelet-pelet seperti cendawan,
berbeda dengan bakteri lain yang koloninya
lunak di atas agar-agar.
Dari hasil penelitian diperoleh enam
isolat aktinomiset. Keenam isolat tersebut
kemudian dimurnikan, setelah dilakukan
pengamatan secara makroskopis dan
mikroskopis diperoleh bahwa isolat tersebut
merupakan genus Streptomyces.
Genus Streptomyces memiliki ciri-ciri
diantaranya adalah berfilamen dengan
diameter 0.5–1 μm, aerob, bakteri Gram
positif dan berproduksi seksual dengan
spora yang dihasilkan miselium aerial10.
Miselium vegetatif merupakan kumpulan hifa
yang tumbuh di dalam substrat. Miselium
aerial merupakan kumpulan hifa yang
tumbuh secara vertikal menembus substrat
dan secara permanen berhubungan dengan
udara. Selain itu, identifikasi koloni
aktinomiset pada genus Streptomyces dapat
5
0.22
0.33
6
0
0.22
dilakukan dengan mengamati morfologi
rantai sporanya secara mikroskopis12.
Aktinomiset
memiliki
kemampuan
untuk
mensintesis
banyak
senyawa
metabolit sekunder yang berbeda seperti
antibiotik
dan
enzim13.
Aktinomiset
menghasilkan 60% dari total antibiotik dan
Streptomyces mencakup sekitar 80% dari
aktinomicet14. Penggunaan isolat aktinomiset
berumur
7
hari
bertujuan
untuk
menghasilkan senyawa metabolit sekunder
dari bakteri Aktinomiset. Metabolit sekunder
dihasilkan pada saat bakteri menjelang fase
stasioner.
Keenam isolat kemudian dilakukan
pengujian sifat antagonis dengan bakteri uji
yaitu EPEC dan S. aureus. Dari hasil
penelitian diperoleh bahwa isolat 3 memiliki
indeks zona hambat tertinggi pada bakteri uji
S. aureus dan isolat 1 memiliki zona hambat
tertinggi pada bakteri uji EPEC. Hal ini
sejalan dengan hasil penelitian yang
melaporkan bahwa aktinomiset mampu
menghambat pertumbuhan patogen pada
manusia diantaranya E. coli dan S. aureus15.
Lestari (2006) juga melaporkan bahwa isolat
118
Riset Informasi Kesehatan, Vol. 5, No. 2
Juni 2015
Streptomyces spp. yang diisolasi dari tanah 7.
di daerah Sukabumi, Kepulauan Seribu,
Cipanas, dan Kalimantan Timur mampu
menghasilkan senyawa antibakteri yang
mampu menghambat pertumbuhan bakteri
patogen seperti Bacillus subtilis, dan 8.
Xanthomonas axonopodis7. Kemampuan
aktinomiset dalam menghasilkan senyawa
antibiotik sangat ditentukan oleh sumber
nutrisi yang tersedia16.
9.
KESIMPULAN
Sebanyak 6 isolat aktinomiset
berhasil diisolasi dari tanah asal perakaran
tanaman jeruk nipis (Citrus aurantifolia) di
sekitar pekarangan FPIK IPB Dramaga. 10.
Hasil uji antagonis terhadap bakteri patogen,
isolat 3 menghasilkan zona bening tertinggi
terhadap bakteri uji S. aureus sedangkan
isolat 1 menghasilkan zona bening tertinggi 11.
terhadap E. coli.
DAFTAR PUSTAKA
1. Oskay M, et al. Antibacterial activity of
some actinomycetes isolated from
farming soils of turkey. African J
Biotechnol. 2004; 3(9): 441-446.
2. Puryatiningsih RA. Isolasi streptomyces
dari rizosfer familia poaceae yang
berpotensi
menghasilkan
antibiotik
terhadap Escherichia coli. Skripsi.
Fakultas
Farmasi
Universitas
Muhammadiyah Surakarta; 2009.
3. Barreto TR, et al. Population densities
and genetic diversity of actinomycetes
associated to the rhizosphere of
theobroma cacao. Brazil J Microbiol.
2008; 39(3):464–470.
4. Atlas R. 1998. Principle of microbiology.
USA: Brown Publisher.
5. Ambarwati,
Gama
A.
Isolasi
actinomycetes dari tanah sawah sebagai
penghasil antibiotik. J Penelitian Sains
dan Teknol. 2009; 10 (2):110-111.
6. Cross T. Actinomycetes: A Continuing
Sources of New Metabolites. Inggris:
Invitation ONR Lecture. Postgraduate
School of Studies in Biological Science,
University of Bradford; 1998.
12.
13.
14.
15.
16.
119
Lestari Y. Identification of indigenous
streptomyces
spp.
Producing
antibacterial
compounds.
Journal
Mikrobiology Indonesia. 2006; 11(2): 99101.
Miyadoh S, Misa. Workshop on isolation
methods
and
classification
of
actinomycetes. Bogor: Biotechnology
Center, Indonesian Institute of Sciences;
2004.
Schmidt A, et al. Heavy metal resistance
mechanisms in actinobacteria for
survival in amd contaminated soils.
Chemie der Erde Geochemistry. 2005;
65: 131–144.
Holt JG, et al. Bergey’s manual of
determinative bacteriology. Ed ke-9.
Baltimore:
Williams
and
Wilkins
Company; 1994.
Madigan MT, et al. Brock, biology of
microorganism. Ed ke-9. New Jersey:
Prentice-Hall; 2000.
Shirling EB, Gottlieb D. Methods for
characterization
of
streptomyces
species.
International
Journal
of
Systematic Bacteriology. 1996; 16(3):
313-340.
Moncheva P, et al. Characteristics of soil
actinomycetes from Antarctica. J Culture
Collections. 2002; 3: 3-14.
Arifuzzaman., et al. Isolation and
screening
of
actinomycetes
from
sundarbans soil for antibacterial activity.
African J Biotechnol. 2010; 9(29): 46154619.
Rakshanya U, et al. Antagonistic activity
of actinomycetes isolates against human
pathogen. J Microbiol Biotechnol
Research. 2011; (2): 74-79.
Gesheva V. Rhizosphere microflora of
some citrus as a source of antagonistic
actinomycetes. European J Soil Biol.
2005; 38:85-88.
Download