Dr. Risya Cilmiaty AR, drg,M.Si,Sp.KG– Fakultas Kedokteran UNS 1

BAB 1
PENDAHULUAN
Dr. Risya Cilmiaty A.R., drg,M.Si,Sp.KG
Bagian/SMF Gigi dan Mulut Fakultas Kedokteran UNS
[email protected]
1.1
Pengantar
Periapikal kronis merupakan lesi dasar inflamasi periapikal yang disebabkan oleh
iritan pada pulpa nekrotik yang masuk ke jaringan periapikal. Di bidang ilmu Kedokteran
Gigi kasus yang melibatkan periapikal kronis pada pulpa nekrosis dapat secepat mungkin
disembuhkan melalui perawatan saluran akar. Paparan iritan yang terus menerus pada
jaringan periapikal akan menghasilkan suatu pertahanan inang berupa granuloma periapikal.
Proses penyembuhan granuloma periapikal dimungkinkan terjadi kekambuhan setelah
perawatan saluran akar atau berkembang menjadi kista radikular,yang semakin sulit untuk
disembuhkan. Mengingat hal ini, bila proses perjalanan menuju granuloma dapat dicegah
maka berbagai kesulitan proses penyembuhan granuloma periapikal dapat diatasi. Sejauh ini
imunopatobiogenesis granuloma periapikal yang berkembang dari periapikal kronis karena
gigi karies belum dapat dijelaskan.
Saat ini secara imunopatobiogenesis granuloma periapikal masih belum jelas, karena
masih banyak peneliti yang membahas tentang penyebab gigi yang mengalami nekrosis
pulpa. Penelitian yang berkonsep patobiologik secara univariat telah dilakukan, misalnya
TNF α (tumor necrosis factor α) dan IL-6 (interleukin-6) pada lesi periapikal (Pršo et al.,
2007). Beberapa penelitian yang berkonsep imunopatobiologik juga telah dilakukan, namun
hal ini belum menjelaskan secara tuntas, khususnya mengenai mekanisme kejadian
granuloma periapikal yang disebabkan oleh gigi karies. Selain itu bila ditinjau dari jumlah
kasus gigi nekrosis pulpa yang banyak terjadi pada pasien gigi karies, maka masih
diperlukan penelitian yang mendalam tentang mekanisme kejadian granuloma periapikal. Di
Indonesia data mengenai penyakit gigi dan mulut diderita oleh 90% penduduk, penyakit gigi
dan mulut yang banyak diderita masyarakat di Indonesia adalah penyakit jaringan penyangga
gigi dan karies gigi, sumber dari kedua penyakit tersebut akibat kebersihan rongga mulut
yang tidak baik sehingga terjadi akumulasi plak. Data ini sesuai dengan hasil survei
kesehatan rumah tangga (SKRT) 2004 yang dilakukan oleh Departemen Kesehatan RI
(Balitbangkes, 2004). Survei itu menyebut prevalensi karies gigi di Indonesia adalah 90,05
%. Di Rumah Sakit Dr. Moewardi Surakarta tercatat data pasien dari bulan Januari 2007
Dr. Risya Cilmiaty A.R., drg,M.Si,Sp.KG– Fakultas Kedokteran UNS
1
sampai dengan Desember 2007 yang berkunjung ke poli Gigi adalah 7656 orang. Dari
keseluruhan pasien yang datang, 46,7 % adalah pasien dengan diagnosis gigi karies
sedangkan 53,3% adalah dengan diagnosis yang lain. Di antara penderita gigi karies, maka
26,3 % adalah pasien dengan diagnosis nekrosis pulpa, yang sebagian besar sudah terdapat
lesi periapikal. Secara teoritis diketahui bahwa granuloma periapikal gigi karies disebabkan
karena invasi bakteri.
Gigi karies yang tidak dilakukan perawatan lambat laun akan berlanjut mencapai
bagian pulpa dan mengakibatkan keradangan pada pulpa. Keradangan pada pulpa oleh
Walton diklasifikasikan sebagai berikut: pulpitis reversibel, pulpitis irreversibel, degeneratif
pulpa dan nekrosis pulpa. Proses keradangan pulpa yang berlanjut dapat menyebabkan
kelainan jaringan periapikal, yaitu lesi periapikal yang dikelompokkan menjadi: periodontitis
simptomatik apikalis, periodontitis asimptomatik apikalis dan abses periapikal. Nobuhara
dan del Rio dalam penelitiannya menunjukkan bahwa 59,3% dari lesi periapikal merupakan
granuloma periapikal, 22% kista periapikal, 12% jaringan parut periapikal dan 6,7% lainnya
(Torabinejad and Walton , 2008).
Perubahan histologis pada jaringan periapikal oleh invasi bakteri akan
ditandai
dengan keberadaan jaringan granulasi yang berisi makrofag, limfosit, sel plasma, netrofil,
dan elemen fibrovaskular dalam jumlah bervariasi. Pada saat bersamaan akan terjadi
kerusakan jaringan periapikal dan resorpsi tulang (Radics, 2004). Granuloma periapikal
terdiri dari jaringan granulasi yang dikelilingi oleh dinding sel berupa jaringan ikat fibrous.
Pada keadaan yang kronis, cenderung memberikan gambaran keberadaan limfosit, sel
plasma, neutrofil, histiosit dan eusinofil serta sel epithelial rests of Mallessez (Garcia et al.,
2007). Limfosit merupakan tipe sel yang predominan (50%), jumlahnya berkaitan erat
dengan jumlah keseluruhan (sel T CD4 dan sel T CD8). Pada lesi kronik akan terjadi
peningkatan jumlah sel T CD8. Semua struktur tersebut dikelilingi oleh kapsul jaringan ikat
fibrus yang terdiri dari limfosit T CD8 (Radics, 2004). Granuloma periapikal diinduksi oleh
infeksi bakteri pada pulpa gigi dan mengakibatkan kerusakan pada tulang alveolar di
sekelilingnya, keadaan ini terutama disebabkan oleh IL-1, IL-12 yang diekspresikan oleh
makrofag (Graves et al., 2000; Sasaki et al., 2004). Pulpa nekrosis merupakan proses lanjut
dari radang jaringan pulpa dan kematian pulpa, hal ini sebagai akibat kegagalan jaringan
pulpa dalam mengusahakan pemulihan/ penyembuhan (Grossman, 1988; Simon, 1994). Pada
kondisi patologis granuloma periapikal sering dijumpai dan pada umumnya merupakan akibat
dari gigi karies (Pršo et al., 2007). Proses karies merupakan proses patologis yang kronis,
dapat menimbulkan berbagai perubahan pada jaringan pulpa, antara lain berupa respons
Dr. Risya Cilmiaty A.R., drg,M.Si,Sp.KG– Fakultas Kedokteran UNS
2
imun. Mikroorganisme yang terdapat pada jaringan gigi yang karies merupakan imunogen
yang potensial untuk memicu respons imun (Morse, 1977; Trowbridge, 1990).
Bakteri
merupakan faktor penting pada perkembangan dan pertumbuhan gigi karies.
Bakteri
berkoloni di sistem saluran akar, membuat akses ke jaringan pulpa melalui tubulus dentinalis
atau ramifikasi apikal dan pergerakan cairan dentin pada gigi yang karies, sehingga akan
menimbulkan respons imun. Pemeriksaan kultur bakteri dari jaringan periapikal gigi nekrosis
ditemukan bakteri anaerob jenis Porphyromonas sp., Peptostreptococcus sp., dan Prevotella
intermedia (Baumgartner, 1997; Garcia et al., 2007). Namun sampai saat ini penjelasan
mengenai imunopatobiogenesis granuloma periapikal belum terungkap dengan jelas.
Berdasar berbagai hasil penelitian yang telah ada dan hasil ekstrapolasi serta sintesis
maka dideduksikan mekanisme kejadian granuloma periapikal melalui gigi karies yang
disebabkan invasi bakteri sebagai berikut: diawali bakteri yang masuk melalui gigi karies
selanjutnya akan masuk sampai ke jaringan periapikal melalui saluran akar. Bakteri sampai di
jaringan periapikal akan ditangkap dan dihancurkan oleh histiosit. Keberadaan bakteri yang
merupakan patogen memicu perkembangan histiosit menjadi makrofag (angry macrophage)
dan APC (Antigent precenting cell) yang mendorong kejadian granuloma. Di sisi lain histiosit
berkembang menjadi fagosit sehingga tidak terjadi granuloma.
Pada Angry macrophage, LPS dari bakteri menginduksi reaksi inflamasi melalui
TLR-4 di permukaan makrofag, dengan perantaraan CD-14 akan memicu sinyal transduksi
intraseluler sehingga terjadi aktivasi IRAK (Interleukin-1 Receptor Associated Kinase).
Interleukin-1 receptor associated kinase akan mengaktifkan TRAF-6 (TNF-α Receptor
Associated Factor-6), dan TRAF6 ini akan mengaktivasi TAK (TGF-β Activated Kinase).
Kemudian TAK akan mengativasi Iκ-β kinase, selanjutnya Iκ-β kinase (IKK) menghambat
Iκ-β. Molekul Hsp60 diproduksi melalui jalur non klasik yang diperlukan sebagai chaperone
untuk memicu sitokin dan memfungsionalkan protein (IFN-γ dan nuclear factor kappa
beta/NFκ-β). Hsp60 ini akan menghambat Iκ-β, selanjutnya Hsp60 dan Iκ-β akan
mengaktivasi NFκ-β, sehingga akan
mengalami translokasi ke inti dan memicu faktor
transkripsi pada inti untuk menghasilkan IL-12. Selain menghambat Iκ-β, Hsp60 akan
mengapoptosis sel Thelper2 (Th2) sehingga mengakibatkan peningkatan sel Th1.
Peningkatan sel Th1 juga diinduksi oleh IL-12, yang mengakibatkan produksi sel penghasil
IFN-γ meningkat. Molekul IFN-γ yang meningkat akan memicu limfosit CD-8 untuk
proliferasi, sehingga terjadi peningkatan limfosit CD-8 dan limfosit CD-8 yang aktif akan
mensekresi IFN-γ, sehingga terjadi peningkatan IFN-γ. Molekul IFN-γ (dari angry
macrophage & limfosit CD-8) akan memicu pembentukan granuloma (Doyle and O’neill,
Dr. Risya Cilmiaty A.R., drg,M.Si,Sp.KG– Fakultas Kedokteran UNS
3
2006; Hayden et al., 2006; Stolzing et al., 2006; Siqueira and Roqas, 2007, Abbas et al.,
2007; Amorim and Moseley, 2010).
Di dalam proses APC, Hsp60 sebagai chaperone berperan dalam alur fraksi protein
yang terlibat dalam APC. Sel host yang mengalami distress akibat paparan imunogen yang
terus menerus, akan menghasilkan Hsp60.
Hsp60 yang disintesis dalam exosome
dan
digunakan untuk membantu sintesis dan maturasi sehingga menjadi protein yang fungsional.
Dengan demikian pemrosesan epitop berjalan sehingga akan ditampilkan ke permukaan sel
dan dikenal oleh CTL/limfosit CD-8 yang selanjutnya akan mensekresikan IFN-γ (Clancy,
1998; Abbas et al., 2009).
Berdasarkan dua jalur ini, maka IFN-γ yang dilepas oleh Th-1 maupun oleh CTL/
CD-8 akan menginduksi aktivitas makrofag (IFN-γ bersifat MCF/Macrophage chemotactic
factor). Makrofag tersebut akan migrasi mengelilingi sel histiosit yang mengandung bakteri
intraseluler, sehingga terbentuk granuloma. Apabila bakteri yang difagositosis oleh makrofag
dan memicu reaksi inflamasi akan menghasilkan IL-12. Sitokin ini akan merangsang Th-1
untuk mensekresi IFN-γ, namun IFN-γ yang dihasilkan oleh Th-1 dan limfosit CD-8 tidak
terlalu tinggi, sehingga kemampuan untuk mengaktivasi makrofag berkurang, maka tidak
terjadi pembentukan granuloma (Goldsby et al., 2000).
Solusi konseptual di atas masih memerlukan suatu penelitian yang lebih lanjut untuk
menjelaskan imunopatobiogenesis granuloma periapikal pada gigi karies, sehingga
memunculkan suatu permasalahan yang selanjutnya akan diuraikan dan dibahas pada buku
ini.
1.2 Metode Penelitian
1.2.1 Jenis penelitian
Jenis penelitian yang digunakan adalah Observasional Analitik dengan pendekatan
Cross sectional Study, dengan kurun waktu antara periode Juli 2008 sampai dengan Juli
2009.
1.2.2 Populasi, sampel, besar sampel dan teknik pengambilan sampel
a. Populasi dan sampel
Populasi target / populasi infinit penelitian adalah semua pasien yang berkunjung
ke Poli Gigi RSUD Dr. Moewardi Surakarta. Populasi Studi atau populasi finitnya adalah
pasien dengan diagnosis nekrosis pulpa (granuloma dan non granuloma periapikal) yang
Dr. Risya Cilmiaty A.R., drg,M.Si,Sp.KG– Fakultas Kedokteran UNS
4
datang ke Poliklinik Gigi dan Mulut RSUD Dr. Moewardi Surakarta, yang sudah dilakukan
pencabutan oleh dokter gigi. Sampel dipilih dari populasi studi yang memenuhi kriteria
inklusi. Gigi penderita merupakan indikasi untuk dilakukan pencabutan dan penderita telah
menyatakan kesanggupannya setelah diberi penjelasan (informed consent) tentang maksud
dan tujuan penelitian ini. Sampel dipilih dari populasi studi yang memenuhi kriteria inklusi
(purposive sampling) dari kelompok granuloma dan non granuloma.
b. Besar sampel penelitian
Besar sampel untuk pengujian hipotesis ditentukan dengan replikasi dari Steel and
Torrie (1980) dan Sastroasmoro dan Ismael (2002).
æ
ö
ç (Z1-a + Z b )s ÷
n=ç
÷
ç
÷
d
è
ø
Rumus:
2
Keterangan:
n
= besar sampel masing-masing kelompok.
Z1-α
= nilai pada kurva distribusi normal baku pada α tertentu.
Zβ
= nilai pada kurva distribusi normal baku pada β tertentu.
σ2
= varian variabel (NFκ-β, Hsp60, limfosit CD-8 dan IFN-γ) yang diteliti.
d2
= selisih rerata variabel (NFκ-β, Hsp60, limfosit CD-8 dan IFN-γ) yang
diteliti dari pasien yang datang dan pasien dengan diagnosis gigi karies.
a
= 0,05
Z1-α
= 1,645 (satu arah), karena dua arah menjadi = 1,960
b
= 0,1
Zβ
= 1, 282
σ2
= d2, karena σ2 sulit ditaksir dari literatur, studi yang sama sebelumnya atau studi
pendahuluan oleh peneliti, maka diasumsikan --- σ2 = d2.
n = 8,57 dibulatkan menjadi 9.
Analisis menggunakan uji dua arah, maka n dikalikan 2, sehingga besar sampel keseluruhan
per kelompok penelitian = 18 sampel.
c. Teknik pengambilan sampel
Sampel diambil dari jaringan periapikal gigi pasien yang sudah dilakukan pencabutan
di Poli Gigi & Mulut RSUD Dr. Moewardi Surakarta. Jaringan periapikal sebagian difiksasi
Dr. Risya Cilmiaty A.R., drg,M.Si,Sp.KG– Fakultas Kedokteran UNS
5
dengan formalin buffer 10%, kemudian dikirim ke Laboratorium Patologi Anatomi Fakultas
Kedokteran Universitas Sebelas Maret Surakarta.
d. Kriteria inklusi
1. Kronik periapikal dengan karies profunda
2. Gigi permanen
3. Tidak menderita penyakit sistemik
4. Tidak sedang minum obat antibiotik/imunosupressan
1.2.3 Variabel penelitian
Variabel penelitian meliputi: NFκ-β, Hsp60, limfosit
CD-8 dan IFN-γ,
pada
granuloma dan non granuloma periapikal gigi karies.
1.2.4 Variabel pengendali adalah:
1. Usia ( 17-57) tahun
2. Albumin darah (normal : 3,5 – 5,2 mg/dl)
3. Tidak menderita Anemia (Hemoglobin normal : 12,3 – 15,0 g/dl)
1.2.5 Definisi operasional variabel penelitian:
1.
Jaringan granuloma adalah jaringan yang mengalami inflamasi kronik pada
periapikal, yang terdiri dari jaringan granulasi, dan dindingnya dikelilingi oleh
jaringan fibrous, dengan pemeriksaan histopatologi menunjukkan keberadaan:
makrofag, limfosit, sel plasma, sel raksasa, sel fibroblas dan sel mast.
2.
Jaringan non granuloma adalah jaringan yang mengalami inflamasi kronik pada
periapikal yang secara makroskopis tidak ditemukan jaringan granuloma, dengan
pemeriksaan histopatologi menunjukkan gambaran makrofag, limfosit, sel
plasma, sel fibroblas dan sel mast.
3.
NFκ-β adalah protein yang dihasilkan oleh makrofag akibat adanya rangsangan
toksin ekstraseluler (LPS) dengan perantara CD-14 dan TLR. Untuk
mengukurnya dengan menggunakan metoda imunohistokimia yaitu dengan cara
meghitung jumlah sel makrofag yang memberikan reaksi positif terhadap anti
NFκ-β, yang dihitung pada luas sayatan jaringan granuloma.
Dr. Risya Cilmiaty A.R., drg,M.Si,Sp.KG– Fakultas Kedokteran UNS
6
4.
Hsp-60 adalah stres protein yang dihasilkan oleh makrofag yang mengandung
bakteri intraseluler. Untuk mengukurnya dengan menggunakan metoda
imunohistokimia yaitu dengan cara meghitung jumlah
makrofag yang
memberikan reaksi positif terhadap anti Hsp-60, yang dihitung pada luas sayatan
jaringan granuloma.
5.
CTL (CD-8) merupakan petanda (marker) dari limfosit sitotoksik,
untuk
mengukurnya dengan menggunakan metoda imunohistokimia yaitu dengan cara
meghitung jumlah sel yang memberikan reaksi positif terhadap anti CD-8, yang
dihitung pada luas sayatan jaringan granuloma.
6.
IFN-γ merupakan salah satu sitokin yang disekresikan oleh limfosit
(Th-
1/CD-8). Sitokin ini berperan sebagai macrophage activating factor (MAF),
untuk mengukurnya dengan menggunakan metoda imunohistokimia yaitu dengan
cara meghitung jumlah sel yang memberikan reaksi positif terhadap anti IFN-γ,
yang dihitung pada luas sayatan jaringan granuloma.
1.3 Bahan penelitian
1. Jaringan kronik periapikal (granuloma dan non granuloma)
2. Larutan penyangga 10 % (Merck)
3. Antibodi monoklonal ( anti human NFκ-β, anti human IFN-γ dan anti
limfosit human CD-8,) Lab. Vision).
4. Antibodi monoklonal anti human Hsp60 (Stressgen)
5. Kit Imunohistokimia (Ultravision plus)
6. Parafin (Merck)
7. P B S (phosphat buffer saline/ Merck )
8. Canada Balsem (mounting media/ Merck)
9. Hematoxylin (nuclear stain/ Merck)
10. Xylol (Merck)
11. Methanol (bahan dehydran/ Merck)
12. D A B (KPL)
13. Filter tips 100 ul, 200 ul
14. Microtube 10 ul, 1000 ul
15. Poly-L-Lysine (tissue adhesive/ MUTO)
1.4 Instrumen penelitian
Dr. Risya Cilmiaty A.R., drg,M.Si,Sp.KG– Fakultas Kedokteran UNS
7
Gelas objek, mikroskop, cover glass, vortex, shaker, mikro pipet, watherbath,
inkubator, centrifuge, kamera digital (Cannon), Tissue processor, Tissue cassette block.
1.5 Lokasi dan waktu penelitian
Penelitian dilakukan di Poliklinik Gigi RSUD Dr. Moewardi Surakarta, Laboratorium
Mikrobiologi FK-UNS, Laboratorium PAU-UGM, Laboratorium Patologi Anatomi FK-UNS
dan Unit Gramik UNAIR, mulai bulan Juli 2008 sampai dengan bulan Mei 2009.
1.6 Pengumpulan data
Pengumpulan sampel jaringan kronik periapikal pada gigi karies dengan indikasi
pencabutan, dilakukan di RSUD dr. Moewardi Surakarta selama bulan Juli 2008 sampai
dengan Mei 2009. Identifikasi pasien dicatat yaitu meliputi: jenis kelamin, umur, elemen
gigi, radiografik gigi.
Jaringan kronik periapikal yang berasal dari gigi karies dikumpulkan, dimasukkan ke
dalam buffer formalin 10 %, selanjutnya dilakukan pemeriksaan histopatologi dengan
pengecatan HE (hematoksilin Eusin) untuk identifikasi sampel termasuk kelompok
granuloma atau non granuloma. Pemeriksaan histopatologi jaringan periapikal dengan
perbesaran 400 kali dilakukan oleh dua orang pakar Patologi Anatomi. Hasil yang diperoleh
adalah jaringan periapikal yang telah memenuhi kriteria sebagai sampel penelitian.
Kemudian dilanjutkan dengan penghitungan sel penghasil NFκ-β, Hsp60, CD-8 dan IFN-γ
dengan metode imunohistokimia, yang dilakukan oleh dua orang pakar, kemudian hasilnya
dirata-rata.
1.7 Cara pengolahan dan analisis data
Unit analisis pada penelitian ini adalah sampel kronik periapikal (jaringan granuloma
dan non granuloma) yang diambil dari gigi karies melalui pemeriksaan radiografik dan
makroskopis di RSUD dr. Moewardi mulai Juli 2008 sampai dengan Mei 2009. Dilakukan
pemeriksaan beberapa variabel seperti: NFκ-β, Hsp60, limfosit CD-8 dan IFN-γ dengan
metoda imunohistokimia. Analisis data menggunakan Manova dilanjutkan dengan analisis
Diskriminan
1.8 Penghitungan sel penghasil komponen imunitas NFκ-β, Hsp60, CD-8 dan
IFN-γ
Sediaan diamati menggunakan mikroskop cahaya pembesaran 400 kali dan dilakukan
penghitungan sel dengan alat counter dalam lima lapang pandang. Hasil penghitungan adalah
Dr. Risya Cilmiaty A.R., drg,M.Si,Sp.KG– Fakultas Kedokteran UNS
8
banyaknya sel yang memberikan reaksi positif terhadap antibodimonoklonal, dibagi total
(jumlah sel) dan dikalikan 100% (Sudiana, 1999).
1.9 Analisis data
Sebelum melakukan analisis data dilakukan reliabilitas dan validitas penelitian yang
dicapai melalui langkah-langkah sebagai berikut:
1. Untuk menjamin reliabilitas, pada evaluasi objek pengamatan yang sama peneliti
menggunakan tenaga peneliti dan tenaga laboratorium yang sama.
2. Untuk menjamin validitas pada penilaian variabel penelitian dipilih alat dan bahan uji
yang mempunyai sensitivitas dan spesifisitas yang tinggi, konsisten dan dapat
dipertanggungjawabkan.
3. Peneliti konsultasi dengan tim promotor dan tenaga konsultan dalam pelaksanaan
penelitian, yang meliputi: pengambilan sampel jaringan pada pasien, pemeriksaan
histopatologi dan imunohistokimia.
Pada penelitian ini menggunakan uji homogenitas dan uji normalitas, dilanjutkan
dengan analisis Manova, untuk membuktikan perbedaan variabel serta analisis Diskriminan
untuk mendapatkan pola diskriminan.
Dr. Risya Cilmiaty A.R., drg,M.Si,Sp.KG– Fakultas Kedokteran UNS
9
Kerangka Operasional Penelitian
Sampel Jaringan
Periapikal
JARINGAN
GRANULOMA
(18 SAMPEL)
JARINGAN
NON GRANULOMA
(18 SAMPEL)
JARINGAN
(Buffer Formalin)
(Buffer Formalin)
Pemeriksaan HPA
dengan pengecatan HE
Pemeriksaan HPA
dengan pengecatan HE
JARINGAN
IMUNOHISTOKIMIA
NF-Ќβ
Hsp-60
CD-8
IMUNOHISTOKIMIA
IFN-γ
NF-Ќβ
Hsp-60
CD-8
IFN-γ
DATA
ANALISIS
STATISTIK
HASIL
Gambar 1.1 Kerangka Operasional Penelitian
Dr. Risya Cilmiaty A.R., drg,M.Si,Sp.KG– Fakultas Kedokteran UNS
10