TRANSFORMASI GENETIK PADI INDICA DENGAN GEN

TRANSFORMASI GENETIK PADI INDICA DENGAN GEN OsMADS18
MENGGUNAKAN Agrobacterium tumefaciens UNTUK MERAKIT
VARIETAS PADI UMUR PENDEK
MUJIBUR RAHMAN
DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2013
ABSTRAK
MUJIBUR RAHMAN. Transformasi Genetik Padi Indica dengan Gen
OsMADS18 Menggunakan Agrobacterium tumefaciens untuk Merakit Varietas
Padi Umur Pendek. Dibimbing oleh I MADE ARTIKA.
Padi adalah makanan pokok lebih dari setengah populasi manusia di dunia.
Kebutuhan padi setiap tahunnya terus meningkat seiring bertambahnya penduduk.
Penelitian ini bertujuan untuk merakit varietas padi berumur pendek dengan
mengintroduksikan gen OsMADS18 ke dalam genom tanaman menggunakan
Agrobacterium tumefaciens. Gen OsMADS18 merupakan gen umur pendek yang
berhasil dikonstruksi ke vektor pCAMBIA 1301 di bawah promotor konstitutif
CaMV35S. Hal ini dibuktikan dengan munculnya pita DNA dengan ukuran 12561
bp, ukuran ini merupakan gabungan antara vektor pCAMBIA 1301 (11819 bp)
dan gen OsMADS18 (742 bp). Kemudian vektor pCAMBIA 1301-OsMADS18
ditransformasikan ke Agrobacterium tumefaciens EHA105 melalui metode Heatshock. Keberhasilan transformasi Agrobacterium tumefaciens ditandai dengan
tumbuhnya koloni putih pada media LB padat yang telah diberikan antibiotik, Xgal, dan IPTG. Kemudian bakteri tersebut digunakan untuk mentransformasikan
50 kalus padi Indica dengan cara merendam kalus tersebut ke dalam koloni
bakteri selama 20 menit. Kalus di pindahkan ke media seleksi yang mengandung
higromisin. Setelah 14 hari, kalus yang tidak mengalami nekrotik di pindahkan ke
media regenerasi R3B untuk ditumbuhkan sebagai tanaman transgenik. Dari
penelitian diperoleh 18 planlet transforman Indica. Keberhasilan uji gus-A di
tunjukkan dengan munculnya warna biru pada jaringan daun. Sedangkan analisis
PCR terhadap 18 planlet transgenik menghasilkan pita berukuran 742 bp.
Kata kunci : Agrobacterium tumefaciens, Transformasi genetik, Transgenik,
OsMADS18
ABSTRACT
MUJIBUR RAHMAN. Genetic Transformation of Indica rice by OsMADS18
gene using Agrobacterium tumefaciens to assemble short life plant.
Supervised by I MADE ARTIKA.
Rice is the staple food of more than half the world's human population. The
need of rice each year continues to increase with increasing population. This study
aimed to assemble a short-lived rice varieties by introducing OsMADS18 gene
into the genome of plants using Agrobacterium tumefaciens. OsMADS18 gene is a
short age gene which has been successfully constructed to pCAMBIA1301 vector
under CaMV35S constitutive promoter. This is evidenced by the emergence of
12561 bp DNA band size, this measure is a combination among vector pCAMBIA
1301 (11819 bp) and OsMADS18 genes (742 bp). Then the vector pCAMBIA
1301 that contains OsMADS18, was used to transform Agrobacterium tumefaciens
strain EHA105 through Heat-shock method. The success of transformation
marked by the growth of the white colonies Agrobacterium tumefaciens on solid
media LB, this media contained antibiotic, X-gal and IPTG. Then the bacteria are
used to transforms 50 calli Indica rice by soaking the calli into colonies for 20
minutes. The calli moved to selection media that contains hygromycin. After 14
days, calli that resistant to hygromycin moved to regeneration media R3B grown
for transgenic plant. 18 transformants plantlets were obtained. Gus-A successful
test on the show with the appearance of blue color in leaf tissues. While PCR
analysis of the 18 transgenic plantlets produced 742 bp sized bands.
Keywords: Agrobacterium tumefaciens, Genetic Transformation, Transgenic,
OsMADS18.
TRANSFORMASI GENETIKA PADI INDICA DENGAN GEN OsMADS18
MENGGUNAKAN Agrobacterium tumefaciens UNTUK MERAKIT
VARIETAS PADI UMUR PENDEK
MUJIBUR RAHMAN
Skripsi
Sebagai salah satu syarat memperoleh gelar
Sarjana Sains pada
Departemen Biokimia
DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2013
Judul Skripsi
Nama
NIM
: Transformasi Genetika Padi Indica dengan Gen OsMADS18
Menggunakan Agrobacterium Tumefaciens untuk Merakit
Varietas Padi Umur Pendek
: Mujibur Rahman
: G84070020
Disetujui,
Dr. I Made Artika, M.App.Sc
Pembimbing
Diketahui,
Dr. I Made Artika, M.App.Sc
Ketua Departemen Biokimia
\
Tanggal Lulus :
KATA PENGANTAR
Puji syukur penulis ucapkan kehadirat Tuhan Yang Maha Esa atas segala
berkah dan rahmat-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan karya ilmiah yang
berjudul “Transformasi Genetika Padi Indica dengan Gen OsMADS18
Menggunakan Agrobacterium Tumefaciens untuk Merakit Varietas Padi Umur
Pendek”. Karya ilmiah ini disusun berdasarkan kegiatan penelitian yang dilakukan
dari bulan Februari 2011 hingga bulan Mei 2012, di Laboratorium Kultur
Jaringan, Departemen Agronomi dan Hortikultura, Fakultas Pertanian, IPB.
Penulis mengucapkan terima kasih kepada Dr. I Made Artika M.App.Sc
selaku pembimbing yang telah memberikan bimbingan, masukan, dan arahan
selama penulisan karya ilmiah ini, Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi dan
Kementerian Riset dan Teknologi RI yang telah mendanai penelitian ini. Selain
itu penulis juga mengucapkan terima kasih kepada Indra Kurniawan S, Harryade
Putra, Ridho Pratama, Putri Jumiarti, Cinthya Lestari HD dan Dian Rachmawati
atas bantuan teknis, teoritis maupun materil selama pengerjaan penelitian ini.
Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada orang tua dan seluruh keluarga
yang telah mendukung secara moril, dan juga kepada semua pihak yang telah
membantu terselesaikannya skripsi ini.
Penulis menyadari bahwa tulisan ini belum sempurna sehingga saran dan
kritik yang membangun sangat penulis harapkan. Akhirnya penulis berharap
semoga karya ilmiah ini dapat dimanfaatkan bagi kemajuan pengetahuan,
pendidikan, dan penelitian.
Bogor, Februari 2013
Mujibur Rahman
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Aceh Utara pada tanggal 16 Februari 1989 sebagai
putra kedua dari lima bersaudara pasangan Bapak Zainal Abidin (alm) dan Ibu
Nurul Hidayat. Penulis tinggal dan dibesarkan di Krueng Geukuh dan sekolah di
SD 06 Kec. Dewantara, pada tahun 1998 penulis pindah dan menetap di kota
Banda Aceh dan pada tahun 2001 penulis lulus dari SD 105 Lam Ujong, Ulee
Kareng dan melanjutkan pendidikan ke SMP 10 Lam Teh. Setelah lulus pada
tahun 2004, penulis melanjutkan sekolah ke SMA 4 Negeri Banda Aceh dan
Lulus pada tahun 2007. Pada tahun yang sama penulis diterima di Institut
Pertanian Bogor pada Mayor Biokimia, Departemen Biokimia, Fakultas
Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam IPB, melalui jalur Undangan Seleksi
Masuk IPB (USMI).
Selama duduk di bangku perkuliahan, penulis aktif di berbagai organisasi
kemahasiswaan. Tahun 2007-2008 penulis aktif sebagai Ketua ROHIS A18.
Selain itu penulis juga aktif di Organisasi Mahasiswa Daerah (OMDA) Ikatan
Mahasiswa Tanah Rencong (IMTR). Pada tahun 2009-2010 penulis aktif sebagai
pengurus dan kepanitian Himpunan Keprofesian CREB’s, BEM-G, dan beberapa
Unit Kegiatan mahasiswa (UKM) di lingkup IPB. Diantaranya pernah menjabat
sebagai Ketua Divisi Keilmuan Metabolisme CREB’s pada tahun 2009/2010,
Ketua Pelaksana PEMIRA dan MUBES CREB’s 2010, Kepanitian Kajian Ilmiah
CREB’s, LKIP, BCL 2010 (Biochemistry Champion League), MPD BIOKIMIA
45, The CEBOCH, anggota BP CREB’s 2011, dan berbagai kegiatan lainnya.
Tahun 2011-2012 penulis pernah menjadi finalis BIOFRONT ITB, finalis TUN
Mipa Untuk Negeri UI 2012, mendapatkan hibah dana penelitian dari DIKTI
melalui Program Kreativitas Mahasiswa (PKM-P dan PKM-GT), mendapatkan
penghargaan setara emas di Penunjang PIMNAS XXIV di Universitas
Hasanuddin, Makassar 2011. Finalis PIMNAS XXV dan mendapatkan mendali
setara emas di Universitas Muhammadiyah Yogyakarta 2012. Selain itu penulis
juga berkesempatan menjadi peserta dalam 4th World Congress of Industrial
Biotechnology China 2011, dan peserta dalam annual Meeting of the German
society for Genetic Engineering Jerman 2011.
Sebagai pengalaman profesi, penulis juga aktif sebagai asisten praktikum
Biologi Dasar untuk mahasiswa Tingkat Persiapan Bersama (TPB) IPB tahun
2008. Pada semester 7, penulis menjalani praktik lapang (PL) di Balai Besar
Litbang Bioteknologi dan Sumber Daya Genetik Pertanian (BB-BIOGEN), dan
melanjutkan dengan magang pada tahun 2010-2011, pada tahun 2011-2012
penulis mengerjakan proyek dari kementerian Negara Riset dan Teknologi RI.
Selain itu, penulis juga aktif sebagai tentor matematika di lembaga Bimbingan
Belajar Bintang Pelajar pada tahun 2007-2009 dan kegiatan dakwah antar kampus.
DAFTAR ISI
Halaman
ix
DAFTAR GAMBAR ………………………………………………………………
ix
DAFTAR LAMPIRAN ……………………………………………………………
PENDAHULUAN………………………………………………………………….1
TINJAUAN PUSTAKA……………………………………………………………2
Padi………………………………………………………………………………2
2
MADS Box………………………………………………………………………
Transformasi Genetik……………………………………………………………2
Konstruksi DNA Rekombinan……………………………………………….….2
Vektor……………………………………………………………………………3
Plasmid pCAMBIA 1301……………………………………………………….3
Agrobacterium tumefaciens…………………………………..…………………4
Analisis Tanaman Transgenik…………………………………………………..4
BAHAN DAN METODE…………………………………………………………..5
Alat dan Bahan………………………………………………………………….5
Metode…………………………………………………………………………..5
HASIL DAN PEMBAHASAN…………………………………………………….8
Plasmid rekombinan pembawa Gen OsMADS18………………….……………8
Agrobacterium tumefaciens Pembawa vektor pCAMBIA 1301-OsMADS18... 9
Tranformasi dan Regenerasi Tanaman………………………………………….9
10
Tanaman Transgenik……………………………………………………………
10
KESIMPULAN…………………………………………………………………….
11
SARAN…………………………………………………………………………….
11
DAFTAR PUSTAKA………………………………………………………………
LAMPIRAN ………………………………………………………………….… 15
DAFTAR GAMBAR
Halaman
1.
2.
3.
4.
5.
6.
8
Elektroforegram DNA pGEM-T Easy-OsMADS18 ….…………………. ……...
9
Elektroforegram pemotongan pCAMBIA 1301 dengan enzim restriksi ….……
Koloni Agrobacterium tumefaciesn EHA 105 hasil transformasi ………………9
10
Transformasi genetik padi Indica ……………………………………………….
10
Hasil uji β-glucuronidase terhadap daun tanaman padi ………………………..
Elektroforegram PCR terhadap gen OsMADS18………………………………11
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Diagram alir penelitian …………………………………………………………
16
Proses umum isolasi plasmid ……………………………………………………
17
Peta Plasmid pCAMBIA 1301 ………………………………………………. 18
Proses umum reaksi ligasi ………………………………………………………
18
Proses purifikasi DNA dengan metode dari QiAgen (2006) ……………………
19
Proses umum isolasi DNA tanaman …………………………………………….
20
Bahan-bahan pembuatan media ……………………………………………... 21
1
PENDAHULUAN
Padi adalah makanan pokok lebih dari
setengah populasi di dunia. Sebagian besar
tanaman padi di produksi dan dikonsumsi di
Asia (Kibria et al. 2008). Padi memegang
peranan paling penting di antara berbagai
sumber bahan pangan lainnya di Indonesia,
terutama dalam penyediaan pangan yang
mendukung ke arah ketahanan pangan
nasional dan pemberdayaan ekonomi rumah
tangga petani. Mutu suatu varietas sangat
mempengaruhi besarnya pendapatan petani
(Lestari et al. 2007). Kebutuhan pangan dunia
setiap tahunnya semakin meningkat seiring
dengan bertambahnya jumlah penduduk dan
perkembangan industri pangan. Menurut data
dari BPS (2012), produksi gabah pada tahun
2012 sebesar 65,39 juta ton. Namun, jumlah
ini belum mampu untuk memenuhi kebutuhan
lebih dari 259 juta penduduk Indonesia. Maka
diperlukan suatu inovasi untuk memenuhi
permintaan konsumen tersebut, salah satunya
dengan melakukan pemuliaan tanaman
(Herman 2010).
Pemuliaan tanaman merupakan suatu
metode yang menggali potensi genetik suatu
tanaman untuk memaksimumkan ekspresi dari
potensi tersebut pada suatu kondisi lingkungan
tertentu (Wangxia 2003, Joseph et al. 2011).
Salah satunya dengan merakit varietas padi
berumur pendek. Pemulian tanaman bisa
dilakukan melalui tranformasi genetik, yaitu
dengan menyisipkan gen asing ke dalam
genom tanaman ( Heryati 2002). Transformasi
genetik dapat dilakukan melalui berbagai
metode antara lain elektroporasi (Widodo
2002), polyethylene glycol (Rachmawati
2010), penggunakan serat silicon carbide
(Herman 2010), penembakan partikel DNA
(Frame et al. 2000, Sutrisno et al. 2000) dan
perantara
Agrobacterium
tumefaciens
(Belarmino dan Mii 2000, Joseph et al. 2011).
Teknik penyisipan gen dengan menggunakan
metode tersebut sudah berhasil dilakukan
(Schroeder et al. 2000, Chuanfeng et al.
2010). Penggunaan Agrobacterium untuk
proses transformasi genetik pada tanaman
monokotil seperti padi, masih belum efisien,
akan tetapi beberapa penelitian telah
menunjukkan keberhasilan (Cheng et al. 2004,
Rachmawati et al. 2004, Rajesh et al. 2008)
Tantangan lain dari teknik transformasi
genetik adalah penggunaan promotor yang
tidak sesuai, sehingga ekspresi gen yang
diinginkan tidak terjadi (Yina et al. 2004).
Selain itu teknik penyisipan gen pada tanaman
padi dengan Agrobacterium tumefaciens
kurang efektif (Enriquez-Obregon et al. 2000,
Opabode 2006). Hal ini disebabkan tidak
efektifnya infeksi Agrobacterium tumefaciens
pada tanaman monokotil karena tidak adanya
respon pelukaan yang menghasilkan senyawa
fenolik yang digunakan oleh bakteri untuk
menginduksi gen-gen vir (Lucca et al. 2001,
Gao et al. 2005), akan tetapi masalah ini bisa
diatasi dengan melakukan penyesuaian
kondisi, yaitu dengan menambahkan senyawa
fenolik, monosakarida, dan penggunaan
vektor ekspresi seperti pCAMBIA (Zupan et
al. 2000, Cheng et al. 2004). Agrobacterium
tumefaciens dapat menginfeksi tanaman
secara alami karena memiliki plasmid Ti
(tumor inducer), yaitu vektor (pembawa
DNA) untuk menyisipkan gen asing (Madigan
dan Martinko 2006). Gen asing yang ingin
dimasukkan ke dalam tanaman dapat
disisipkan di dalam plasmid Ti tersebut.
Selanjutnya,
Agrobacterium tumefaciens
secara langsung akan memindahkan gen pada
plasmid tersebut ke dalam genom tanaman
(Olhoft et al. 2004).
Teknik tranformasi genetik yang bertujuan
untuk membuat varietas padi berumur pendek
mulai dikembangkan di Indonesia. Salah satu
gen yang membawa sifat umur pendek adalah
gen OsMADS18 (Masiero et al. 2002). Gen
OsMADS18 merupakan gen yang memiliki
sifat dalam mempercepat masa transisi
tanaman sehingga tanaman dapat berbunga
lebih awal (Xiao et al. 2003). Selain itu gen
ini juga berfungsi dalam proses perkembangan
tanaman, seperti dalam proses pengendalian
masa transisi reproduksi vegetatif pada
tanaman jagung (Pelucchi et al. 2002),
penentu identitas organ pada Antirrhinum
(Muller et al. 2001), dan pengaturan
pematangan buah (Masiero et al. 2002, Favoro
et al. 2003, Xiao et al. 2003).
Penelitian ini bertujuan untuk merakit
varietas padi berumur pendek dengan
mengintroduksikan gen OsMADS18 ke dalam
genom tanaman menggunakan Agrobacterium
tumefaciens. Sedangkan hipotesis penelitian
adalah, Gen OsMADS18 dapat diintroduksikan
ke dalam genom tanaman padi dengan
menggunakan Agrobacterium tumefaciens,
sehingga akan diperoleh tanaman padi
berumur pendek. Hasil penelitian ini
diharapkan mampu memberikan informasi dan
wawasan ilmiah terkait dengan kegiatan
rekayasa genetika pada tanaman. Kemudian
pengetahuan ini dapat di arahkan ke program
pemuliaan tanaman dalam meningkatkan
produktivitas tanaman padi, khususnya dalam
perakitan tanaman padi berumur pendek.
2
TINJAUAN PUSTAKA
Padi
Padi (Oryza sativa L.) merupakan tanaman
pangan terpenting pada wilayah tropis maupun
sub tropis. Upaya peningkatan produksi padi
merupakan salah satu strategi untuk
menghadapi peningkatan kebutuhan pangan
akibat pertambahan populasi penduduk
(KOMPAS 2011). Selain itu padi juga dapat
digunakan sebagai organisme model dalam
kajian genetika tumbuhan karena memiliki
ukuran kromosom yang relatif kecil, yaitu
1.6~2.3 × 108 pasangan basa (Garris 2004).
Dari hasil kajian biologi molekuler padi di
bagi ke dalam dua subspesies utama, yaitu
indica dan japonica . Selain itu juga terdapat
subspesies
minor
yang
beradaptasi
berdasarkan ekosistemnya seperti aus, royada,
ashina, dan aromatic (Zohary dan Hopf 2000)
Regenerasi tanaman dari protoplast padi
indica lebih sulit dibandingkan japonica.
Untuk memecahkan masalah ini Christou et
al. (1991) melakukan bombardment terhadap
embrio muda padi indica menggunakan emas
pembawa DNA. Tanaman transgenik padi
indica terbukti dapat dihasilkan dari kalus
hasil transformasi, hal ini membuka peluang
pengembangan sistem transformasi padi
indica tanpa kultur protoplas. Dalam
perkembangan selanjutnya, Datta et al. (1992)
berhasil melakukan transformasi pada
protoplas padi kelompok indica kultivar IR72.
Regenerasi tanaman dari protoplas
beberapa varietas padi indica telah dilaporkan.
Datta et al. (1990) mengembangkan teknik
regenerasi dari protoplas padi indica
Chinsurah Boro dan mentransformasikan gen
hygromycin
phosphotransferase
glycol.
Regenerasi tanaman dari protoplas IR54 telah
dilaporkan peng et al. (1992) dan diperoleh
tanaman
dengan
gen
neomycin
phosphotransferase. Hal ini membuktikan
transformasi menggunakan protoplas dapat
dilakukan pada padi indica, akan tetapi
kelemahan dari teknik ini adalah terbatasnya
keberhasilan pada kultivar tertentu.
tanaman seperti dalam proses pengendalian
masa transisi reproduksi vegetatif pada
tanaman jagung (Pelucchi et al. 2002), selain
itu gen ini juga menjadi penentuan identitas
organ, dan pengaturan pematangan buah
(Favoro et al. 2003). Gen OsMADS18 banyak
terakumulasi pada meristem, ekspresi gen ini
lebih awal dapat menentukan faktor histologi
yang menunjukkan pembentukan tunas aksiler
meristem akan dipercepat (Ferrandiz et al.
2000). OsMADS18 merupakan keluarga dari
MADS Box, gen inilah yang menyandi
ekspresi umur genjah pada berbagai jenis
tanaman (Pelucchi et al. 2002).
Transformasi Genetik
Transformasi genetik merupakan salah satu
metode yang dapat dimanfaatkan untuk
mempelajari regulasi gen, identifikasi fungsi
gen, pengujian metabolisme, mempelajari
fisiologi serta perkembangan tanaman
(Walkerpeach dan Velten 1994, Utomo 2005).
Transformasi
genetik
tidak
hanya
dipergunakan untuk studi dasar dalam ilmu
tanaman, tetapi juga telah menjadi salah satu
cara untuk pengembangan varietas baru.
Keberhasilan proses transformasi gen melalui
Agrobacterium tumefaciens sangat ditentukan
oleh berbagai hal antara lain kesesuaian antara
strain Agrobacterium tumefaciens dengan
jenis tanaman dan plasmid vektor yang
dipergunakan, kerapatan sel Agrobacterium
yang digunakan pada saat proses tranformasi
genetik, lama waktu ko-kultivasi, tingkat
kemasaman media, kondisi kultur in vitro dan
sebagainya (Zupan et al. 2000, Cheng et al.
2004).
Disamping
itu
pemanfaatan
Agrobacterium tumefaciens pada proses
transformasi genetik jenis tanaman monokotil
masih memerlukan berbagai penyesuaian
dalam
upaya
meningkatkan
efisiensi
transformasi (Klee 2000, Utomo 2004). Hal
ini disebabkan secara alami bakteri patogen
tanah tersebut hanya menginfeksi tanaman
dikotil dengan cara mengintroduksi T-DNA
dari plasmid Ti bakteri ke dalam inti sel
tanaman (Le et al. 2001, Olhoft et al. 2004).
MADS Box
Konstruksi DNA Rekombinan
MADS Box merupakan protein faktor
trankripsi yang mengendalikan perkembangan
tanaman (Masiero et al. 2002). Hasil beberapa
penelitian terdahulu menunjukkan bahwa gen
homolog MADs Box yang di isolasi dari
spesies yang berbeda memiliki fungsi yang
sama (Xiao et al. 2003). Misalnya OsMADS18
yang diisolasi dari padi (Oryza sativa)
memiliki fungsi dalam perkembangan
Teknik DNA rekombinan merupakan
teknik pembentukan kombinasi baru dari
DNA dengan cara melakukan penyisipan
molekul-molekul DNA yang dikerjakan di
luar
sel
dalam
suatu
vektor
dan
diintroduksikan ke dalam sel inang sehingga
gen tersebut akan berkembang dalam sel inang
tersebut (Sarkar et al. 2002). Teknologi DNA
rekombinan atau rekayasa genetika pada
3
intinya adalah proses kloning gen. Gen
merupakan sekuen nukleotida yang menyandi
RNA yang dibatasi oleh promotor dan
terminator (Watson et al. 2007). Teknologi
DNA rekombinan memungkinkan sejumlah
gen dari sumber berbeda disatukan untuk
membentuk DNA rekombinan. Tahapan
dalam kloning gen meliputi: penyisipan
fragmen DNA yang mengandung gen target
ke dalam molekul DNA vektor, vektor
rekombinan dimasukkan kedalam sel inang,
vektor dalam sel inang akan diperbanyak
seiring dengan pembelahan sel inang (Pray
2008).
Komponen penting dalam rekombinasi
DNA adalah enzim-enzim manipulasi DNA
serta vektor. Bernard and Pasternak (2002)
membagi enzim manipulasi berdasarkan jenis
dan reaksi yang dikatalisnya menjadi lima
golongan yaitu : a) nuklease yaitu enzim yang
mampu memotong molekul asam nukleat, b)
ligase adalah enzim yang berfungsi
menyatukan molekul asam nukleat, c)
polimerase adalah enzim yang dapat
mensintesis DNA, d) enzim modifikasi yang
mampu menghilangkan atau menambahkan
gugus kimia, dan e) topoisomerase adalah
enzim yang mengubah DNA tertutup secara
kovalen menjadi DNA supercoil. Pada
pengklonan gen hanya dua jenis enzim yang
berperan yaitu enzim restriksi endonuklease
dan enzim ligase.
Vektor
Vektor kloning adalah agen pembawa
fragmen DNA masuk ke dalam sel makhluk
hidup yang berfungsi untuk memperbanyak
fragmen DNA. Beberapa vektor kloning yang
umum digunakan adalah plasmid, vektor
lamda, virus, kromosom bakteri buatan,
kromosom khamir buatan, dan cosmid
(Primrose dan Twyman 2006). Suatu vektor
kloning harus dapat disambungkan atau
menyatu dengan fragmen DNA yang ingin
ditransfer kemudian dapat dimasukkan ke
dalam sel. Di dalam sel tersebut, fragmen
DNA akan diperbanyak jumlahnya. Untuk
memilih vektor kloning yang cocok dalam
penelitian, beberapa hal yang harus
dipertimbangkan adalah ukuran fragmen DNA
yang akan ditransfer, jumlah salinan,
inkompatibilitas (ketidaksesuaian), marka
pemilihan (selectable marker) untuk seleksi,
situs kloning, dan fungsi khusus dari suatu
vektor (Casali et al. 2003). Dalam penelitian
ini vektor yang digunakan adalah pGEM-T
Easy, vektor ini mempunyai multiple cloning
site, serta tidak perlu dipotong lagi ketika
digunakan. Sedangkan vektor ekspresi yang
digunakan adalah pCAMBIA 1301.
Plasmid pCAMBIA 1301
DNA vektor adalah molekul DNA yang
dapat bereplikasi secara mandiri dan dapat
digunakan sebagai pembawa molekul DNA
lain yang tidak memiliki kemampuan
bereplikasi sendiri di dalam sel. DNA yang
sering digunakan adalah plasmid bakteri.
Plasmid
adalah
bahan
genetik
ekstrakromosom yang diwariskan secara tetap
(Dworkin et al. 2006). Ciri-ciri plasmid antara
lain berukuran kecil dan hanya mengandung
beberapa gen, membawa informasi genetik,
terlepas dari DNA kromosom atau kadangkadang dapat berintegrasi dengan DNA
kromosom, dan dapat diisolasi dengan mudah
dari sel bakteri. Ciri lain plasmid adalah
mempunyai situs untuk memulai replikasi
yang disebut ORI (origin of replication) (Tsen
et al. 2002)
Plasmid pCAMBIA 1303 merupakan
plasmid yang dikonstruksi sebagai vektor
DNA dalam metode transformasi langsung
dan menggunakan Agrobacterium tumefaciens
(Opabode 2006). Plasmid pCAMBIA 1301
berukuran 11.837 pb (pasang basa) dan cocok
untuk tranformasi pada tanaman padi (Listanto
et al. 2005). Plasmid ini mempunyai beberapa
kelebihan, diantaranya adalah ukurannya yang
relatif kecil, jumlah salinan yang banyak
dalam E. coli, rangkaiannya lengkap,
mempunyai pBR 322 ori untuk replikasi
dalam E.coli dan A. tumefaciens (Zipursky
and Marians 2001), mengandung situs LacZ
(Sambrook and Russel 2001), mempunyai
multiple cloning site (MCS) dengan 10 sisi
unik, dan mengandung promotor CaMV 35S
(cauliflower
mosaic
virus)
yang
memungkinkan pembuatan klon langsung ke
dalam
T-DNA
plasmid,
Hal
ini
memungkinkan pembuatan klon langsung ke
dalam T-DNA plasmid. Tersedianya promotor
aktif yang kuat sangat diperlukan untuk
ekspresi suatu gen pada tanaman baik
monokotil maupun dikotil. Beberapa hasil
penelitian menyatakan bahwa CaMV35S
adalah promotor konstitutif yang aktif pada sel
tanaman monokotil, tetapi kekuatannya sedikit
menurun pada sel tumbuhan dikotil dan tidak
aktif pada beberapa tipe sel seperti pollen.
Selain itu, pCAMBIA 1303 mempunyai gen
gusA. Gen gusA (β-glucuronidase) dalam
plasmid pCAMBIA 1303 berfungsi sebagai
gen reporter untuk memonitor proses
transformasi dan introduksi gen yang
direkayasa (Tzfira & Citovsky 2002).
4
Plasmid pCAMBIA 1301 (Lampiran 3)
mengandung T-DNA, yang merupakan
untaian DNA yang akan ditransfer ke sel
tanaman. T-DNA pCAMBIA 1301 memiliki
gen neomisin fosfotranferase II (nptII) dan
gen higromisin fosfotransferase (hpt). Gen npt
II menyandi enzim neomisin fosfotranferase
yang digunakan untuk menyeleksi bakteri.
Gen hpt untuk menyandikan enzim higromisis
fosfotransferase sebagai penyeleksi untuk
mengetahui telah terintegrasinya T-DNA dari
A.tumefaciens ke dalam genom tanaman
(Dobhal et al. 2010). Plasmid pCAMBIA
1301 juga mempunyai gen penanda yaitu GusA yang disisipkan dibagian yang dapat
menyandikan, sehingga ekspresi gen hanya
mungkin terjadi bila sudah terintegrasi pada
tanaman (Ghasemi et al. 2008).
atau jaringan tanaman target. Proses transfer
gen dalam tanaman tidakk menjamin bahwa
gen asing yang diintroduksikan akan selalu
terekspresi. Oleh karena itu diperlukan
serangkaian analisis untuk memastikan
keberadaan gen yang telah diintroduksikan ke
genom tanaman.
Analisis tanaman transgenik dalam proses
transformasi genetik tanaman dapat dilakukan
pada berbagai tahapan, yaitu; 1) introduksi
gen, 2) transkripsi, 3) translasi, 4) pengujian
efektifitas protein yang dihasilkan. Saat ini
telah dikembangkan berbagai teknik analisis
tanapan trasgenik, seperti uji histokimia bglucuronidase (uji Gus), analisis polymerase
chain reaction (PCR), analisis Southern Blot,
Nothern, Western, Elysa, dan lainnya.
Agrobacterium tumaficiens
Uji histokimia β-glucuronidase (uji Gus)
dapat dilakukan pada tahap awal setelah kokultivasi maupun setelah gen terintegrasi
dengan stabil dalam kromosom. Warna biru
yang muncul pada sel atau jaringan
menunjukkan hasil transformasi positif.
Warna biru disebabkan oleh reaksi substrat Xgluc
(5-bromo-4-chromo-3-indolyl-B-Dglucuronide) dengan enzim β-glucuronidase
menjadi suatu
senyawa perantara yang
kemudian melalui reaksi dimerisasi oksidatif
membentuk senyawa dichloro-dibromoindigo
(CIBr-Indigo) yang berwarna biru (Stomp
1992). Warna biru tersebut menunjukkan telah
terekspresinya gen gus-A.
Pemakainan gen gus-A sebagai gen
penanda pada proses transformasi genetik
sangat menguntungkan karena produk gen ini
dapat diamati secara in vivo pada irisan
jaringan tanaman dengan menggunakan teknik
histokimia, dapat berupa daun, batang, dan
bagian akar tanaman transforman. Sehingga
gen gus-A sering dipergunakan sebagai
penanda dalam kondisi pemakaian antibiotik
tidak memungkinkan bagi regenerasi tanaman
(Lal dan Lal 1993). Gen gus banyak
digunakan sebagai penanda pada sistem
transformasi tanaman (Jefferson 1987) dan
seringkali digunakan untuk mempelajari
fungsi promotor (Stomp 1992). Hiei et al.
(1997) berhasil mentransfer gen gus-A ke
tanamam padi melalui Agrobacterium dan
membuktikan bahwa gen tersebut dapat
berekspresi sampai beberapa generasi
tanaman. Kelemahan dari uji GUS adalah
bersifat destruktif sehingga jaringan yang diuji
tidak dapat dikembangkan lebih lanjut,
memerlukan waktu dan penanganan khusus
untuk pengujian.
Agrobacterium tumefaciens merupakan
bakteri tanah gram positif yang bersifat
fitopatogen pada tanaman dikotil. Bakteri ini
secara alami mempunyai kemampuan untuk
mentransfer potongan DNA atau disebut TDNA (transfer DNA) ke dalam genom
tanaman dan menyebabkan terbentuknya
tumor (crown gall). Tumor ini merupakan
sumber makanan atau sebagai sumber karbon
bagi Agrobacterium (Rajesh et al. 2008).
Terdapat tiga komponen genetik penting
terlibat dalam proses pembentukan tumor
(Tzfira et al. 2004). Pertama, gen virulen
kromosom (chromosomal virulence), yang
terdapat pada kromosom Agrobacterium dan
berfungsi dalam pelekatan bakteri dengan sel
tanaman. Kedua, sekelompok gen virulen (vir)
yang terdapat dalam plasmid Ti (Tumor
inducing), berukuran 200 kb yang berperan
dalam menginduksi transfer dan integrasi TDNA. Ketiga, daerah T-DNA yang juga
terletak pada plasmid Ti (Daerah T-DNA,
dibatasi oleh LB (left border) dan RB (right
border), mengandung gen penting bagi
Agrobacterium (Matthews et al. 2001, Zhou et
al. 2003, Sha et al. 2004). Daerah T-DNA
mengandung gen iaaH, iaaM, dan ipt yang
menyandikan enzim-enzim penting dalam
biosintesis auksin dan sitokinin, yaitu zat
penting untuk pembelahan sel sehingga terjadi
pembelahan sel yang tidak terkontrol dan
menyebabkan
terbentuknya
tumor
(Azhakanandam et al. 2000).
Analisis Tanaman Transgenik
Tujuan utama dalam proses transformasi
genetik adalah mendapatkan ekspresi dari gengen asing yang diintroduksikan ke dalam sel
1. Uji Gus (Glucuronidase)
5
2. Analisis PCR (Polmerase Chain Reaction)
Teknik PCR merupakan salah satu
komponen utama teknologi DNA rekombinan
dan pertama kali ditemukan oleh Kary B.
Mulis pada tahun 1983. Teknik ini merupakan
amplifikasi in vitro sejumlah sekuens DNA
dengan menggunakan 2 oligonukleotida
sebagai primer yang berhibridisasi secara
berlawanan pada sisi daerah target DNA yang
diinginkan. PCR mampu mengamplifikasi
secara selektif sekuens DNA spesifik, hal
inilah yang membuat penggunaan teknik PCR
semakin meluas disamping kesederhanaan
metodenya (Dieffenbach & Dveksler 2003).
Reaksi PCR adalah tiruan dari proses
replikasi DNA, penempatan primer, dan
perpanjanagan rantai DNA baru oleh DNA
polimerase dari arah 5’ ke 3’, hanya saja pada
teknik PCR tidak menggunakan enzim ligase
dan primerRNA. Secara ringkas, teknik PCR
dilakukan dengan cara mencampurkan sampel
DNA
dengan
primer
oligonukleotida,
deoksiribonukleotida trifosfat,
enzim
termostabil Taq DNA polimerase dalam
larutan yang sesuai, kemudian menaikkan dan
menurunkan suhu campuran secara berulang
selama beberapa jam sampai diperoleh jumlah
sekuen DNA yang diinginkan.
Satu siklus pada teknik PCR terdiri atas
tiga tahap, yaitu denaturasi, annealing dan
ekstensi. Denaturasi dilakukan pada suhu 90950C, sehingga terjadi pemisahan utas ganda
DNA menjadi dua utas tunggal DNA yang
menjadi
cetakan
(template)
tempat
penempelan primer dan tempat kerja DNA
polimerase. Selanjutnya suhu diturunkan
untuk penempelan primer oligonukleotida
pada sekuen yang komplementer pada
molekul DNA cetakan. Tahap ini disebut
annealing. Suhu annealing tiap sekuen DNA
sifatnya spesifik dan merupakan penentu
utama keberhasilan suatu reaksi PCR. Tahap
terakhir adalah tahap ekstensi yang dilakukan
pada suhu 720C. Suhu ini merupakan suhu
optimum untuk kerja enzim Taq DNA
polimerase. Sintesis DNA komplemen dengan
DNA cetakan terjadi pada rahap ekstensi.
Ketiga tahap tersebut disusun berulang kali
dalam mesin PCR, umumnya antara 25-40
siklus, bergantung pada jumlah DNA yang
diinginkan. Primer oligonukleotida yang
digunakan dalam teknik PCR harus memenuhi
beberapa syarat, antara lain memiliki susunan
basa yang acak, sehingga tidak terjadi
polipurin atau polipirimidin, memiliki jumlah
purin dan pirimidin yang seimbang, memiliki
titik leleh saling mendekati satu sama lain, dan
sedikit mungkin memiliki basa yang
komplementer.Panjang primer yang umum
digunakan berkisar 20-30 (Mikkelsen &
Corton 2004).
BAHAN DAN METODE
Alat dan Bahan
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian
ini adalah pipet mikro, tip, tabung Eppendorf,
neraca analitik, autoklaf, laminar, vorteks,
sentrifus, inkubator bergoyang, cawan petri,
alumuniumfoil, stopwatch, penangas air,
microwave, mesin PCR, spektrofotometri
OD600,
elektroforesis,
UV
illuminator
Chemidoc EQ Biorad, cawan petri, api
spiritus, erlenmeyer, sheld, parafilm, wadah
air, kompor, rak tabung Eppendorf, QIAquick
tube, waterbath, cutter.
Bahan-bahan yang digunakan adalah
primer OL13F-(GGATTCGGGAGAGGGCC
GGTGC) dan OL14R-(GTCGACTCATG
TGTGACTTGTCCGGAG) (Masiero et al.
2002), enzim restriksi BamHI, enzim restriksi
SalI, Plasmid vektor pCambia 1301 yang
disisipi CaMV35S promotor pada MCS, air
steril, 2x ligasi buffer, enzim T4 ligase, LB
cari, LB padat, glukosa, 1 M Tris-Cl pH 8, 0,5
M EDTA pH 8, 10 N NaOH, 10% SDS, 5 M
Kalium asetat, Asam asetat glasial, EtOH
70%, EtOH 95%, TE Buffer, dNTP, MgCl2,
10x PCR buffer, enzim platinum taq
polimerase, TAE buffer, leader 1 kb, loading
dye, etidium bromida, buffer QG, isopropanol,
asetosiringon, buffer PE, buffer EB, Detergen,
Baycline, Agrapt, Banlok, Agar, Media MS,
media R3B, Media AAM, Media LB
padat/cari, Media IK3, Media seleksi I dan II.
Sel bakteri yang digunakan adalah E. coli
DH5α yang membawa vektor pGEM-T EasyOsMADS18, Agrobacterium tumefaciens
strain EHA105, dan padi yang digunakan
adalah Indica.
Metode
Perbanyakan E.coli DH5α yang
mengandung pGEM-T Easy
(Sambrook dan Russel 2001)
Eschericia coli (E.coli) diperbanyak dalam
media LB yang mengandung antibiotik.
Perbanyakan E.coli yang mengandung pGEMT Easy dilakukan dengan memasukkan 1
koloni putih E.coli ke dalam media LB cair
yang mengandung Ampisilin 100 mg/l,
kemudian suspensi diinkubasi pada suhu 37 0C
selama semalam (24 jam) sambil digoyangkan
pada 250 rpm.
6
Isolasi DNA Plasmid (QIAGEN 2006)
Isolasi DNA plasmid dilakukan dengan
prosedur Mini Preps (QIAGEN 2006).
Sebanyak 100 mL kultur bakteri hasil
perbanyakan LB cair dimasukkan ke tabung
Eppendorf dan disentrifus pada 12000 rpm
selama 1 menit (bagian ini diulangi lagi
dengan
membuang
supernatan
dan
menambahkan lagi kultur ke dalam Ependorf
dan disentrifus). Tahap selanjutnya supernatan
dibuang dan dilarutkan dengan 100 µL larutan
I, di vortek selama 5 menit, kemudian
ditambahkan larutan II sebanyak 200 µL
(larutan II harus freshmade) dan digoyang
bolak-balik 10 kali, kemudian ditambahkan
larutan III sebanyak 150 µL, dan di bolakbalik selam 10 kali. Lalu campuran disentrifus
dengan kecepatan tinggi (12.000 rpm) selama
10 menit, setelah itu supernatan dipindahkan
ke tabung Eppendorf yang baru dan ditambah
450 µL EtOH 95%, disentrifus dengan
kecepatan tinggi (12.000 rpm) selama 10
menit, supernatan dibuang dan ditambah
500µL ETOH 70% disentrifus lagi pada
kecepatan 12000 rpm selama 10 menit,
supernatan dibuang lagi. Tabung Eppendorf
diletakkan terbuka pada vakum hingga benarbenar kering, lalu dilarutkan dengan 30 µL
buffer TE.
Pemotongan DNA Plasmid dengan
Enzim BamHI dan SalI (Invitrogen 2003)
Pemotongan DNA plasmid dengan enzim
restriksi sesuai dengan prosedur yang terdapat
pada Invitrogen (2003). Plasmid dipotong
dengan mencampurkan 20 µL DNA dengan
enzim restriksi BamHI sebanyak 1 µL, buffer
TE sebanyak 5 µL, dan BSA sebanyak 0,5 µL.
Setelah
suspensi
homogen,
kemudian
diinkubasi pada suhu optimum selama 2 jam.
Setelah inkubasi enzim diinaktifasi dengan
dipanaskan pada suhu 700C selama 15 menit.
Kemudian dilanjukkan dengan pemotongan
menggunakan enzim SalI, yaitu dengan
menambahkan sebanyak 1 µL enzim SalI dan
diinkubasi lagi selama 2 jam, kemudian enzim
tersebut diinaktifasi dengan pemanasan.
Elektroforesis Gel Agarosa
(Sambrook dan Russel 2001)
Sampel DNA ditambah dengan bufer
loading dye kemudian dimasukkan ke dalam
sumur gel agarosa 1%. Elektroforesis dilakukan
pada tegangan 75 volt, arus 150 mA.
Kemudian gel di cuci dengan Ethidium
bromida dan air selama 10 menit. Kemudian
dilihat dibawah UV illuminator Chemidoc EQ
Biorad. Untuk pemurnian DNA dari gel
agarosa dilakukan dengan mengisolasi gel
yang mengandung DNA target yang diketahui
dengan membandingkannya dengan marker 1
kb.
Pemurnian DNA dari Gel Agarosa
(QIAGEN 2006)
Pemurnian DNA dari gel agarosa
dilakukan berdasarkan QIAGEN (2006), gel
agarosa dimasukkan ke dalam UV illuminator
Chemidoc EQ Biorad, dan diletakkan penanda
untuk mengetahui posisi DNA, lalu dilihat
dengan sinar ultraviolet. Setelah didapat posisi
DNA nya maka dilakukan pemotongan pada
agar yang terdapat DNA dan dimasukkan ke
dalam tabung Eppendorf yang terlebih dahulu
sudah
ditimbang
bobotnya,
setelah
dimasukkan agar ke dalam Eppendorf dihitung
bobot agar dengan mengurangi bobot
Eppendorf kosong dengan Eppendorf yang
berisi agar. Kemudian ditambahkan 3x
volume buffer QG ke dalam tabung
Eppendorf, lalu tabung Eppendorf tersebut
dimasukkan ke oven bersuhu 650C selama 10
menit, lalu ditambahkan isopropanol 1 volume
dan dimasukkan ke dalam tabung QIAquick
dan di sentrifus selama 1 menit, supernatan
dibuang dan ditambahkan buffer PE 0,75 mL
dan disentrifus kembali selama 1 menit, buang
supernatannya. Lalu ke dalam tabung
QIAquick ditambahkan buffer EB 50 µL dan
disentrifus selama 1 menit, dan disimpan pada
suhu -200C.
Penyambungan (Ligasi) DNA
(Invitrogen 2003)
Proses ligasi berdasarkan prosedur dari
Invitrogen (2003). Ligasi dilakukan dengan
nisbah DNA sisipan (OsMADS18) dan vektor
3:1. Proses ligasi dilakukan dengan
memasukkan 2 x Ligation Buffer 5 µL
ditambah 1 µL vektor pCAMBIA1301 vektor
dan 3 µL OsMAD18 serta enzim T4 Ligase
sebanyak 1 µL. Semuanya dicampur dalam
tabung Eppendorf dan diletakkan pada suhu
11-160C selama 16 jam atau semalam.
Transformasi Agrobacterium tumefaciens
(Sambrook dan Russel 2001)
Introduksi plasmid dilakukan dengan
metode heat shock. Sebanyak 1 µL plasmid
dimasukkan ke dalam sel kompeten
Agrobacterium tumefaciens strain EHA105.
Kemudian diinkubasi di es selama 30 menit
setelah itu diletakkan di suhu 420C selama 50
7
detik lalu diinkubasi di dalam es selama 5
menit. Ditambahkan dengan 750 µL media LB
kemudian digoyang pada suhu ruang selama
60 menit. Kemudian disentrifus 6000 rpm
selama 2 menit. Setelah itu supernatan
sebagian dan kemudian disebar pada media
LB padat yang sudah ditambahkan dengan
rifampicin 50 mg/mL dan kanamycin 50
mg/mL.
Penumbuhan
Agrobacterium
tumefaciens pada media LB padat dilakukan
di dalam LAF. Hasil penumbuhan kemudian
diinkubasi pada suhu 280C selama 48 jam. Sel
Agrobacterium tumefaciens yang terinsersi
gen OsMADS18 akan tumbuh membentuk
koloni putih pada media LB.
Koloni tunggal pada media LB padat
kemudian ditumbuhkan pada 5 mL media LB
cair yang sudah ditambahkan dengan
rifampicin 50 mg/mL dan kanamycin 50
mg/mL.
Penumbuhan
koloni
tunggal
Agrobacterium tumefaciens pada media LB
cair dilakukan di dalam LAF. Masing-masing
koloni tunggal diambil dengan menggunakan
tip setelah itu tip dimasukkan ke dalam media
LB cair yang sudah ditambahkan dengan
antibiotik. Hasil penumbuhan kemudian
digoyang pada suhu ruang selama 48 jam.
Sterilisasi Benih (Coombs dan Franco 2003)
Benih padi yang telah dikupas disterilisasi
dengan alkohol 70% selama 1 menit, lalu
dibilas 1x dengan aquades steril, setelah itu di
rendam dalam larutan bakterisida 10 menit
dan larutan fungisida 10 menit, lalu dicuci
dengan aquades 3 kali, kemudian di rendam
kembali dalam bayclean 20% 15 menit dan
bayclean 10% selama 5 menit dan dibilas
sebanyak 6x, kemudian ditanam ke media.
Transformasi kalus embriogenik dengan
Agrobacterium tumefaciens
(Sambrook dan Russel 2001)
Bakteri A.tumefaciens yang telah ditanam
pada media AB padat selama 3 hari dipanen
dengan menggunakan spatula steril sebayak 23 petri (bakteri ditaman merata pada
permukaan petri dengan pengaduk kaca
segitiga), kemudian dimasukkan ke dalam 100
mL media AAM yang mengandung 100 µM
acetoyringone pada erlemeyer steril 250 mL
steril, kemudian digoyang perlahan agar
homogen, ODnya diukur sampai mencapai
OD600 bernilai 1. Kemudian 20 kalus
embriogenik yang telah disiapkan direndam
dengan suspensi bakteri selama 15 menit,
setelah itu kalus hasil infeksi ditiriskan pada
kertas steril dengan dirolling dari ujung ke
ujung agar kering dan diganti sampai 2-3 kali.
Kemudian bagian atas ditutup juga dengan
kertas saring steril dan ditekan sambil
digoyang perlahan. Setelah kalus kering
ditanam pada media ko-kultivasi (IK3+100
µM asetosiringon) selama 3 hari dengan
ditutup plastik hitam.
Seleksi dan Regenerasi
(Purnamaningsih 2006)
Kalus dari hasil ko-kultivasi di tanam pada
media seleksi I selama 14 hari kemudian kalus
yang resisten di subkultur pada media seleksi
II selama 14 hari. Kalus yang resisten ditanam
pada media regenerasi (R3B: media
IK3+0,5mg/L IAA, dan 0,3 mg/L BAP) dan
setelah tumbuh planlet, planlet dipindahkan ke
media MS sampai perakaran cukup kuat untuk
dipindahkan ke media aklimatisasi
Isolasi DNA Tanaman (Jaakola et. al. 2003)
Isolasi DNA dilakukan dengan metode
CTAB yang telah dimodifikasi dari Jaakola et
al. (2003): Daun muda berukuran sekitar 2 cm
atau kalus dimasukkan ke dalam Eppendorf
1,5 mL dan dibekukan dengan nitrogen cair.
Daun digerus sampai halus, kemudian
ditambahkan dengan 750 ul buffer isolasi
yang mengandung buffer lisis [0,2 M tris-HCL
pH 7.5, 0.05 M EDTA, 2 M NaCl, 2% (b/v))
CTAB
(Hexadecyltrimethyl
ammonium
bromide)], buffer ekstraksi [0.35 M sorbitol,
0.1 M tris HCl pH 7.5, 5 mM EDTA]. dan 5%
(b/v) sarkosil dengan perbandingan 2,5:2,5:1.
Selanjutnya campuran diinkubasi 1 jam pada
suhu 650C sambil dibolak-balik perlahan. Lalu
ditambahkan 750 uL kloroform:isoamil
alkohol (24:1). Kemudian sampel disentrifus
(12000 rpm, selama 5 menit pada suhu ruang).
Lapisan atas diambil dan dipindahkan ke
dalam tabung 1,5 mL baru dan ditambah 400
ul isopropanol lalu dibolak-balik hingga
gumpalan DNA terlihat. Selanjutnya cairan
disentrifus (12000 rpm, selama 6 menit pada
suhu ruang) dan cairan dibuang, endapan
dicuci dengan 500 ul 70% etanol dan
disentrifus lagi (12000 rpm selama 3 menit).
Cairan dibuang dan endapan dikeringkan.
DNA dilarutkan dalam 50 ul TE (10mM trisHCL pH 8.0, dan 1 mM EDTA). Sampel DNA
disimpan pada -200C
Uji Gus (Rueb dan Hensgen 1989)
Ekspresi enzim β-glucuronidase (GUS)
diuji terhadap daun tanaman, merujuk pada
metode Rueb dan Hensgen (1989). Daun
direndam dalam buffer fosfat (0.1 M NaPO4;
8
pH 6.8) yang mengandung 1% Triton X-100
pada suhu 370C selama 1 jam, kemudian
dicuci 2 kali dengan buffer fosfat segar, dan
divakum selama 5 menit. Setelah itu daun
direndam dalam larutan X-gluc dan divakum
selama 5 menit, kemudian diinkubasi semalam
pada suhu 370C. Buffer fosfat dibuang dan
ditambahkan alkohol 70%. Pengamatan
dilakukan dengan melihat perubahan warna
yang terbentuk pada daun, apabila daun
berubah menjadi warna biru maka gen βglucuronidase terekspresi.
Analisis PCR (Sambrook dan Russel 2001)
Analisis PCR digunakan untuk mendeteksi
integrasi gen OsMADS18 pada genom
tanaman padi. Komposisi bahan yang
digunakan adalah 1x reaksi PCR di dalam
volume akhir 15 ul adalah : 1 x buffer PCR
yang mengandung Mg2+, 0.05 mM dNTP, 0.05
ul Taq Polymerase, 2.5 ng/ul primer OL13F,
2.5 ng/ul primer OL14R, 1 ul DNA hasil
isolasi dan ditambahkan dH2O hingga volume
mencapai 15 ul, dan dimasukkan dalam mesin
PCR dengan kondisi pra PCR pada susu 950C
5 menit, denaturasi pada 950C 1 menit,
annealing pada 550C 1 menit, sintesis DNA
pada 720C 1 menit dan ekstensi pada 720C
selama 10 menit dengan 40 siklus. Kemudian
hasil PCR di elektroforesis.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Plasmid rekombinan pembawa
Gen OsMADS18
Plasmid rekombinan pembawa gen
OsMADS18 berhasil dikonstruksi dengan
menyisipkan gen tersebut ke pCAMBIA 1301.
Tahap awal kegiatan ini adalah melakukan
isolasi plasmid pGEM-T Easy yang membawa
gen OsMADS18 dari kultur bakteri Eschericia
coli DH5α dan mengkultur bakteri E.coli ke
dalam media LB cair yang mengandung
antibiotik ampisilin 50 mg/l. Isolasi DNA
plasmid dilakukan dengan menggunakan
metode lisis alkali merujuk pada Sambrook
dan Russel (2001). Adapun prinsip dari
metode ini adalah merusak dinding sel dan
membran sel dari sel E.coli. Penggunaan
Etilen diamin tetra asetat (EDTA) bertujuan
untuk
merusak
dinding
sel
dengan
menghilangkan ion magnesium pada selubung
sel, sehingga sel bakteri pecah (Zhiwen et al.
2006). Sodium Deodosil Sulfat (SDS)
berfungsi untuk menghilangkan molekul lipid,
sehingga akan menyebabkan kerusakan pada
membran sel (Davis et al. 2004). Untuk
memisahkan RNA dari DNA ditambahkan
enzim RNAse yang akan mendegradasi
molekul RNA. Protein dihilangkan dengan
penambahan potasium asetat sehingga protein
akan mengendap dan dipisahkan melalui
sentrifus (Holzmann et al. 2008).
Tahap selanjutnya adalah melakukan
pemotongan terhadap vektor dan fragmen gen
OsMADS18 menggunakan enzim BamHI dan
SalI. Enzim ini mengenali gugus 6 basa
spesifik, yaitu G*GATCC (BamHI) dan
G*TCGAC (SalI) sehingga hasil pemotongan
berujung lenket (Bernard and Pasternak 2002).
Pemotongan vektor pCAMBIA 1301 dan gen
OsMADS18 dengan enzim yang sama
bertujuan agar proses ligasi dapat terjadi
karena kedua ujung vektor dan DNA sisipan
saling berkomplemen. Sedangkan penggunaan
dua enzim berbeda bertujuan untuk
memastikan arah orientasi gen OsMADS18
ketika terligasi dalam vektor pCAMBIA1301.
Hasil elektroforegram menunjukkan bahwa
plasmid pGEM-T Easy yang membawa gen
OsMADS18 berhasil diisolasi dari kultur
E.coli, dibuktikan dengan adanya pita DNA
pada ukuran 3757 bp (Gambar 1; lajur 1).
Selanjutnya plasmid dipotong dengan enzim
BamHI
dan
SalI.
Pemotongan
ini
menghasilkan 2 pita yaitu pGEM-T Easy
(3015 bp) dan OsMADS18 (742 bp) (Gambar
1; lajur 2 dan 3). Sedangkan pemurnian
fragmen gen OsMADS18 dari gel agarose
merujuk pada metode dari QIAGEN (2006).
Tujuan pemurnian adalah untuk mendapatkan
fragmen DNA yang diinginkan (OsMADS18)
dan menghilangkan pengotor-pengotor lain
berupa nukleotida, sisa-sisa garam, dan enzim
yang dapat mengganggu proses selanjutnya
(Dobhal et al. 2010). Hasil elektroforegram
terlihat bahwa pemurnian fragmen gen
OsMADS18 berhasil dilakukan, hal ini
ditunjukkan dengan adanya pita DNA
berukuran 742 bp (Gambar 1; lajur 4).
M
1
2
3
4
3757 bp
3015 bp
742 bp
Gambar 1 Elektroforegram DNA pGEM-T
Easy-OsMADS18 (Lajur 1); DNA
yang dipotong dengan enzim
BamHI dan SalI (Lajur 2 dan 3);
Hasil
pemurnian
fragmen
OsMADS18 (Lajur 4)
9
Konstruksi plasmid rekombinan dilakukan
dengan menyisipkan gen OsMADS18 di
bawah kontrol promotor CaMV35S di dalam
vektor pCAMBIA 1301 linear. Dari hasil
proses ligasi antara vektor pCAMBIA 1301
dengan fragmen gen OsMADS18 diperoleh
plasmid rekombinan pCAMBIA 1301OsMADS18 yang berukuran 12651 bp
(Gambar 2 ; lajur 1). Ukuran ini terdiri atas
ukuran vektor pCAMBIA1301 (11819 bp) dan
fragmen gen OsMADS18 (742 bp). Sedangkan
Gambar 3; lajur 2 adalah hasil restriksi vektor
pCAMBIA 1301 – OsMADS18. Pita dengan
ukuran 11819 bp adalah vektor pCAMBIA
1301, sedangkan pita berukuran 742 bp adalah
gen OsMADS18.
M
1
2
membawa gen OsMADS18, sedangkan koloni
biru tidak membawa gen OsMADS18.
Gambar 3 terlihat bahwa semua koloni
yang terbentuk adalah koloni yang berwarna
putih. Terbentuknya koloni putih disebabkan
adanya penyisipan fragmen gen OsMADS18
pada lacZ di MCS yang mengakibatkan enzim
β-galaktosidase tidak terekspresi (Tsen et al.
2004). Hal ini membuktikan bahwa semua
koloni tersebut membawa plasmid pCAMBIA
1301 yang tersisipi gen OsMADS18.
12651 bp
11819 bp
742 bp
Gambar 2 Elektroforegram pemotongan vector
dengan enzim restriksi. lajur 1 ;
pCAMBIA 1301 - OsMADS18.
lajur 2 ; (11819 bp adalah
fragmen vector pCAMBIA 1301,
742 bp adalah fragmen gen
OsMADS18) M = λ HindIII
Agrobacterium tumefaciens Pembawa
vektor pCAMBIA 1301-OsMADS18
Tahapan selanjutnya adalah transformasi
plasmid rekombinan (vertor pCAMBIA 1301
– OsMADS18) ke Agrobaterium tumefacies
EHA105 dengan metode kejut panas.
Kemudian dilakukan seleksi Agrobacterium
tumefaciens EHA105 yang mengandung DNA
rekombinan berdasarkan pada marka seleksi
antibiotik ripamfisin 50 mg/l dan kanamisis 50
mg/l. Selain itu juga dilakukan seleksi koloni
biru-putih melalui pemberian IPTG dan X-gal
pada media seleksi.
Koloni yang tumbuh pada media seleksi
(Gambar 3) adalah koloni yang membawa
vector pCAMBIA 1301, hal ini terjadi karena
Agrobacterium tumefaciens yang membawa
vector ini akan memilik kemampuan resisten
terhadap antibiotik ripamfisin dan kanamisin.
Sedangkan seleksi koloni biru-putih pada A.
tumefaciens
EHA105
bertujuan
untuk
mendeteksi keberadaan gen OsMADS18
dalam vektor berdasarakan marka seleksi LacZ. Koloni putih menunjukkan bahwa sel
Agrobacterium tumefaciens strain EHA105
Gambar 3 Koloni Agrobacterium tumefaciesn
EHA 105 hasil transformasi dengan
pCAMBIA 1301 (koloni putih)
Tranformasi dan Regenerasi Tanaman
Kemampuan Agrobacterium tumefaciens
sebagai mediasi transformasi sel tanaman
sudah banyak dimanfaatkan, hal ini karena
bakteri tersebut mampu membentuk tumor
yang akan mengintroduksikan gen asing ke
dalam genom tanaman dan gen tersebut akan
terintegrasi dan berfungsi dengan baik
(Uchimiya et al. 1989). Transformasi kalus
dilakukan melalui ko-kultivasi dengan
Agrobacterium tumefaciesn EHA105 yang
mengandung pCAMBIA 1301 pembawa gen
OsMADS18.
Beberapa faktor penting yang menentukan
keberhasilan transformasi tanaman padi
melalui A.tumefaciens adalah; tipe dan umur
jaringan, jenis vektor, genotipe, kondisi kultur
jaringan, waktu infeksi. Kalus embriogenik
merupakan salah satu faktor penting yang
menentukan efisiensi transformasi (Hiei et al.
1997). Secara morfologi, kalus embriogenik
mempunyai bentuk yang teratur, compact,
bewarna putih atau kekuningan, sedangkan
kalus non-embriogenik bersifat lembek, tidak
membentuk embrio, dan pertumbuhan
kalusnya lambat, tetapi dapat tumbuh besar
dalam waktu yang lama (Rueb et al. 1994).
10
Hasil tranformasi diperoleh sejumlah kalus
yang membawa gen penyeleksi hpt sehingga
bisa hidup dalam media yang mengandung
antibiotik higromisin. Jumlah kalus yang
resisten terhadap higromisin pada media
seleksi adalah 18 kalus. Kalus yang resisten
higromisin akan berwarna putih kekuningan.
Sedangkan kalus yang tidak resisten akan
mengalami gejala nekrotik (warna hitam)
(Gambar 4b). Kemudian kalus tersebut
dipindahkan
ke
media
regenerasi.
Kemampuan regenerasi kalus setelah proses
transformasi akan menentukan jumlah planlet
yang dihasilkan. Hal ini terkait dengan
kombinasi dan konsentrasi hormon yang
digunakan
pada
media
regenerasi.
Pertumbuhan tunas pertama kali terjadi pada
hari ke-4, yaitu dengan menculnya green spot
pada kalus (Gambar 4c). Green spot ini akan
terus tumbuh hingga menjadi planlet padi
trangenik (Gambar 4d).
a
d
b
Tanaman Transgenik
Percobaan ini menghasilkan 18 tanaman
transgenik yang mengandung gen OsMADS18.
Hal ini dibuktikan dengan uji gus-A dan PCR
(Polymerase Chain Reaction). Uji gus-A bisa
dilakukan karena plasmid pCAMBIA 1301
mengandung gen gus-A dan gen hpt untuk
ketahanan terhadap atibiotik higromisin. Uji
histokimia β-glucuronidase dapat dilakukan
pada tahap awal segera setelah ko-kultivasi
maupun setelah gen diintroduksikan dan
terintegrasi dengan stabil dalam genom
tanaman. Pada penelitian ini digunakan daun
tanaman padi hasil transformasi.
Hasil pengujian terhadap semua tanaman
menunjukkan
bahwa
semua
tanaman
mengandung gen gus-A. Hasil transformasi
positif ditunjukkan dengan adanya warna biru
yang muncul pada irisan daun (Gambar 5).
Warna biru tersebut disebabkan oleh reaksi
substrat X-gluc (5-bromo-4-chromo-3-indolysβ-D-glucuronide)
dengan
enzim
βglucuronidase menjadi senyawa intermediet
melalui reaksi dimerisasi oksidatif membentuk
senyawa
dichloro-dibromoindigo
(CIBrIndigo) yang berwarna biru.
Berdasarkan elektroforegram hasil PCR
terhadap 18 tanaman transgenik (Gambar 6),
semua tanaman membawa gen OsMADS18.
Hal ini ditunjukkan dengan adanya pita yang
berukuran 742 bp yang merupakan ukuran
dari gen tersebut.
c
Gambar 5 Hasil uji β-glucuronidase terhadap
daun tanaman padi. Hasil positif
ditunjukkan dengan terbentuknya
warna biru.
Gambar 4 Transformasi genetik padi Indica
menggunakan A. tumefaciens a)
Kalus yang telah diinfeksi
A.tumefaciens pada media kokultivasi (kalus hitam mengalami
nekrotik = gagal). b) Seleksi kalus
resisten
higromisin.
c)
Pertumbuhan tunas awal pada
media regenerasi (wana hijau
adalah greenspot yang akan
menjadi planlet). d) Planlet padi
transgenik.
KESIMPULAN
Sejumlah 18 planlet Indica berhasil di
transformasikan dengan gen OsMADS18.
Keberhasilan uji gus-A di tunjukkan dengan
munculnya warna biru pada irisan jaringan
daun. Sedangkan analisis PCR terhadap 18
planlet
transgenik
menghasilkan
pita
berukuran 742 bp, ini menunjukkan bahwa
gen OsMADS18 sudah terintegrasi ke dalam
genom tanaman padi.
11
742 bp
Gambar 6 Elektroforegram PCR terhadap gen OsMADS18, M = 1kb, kontrol negative (-) non
transgenik, lajur 1-18 tanaman transgenik positif terdapat gen OsMADS18 (ukuran pita
742 bp).
SARAN
Tanaman transgenik yang dihasilkan perlu
dianalisis lebih lanjut dengan Southern Blot
untuk mengetahui jumlah kopi. analisis
Western Blot untuk mengetahui ekspresi gen
yang diintroduksi. Uji segregasi terhadap
keturunan berikutnya untuk mendapatkan
tanaman transgenik yang mengandung gen
sasaran tetapi tidak mengandung gen
penyeleksi antibiotik.
DAFTAR PUSTAKA
Azhakanandam K, MS McCabe, JB POwer,
KC LOwe, EC Cocking, MR Davey. 2000.
T-DNA transfer, integration, expression
and inheritance in rice: Effects of plant
genotype and Agrobacterium tumefaciens
super-virulence. J Plant Physiol 157:429439
Belarmino MM. and Mii M.
2000.
Agrobacterium
mediated
genetic
transformation of a phalaenopsis orchid.
Plant Cell Report 19:435-442
Bernard JG, Pasternak JJ. 2002. Molecular
Biotechnology:
Principles
and
Applications of Recombinant DNA. 3rd
Edition. USA: American Society for
Microbiology
Casali N, Andrew P, Preston A. 2003. E coli
plasmid vectors: methods and applications.
Humana Press 12:19-25
Cheng M, Lowe BA ,Spencer M ,Ye X,
Armstrong CL. 2004. Factors influencing
Agrobacterium-mediated transformation
of monocotyledonous species. Dev
Biology-Plant 40: 31-45
Christou P. 1990. Inheritance and expression
of foreign genes in transgenic soybean
plants. Proc. Natl. Acad. Sci. 86:75007504. In. Marc de Block. 1993. The cell
biology of plant transformation : current
state, problem, prospects and the
implication for the plant breeding. Kluwer
Aad Publisher. Netherlands.
Chuanfeng Z, Jiahe W, Chaozu H. 2010.
Induction of chromosomal inversion by
integration of T-DNA in the rice genome. J
Genet Genomics 37:1-9
Coombs JT, Franco CMM. 2003. Isolation and
identification of actinobacterial isolated
from surface-sterilized wheat roots.
Applied Environ Microbiol 69:5303-5308.
Datta SK, Peterhand A, Datta K and Potrykus
I. 1990. Genetically enginered fertile
Indica-rice recovered from protoplast.
Biotech 8:736-740
Datta SK, Datta K, Soltanifar N, Donn G and
Potrykus I. 1992. herbicide resistant
Indica-rice plants from IRRI breeding line
IR72 after PEG mediated transformation of
protoplast. Plant Mol Biol 20:619-629
Davis L et al. 1994. Basic Methods:
Molecular Biology. Jilid 2. Norwola :
Appletn & Lange
Dobhal S, P Dinesh, K Anil, A Sanjeev. 2010.
Studies on plant regeneration and
transformation
efficiency
of
Agrobacterium mediated transformation
using neomycin phosphotransferase II
(nptII) and glucuronidase (GUS) as a
reporter gene. Afr J of Biotech vol
9(41):6853-6859
12
Dieffenbach CW, Dveksler GS. 2003. PCR
Primer, A Laboratory Manual. 2nd
Edition. USA: Spring Harbor Laboratory Pr.
Dworkin MM, Falkow W, Rosenberg E,
Schleifer K, Stackebrandt E. 2006. The
Prokaryotes. 3rd Edition. USA: Springer.
Enriquez-Obregon GA, Prieto-Samsonov DL,
de la Riva GA, Perez MI, SelmanHousein G, Vazquz-Padron RI. 2000.
Agrobacterium-mediated Japonica rice
transformation a procedure assisted by an
antinecrotic treatment. Plant Cell Tiss.
Organ Cult. 59: 159-168l
Favaro R, Pinyopich A, Battaglia R, Kooiker
M, Borghi L, Ditta G, Yanofsky MF, Kater
MM, Colombo L. 2003. MADS box
protein complexes control carpel and ovule
development in Arabidopsis. Plant Cell
15:2603–2611
Ferrandiz C, Gu Q, Martienssen R, Yanofsky
MF. 2000. Redundant regulation of
meristem identity and plant architecture by
FRUITFUL,
APETALA1
and
CAULIFLOWER. Development 127:725–
734
Agrobacterium-mediated transformation. J
App Bioscien vol 10(2):538-546
Herman M. 2002. Perakitan hasil rekayasa
genetik dan pengaturan keamanan hayati
Indonesia. Bul Agrobio vol 5(1).
Herman M 2010. Aplikasi teknik rekayasa
genetik dalam perbaikan sumber daya
genetik tanaman untuk ketahanan cekaman
biotik. Bul Plasma Nutfah Vol 16(1):172.
Heryati N. 2002. Konstruksi Plasmid
Rekombinan cryIB dan cryIAc di bawah
kontrol promotor terinduksi pelukaan
[SKRIPSI]. Derpartemen Kimia IPB.
Hiei Y, KOmari T, Kubo T. 1997. Efficient
transformation of rice (O.sativa L.)
mediated by Agrobacterium and sequence
analysis of the boundaries of the T-DNA.
The Plant J 6(0):001-011.
Holzmann J, P Frank, E Löffler, K Bennett, C.
Gerner, W Rossmanith .2008. RNase P
without RNA: Identification and functional
reconstitution of the human mitochondrial
tRNA processing enzyme. Cell 135 (3):
462–474
Fornara F, Parenicova L, Falasca G, Pelucchi
N, Masiero S, Ciannamea S, Lopez-Dee Z,
Altamura MM, Colombo L, Kater MM.
2004. Functional characterization of
OsMADS18, a member of the AP1/SQUA
subfamily of MADS box genes. Plant
Physiol 135:2207-2219
Jaakola L. AM Pirtilla, M Halonen, and A
Hohtola. 2001. Isolation of hight-quality
DNA from bilberry (Vaccinium myrtillus
L.) fruit. Mol Biotech 19:201-203
Frame B. H Zhang, S Cocciolone, L
Sidorenko, C Dictrich, S Pegg, S Zhen, P
Schnable, K Wang. 2000. Production of
transgenic maize from bombarded type II
callus: effect of gold particle size and
callus morphology on transformation
efficiency. In Vitro Cell Dev Plant 36:2129
Joseph B, Jini D, Ajisha SU. 2011. Fight
global warming wiht genetically altered
trees. Asian J Biotech 1-8
Garris AJ. 2004. Genetic structure and
diversity in Oryza sativa L. Genetics
169:1631-1638
Klee H. 2000. A guide to Agrobacterium
binary Ti vectors. Trends in Plant Scie
5:446-451
Gao Z, Xie X, Ling Y, Muthurrishnan S,
Liang
HG.
2005.
Agrobacterium
tumefaciens transformation using an
mannose selection system. J Plant Biotech
3:591-597
Lal R and Lal S. 1993. Genetic Enginering of
Plants for Crop Improvement. New Delhi:
CRS Pr.
Ghasemi BK, SV Stepanovich, KG Illich.
2008. Design, construction and cloning of
pCAMBIA-MiAMP1 vector for enhancing
disease resistance in plants using
Jefferson RA. 1987. Assaying chimeric genes
in plant : the GUS gene fusion system.
Plant Mol Biol Rep 55:387-405
Kibria K, Islam MM, and Begum SN. 2008.
Screening of aromatic rice lines by
phenotypic and molecular markers. J Bot
37(2):141-147
Le VQ, Belles-Isles J, Dusabenyagusani M,
tremblay FM. 2001. An improved
procedure for production of white pruce
(Picea glauca) transgenic plants using
Agrobacterium tumefaciens. J Exp Bot
52:2089-2095
13
Lestari AP, Aswidinnorr H, Suwarno. 2007.
Uji daya hasil pendahuluan dan mutu beras
21 padi hibrida harapan. Bul Agron
35(1):1-7
Listanto E, Sutrisno, Saptowo JP, Herman M.
2005. Penyisipan gen inhibitor α-amilase
pada plasmid biner pCAMBIA 1301. J
Agro Biogen 1(2):45-52
Lucca P, Ye X, Potrykus I. 2001. Effective
selection and regeneration of transgenic
rice plants with mannose as selective
agent. Mol Breed 7:43-49
Madigan MT, Martinko JM. 2006. Brock:
Biology of Microorganism. 12th edition,
San
Francisco
Perason
Education
International. p989-990
Masiero S, Imbriano C, Ravasio F, Favoro R,
Pelucchi N, Gorla MS, Mantovani R,
Colombo L, Kater MM. 2002. Ternary
complex formation between MADS-box
transcription factor and the histone fold
protein NF-YB. J Biol Chem Vol. 277
(29):26429-26435
Matthews PR. Ming-Bo W, Waterhouse PM,
Thornton S, Fieg SJ, Gubler F, Jacobsen
JV. 2001. Marker gene elimination from
transgenic barley, using co-transformation
with adjacent "twin T-DNAs" on a
standard Agrobacterium transformation
vector. Mol Breed 7:195-202
Mikkelsen SR, Corton E. 2004. Bioanalytical
Chemistry. New Jersey: John Wiley &
Sons.
Olhoft PM, Flaye, LE, Sowers DA. 2004. TDNA locus structure in a large population
of soyabean plant transform using the
Agrobacterium-mediated
cotyledonanynode methods. Plant Biotech. J. 2: 289300.
Opabode JT. 2006. Agrobacterium-mediated
transformation of plants: emergin factors
that influence efficiency. Biotech Mol Biol
Rev 1(1):12-20
Pray L. 2008. Recombinant DNA technology
and transgenic animal. Nature Education
1(1):125-133
Primrose SB, Twyman RM. 2006. Principles
of Gene Manipulation and Genomics. Ed.
Ke-7. Oxford: Blackwell Publishing
Purnamaningsih R. 2006. Induksi kalus dan
optimasi regenerasi empat varietas padi
melalui kultur In Vitro. J Agro Biogen
2(2):74-80
Rachmawati D, T Hosaka, E Inoue, H Anzai.
2004.
Agrobacterium-mediated
transformation of javanica rice cv.
Rojolele. Biosci Biotech Bioch 68:11931200
Rachmawati EE. 2010. Peningkatan Viabilitas
(Priming) Benih Juwawut (Setaria italica
(L.) P. Beauvois) dengan Polyethylene
Glycol (PEG) 6000 [SKRIPSI]. Biologi.
Fakultas Sains dan Teknologi. UIN
Malang.
Rajesh S, Krishnaveni S, Sudhakar D,
Raveendran M, Sivakumar P, Gnanam R,
Manickam A. 2008. Agrobacteriummediated transformation on indica rice
(Oryza sativa L.), IR64 with mungbean
LEA protein gene for water-stress
tolerance. Am J Plant Physiol 3(3):101-110
Rueb S and Hensgens LAM. 1989. Improved
histochemical
staining
for
β-Dglucuronidase
activity
in
monocotyledonous plant. Genet 6:168169.
Rueb S, Leneman M, Schilperoort RA,
Hensgens LAM. 1994. Efficient plant
regenartion
through
somatic
embryogenesis from callus induced on
mature rice embryos (Oryza sativa L.).
Plant Cell, Tissue And Organ Cult 36:259264.
Sarkar S, Chaudhuri S, Basu T. 2002.
Mechanism of arttificial transformation of
E.coli with plasmid DNA-clues from the
influence of ethanol. Current Science
83:1376-1380
Pelucchi N, Fornara F, Favalli C, Masiero S,
Lago C, Pe ` ME, Colombo L, Kater MM.
2002. Comparative analysis of rice MADS
box genes expressed during flower
development. Sex Plant Reprod 15:113–
122
Sambrook J, Russel DW. 2001. Molecular
Cloning : A Laboratory manual.3rd
Edition. New York: Cold Spring Harbor
Laboratory Pr, Cold Spring Harbor
Peng J, Kononowcz H and Hodges TK. 1992.
Transgenic indica rice plants. Theor Appl
Genet 83:855-863
Schroeder S, Hondred D, Seltzer J, Pierce D.
2000. Agrobacterium-mediated sorghum
transformation. Plant Mol Biol 44:789-798
14
Sha Y, Li S, Pei Z, Luo L, Tian Y, He C.
2004. Generation and flanking sequence
analysis of a rice T-DNA tagged
population. Theor Appl Genet 108:306-314
Stomp AM. 1992. Histochemical localization
of B-glucuronidase. IN : S.R. Gallagher
(ed) GUS Protocols : using the GUS gene
as reporter of gene expression. London :
Academic Press, Inc.
Sutrisno M, Herman S, J Pardal, E Listanto, A
Sisharmini, SG Budiarti, D Damayanti, TJ
Santoso, R. Wu. 2000. Regenerasi embrio
muda jagung Antasena dan Bisma yang
ditembak dengan Plasmid pTW-a dan
pRQ6. Dalam Moejopawiro S, T
Purwadaria, M Herman, A Rukyani,
Sutrisno, H Kasim, IN Orbani (eds.).
Prosiding Ekspose Hasil Penelitian
Bioteknologi Pertanian dalam rangka 25
Tahun
Badan
Penelitian
dan
Pengembangan Pertanian. Balitbangtan,
Deptan.
Tsen Z et al. 2002. Natural plasmid
transformation in Escherichia coli. J
Biomel Scine 9:246-252.
Tzfira T, citovsky V. 2002. Partners-ininfection: host proteins involved in the
transformation
of
plant
cell
by
Agrobacterium. Trends in Cell Biol
12:121-130
Tzfira T, Li JX, Lacroix B, Citovsky V. 2004.
Agrobacterium
T-DNA
integration:
molecules and models. Trends Genet
20:375-383.
Uchimiya H, Handa T, Brar DS. 1989.
Transgenic plant. J Biotech 12:1-20
Utomo SD. 2005. The effect of L-Cysteine on
the efficiency of Agrobacterium-mediated
transformation of maize (Zea mays). Bul
Agron 33(3):7-16
Walkerpeach C and Velten J. 1994.
Agrobacterium-mediated gene transfer to
plant cells : cointegrate and binary vector
systems. Plant Mol Biol Man B1:1-19
Wangxia W. 2003. Plant responses to drought,
salinity and extreme termperatures:
towards genetic engineering for stress
tolerance. PLANTA 218(1):1-14
Watson JD, Hopkins NH, Roberts J, Seitz JA,
Wainer AM. 2007. Molecular Biology of
the Gene. 6 Edition. California: The
Benyamin/Cumming Publishing Co Inc.
Widodo
2002.
Pengaruh
tegangan
elektroporasi
terhadap
efisiensi
transformasi plasmid pND968 bakteri
asam laktat ke E.coli HB101. J Teknol dan
Ind Pang Vol XIII(2):173-177
Xiao H, Wang Y, Liu D, Wang W, Li X, Zhao
X, Xu J, Zhai W, Zhu L. 2003. Functional
analysis of the rice AP3 homologue
OsMADS16 by RNA interference. Plant
Mol Biol 52:957–966
Yina K, Biran I, Davie RW. 2004.
Simultaneously
monitoring
gene
expression kinetics and genetic noise in
single cells by optical well array. Anal
Chem 76:6282-6286
Zhiwen Yuan, Jeanne M. VanBriesen. 2006.
The formation of intermediates in EDTA
and nta biodegradation. Environ Eng Sci
23:533-544.
Zhou HY, et al. 2003. Generating marker-free
transgenic tobacco by Agrobacteriummediated transformation with double TDNA binary vector. Acta Bot Sin 45:11031108
Zohary D, Hopf M. 2000. Domestication of
Plants in The Old World. Oxford: Oxford
University Pr
Zupan J, Muth TR, Draper O, Zambryski P.
2000. The transfer of DNA from
Agrobacterium tumefaciens into plants: A
feast of fundamental insights. Plant J 23:
11-28
LAMPIRAN
16
Lampiran 1 Diagram alir penelitian
Isolasi Plasmid dari E.coli DH5α
Restriksi dengan enzim BamHI dan SalI
Purifikasi DNA dari Gel Agarose
Seleksi dan Sterilisasi
Benih Padi Indica
Ligasi DNA ke Vektor pCAMBIA 1301
Transformasi ke Agrobacterium tumefaciens
Kultur Jaringan
Padi Indica
Transformasi Kalus dengan A. tumefaciens
Seleksi dan Regenerasi
Uji gus-A
Isolasi DNA Tanaman
Analisis PCR
17
Lampiran 2 Proses umum isolasi plasmid (Sambrook & Russel 2001)
Koloni tunggal bakteri E.coli
ditumbuhkan ke media LB
diinkubasi selama 24 jam
pada suhu ruang
kultur bakteri dipanen dengan sentrifugasi
pada 10.000 rpm selama 1 menit
pemurnian DNA dengan larutan I, larutan II
dan larutan III
pemekatan DNA dengan etanol absolut
18
Lampiran 3 Peta Plasmid pCAMBIA 1301 (cambia.org)
Lampiran 4 Proses umum reaksi ligasi (Sambrook & Russel 2001)
pCAMBIA 1301
19
Lampiran 5 Proses purifikasi DNA dengan metode dari QiAgen (2006)
Hasil PCR
+ 3x volume buffer QG dan 1x volume isopropanol
Sentrifuse
+ Buffer PE 0,75 mL
Sentrifuse
+ Buffer EB 50 µL
Sentrifuse
Diperoleh DNA murni
20
Lampiran 6 Proses umum isolasi DNA tanaman (Sambrook & Russel 2001)
0,5 g bunga padi Indica, ditambah N2
lisis sel secara mekanik dengan penggerusan
sel dipanen dengan sentrifugasi
pada 12.000 rpm 10 menit
pemurnian DNA dengan kloroform/isoamilalkohol (1:1) dan disentrifugasi pada 12.000 rpm
selama 10 menit
pemekatan DNA dengan etanol absolut
pelet diresuspensi dengan etanol 70%
disentrifugasi pada 12.000 rpm selama 2 menit
dan dikeringkan selama 5 menit
DNA kering dilarutkan dengan 50 µL bufer TE
21
Lampiran 7 Bahan-bahan pembuatan media
Media
LB
Makro
elemen
Mikro
elemen
IK3
Ko-kultivasi
Seleksi I
Seleksi II
Regenerasi
R3B
MS
AAM pH
5,2
Komposisi
5 g/l bacto yeast extract, 10 g/l bacto tripton, 5 g/l NaCl, dibuat
pH 7.5; untuk media padat + 15 g/l bacto agar
0.65 mg/l NH4NO3, 1.9 mg/l KNO3, 0.37 mg/l MgSO4.7H2O,
0.17 mg/l KH2PO4, 0.44 mg/l CaCL2.2H2O)
0.8 mg/l KI, 6.2 mg/l H3BO3, 22.3 mg/l MnSO2.4H2O, 8.6 mg/l
ZnSO4.7H2O, 0.25 mg/l Na2MoO4.2H2O, 0.025 mg/l
CuSO4.5H2O, 0.025 mg/l CoCl2.6H2O
50 ml/l Makro elemen, 2 ml/l Mikro elemen, EDTA 36.7 mg/l,
Thiamin HCL 0.5 mg/l, 30 g/l sukrosa, 2.5 mg/l 2.4-D,
Myoinositol 0.1 g/l, Phytagel 3.75 g/l
media IK3 + 100 uM acetosyringone, pH 5,2
IK3 + 250 mg/l cefotaxime, 50 mg/l higromisin, 60 mg/l
timentin, pH5,8
IK3 + 50 mg/l cefotaxime, 50 mg/l higromisin, 50 mg/l timentin,
pH 5,8
IK3 + hormon 0.5 mg/l, IAA 0.3 mg/l BAP
50 ml/l Makro elemen, 2 ml/l Mikro elemen, EDTA 36.7 mg/l,
Vitamin, AA (pyridoxine-HCl 0.5 mg/l, thiamin HCl 0.1 mg/l,
nicotinic acid 0.5 mg/l, glycine 3 mg/l), 30 g/l sukrosa, 0.1 g/l
myoinositol, 3.75 g/l phytagel
Makro elemen I AA, Makro elemen II AA, 2 ml/l Mikro elemen
LS, EDTA 36.7 mg/l, Asam amino (L-glutamine 877 mg/l, Lasparagine 266 mg/l, l-arginin 228 mg/l, l-glycine 75 mg/l),
Pyridoxine-HCl 1 mg/l, Thiamin HCL 0.6 mg/l, Nicotinic acid
0.5 mg/l, Hormon 2.4-D 0.5 mg/l, 30 g.l sukrosa, 100 uM
acetosyringone