laporan kemajuan penelitian - Pustaka Ilmiah Universitas Padjadjaran

advertisement
LAPORAN AKHIR
PENELITIAN UNGGULAN PERGURUAN TINGGI
Pengaruh Ko-ekspresi Sec4p Pichia pastoris Terhadap Tingkat Sekresi
-Amilase Saccharomycopsis fibuligera oleh
Pichia pastoris rekombinan
Tahun ke-1 dari rencana 2 tahun
Ketua Peneliti
Dr. Shabarni Gaffar, M.Si. (NIDN: 0025047105)
Anggota Peneliti
Dr. Yeni Wahyuni Hartati (NIDN: 0024097101)
DIBIAYAI OLEH:
DIPA BLU Nomor 023.04.2.189726/2013Tanggal 5 Desember 2012
Sesuai dengan Keputusan Rektor Unpad No. 7632/UN6.RKT/KU/2013
Tanggal 1 Februari 2013
UNIVERSITAS PADJADJARAN
NOVEMBER, 2013
2
DAFTAR ISI
LEMBAR PENGESAHAN....................................................................................... 2
DAFTAR ISI .............................................................................................................
3
DAFTAR GAMBAR.................................................................................................
5
DAFTAR TABEL.....................................................................................................
6
DAFTAR LAMPIRAN............................................................................................
7
RINGKASAN ...........................................................................................................
8
PRAKATA................................................................................................................ 10
BAB I. PENDAHULUAN ........................................................................................ 11
1.1. Latar belakang dan permasalahan yang akan diteliti .................................... 11
1.2. Permasalahan yang akan dikaji .................................................................... 12
BAB II. KAJIAN PUSTAKA ................................................................................... 14
2.1. Jalur sekresi protein ...................................................................................... 13
2.2. Eksositosis .................................................................................................... 15
2.3. Protein Sec4p ................................................................................................ 16
2.4. Peran Sec4p dalam penargetan dan penambatan vesikel sekresi ................. 18
2.5. Jalur sinyal dari Sec4p dalam mengarahkan vesikel ke proses fusi ............
21
2.6. Sistem ekspresi P. pastoris dan vektor pPIC3.5K untuk P. pastoris .........
22
BAB III. TUJUAN DAN MANFAAT PENELITIAN............................................ 25
3.1. Tujuan Khusus............................................................................................... 26
3.2. Penelitian pendahuluan yang telah dilakukan................................................ 27
BAB IV. METODE PENELITIAN ......................................................................... 29
4.1. Disain Penelitian .......................................................................................... 29
4.2. Metoda Penelitian ......................................................................................... 29
4.2.1. Amplifikasi SEC4 P. pastoris dan subkloning dalam E. coli............ 29
4.2.2. Karakterisasi pJET1.2-SEC4 rekombinan ........................................ 30
4.2.3. Penentuan urutan Nukleotida SEC4 dalam pJET1.2─SEC4 ...........
32
4.2.4. Kloning fragmen SEC4 menggunakan vektor pPIC3.5K ...............
32
4.2.5. Penentuan urutan nukleotida SEC4 dalam pPIC3.5K-SEC4............
33
4.2.6. Transformasi P. pastoris menggunakan plasmid pPIC3.5K-SEC4... 33
4.2.7. Seleksi dan karakterisasi transforman P. pastoris............................. 34
4.2.7. Ekspresi -amilase dan ko-ekspresi Sec4p.......................................
34
3
4.2.8. Analisis aktivitas -amilase..............................................................
35
4.2.9. Karakterisasi -amilase dan Sec4p intra dan ekstraselular............... 35
4.3. Bagan alir penelitian...................................................................................... 36
BAB V. HASIL YANG DICAPAI............................................................................ 38
5.1. Amplifikasi SEC4 P. pastoris dan subkloning dalam E. coli........................ 38
5.2. Konstruksi plasmid pPIC3.5K-SEC4 dan kloning dalam E. coli.................. 39
5.3. Isolasi plasmid pPIC3.5K-SEC4 dari E. coli TOP10F’ dan linearisasi.......
42
5.4. Uji kuantitatif P. pastoris WT-68 dan WT-78.............................................. 44
5.5. Transformasi P. pastoris menggunakan plasmid pPIC3.5K-SEC4.............. 45
5.6. Seleksi dan karakterisasi transforman P. pastoris ...................................... 46
5.7. Ekspresi -amilase oleh P. pastoris rekombinan......................................... 47
5.8. Aktivitas -amilase hasil ekspresi................................................................ 49
5.9. Kadar protein............................................................................................... 51
VII. KESIMPULAN DAN SARAN........................................................................ 54
7.1. Kesimpulan................................................................................................... 54
7.2. Saran............................................................................................................. 54
DAFTAR PUSTAKA .............................................................................................. 55
LAMPIRAN.............................................................................................................. 57
4
DAFTAR GAMBAR
Gambar 2.1
Diagram jalur sekresi protein................................................................... 14
Gambar 2.2
Siklus aktivasi/inaktivasi dan translokasi protein Rab............................. 17
Gambar 2.3
Tahapan lanjut eksositosis pada membran plasma................................... 19
Gambar 2.4
Kompleks eksosis.................................................................................... 20
Gambar 2.5
Model jalur sinyal Sec4p dalam peranannya meregulasi proses
eksositosis................................................................................................ 22
Gambar 2.6
Peta vektor pPIC3.5K.............................................................................. 24
Gambar 2.7
Urutan multiple cloning sites pada vektor pPIC3.5K............................. 24
Gambar 3.1
Amplikon SEC4...................................................................................... 27
Gambar 4.1
Bagan alir penelitian tahap 1................................................................... 36
Gambar 4.2
Bagan alir penelitian tahap 2................................................................... 36
Gambar 5.1
Produk PCR gen SEC4 dan koloni transforman
E. coli [pJET1.2-SEC4].......................................................................... 38
Gambar 5.2
Hasil restriksi plasmid pJET1.2-SEC4 dengan enzim EcoRI................. 39
Gambar 5.3
Hasil restriks pJET1.2-SEC4 dan vektor pPICK3.5K dengan
enzim EcoR1............................................................................................ 39
Gambar 5.4
Koloni E. coli [pPIC3.5K-SEC4] yang diremajakan............................... 40
Gambar 5.5
Peta plasmid pPIC3.5K-SEC4 hasil konstruksi........................................ 40
Gambar 5.6
Homologi urutan nukleotida SEC4 hasil subkloning dengan
urutan SEC4 nomor NCBI...................................................................... 41
Gambar 5.7.
Hasil isolasi plasmid pPIC3.5K-SEC4.................................................... 42
Gambar 5.8
Hasil linearisasi plasmid pPIC3.5K-SEC4.............................................. 44
Gambar 5.9
Hasil uji aktivitas -amilase secara kualitatif......................................... 44
Gambar 5.10 Koloni P. pastoris[ALP1-SEC4] hasil transformasi................................ 45
Gambar 5.11 Koloni P. pastoris[ALP1-SEC4] pada media YPD padat........................ 46
Gambar 5.12 Seleksi fenotipe His+................................................................................ 47
Gambar 5.13 Hasil peremajaan transforman P. pastoris............................................... 47
Gambar 5.14 Densitas optik P. pastoris [ALP1-68/SEC4] dan [ALP1-78/SEC4]....... 49
Gambar 5.15 Hasil reaksi penentuan aktivitas dengan metoda DNS............................ 50
Gambar 5.16 Hasil uji aktivitas a-amilase dengan metoda DNS................................... 51
5
DAFTAR TABEL
Tabel 5.1 Pengaruh ko-ekspresi Sec4p terhadap level ekspresi -amilase..................... 52
Tabel L1. Penentuan serapan standar glukosa dengan metoda DNS............................... 61
Tabel L.2 Aktivitas P. pastoris [ALP1-68/SEC4]............................................................ 62
Tabel L.3 Aktivitas P. pastoris [ALP1-68]..................................................................... 62
Tabel L.4 Aktivitas P. pastoris [ALP1-78]...................................................................... 62
Tabel L.5 Aktivitas P. pastoris setelah transformasi [ALP1-78/SEC4]........................... 62
Tabel L.6 Kurva Standar Protein...................................................................................... 64
Tabel L.7 Kadar protein supernatan P. pastoris [ALP1-68]............................................65
Tabel L.8 Kadar protein supernatan P. pastoris [ALP1-68/SEC4].................................. 66
Tabel L.9 Kadar protein supernatan P. pastoris [ALP1-78]...........................................66
Tabel L.10 Kadar protein supernatan P. pastoris [ALP1-78/SEC4]................................ 66
6
DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran 1. Instrumen penelitian..................................................................................... 57
Lampiran 2. Evaluasi capaian luaran kegiatan.................................................................. 58
Lampiran 3. Sertifikat seminar nasional........................................................................... 59
Lampiran 4. Abstrak seminar nasional.............................................................................. 60
Lampiran 5. Penentuan Serapan Standar Glukosa............................................................ 61
Lampiran 6. Penentuan Aktivitas -amilase dengan Metoda DNS.................................. 62
Lampiran 7. Penentuan kadar protein............................................................................... 64
Lampiran 8. Biodata ketua dan anggota peneliti.............................................................. 67
7
RINGKASAN
Produksi -amilase rekombinan oleh sistem ekspresi P. pastoris dapat
dimanfaatkan untuk berbagai industri. Enzim -amilase dibutuhkan oleh industri pangan,
tekstil, farmasi dan bioetanol. Inang ekspresi yang dapat mensekresikan protein keluar sel
lebih disukai karena memudahkan proses pemurnian. Protein yang akan disekresikan ke
luar sel akan melalui suatu jalur sekresi protein yang melibatkan banyak protein dan
kompartemen di dalam sel. Sec4p merupakan suatu protein Rab yang berperan penting
dalam tahap akhir sekresi protein. Protein ini berfungsi untuk menargetkan vesikel
sekresi yang membawa protein yang akan disekresikan ke membran plasma pada proses
pasca-Golgi untuk kemudian mengalami penggabungan dengan membran plasma dan
mensekresikan protein yang dikandungnya ke luar sel. Ko-ekspresi Sec4p dalam suatu
inang ekspresi ragi diketahui dapat meningkatkan tingkat sekresi protein asing.
Penelitian ini bermaksud untuk mempelajari pengaruh ko-ekspresi protein Sec4p P.
pastoris terhadap tingkat sekresi -amilase S. fibuligera oleh P. pastoris. Pada penelitian
pendahuluan yang telah dilakukan, gen SEC4 yang berukuran 615 pb telah diamplifikasi
dari genom P. pastoris dengan metoda PCR dan di subkloning menggunakan vektor
pJET1.2 dalam inang E. coli.
Pada penelitian ini fragmen SEC4 hasil subkloning telah ditentukan urutan
nukleotidanya dengan metoda Dye terminator. Selanjutnya fragmen SEC4 di kloning
mengggunakan vektor ekspresi pPIC3.5K untuk P. pastoris menghasilkan plasmid
rekombinan
pPIC3.5K-SEC4.
Plasmid
pPIC3.5K-SEC4
dikarakterisasi
melalui
pemotongan dengan enzim restriksi dan penentuan urutan nukleotida. Plasmid
pPIC3.5K-SEC4 selanjutnya digunakan untuk mentransformasi P. pastoris rekombinan
yang telah mengandung gen pengode -amilase (ALP1) S. fibuligera.
Inang P. pastoris [ALP1/SEC4] digunakan untuk mempelajari pengaruh koekspresi Sec4p terhadap tingkat sekresi -amilase oleh P. pastoris rekombinan.
-Amilase hasil ekspresi dianalisis aktivitasnya dan ditentukan kadar proteinnya, serta
dibandingkan dengan hasil ekspresi tanpa ko-ekspresi Sec4p. Ko-ekspresi Sec4p
diharapkan meningkatkan level sekresi -amilase oleh P. pastoris. Inang P. pastoris
yang mensekresikan -amilase level tinggi dapat digunakan untuk produksi enzim
-amilase yang dapat diaplikasikan untuk berbagai industri, seperti industri pangan,
farmasi, tekstil dan detergen.
8
Hasil penelitian yang telah diperoleh dan dilaporkan pada laporan ini adalah: Gen
SEC4 berhasil diamplifikasi dari genom P. pastoris menggunakan metode PCR. Fragmen
SEC4 dengan ukuran 615 pb diligasi ke vektor pJET1.2 menghasilkan plasmid
rekombinan pJET1.2-SEC4 dan disubkloning dalam E. coli TOP10F’. Gen SEC4 dari
plasmid pJET1.2-SEC4 yang telah dikarakterisasi, dipotong menggunakan enzim
restriksi EcoR1. Fragmen SEC4 hasil pemotongan dengan enzim EcoR1 diligasi ke
vektor pPIC3.5K menghasilkan vektor ekspresi rekombinan pPIC3.5K-SEC4 dan
selanjutnya dikloning dalam E. coli TOP10F’. Hasil analisis restriksi dan penentuan
urutan nukleotida gen SEC4 dalam plasmid pPIC3.5K-SEC4 hasil kloning menunjukkan
bahwa vektor ekspresi yang mengandung gen SEC4 berhasil dikonstruksi dan gen SEC4
dengan ukuran 615 pb memiliki urutan nukleotida yang identik dengan urutan SEC4
P. pastoris di Genbank. .
Selanjutnya gen SEC4 telah berhasil diintroduksi ke dalam P. pastoris [ALP1]
sehingga diperoleh P. pastoris [ALP1-SEC4]. Hasil analisis aktivitas -amilase pada
supernatan P. pastoris [ALP1-SEC4] menunjukkan ko-ekspresi Sec4p meningkatkan
level sekresi -amilase 2x lipat dibanding tanpa ko-ekspresi. Berdasarkan hasil penelitian
diperoleh waktu induksi yang paling optimum adalah 72 jam, dengan aktivitas spesifik
36, 91 U/mg.
9
PRAKATA
Segala puji bagi Allah SWT yang telah melimpahkan rahmat dan karunia-Nya
kepada kami tim peneliti untuk melaksanakan penelitian dan menyelesaikan penulisan
Laporan Akhir Penelitian Unggulan Perguruan Tinggi tahun 2013 berjudul ”Pengaruh
Ko-ekspresi
Sec4p
Pichia
pastoris
Terhadap
Tingkat
Sekresi
-Amilase
Saccharomycopsis fibuligera oleh Pichia pastoris rekombinan”.
Pada kesempatan ini perkenankanlah peneliti mengucapkan terima kasih yang
sebesar-besarnya kepada :
1. Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi, Departemen Pendidikan Nasional atas
dana yang telah disediakan sehingga penelitian ini dapat terlaksana.
2. Universitas Padjadjaran dan Lembaga Penelitian UNPAD atas pengelolaan
administrasi yang baik bagi proyek penelitian ini.
3. Dekan Fakultas MIPA, Ketua Jurusan Kimia, serta kepala Laboratorium
Penelitian Jurusan Kimia, yang telah menyediakan fasilitas bagi peneliti untuk
melaksanakan penelitian ini.
4. Semua pihak yang telah banyak membantu dalam pelaksanaan penelitian ini.
Akhir kata dengan penuh harapan dan rasa optimis, mudah-mudahan hasil
penelitian ini dapat memberikan kontribusi ilmu pengetahuan di bidang biologi molekul
khususnya dalam kajian produksi enzim rekombinan.
Bandung, November 2013
Penulis
10
BAB I. PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang dan Permasalahan yang akan Diteliti
Tingkat ekspresi sekresi protein rekombinan dalam suatu inang ekspresi
dipengaruhi oleh banyak faktor, diantaranya adalah jenis kodon yang digunakan dari gen
yang diekspresikan; jumlah gen yang digunakan; efisiensi dan kekuatan promoter;
efisiensi sinyal translasi; jenis peptida sinyal; proses dan pelipatan protein di dalam
retikulum endoplasma dan badan Golgi; faktor lingkungan dalam sekresi ekstraseluler;
serta hidrolisis protein oleh protease. Modifikasi salah satu atau beberapa faktor yang
mempengaruhi ekspresi protein dilaporkan dapat meningkatkan sekresi protein.
Gaffar (2011) melaporkan bahwa kombinasi manipulasi genetik yang meliputi
modifikasi peptida sinyal, peningkatan jumlah kopi gen dan ko-ekspresi protein yang
berperan dalam pelipatan protein di retikulum endoplasma dapat meningkatkan sekresi
α-amilase Saccharomycopsis fibuligera (Sfamy) oleh Pichia pastoris hingga 20 kali lipat
dibandingkan dengan P. pastoris wildtype. Produksi Sfamy dan protein rekombinan lain
oleh P. pastoris dapat dioptimalkan dengan memperhatikan faktor-faktor lainnya, salah
satunya adalah faktor lingkungan dalam sekresi ekstraseluler.
Protein yang akan disekresikan ke luar sel akan melalui suatu jalur sekresi protein
yang melibatkan organel sel dan protein pembantu. Secara garis besar, protein yang baru
terbentuk akan melewati retikulum endoplasma (RE), kompleks Golgi, dan kemudian
menuju membran plasma untuk selanjutnya disekresikan ke luar sel. Transportasi protein
antar kompartemen di dalam sel dimediasi oleh suatu vesikel.
Salah satu protein yang berperan pada sekresi ekstraseluler adalah Sec4p.
Peningkatan level Sec4p dalam inang ekspresi ragi dapat meningkatkan sekresi protein
asing. Hal ini dibuktikan melalui penelitian yang dilakukan oleh Shi-Hwei dan koleganya
(2004) yang melibatkan overekspresi SEC4 Pichia pastoris dalam manipulasi genetik
terhadap sistem ekspresi P. pastoris yang telah mengandung gen asing. Dari hasil studi
ini dilaporkan adanya peningkatan level sekresi protein glukoamilase hingga mencapai
100 kali. Meskipun fungsi Sec4p di P. pastoris jarang dibahas dalam hal perannya
dalam sekresi protein, urutan asam amino Sec4p dari P. pastoris mirip dengan urutan
Sec4p ragi lain pada domain yang terlibat dalam pengikatan dan hidrolisis nukleotida.
Penelitian tersebut membuktikan bahwa Sec4p memiliki kontribusi peran yang penting
dalam proses produksi protein rekombinan, khususnya dalam proses sekresi protein.
11
Sec4p merupakan protein berukuran 24 kDa yang dikode gen SEC4 dari
Saccharomyces cerevisiae. Protein ini termasuk keluarga protein Rab dari protein
pengikat GTP yang merupakan regulator penting pada semua aktivitas peredaran
vesikuler. Sec4p berperan penting dalam tahap akhir sekresi protein, berfungsi untuk
menargetkan vesikel sekretori ke membran plasma pada proses pasca-Golgi dalam
sekresi protein pada ragi.
Menurut Cowan (1996), sebagian besar (sekitar 45%) enzim yang digunakan di
industri merupakan enzim hasil rekayasa, baik rekayasa pada tingkat genetik maupun
protein. Salah satu metode yang umum digunakan dalam rekayasa genetik adalah dengan
cara kloning, yaitu dengan memindahkan gen pengode enzim atau protein tertentu ke
suatu inang dengan tujuan gen tersebut akan mengalami perbanyakan di dalam sel inang.
Penelitian-penelitian selanjutnya berkembang ke arah peningkatan tingkat ekspresi
protein rekombinan dari suatu inang ekspresi.
Berdasarkan latar belakang tersebut, penelitian ini bermaksud mempelajari
pengaruh ko-ekspresi Sec4p P. pastoris terhadap tingkat sekresi -amilase S. fibuligera
oleh P. pastoris rekombinan. Gen SEC4 mengode protein Sec4p yang berperan pada
sekresi protein ke luar sel ragi. Sec4p berikatan dengan vesikel sekresi yang berisi
protein yang akan disekresikan dan membantu mengarahkannya ke membran plasma.
Ko-ekspresi Sec4p dalam inang ekspresi ragi telah terbukti dapat meningkatkan level
sekresi glukoamilase Rizhopus orizae (Shi-Hwei et al., 2005).
1.2. Permasalahan yang akan dikaji
Berdasarkan latar belakang yang telah diungkapkan, maka permasalahan yang
akan dikaji dalam penelitian ini adalah:
1. Apakah gen SEC4 Pichia pastoris dapat dikonstruksi dalam vektor ekspresi untuk
P. pastoris dan dikloning dalam E. coli.
2. Bagaimana homologi urutan nukleotida gen SEC4 Pichia pastoris hasil kloning
dalam E. coli dengan urutan gen SEC4 NCBI (nomor akses: XM_002492307.1).
3. Apakah gen SEC4 P. pastoris berhasil di ko-ekspresikan dalam inang P. pastoris
yang telah membawa gen ALP1.
4. Bagaimana pengaruh ko-ekspresi Sec4p terhadap tingkat ekspresi -amilase oleh
P. pastoris rekombinan.
12
Enzim -amilase bekerja menghidrolisis ikatan -1,4-glikosidik dalam pati untuk
menghasilkan maltosa dan oligosakarida berbagai ukuran. Enzim -amilase banyak
digunakan dalam berbagai industri, dengan demikian pengembangan produksi -amilase
perlu dilakukan. Sistem ekspresi Pichia pastoris banyak digunakan untuk memproduksi
protein rekombinan karena tingkat ekspresinya yang tinggi, mudah dilakukan untuk
peningkatan skala produksi, adanya modifikasi pasca translasi, serta mampu
mensekresikan protein heterolog. Sampai saat ini, Indonesia masih mengimpor enzim ini
dari beberapa negara, karena belum adanya industri yang memproduksi enzim ini.
Padahal Indonesia memiliki sumber mikroba penghasil -amilase yang melimpah dan
telah banyak dilaporkan, salah satunya adalah Saccharomycopsis fibuligera (Gaffar,
2011). -Amilase S. fibuligera merupakan salah suatu enzim ekstraseluler yang mampu
memecah pati mentah sehingga dapat menghemat energi dalam pemrosesan pati, dengan
demikian memiliki potensi untuk dikembangkan dan diaplikasikan dalam industri. State
of the art dari penelitian ini adalah penggunaan sistem ekspresi P. pastoris untuk
produksi enzim -amilase dan mempelajari faktor-faktor yang mempengaruhi tingkat
sekresi protein, pada proposal ini yang menjadi kajian utama adalah yaitu protein Sec4p
yang berperan pada transport protein ke luar sel.
13
BAB II. KAJIAN PUSTAKA
2. 1 Jalur Sekresi Protein
Protein larut (soluble protein) dan protein membran disintesis dalam ribosom yang
terikat pada retikulum endoplasma (RE) kasar dan kemudian bergerak ke tujuan akhir
dari masing-masing protein melalui jalur sekresi. Pada sel eukariot, jalur sekresi protein
melibatkan suatu migrasi vesikuler. Sebuah prinsip mengatur semua lalu-lintas peredaran
protein dalam jalur sekresi, yaitu transportasi protein dari satu kompartemen ke
kompartemen lain yang dibatasi membrane, dimediasi oleh vesikel. Vesikel ini akan
mengumpulkan protein "kargo" dalam bentuk bud atau tunas vesikel yang timbul dari
suatu membran kompartemen, kemudian protein kargo dikirim ke kompartemen
berikutnya melalui fusi vesikel dengan membran kompartemen target (Lodish et al,
2003).
Sekresi protein merupakan suatu proses kompleks yang melibatkan banyak organel
dan molekul pembantu (Gambar 2.1). Secara garis besar, protein yang akan disekresikan
akan melalui jalur sekresi protein dimana protein yang baru terbentuk akan melewati
retikulum endoplasma, kompleks Golgi, dan kemudian menuju membran plasma untuk
selanjutnya disekresikan ke luar sel (Oliveira et al., 2010; Salminen & Novick, 1989).
Protein
disekresikan ke
luar sel
Vesikel sekresi
seksekresi
Vesikel Golgi
aparatus
RE kasar
Gambar 2.1 Diagram jalur sekresi protein. Setelah protein disintesis oleh ribosom di RE kasar,
protein yang akan disekresikan dikemas dalam vesikel dan dikirim ke komples
Golgi (1), kemudian protein yang siap untuk disekresikan akan dikemas dalam
vesikel sekresi dan diarahkan ke membran plasma (2)(3), vesikel sekresi berfusi
untuk mengeluarkan protein kargo (4) (Lodish et al, 2003).
14
Transportasi protein yang dimediasi oleh vesikel melibatkan beberapa protein
untuk menjalankan proses pertumbuhan tunas vesikel dan fusi membran, diantaranya
yaitu (Lodish et al., 2003):
1. Protein pelapis. Berfungsi untuk mengarahkan vesikel yang mengandung protein
kargo ke kompartemen tujuannya masing-masing. Contohnya COPI (dari cisGolgi ke RE/vesikel retrograde), COPII (dari RE kasar ke Golgi/vesikel
anterograde), Clathrin (dari membran plasma dan jaringan trans-Golgi ke
endosom).
2. Protein reseptor integral membran soluble N-ethylmaleimide-sensittive factor
attachment protein receptors (SNARE). Berfungsi dalam proses fusi vesikel
dengan membran target. Terdiri atas v-SNARE yang terletak pada vesikel dan tSNARE yang terletak pada membran target.
3. Protein Rab (protein pengikat GTP). Berfungsi dalam proses perakitan protein
pelapis dan penargetan vesikel ke membran target.
Protein pada jalur sekresi yang ditujukan untuk kompartemen lain selain retikulum
endoplasma dan Golgi (protein yang akan diskresikan), pada akhirnya akan sampai pada
jaringan kompleks membran dan vesikel yang disebut sebagai jaringan trans-Golgi
(trans-Golgi network/TGN). Protein yang ditujukan untuk disekresikan ke luar sel akan
diarahkan ke membran plasma melalui vesikel sekresi yang tumbuh dari TGN, vesikel ini
kemudian akan berfusi dengan membran plasma dan mengeluarkan protein kargo ke luar
sel melalui proses eksositosis (Lodish et al., 2003).
2. 2. Eksositosis
Eksositosis adalah mekanisme perpindahan molekul (protein dan polisakarida,
hormon, neurotransmitter, dll) melintasi membran plasma dari dalam ke luar sel (sekresi)
dengan cara menggabungkan (fusi) vesikel berisi molekul dengan membran plasma.
Vesikel yang lepas dari Golgi aparatus dipindahkan oleh sitoskeleton ke membran
plasma. Ketika membran vesikel dan membran plasma bertemu, kandungan vesikelnya
kemudian disekresikan ke luar sel (Campbel et al., 2002; Madigan et al., 2006).
Proses eksositosis adalah langkah penting dalam mengeluarkan enzim-enzim dan
protein-protein lain yang berguna untuk proses fisiologis di luar sel atau untuk
mengeluarkan molekul-molekul yang membantu komunikasi antar sel satu dengan sel
15
yang lain. Eksositosis terbagi atas jalur sekresi konsitutif dan jalur sekresi yang
diregulasi (Thomas, 2009);
1. Jalur sekresi konstitutif. Vesikel sekresi konstitutif membawa protein yang
disekresikan sel secara terus menerus. Vesikel ini berasal dari sisi trans-Golgi,
bergerak sepanjang lintasan mikrotubulus, dan dengan segera berfusi dengan
membran plasma melepaskan isinya. Beberapa protein yang tidak saling berkaitan
dapat dikemas dalam vesikel sekresi konstitutif tunggal.
2. Jalur sekresi yang diregulasi. Vesikel sekresi pada jalur ini juga berasal dari sisi
trans-Golgi, namun vesikel ini akan berfusi dengan membran plasma apabila sel
menerima sinyal sekresi. Vesikel sekresi ini seringkali mengandung protein
hormon, enzim pencernaan, dan neuro-peptida, tergantung pada jenis selnya.
2.3 Protein Sec4p
Analisis biokimia telah mengidentifikasi beberapa faktor yang diperlukan untuk
transportasi vesikuler melalui Golgi aparatus. Analisis genetik jalur sekresi ragi
mengungkapkan 26 gen yang produknya diperlukan untuk transportasi protein dari
retikulum endoplasma ke membran plasma. Sepuluh dari gen-gen tersebut mengatur
peredaran vesikuler dari Golgi aparatus ke membran plasma pada tahap lanjut sekresi
protein. Salah satu dari sepuluh gen ini, SEC4, mengkode protein pengikat GTP yang
berasosiasi dengan sisi sitoplasmik dari vesikel sekresi dan membran plasma. Protein
Sec4 (Sec4p) diperlukan pada eksositosis konstitutif pada ragi dan mengalami siklus
antara membran plasma dan vesikel sekresi. Siklus lokalisasi Sec4p dirangkai dengan
siklus pengikatan dan hidrolisis GTP yang berfungsi untuk mengontrol peredaran
vesikuler (Salminen & Novick, 1989).
Gen SEC4 dari Saccharomyces cerevisiae mengkode protein pengikat GTP
(Sec4p) berukuran 24 kDa yang memainkan peran penting dalam tahap akhir sekresi
protein. Sec4p termasuk ke dalam keluarga protein Rab dari protein pengikat GTP yang
merupakan regulator penting pada semua aktivitas peredaran vesikuler. Sec4p berperan
penting untuk menargetkan vesikel sekresi ke membran plasma pada proses pasca-Golgi
pada sekresi protein ragi (Shi-Hwei et al., 2004; Walworth et al., 1989).
Selama proses sekresi protein, Sec4p tertahan (anchored) pada membran vesikel
melalui geranil-geranilasi pada C-terminal dan selanjutnya diangkut ke membran plasma
setelah docking vesikel. Analisis genetik menunjukkan bahwa Sec4p berperan pada awal
16
proses dari eksosis, sebuah efektor untuk Sec4p, dan menargetkan vesikel sekresi situs
eksositosis dalam ragi (Shi-Hwei et al., 2004).
Siklus antara bentuk
inaktif dan bentuk aktif protein Rab dimediasi oleh
hidrolisis GTP (aktivitas GTPase) dan pertukaran GTP menjadi GDP pada protein.
Siklus aktivasi, inaktivasi, dan translokasi diatur oleh setidaknya tiga jenis regulator,
yaitu: GDP/GTP exchange factor (GEF), GDP dissociation inhibitor (GDI), dan GTPaseactivating protein (GAP). Dalam sitosol, protein Rab dipertahankan dalam bentuk inaktif
(mengikat GDP) oleh aktivitas GDI. Rab-GDP dilepaskan terlebih dahulu dari GDI
dengan mekanisme yang masih belum diketahui, dan kemudian dikirim ke kompartemen
membran spesifik; protein Rab selanjutnya diubah menjadi bentuk Rab yang terikat GTP
(Rab-GTP) dengan bantuan GEF. Bentuk Rab-GTP ini kemudian berinteraksi dengan
efektor hilir (downstream). Setelah itu, Rab-GTP dikonversi ke bentuk Rab-GDP oleh
suatu protein GAP. Bentuk Rab-GDP yang dihasilkan ini terletak pada membran dan
kemudian dapat membentuk kompleks dengan GDI sehingga akan kembali ke sitosol
sebagai kompleks protein (Rab-GDP)-GDI (Gambar 2.2). Dari penjelasan di atas dapat
diketahui bahwa karakteristik dari protein Rab adalah siklus asosiasi-disosiasi
membrannya berhubungan dengan siklus pertukaran GDP-GTP pada protein tersebut
(Rothman, 1996; Takai et al., 2001).
vesikel
Membran target
Gambar 2.2 Siklus aktivasi/inaktivasi dan translokasi protein Rab. Siklus ini mengatur protein
Rab dalam bentuk aktif-inaktif dan lokalisasinya pada membran-sitosol (Takai et
al., 2001)
Sebagai protein Rab, Sec4p berosilasi antara bentuk inaktif yang mengikat GDP
dan bentuk aktif yang mengikat GTP, dengan demikian Sec4p berfungsi sebagai molekul
pertukaran untuk mengatur pengiriman vesikel. Sec4p diaktifkan oleh Sec2p, dan
17
bersama dengan Sec2p, Sec4p berasosiasi secara reversibel dengan vesikel sekresi dan
kompleks protein eksosis pada membran plasma, dengan demikian vesikel dapat
diarahkan menuju situs sekresi. Sec2p adalah protein GEF (GDP/GTP exchange factor)
yang bekerja pada protein Sec4p ragi, dan keduanya berpartisipasi dalam transportasi
vesikel sekresi menuju membran plasma (Chavrier et al., 1990).
2.4 Peran Sec4p dalam Penargetan dan Penambatan Vesikel Sekresi
Eksositosis yang melibatkan proses docking dan fusi vesikel, merupakan proses
yang penting dalam pelepasan protein kargo ke luar sel. Dalam perjalanannya menuju
tujuan akhir, vesikel akan ditambatkan ke membran plasma yang kemudian akan
diarahkan ke arah fusi vesikel sekresi dengan membran plasma. Komponen kunci yang
terlibat dalam proses penambatan ini adalah kompleks protein eksosis dan GTPase kecil,
dan fusi vesikel pada membran plasma meliputi keterlibatan protein reseptor SNARE.
(Orlando & Guo, 2009).
Eksosis adalah suatu protein kompleks yang bertindak sebagai faktor docking,
terdiri dari delapan subunit lestari yang terlibat dalam docking vesikel eksositik : Sec3p,
Sec5p, Sec6p, Sec8p, Sec10p, Sec15p, Exo70p dan Exo84p (Gambar 2.3). Kompleks
protein ini pada awalnya diidentifikasi pada ragi S. cerevisiae, dimana eksosis telah
terbukti berperan penting untuk eksositosis. Enam protein 'Sec', dinamakan demikian
karena mutasi dalam gen mereka menghambat proses sekresi, berinteraksi secara fisik
satu sama lain (Walworth et al., 1989; Lipschutz & Mostov, 2002).
Eksosis terlibat dalam pengarahan vesikel ke situs yang tepat pada membran
plasma. Eksosis berfungsi untuk mengarahkan dan mengirimkan vesikel ke situs docking
pada membran plasma yang kemudian dilanjutkan dengan reaksi perakitan SNARE dan
fusi vesikel. Semua komponen eksosis merupakan suatu protein hidrofilik yang
berinteraksi satu sama lain untuk membentuk kompleks periferal yang berasosiasi dengan
membran plasma. Kompleks eksosis berfungsi sebagai kompleks penambat yang
memediasi koneksi awal antara vesikel sekresi dan membran plasma sebelum docking
dan fusi. Meskipun sudah jelas bahwa eksosis memainkan peranan sentral dalam
eksositosis, namun masih sedikit yang diketahui tentang bagaimana proses ini
dikendalikan (Orlando & Guo, 2009; Brennwald, 2000; Guo et al., 1999).
18
Membran plasma
plaplasma
Vesikel
Vesikel
Vesikel
Vesikel
Gambar 2.3 Tahapan lanjut eksositosis pada membran plasma. (1) vesikel sekresi yang
mengandung protein Rab (bulatan merah), subunit kompleks eksosis (bulatan
hijau), dan v-SNARE (lengkungan merah) diarahkan sepanjang sitoskeleton
(garis merah) ke membran plasma melalui sebuah motor (bulatan biru). (2)
vesikel ditambatkan ke membran plasma melalui interaksi kompleks eksosis.
(3)(4) t-SNARE (lengkungan biru) pada membran plasma berikatan dengan vSNARE pada vesikel, perakitan kompleks SNARE ini selanjutnya akan mengacu
pada fusi vesikel dengan membran plasma (Orlando & Guo, 2009).
Sejumlah GTPase kecil mengatur eksosis. GTPase pertama yang ditemukan untuk
berinteraksi dengan eksosis yang adalah Sec4p. Analisis genetik membuktikan bahwa
Sec4p berperan pada awal proses eksositosis pada ragi. Sec4p dan Sec2p akan
mengontrol perakitan kompleks eksosis yang diperlukan untuk menambatkan vesikel ke
membran plasma (Orlando & Guo, 2009; Guo et al., 1999).
Aktivasi Sec4p oleh Sec2p diperlukan untuk pengiriman vesikel sekresi yang
terpolarisasi. Sec4p dalam bentuk aktif (Sec4p-GTP) dapat membantu pergerakan vesikel
sekresi yang tergantung pada myosin sepanjang kabel aktin. Namun, bagaimana vesikel
yang mengandung Sec4p terhubungkan dengan motor myosin belum diketahui secara
pasti. Sec4p dan Sec2p kemudian akan berinteraksi dengan salah satu komponen
kompleks eksosis, yaitu Sec15p, yang akan mengarahkan transportasi vesikel sekresi ke
membran plasma (Grosshans et al., 2006b; Chavrier et al., 1990).
Sec15p membutuhkan Sec10p untuk berasosiasi dengan kompleks eksosis. Sec10p
diperlukan untuk menghubungkan Sec15p ke kompleks yang tersisa. Sec15p berikatan
langsung dengan Sec10p. Pengikatan subkompleks Sec10p/Sec15p ke seluruh eksosis ini
dimediasi oleh interaksi Sec10p dengan Sec5p. Sec5p juga membuat mata rantai dengan
19
Exo70p, Sec6p dan Sec3p. Jadi, Sec5p tampaknya berada pada inti kompleks. Sec5p juga
mempunyai peranan penting dalam menghubungkan Sec3p ke Sec8p, mungkin melalui
asosiasi Sec5p dengan Sec6p dan Sec6p dengan Sec8p. Sec3p mungkin juga terikat
langsung ke Sec8p atau Sec6p (Gambar 2.4) (Guo et al., 1999).
Vesikel
Membran plasma
Gambar 2. 4 Kompleks eksosis. Gambaran penambatan vesikel ke membran plasma melalui
interaksinya dengan kompleks eksosis. Subunit komponen eksosis digambarkan
dengan bulatan biru, GTPase digambarkan dengan bulatan merah. GTPase ini
dapat meregulasi aktivasi dan polarisasi eksosis pada membran plasma. Sec4p
berikatan dengan vesikel sekresi dan berinteraksi dengan Sec15p pada eksosis
(Orlando & Guo, 2009).
Dua subunit eksosis yaitu: Exo70p dan Sec3p, berfungsi sebagai penanda yang
terdapat di membran plasma. Komponen eksosis lainnya bergabung dengan vesikel
sekresi bergerak sepanjang kabel aktin dan kemudian diarahkan ke membran plasma
dimana Exo70p dan Sec3p berada. Perakitan kompleks eksosis dapat menambatkan
vesikel sekresi ke membran plasma. Exo70p dan Sec3p berikatan dengan membran
plasma melalui suatu ikatan lipid, ikatan ini lestari dari mulai ragi hingga mamalia.
Interaksi ini penting untuk perekrutan Exo70p, Sec3p, dan komponen eksosis lainnya ke
membran plasma untuk penambatan vesikel (Orlando & Guo, 2009).
Perakitan kompleks eksosis dapat terjadi selama proses docking vesikel, dan
kelainan pada Sec4p dapat mempengaruhi perakitan kompleks eksosis. Belum diketahui
apakah semua protein eksosis terakit di dalam sel. Ada kemungkinan bahwa mutasi pada
Sec4p akan mempengaruhi perakitan subunit eksosis dengan Sec3p pada membran target.
Pada sel wild type, Sec3p bermigrasi secara eksklusif di kompleks eksosis. Perekrutan
protein eksosis untuk kemudian diarahkan ke Sec3p membutuhkan Sec4p yang
20
fungsional. Penempatan Sec3p ke situs eksositosis adalah tidak tergantung pada lalu
lintas membran yang sedang berlangsung, sementara komponen lainnya dari eksosis
memerlukan fungsi Sec4p untuk penempatannya (Guo et al., 1999).
Penempatan Sec3p ke domain tertentu pada membran plasma dan interaksi
Sec15p dengan Sec4p-GTP menunjukkan bahwa kompleks eksosis memainkan peran
penting dalam docking dan fusi membran yang diarahkan oleh Rab/GTPase. Sec4p
memiliki peranan dalam mengaktivasi perakitan komponen eksosis tersebut ke Sec3p,
yang menandai lokasi sekresi (Guo et al., 1999).
2.5 Jalur Sinyal dari Sec4p dalam Mengarahkan Vesikel ke Proses Fusi
Protein Rab juga mempengaruhi proses fusi vesikel melalui peranannya dalam
meregulasi perakitan kompleks protein reseptor SNARE. Setelah vesikel sekresi
tertambat pada membran plasma melalui interaksi Sec4p-GTP dengan kompleks protein
eksosi, vesikel sekresi akan diarahkan ke proses penggabungan protein reseptor SNARE
yang terdapat pada vesikel sekresi (v-SNARE) dengan protein reseptor SNARE yang
terdapat pada membran plasma (t-SNARE). v-SNARE dan t-SNARE akan membentuk
kompleks trans-SNARE yang mengarah pada proses fusi vesikel dengan membran
plasma (Grosshans et al., 2006a; Grosshans et al., 2006b).
SNARE merupakan protein transmembran yang bagian C-terminalnya tertahan
pada membran dan domain N-terminalnya menghadap ke sitosol. SNARE diperlukan
pada tahap fusi membran pada sebagian besar proses transportasi intraseluler. Untuk
terjadinya fusi, protein SNARE pada membran donor dan target harus membentuk suatu
kompleks trans-SNARE. Pada ragi, perakitan kompleks SNARE antara SNARE vesikel
sekresi (Sncp) dan SNARE membran plasma (Ssop dan Sec9p) terjadi pada tahap lanjut
dari reaksi eksositosis (Grote et al., 2000).
Sec4p berperan dalam regulasi perakitan SNARE melalui efektornya yang lain
dalam proses fusi vesikel, yaitu Sro7p. Sro7p akan berikatan dengan Sec9p yang
merupakan SNARE pada membran plasma target dan memediasi fusi vesikel dengan
membran plasma (Grosshans et al., 2006a).
Terdapat dua jalur sinyal dari Sec4p yang saling bertemu dalam mengarahkan
vesikel ke proses fusi pada ragi (Gambar 2.5). Vesikel sekresi (V) berikatan dengan Rab
GTPase Sec4p dan Sec2p (GEF Sec4p). Sec2p akan menjaga Sec4p tetap berada dalam
bentuk aktifnya. Kemudian proses penambatan vesikel pada eksositosis terjadi dengan
21
adanya interaksi antara Sec4p pada vesikel dengan Sec15p yang merupakan salah satu
subunit dari eksosis, interaksi ini diperlukan untuk perakitan kompleks eksosis. Eksosis
Sec1p berikatan dengan kompleks t-SNARE, tetapi tidak dengan Ssop bebas, kemudian
akan berinteraksi dengan Sec1p, yang diperlukan untuk mengubungkannya dengan
fungsi SNARE pada proses eksositosis (Grosshans et al., 2006a).
Gambar 2. 5 Model jalur sinyal Sec4p dalam peranannya meregulasi proses eksositosis
(Grosshans et al., 2006a).
Sro7p yang merupakan efektor lain dari Sec4p, meneruskan sinyal dari Sec4p ke
fungsi SNARE melalui interaksinya dengan t-SNARE eksositik Sec9p. Sro7p
berasosisasi dengan eksosis melalui intraksinya dengan subunit Exo84p pada eksosis.
Tanda panah pada gambar di atas mengindikasikan interaksi fisik yang mungkin terjadi
(Grosshans et al., 2006a; Grote et al., 2000).
2.6 Sistem ekspresi P. pastoris dan vektor ekspresi pPIC3.5K untuk P. pastoris
Penggunaan sistem ekspresi P. pastoris memberikan keuntungan dibandingkan
dengan sistem ekspresi lain. Sistem ini merupakan satu-satunya sistem yang
menggabungkan keuntungan penggunaan E. coli (tingkat ekspresi tinggi, mudah
dilakukan peningkatan skala produksi, dan murah) dengan sistem ekspresi eukariot
(adanya komponen pelipatan protein dan modifikasi pasca-translasi) (Glick & Pasternak,
2003).
Ekspresi protein asing pada P. pastoris membutuhkan tiga tahap penting, yaitu:
insersi gen ke vektor ekspresi, introduksi vektor ekspresi ke genom P. pastoris, dan
22
pengujian galur yang mempunyai potensi untuk mengekspresikan produk gen asing
(Gaffar, 2010b).
Sama seperti S. cerevisiae, transformasi P. pastoris akan menghasilkan integrasi
kaset ekspresi ke kromosom pada lokus spesifik untuk menghasilkan transforman yang
stabil secara genetik. Integrasi dapat dilakukan dengan dua cara. Cara yang paling
sederhana adalah dengan memotong vektor pada sisi yang unik dalam gen penanda
(seperti HIS4) atau pada fragmen promotor AOX1 (Romanos, 1995; Gaffar, 2010b).
Pemotongan vektor P. pastoris dalam urutan yang sama dengan genom inang, akan
menstimulasi peristiwa rekombinasi homolog yang merupakan target yang efisien untuk
integrasi vektor ke lokus genom (Cregg & Madden, 1988).
Vektor ekspresi P. pastoris pada umumnya memiliki format yang sama. Semua
vektor ekspresi telah didisain sebagai shuttle vektor E. coli/P. pastoris, yang
mengandung titik awal replikasi untuk mempertahankan plasmid di E. coli dan marker
fungsional di satu atau kedua organisme. (Cregg et al., 1985)
Vektor pPIC3.5K (Gambar 2.6) merupakan vektor ekspresi berukuran 9004 bp
yang dirancang untuk memungkinkan identifikasi dari gen sisipan secara in vivo dalam
genom Pichia pastoris. Vektor ini mempunyai gen penanda yang berfungsi sebagai
marker penyeleksi transforman di E. coli dan P. pastoris, yaitu resisten kanamisin di
E. coli dan resistan geneticin di P. pastoris. Selain itu vektor ini juga memiliki gen
marker HIS4 untuk seleksi menggunakan media yang mengandung histidin. Gen histidin
dehidrogenase (HIS4) fungsional dapat digunakan sebagai marker penyeleksi setelah
transformasi ke dalam P. pastoris his4 (galur yang defisien histidin dehidrogenase)
melalui metode transformasi integrasi yang dipilih. Vektor ini merupakan vektor ekspresi,
memiliki kaset ekspresi yang terdiri dari fragmen AOX1 yang mengandung urutan
promoter 5’ dan urutan pendek fragmen AOX1 yang mengandung urutan yang
dibutuhkan untuk terminasi transkripsi. Di antara urutan promotor dan terminator
terdapat multiple cloning site (MCS) untuk insersi urutan pengode gen asing (Gambar
2.7) (Invitrogen, 2006).
23
Gambar 2.6 Peta vektor ekspresi pPIC3.5K (Invitrogen, 2006).
Gambar 2.7 Urutan multiple cloning sites pada vektor pPIC3.5K (Invitrogen, 2006).
24
BAB III. TUJUAN DAN MANFAAT PENELITIAN
Meningkatnya kebutuhan berbagai industri terhadap produksi protein rekombinan
yang tinggi mendorong dilakukannya berbagai upaya untuk meningkatkan tingkat sekresi
protein rekombinan dengan cara rekayasa di tingkat genetika. Menurut Shi-Wei et al.
(2004), tingkat sekresi suatu protein oleh suatu sel inang dapat dipengaruhi oleh beberapa
faktor, yaitu : (1) jenis penggunaan kodon dari gen yang diekspresikan, (2) jumlah gen
yang digunakan, (3) efisiensi dan kekuatan promotor, (4) efisiensi sinyal translasi, (5)
jenis peptida sinyal, (6) proses dan pelipatan di dalam retikulum endoplasma dan badan
Golgi, (7) faktor lingkungan dalam sekresi ekstraseluler, dan (8) hidrolisis protein oleh
protease.
Dalam jalur sekresi protein, eksositosis merupakan suatu proses penting yang
melibatkan transportasi vesikular pasca-Golgi untuk mensekresikan protein ke luar sel.
Proses eksositosis diregulasi oleh suatu protein anggota keluarga protein kecil Rab
GTPase, Sec4p. Sec4p merupakan protein berukuran sekitar 24 kDa yang berperan dalam
menargetkan vesikel sekresi ke membran plasma pada proses pasca-Golgi dalam sekresi
protein pada ragi.
Pada penelitian terdahulu dari kelompok kami, telah dipelajari pengaruh peptida
sinyal dan ko-ekspresi Protein Disulfida Isomerase terhadap tingkat sekresi -amilase
Saccharomycopsis fibuligera dalam P. pastoris dan diperoleh 20x peningkatan sekresi
(Gaffar et al, 2009; Gaffar et al 2011). Tujuan penelitian ini adalah untuk mempelajari
pengaruh ko-ekspresi SEC4 terhadap tingkat sekresi -amilase S. fibuligera oleh
P. pastoris.
Penelitian ini merupakan rangkaian penelitian yang dikembangkan oleh kelompok
ekspresi protein rekombinan menggunakan sistem ekspresi P. pastoris. Pada penelitian
terdahulu dari kelompok kami telah dibuktikan bahwa peptida sinyal, jumlah kopi gen
dan pelipatan protein mempengaruhi level sekresi protein. Penelitian ini secara khusus
akan mempelajari pengaruh protein yang berperan pada sekresi ekstraselular, yaitu Sec4p
terhadap tingkat sekresi -amilase S. fibuligera oleh sistem ekspresi P. pastoris.
Penelitian ini akan menghasilkan inang P. pastoris yang mengandung tambahan
gen SEC4 dan gen ALP1 serta mensekresikan -amilase level tinggi. Pada penelitian
terdahulu telah diperoleh P. pastoris yang mengandung gen ALP1 dan mensekresikan
-amilase S. fibuligera. Sec4p berperan pada sekresi protein ekstraselular, sehingga
25
tambahan ko-ekspresi Sec4p pada inang P. pastoris yang telah mengandung gen ALP1
akan menambah jumlah Sec4p yang dapat membantu sekresi -amilase oleh P. pastoris.
Ko-ekspresi Sec4p diharapkan akan meningkatkan sekresi -amilase oleh P. pastoris.
Hasil penelitian ini akan dipublikasikan pada jurnal nasional terakreditasi.
Inovasi dari penelitian ini adalah dihasilkan galur P. pastoris rekombinan yang
mengandung tambahan gen SEC4 dan ALP1. Ko-ekspresi Sec4p oleh inang P. pastoris
diharapkan dapat meningkatkan sekresi -amilase oleh P. pastoris rekombinan. Manfaat
dari penelitian ini secara khusus adalah diperolehnya informasi pengaruh ko-ekspresi
protein Sec4p terhadap tingkat sekresi -amilase S. fibuligera oleh P. pastoris, dan
diperolehnya galur P. pastoris yang dapat memproduksi -amilase S. fibuligera level
tinggi. Secara umum, inovasi dari penelitian ini adalah penggunaan sistem ekspresi
P. pastoris untuk produksi enzim rekombinan dari mikroba galur lokal, dan mempelajari
faktor-faktor yang mempengaruhinya. Manfaat jangka panjang dari penelitian ini adalah
sangat bermanfaat dalam rangka produksi enzim rekombinan lain menggunakan system
ekspresi P. pastoris.
3.1 Tujuan Khusus
Maksud penelitian ini adalah mendapatkan transforman P. pastoris yang
mengandung tambahan gen SEC4 dan ALP1, serta mempelajari pengaruh ko-ekspresi
Sec4p terhadap tingkat sekresi -amilase oleh P. pastoris. Sedangkan tujuan khusus
penelitian ini adalah:
1. Konstruksi vektor ekspresi pPIC3.5K-SEC4 untuk Pichia pastoris dan kloning
dalam E. coli.
2. Mengetahui homologi urutan nukleotida gen SEC4 Pichia pastoris hasil kloning
dalam E. coli dengan urutan gen SEC4 NCBI (nomor akses: XM_002492307.1).
3. Mendapatkan transforman P. pastoris yang mengandung gen ALP1 dan gen
SEC4.
4. Mengkarakterisasi transforman P. pastoris.
5. Mengetahui pengaruh ko-ekspresi Sec4p terhadap tingkat ekspresi -amilase
S. fibuligera oleh P. pastoris rekombinan.
26
3.2 Penelitian Pendahuluan yang Sudah Dilaksanakan
Studi pendahuluan telah dilakukan amplifikasi gen SEC4 P. pastoris dengan
metoda PCR dan subkloning menggunakan vektor pJet1.2 dalam E. coli. Templat
diperoleh dari genom P. pastoris. Amplifikasi gen SEC4 dilakukan menggunakan primer
maju dan balik yang keduanya telah mengandung sisi pengenalan enzim restriksi EcoRI
(5’ G↓AATTC 3’) sehingga akan menghasilkan fragmen gen SEC4 yang memiliki sisi
pengenalan enzim EcoRI di ujung 5’ dan 3’-nya (Shi-Hwei et al., 2004). Adanya sisi
pengenalan enzim ini akan mempermudah dalam karakterisasi transforman yang
mengandung plasmid rekombinan serta mendapatkan dan menyisipkan fragmen gen
SEC4 yang diinginkan pada subkloning menggunakan vektor pJET1.2 maupun kloning
menggunakan vektor pPIC3.5K. Vektor pJET1.2 merupakan vektor linear yang tidak
memiliki sisi pengenalan EcoRI, sehingga pada saat plasmid rekombinan pJET1.2-SEC4
direstriksi menggunakan enzim ini akan dihasilkan dua fragmen, vektor pJET1.2 dan
SEC4. Sedangkan vektor pPIC3.5K merupakan vektor sirkular yang memiliki sisi
pengenalan EcoRI, sehingga pada saat vektor ini direstriksi menggunakan enzim EcoRI,
vektor ini akan komplemen dengan fragmen gen SEC4 hasil subkloning.
Tahapan reaksi PCR untuk amplifikasi gen SEC4 meliputi tahap denaturasi awal
pada suhu 95oC selama 5 menit; denaturasi pada suhu 95oC selama 1 menit; penempelan
primer (annealing) pada suhu 51oC selama 1 menit; dan polimerisasi pada suhu 72oC
selama 1 menit, reaksi PCR dilakukan sebanyak 30 siklus.
Gambar 3.1 Amplikon SEC4. (lajur 1) marker 1 kb, (lajur 2) SEC4.
27
Menurut
literatur
urutan
DNA
SEC4
dari
NCBI
(nomor
akses:
XM_002492307.1), gen SEC4 memiliki 615 bp nukloetida. Amplikon SEC4
dikarakterisasi dengan elektroforesis menggunakan gel agarosa 1%. Hasil karakterisasi
memperlihatkan pita amplikon SEC4 (Gambar 2.11 lajur 2) berada diantara pita 500 bp
dan 750 bp, sehingga dapat disimpulkan bahwa pita lajur 2 pada gel agarosa merupakan
pita fragmen SEC4 yang berukuran ~615 pb.
Fagmen SEC4 hasil PCR selanjutnya telah diligasi ke vektor pJet1.2
menghasilkan plasmid rekombinan pJet1.2-SEC4. Plasmid ini telah digunakan untuk
mentransformasi E. coli TOP10F’, dan telah diperoleh transforman yang mengadung
plasmid rekombinan (data tidak diperlihatkan). Hasil karakterisasi melalui pemotongan
dengan enzim restriksi EcoR1 memperlihatkan bahwa fragmen SEC4 telah berhasil
disubkloning.
Jadi pada penelitian pendahuluan yang telah dilakukan, sudah diperoleh
transforman E. coli yang mengandung plasmid rekombinan pJet1.2-SEC4. Selanjutnya
pada penelitian ini akan dilakukan: (1) penentuan urutan nukleotida SEC4 hasil
subkloning; (2) Ligasi fragmen SEC4 ke vektor pPIC3.5K; (3) Transformasi E. coli
menggunakan plasmid pPIC3.5K-SEC4; (4) penentuan urutan nukleotida SEC4 hasil
cloning; (5) Transformasi P. pastoris menggunakan plasmid pPIC3.5K-SEC4; (6)
Karakterisasi dan seleksi tranforman P. pastoris; (7) Ekspresi -amilase dan ko-ekspresi
Sec4p; (8) Analisis aktivitas -amilase; (9) Karakterisasi -amilase dan Sec4p intra dan
ekstraselular.
28
BAB IV. METODE PENELITIAN
4.1 Desain Penelitian
Penelitian yang akan dilakukan merupakan ekspreimen laboratorium secara
kuantitatif, dengan rincian sebagai berikut:
1. Amplifikasi gen SEC4 dan subkloning dalam E. coli.
2. Karakterisasi dan penentuan urutan nukleotida SEC4 hasil subkloning
3. Ligasi fragmen SEC4 ke vektor pPIC3.5K menghasilkan plasmid pPIC3.5KSEC4
4. Transformasi E. coli menggunakan plasmid pPIC3.5K-SEC4
5. Penentuan urutan nukleotida SEC4 hasil kloning
6. Transformasi P. pastoris menggunakan plasmid pPIC3.5K-SEC4
7. Seleksi dan karakterisasi transforman P. pastoris
8. Ekspresi -amilase dan ko-ekspresi Sec4p
9. Analisis aktivitas -amilase dan penentuan kadar protein
10. Karakterisasi -amilase dan Sec4p intra dan ekstraselular.
4.2. Metodologi Penelitian
4.2.1 Amplifikasi SEC4 P. pastoris dan subkloning dalam E. coli.
Gen SEC4 P. pastoris diamplifikasi dengan teknik PCR. Campuran reaksi PCR
terdiri atas 1 μL hasil isolasi DNA genom P. pastoris; bufer PCR 1X; primer 5’Sec4f (5’TTGAATTCATGGCATCAAGAGGCACATCA-3’) 0,4 μM; primer 3’Sec4r (5’-TT
GAATTCTCAACAACAAGACGATTTGGT-3’) 0,4 μM (urutan yang digarisbawahi
merupakan urutan sisi pengenalan enzim restriksi EcoR1); dNTP 0,2 mM (Fermentas);
MgCl2 2,5 mM; 1,25 U enzim Taq DNA polymerase (Fermentas) dan air bebas nuklease
hingga 50 μL. Proses PCR dilakukan menggunakan mesin Mastercycler® 5330
(Eppendorf) sebanyak 30 siklus, dengan masing-masing siklus terdiri dari tahap-tahap
denaturasi templat pada suhu 95oC selama 1 menit, tahap penempelan primer (annealing)
pada suhu 51oC selama 1 menit, dan tahap pemanjangan primer pada suhu 72 oC selama 1
menit. Hasil PCR dianalisis dengan elektroforesis gel agaros 1% (b/v), kemudian
dimurnikan menggunakan GeneJET Gel Extraction Kit (Fermentas). Fragmen DNA hasil
pemurnian, di analisis dengan elektroforesis agaros 1 %(b/v).
29
Setelah dimurnikan, hasil PCR diligasi ke vektor pJet1.2 (Fermentas). Reaksi
ligasi dilakukan dengan perbandingan molar antara vektor pJET1.2 dan insert gen SEC4
1:3. Campuran reaksi ligasi terdiri dari 10 μL buffer 2x reaksi; 5 μL purified SEC4 hasil
PCR; 1 μL (0.05 pmol ends) vektor pJET1.2; 1 uL blunting enzyme, air bebas nuklease
hingga 19 μL; dan 1 μL T4 DNA ligase. Volume total reaksi ligasi adalah 20 μL.
Campuran kemudian divortex dan disentrifugasi selama 3-5 detik. Campuran diinkubasi
pada suhu 22C selama 15 menit.
Vektor pJet1.2 yang telah membawa gen SEC4 (pJet1.2-SEC4) digunakan untuk
mentransformasi E. coli TOP10F’. Pembuatan sel kompeten dilakukan mengikuti
prosedur CaCl2 (Sambrook, et al., 1989). Sejumlah 5 μL DNA hasil ligasi ditambahkan
ke dalam tabung yang berisi 50 μL sel kompeten, kemudian diinkubasi selama 30 menit
pada suhu 4C, kemudian dilakukan heat shock
pada suhu 42C selama 90 detik.
Kemudian segera didinginkan di dalam es selama 10 menit. Campuran ini kemudian
ditambahkan 950 μL media LB cair dan diinkubasi pada suhu 37 C selama 2 jam dengan
laju pengocokan 150 rpm. Kemudian disentrifugasi pada 12000 rpm selama 30 detik.
Sebanyak 900 μL supernatan dibuang, pelet sel diresuspensi dengan supernatan sisa
sebanyak 100 μL dan kemudian ditumbuhkan pada media LB padat yang telah
mengandung Tetrasiklin 15 μg/mL dan Ampicillin 100 μg/mL, kemudian diinkubasi
pada suhu 37C selama 16-18 jam.
Koloni transforman E. coli yang tumbuh berwarna putih dikarakterisasi melalui
isolasi plasmid rekombinan (Sambrook, et al., 1989), analisis restriksi menggunakan
EcoR1, kemudian ditentukan urutan nukleotidanya. Urutan nukleotida gen SEC4 hasil
isolasi dari E. coli TOP10F’ dengan konsentrasi DNA sekitar 100 ng/μL ditentukan
dengan metode dideoksi Sanger (Dye Terminator) di Macrogene (Korea). Primer yang
digunakan untuk sekuensing adalah pasangan primer pJetfor dan pJetref (primer
universal untuk vektor pJet1.2). Hasil sekuensing di jajarkan menggunakan program
Seqman DNAStar.
4.2.2. Karakterisasi pJET1.2-SEC4 rekombinan
a. Isolasi Transforman E. coli TOP10 F’ (pJET1.2-SEC4 ) dengan Metode Miniprep
Transforman E.coli TOP 10F’ yang mengandung pJET1.2─SEC4 diinokulasi
dalam LB cair 6 mL yang ditambahkan Tetrasiklin 15 μg/mL dan Ampicillin 100 ug/mL
selama 16-18 jam, 37oC, dengan laju pengocokan 150 rpm. Kemudian sejumlah kultur
30
transforman E.coli TOP 10F’ yang telah ditumbuhkan dimasukan ke dalam tabung
mikrosentrifugasi 1.5 mL lalu disentrifugasi dengan kecepatan 12000 rpm selama 30
detik untuk mengumpulkan pelet. Pelet ditambahkan dengan 500 μL buffer STE (NaCl
0,1 M, tris–Cl 10 mM pH 8,0, EDTA pH 8,0), divortex hingga pelet larut, dan kemudian
disentrifugasi dengan kecepatan 10000 rpm selama 30 detik. Pelet diresuspensi dengan
larutan A sebanyak 300 μL, lalu ditambahkan dengan larutan III sebanyak 150 μL,
kemudian larutan diinversi. Campuran didiamkan selama 3 menit, kemudian
disentrifugasi dengan kecepatan 14000 rpm selama 5 menit. Supernatan dipipet sebanyak
400 μL ke tabung mikrosentrifugasi 1.5 mL baru. Supernatan ditambahkan dengan etanol
p.a 100% sebanyak 800 μL (2X volume supernatan), divortex selama 10 detik,
didiamkan selama 5 menit, dan kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 12000 rpm
selama 5 menit. Pelet yang diperoleh dicuci dengan etanol p.a 70% sebanyak 1 mL,
divortex selama 10 detik, dan disentrifugasi dengan kecepatan 12000 rpm selama 3 menit.
Supernatannya dibuang, kemudian pelet dalam tabung mikrosentrifugasi dikeringkan di
dalam konsentrator. Pelet kemudian dilarutkan dengan 50 μL ddH2O steril. Larutan
kemudian dianalisis dengan elektroforesis gel agarosa 1% (b/v).
b. Pemurnian DNA Plasmid Hasil Isolasi dengan Metode Presipitasi Etanol
Larutan hasil isolasi ditambahkan natrium asetat 3M sebanyak 0.1 x volume dan
etanol p.a 100% 2 x volume, campuran larutan kemudian diinversi dan diinkubasi pada
suhu -20oC semalaman. Larutan kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 12000 rpm
selama 30 menit pada suhu 4oC. Supernatan dibuang, pelet dicuci dengan penambahan
etanol p.a 70% sebanyak 5 x volume. Larutan disentrifugasi dengan kecepatan 12000
rpm selama 10 menit pada suhu 4oC. Supernatan dibuang, pelet kemudian dikeringkan di
dalam konsentrator. Pelet kemudian dilarutkan dengan 50 μL ddH2O steril. Larutan
kemudian dianalisis dengan elektroforesis gel agarosa 1% (b/v).
c. Restriksi Plasmid pJET1.2─SEC4
Sebanyak 10 uL plasmid pJET1.2-SEC4 hasil isolasi ditambahkan 2 uL buffer
EcoRI 10x, 2 uL enzim EcoRI (10 U/mL), dan air bebas nuklease hingga volume total
reaksi 20 uL. Kemudian diinkubasi pada suhu 37oC selama 2 jam. Setelah itu
dikarakterisasi dengan elektroforesis gel.
31
4.2.3 Penentuan Urutan Nukleotida pJET1.2─SEC4
Urutan nukleotida gen SEC4 hasil isolasi dari E. coli TOP10F’ dengan
konsentrasi DNA sekitar 100 ng/μL ditentukan dengan Metode dideoksi Sanger (Dye
Terminator) di Macrogene (Korea) dengan menggunakan primer pJet-for dan pJet-rev.
4.2.4 Kloning Fragmen SEC4 dalam E. coli TOP10F’
a. Isolasi/ Restriksi Plasmid pJET1.2─SEC4 dan vektor pPIC3.5K
Koloni
positif
mengandung
plasmid
pJET1.2─SEC4
diisolasi
dengan
menggunakan GeneJET Plamid Miniprep Kit (Fermentas) mengikuti prosedur. DNA
hasil isolasi dilarutkan dalam 50 uL ddH2O steril kemudian direstriksi dengan enzim
EcoRI dan dikarakterisasi dengan elektroforesis agarosa. Hal yang sama dilakukan pada
vektor pPIC3.5K.
b. Pemurnian fragmen SEC4 dan pPIC3.5K GeneJET Extraction Kit (Fermentas)
Masing-masing fragmen DNA (SEC4 dan pPIC3.5K) hasil restriksi pada gel
agarosa dimurnikan menggunakan GeneJET Extraction Kit (Fermentas) mengikuti
prosedur seperti sudah dijelaskan diatas.
c. Ligasi Fragmen DNA SEC4 dengan Vektor pPIC3.5K
Reaksi ligasi dilakukan dengan perbandingan molar antara vektor pPIC3.5K dan
insert gen SEC4 1:5. Campuran reaksi ligasi terdiri dari 2 μL buffer 10x reaksi; 1.22 μL
purified SEC4; 1 μL vektor pJET1.2; air bebas nuklease hingga 19 μL; dan 1 μL T4 DNA
ligase. Volume total reaksi ligasi adalah 20 μL. Campuran kemudian divortex dan
disentrifugasi selama 3-5 detik. Campuran diinkubasi pada suhu 220C selama 1 jam.
d. Transformasi E. coli TOP10F’ Menggunakan Plasmid pPIC3.5K-SEC4
Proses transformasi dimulai dengan pembuatan sel kompeten metoda CaCl2
(Sambrook et al., 1986). Sejumlah 5 μL DNA hasil ligasi digunakan untuk
mentransformasi E. coli TOP10 dengan metoda heat shock pada suhu 420C selama 90
detik. Transforman E. coli ditumbuhkan pada media LB padat yang telah mengandung
Tetrasiklin 15 μg/mL dan Ampicillin 100 μg/mL, kemudian diinkubasi pada suhu 37 0C
selama 16-18 jam.
e. Restriksi Plasmid pPIC3.5K─SEC4
Sebanyak 10 uL plasmid pJET1.2-SEC4 hasil isolasi ditambahkan 2 uL buffer
EcoRI 10x, 2 uL enzim EcoRI (10 U/mL), dan air bebas nuklease hingga volume total
32
reaksi 20 uL. Kemudian diinkubasi pada suhu 37oC selama 2 jam. Setelah itu
dikarakterisasi dengan elektroforesis gel.
4.2.5 Penentuan Urutan Nukleotida pPIC3.5K─SEC4
Urutan nukleotida gen SEC4 dalam plasmid pPIC3.5K-SEC4 hasil isolasi dari E.
coli TOP10F’ dengan konsentrasi DNA sekitar 100 ng/μL ditentukan dengan Metode
dideoksi Sanger (Dye Terminator) di Macrogene (Korea) dengan menggunakan primer
5’AOX dan 3’AOX.
4.2.6 Transformasi P. pastoris menggunakan plasmid pPIC3.5K-SEC4
a. Linearisasi plasmid pPIC3.5K-SEC4
Sebanyak 1-5 μg plasmid rekombinan pPIC3.5K-SEC4 dilinearisasi menggunakan
enzim restriksi BspE1. Campuran reaksi mengandung 1-5 μg plasmid rekombinan, 10
Unit BspE1 dan buffer Tango 1X. Restriksi dilakukan dalam volume 20 L, dan
diinkubasi pada suhu 37C selama 16 jam. Hasil restriksi di elektroforesis dengan gel
agarosa 1%.
b. Transformasi P. pastoris metode EasyCompTM (Invitrogen, 2006)
Persiapan sel kompeten P. pastoris MS-20 [ALP1]. Koloni tunggal P. pastoris
MS-20 [ALP1] diinokulasi ke dalam 10 mL YPD. Kemudian ditumbuhkan semalam pada
suhu 28-30C dengan pengocokan pada 250 rpm. Sebanyak 500 μL kultur dipindahkan
ke dalam 10 mL media YPD baru dan diinkubasi pada suhu 28-30C dengan pengocokan
hingga mencapai OD0,6-1,0 (kira-kira 5 jam). Prosedur persiapan sel kompeten dilakukan
mengikuti protokol (Invitrogen, 2006).
Transformasi P. pastoris. Sebanyak 3 μg (volume 5 μL) plasmid pPIC3.5K–
SEC4 yang telah linear ditambahkan ke dalam suspensi sel kompeten. Kemudian
ditambahkan 1 mL larutan II dan dihomogenkan menggunakan vorteks. Setelah itu
diinkubasi pada suhu 30C selama 1 jam dalam penangas air. Campuran dihomogenkan
setiap 15 menit dengan vorteks. Kemudian dilakukan heat shock menggunakan heating
block atau penangas air pada suhu 42C selama 10 menit. Sel dipisahkan ke dalam dua
tabung 1,5 mL (kira-kira 525 μL per tabung), ditambah 1 mL media YPD cair. Sel
diinkubasi pada suhu 30C selama 1 jam, kemudian disentrifugasi pada 12000 g selama 5
menit pada suhu ruang, supernatan dibuang. Pelet diresuspensi dalam 500 μL larutan III
33
dan pelet digabungkan ke dalam satu tabung. Pelet disentrifugasi pada kecepatan 12000 g
selama 5 menit pada suhu ruangan lalu supernatan dibuang. Pelet diresuspensi dalam 150
μL larutan III. Semua transforman disebarkan pada cawan petri berisi media YPD padat.
Kemudian diinkubasi selama 3 sampai 10 hari pada suhu 30C (Invitrogen, 2006).
4.2.7 Seleksi dan karakterisasi tranforman P. pastoris
Seleksi transforman P. pastoris. Seleksi akan dilakukan dengan menumbuhkan
transforman dalam media padat MMH (minimal methanol medium+ histidin: YNB
1,34% (b/v), biotin 4x10 -5% (b/v), metanol 0,5% (v/v), histidin 0,004% (b/v) dan MM
(minimal methanol medium: YNB 1,34% (b/v), biotin 4x10 -5% (b/v), metanol 0,5% (v/v).
Galur His+ akan tumbuh normal pada kedua media, sementara galur His - tumbuh normal
pada media MMH tetapi menunjukkan pertumbuhan lambat atau sama sekali tidak
tumbuh pada media MM.
Karakterisasi transforman P. pastoris. Karakterisasi dilakukan untuk mengetahui
apakah gen SEC4 dan gen ALP1 sudah terintegrasi ke kromosom P. pastoris.
Karakterisasi dilakukan dengan metoda PCR, menggunakan pasangan primer untuk
mengamplifikasi gen SEC4 dan ALP1 dan templat genom P. pastoris.
4.2.8 Ekspresi -amilase dan ko-ekspresi Sec4p
Satu koloni tunggal transforman P. pastoris diinokulasi dalam 10 mL media YPD
cair, dan diinkubasi semalam pada suhu 30C dengan pengocokan 200 g. Sebanyak 1 mL
kultur cair dipindahkan ke 10 mL media BMGY+ Histidin (buffered glycerol complex
medium: ekstrak ragi 1% (b/v), bakto pepton 2% (b/v), kalium fosfat 100 mM (pH 6),
YNB 1,34% (b/v), biotin 4x10 -5% (b/v), gliserol 1% (v/v)) menggunakan labu 100 mL.
Sel ditumbuhkan pada suhu 28–30C dalam inkubator pengocok 250 g hingga mencapai
OD600 = 6-10 (kira-kira 18-20 jam). Sel di panen dengan sentrifugasi pada 1500 – 3000 g
selama 5 menit pada suhu ruang. Supernatan didekantasi dan pelet sel diresuspensi dalam
25 mL media BMMH (buffered minimal methanol-histidin: YNB 1,34% (b/v), kalium
fosfat 100 mM pH 6, biotin 4x10 -5% (b/v), metanol 1% (v/v), histidin 0,004%)
menggunakan labu 250 mL. Labu ditutup dengan kapas steril dan inkubasi dilanjutkan
dengan pengocokan. Induksi dilakukan dengan menambahkan metanol dengan
konsentrasi akhir 0,75% setiap 24 jam, pada jam ke 24, 36, 72, 96, 120, dan 144.
Pengambilan sampel dilakukan setiap jam induksi dengan mengambil 1 mL kultur hasil
34
ekspresi dipindahkan ke dalam tabung mikro 1,5 mL. Sampel disentrifugasi pada
kecepatan maksimum selama 2-3 menit pada suhu ruang. Supernatan dan pelet disimpan
pada pendingin suhu -20C sampai siap untuk di uji (Invitrogen, 2006).
4.2.9 Analisis aktivitas -amilase
Hasil ekspresi protein pada supernatan dan pelet sel diuji aktivitas amilase intra
dan ekstraselularnya dengan metode DNS (Bernfeld, 1948) ditentukan kadar protein
(metode Lawry, 1975).
4.2.10 Karakterisasi -amilase dan Sec4p intra dan ekstraselular.
Sec4p intraselular P. pastoris dan -amilase hasil ekspresi intra dan ekstraseluler
P. pastoris akan dikarakterisasi dengan metoda SDS-PAGE (Sambrook et al., 1989).
menggunakan gel dengan komposisi 10% separating gel dan 4% stacking gel.
Persiapan supernatan: 50 μL supernatan dicampur dengan sampel bufer (Tris-Cl
50 mM, pH 6,8, gliserol 1% (v/v), β-merkapoetanol 100 mM, SDS 2% (b/v), bromofenol
biru 0,1% b/v) dan dipanaskan dalam air mendidih selama 5 menit dan didinginkan.
Persiapan pelet sel: Pelet sel diresuspensi dalam 300 μL aquadest, dan
ditambahkan 100 μL TCA 50%, diaduk segera. Sampel dibekukan pada suhu -80C
selama 30 menit. Sel disentrifugasi pada suhu ruang dengan kecepatan 14.000 g selama 5
menit. Pelet sel dicuci dua kali dengan 500 μL aseton 80% dingin, dilanjutkan dengan
sentrifugasi pada 14.000 g selama 5 menit pada suhu ruang. Supernatan dibuang dengan
hati-hati, dan pelet dibiarkan mengering. Pelet dilarutkan dalam 100 μL SDS 1% dalam
natrium hidroksida 0,1N. Kemudian ditambahkan sampel buffer (Tris-Cl 50 mM pH 6,8,
gliserol 1% v/v, β-merkaptoetanol 100 mM, SDS 2% b/v, bromofenol biru 0,1% b/v) dan
dipanaskan dalam air mendidih selama 5 menit dan didinginkan. Kemudian
dikarakterisasi dengan SDS-PAGE.
35
4.3 Bagan Alir Penelitian
36
37
BAB V. HASIL YANG DICAPAI
5.1 Amplifikasi SEC4 P. pastoris dan subkloning dalam E. coli.
Amplifikasi gen SEC4 dengan teknik PCR menggunakan pasangan primer
5’Sec4f dan 3’Sec4r menghasilkan fragmen berukuran 615 pb (Gambar 1a) sesuai
dengan panjang gen SEC4 P. pastoris di GenBank (nomor akses: XM_002492307.1).
Selanjutnya gen SEC4 telah berhasil disubkloning menggunakan vektor pJet1.2 dalam
E. coli (Gambar 1b). Sebanyak 104 koloni transforman E. coli telah diperoleh dan
diremajakan untuk pencarian koloni yang mengandung plasmid rekombinan.
a.
b.
Gambar 5.1. (a) Produk PCR gen SEC4. (lajur 1) marker 1 kb, (lajur 2) SEC4. (b) Koloni
transforman E. coli [pJET1.2-SEC4].
Hasil isolasi plasmid dan karakterisasi dengan enzim EcoR1 diperoleh koloni
yang positif mengandung gen SEC4 (Gambar 2). Hasil restriksi plasmid yang
ditunjukkan pada Gambar 2 menunjukkan bahwa koloni 92 (lajur 6) positif mengandung
plasmid pJET-SEC4, ditunjukkan dengan adanya pita pada daerah ~3000 bp yang sesuai
dengan ukuran plasmid pJET1.2 dan pita pada daerah ~615 bp yang sesuai dengan
ukuran gen SEC4. Koloni 64 dan 68 (lajur 3 dan 4) diduga mengandung vektor pJET1.2
yang mengalami re-ligasi, ditunjukkan dengan pita plasmid yang tidak terpotong oleh
enzim EcoRI karena vektor pJET1.2 tidak memiliki sisi pengenal EcoRI. Namun,
seharusnya koloni ini tidak tumbuh pada media seleksi karena vektor pJET1.2 yang tidak
disisipi DNA sisipan akan mengekspresikan protein yang mematikan bagi transforman
E. coli. Diduga hal ini terjadi karena adanya kontaminasi nuklease. Kontaminasi ini dapat
38
merusak integritas dari gen mematikan dengan rusaknya ujung vektor pJET1.2 oleh
aktivitas nuklease. Hasil restriksi koloni 21 dan 50 (lajur 2 dan 5) menghasilkan plasmid
yang terpotong oleh enzim EcoRI, namun tidak menunjukkan pita spesifik pET1.2
maupun SEC4. Diduga hal ini terjadi karena proses restriksi yang kurang sempurna
sehingga menghasilkan plasmid pJET-SEC4 linear, ditunjukkan dengan pita yang terletak
diantara daerah ~3500 pb.
Gambar 5.2. Hasil restriksi plasmid pJET1.2-SEC4 dengan enzim EcoRI. (lajur 1) marker 1 kb,
(lajur 2) pJET-SEC4 koloni 21 cut/ EcoRI, (lajur 3) pJET-SEC4 koloni 64 cut/
EcoRI, (lajur 4) pJET-SEC4 koloni 68 cut/EcoRI, (lajur 5) pJET-SEC4 koloni 50
cut/ EcoRI, (lajur 6) pJET-SEC4 koloni 92 cut/EcoRI.
5.2 Kostruksi plasmid ekspresi pPIC3,5K-SEC4 dan kloning dalam E. coli
Gen SEC4 hasil subkloning dipotong dari plasmid pJet1.2-SEC4 menggunakan
enzim EcoR1. Pemotongan plasmid ini dengan enzim EcoR1 menghasilkan dua pita
DNA yaitu 3000 pb (vektor pJet1.2) dan 615 pb (gen SEC4). Sedangkan pemotongan
plasmid pPIC3.5K dengan enzim EcoR1 menghasilkan satu pita dengan ukuran 9000 pb
(Gambar 5.3)
Gambar 5.3. Hasil restriks pJET1.2-SEC4 dan vektor pPICK3.5K dengan enzim EcoR1. (lajur
1) marker 1 kb, (lajur 2) pPICK3.5K cut/ EcoR1, (lajur 3) pJET1.2-SEC4 cut/
EcoR1.
39
Fragmen 9000 pb (pPIC3.5K) dan 615 pb(SEC4) dipotong dari gel agaros,
kemudian dimurnikan menggunakan GeneJet Gel Extraction Kit (Fermentas). Kedua
fragmen DNA ini diligasi dengan perbandingan molar fragmen SEC4:vektor pPIC3.5K =
5:1. Hasil ligasi dikloning dalam E. coli TOP10F’ dan diperoleh 104 transforman E. coli
(Gambar 5.4).
a.
b.
Gambar 5.4. Koloni E. coli [pPIC3.5K-SEC4] yang diremajakan.(a) koloni 1-52, (b) koloni 53104.
Peta plasmid rekombinan pPIC3.5K-SEC4 hasil konstruksi diperlihatkan pada
gambar 5.5. Plasmid ini membawa dua gen marker seleksi yaitu gen pengode resistan
ampisilin dan kanamisin. Gen SEC4 berada dibawah kontrol promotor dan terminator
AOX1. Induksi ekspresi dilakukan dengan menambahkan penginduksi metanol.
Gambar 5.5 Peta plasmid pPIC3.5K-SEC4 hasil konstruksi
40
Hasil penentuan urutan nukleotida terhadap urutan gen SEC4 dalam plasmid
rekombinan pJet1.2-SEC4 menunjukkan bahwa gen SEC4 hasil subkloning homologi
100% dengan urutan gen SEC4 P. pastoris pada GenBank (nomor akses:
XM_002492307.1) (Gambar 5.6).
Gambar 5.6 Homologi urutan nukleotida SEC4 hasil subkloning dengan urutan SEC4
nomor NCBI. Warna merah menunjukkan tingkat homologi 100%.
41
5.3 Isolasi Plasmid pPIC3,5K-SEC4 dari E.coli TOP10F’ dan linearisasi
Plasmid pPIC3,5K-SEC4 diisolasi dari transforman E. coli TOP10F’ yang akan
digunakan untuk transformasi P. pastoris. E. coli TOP10F’ [pPIC3,5K-SEC4]
ditumbuhkan dalam media LB cair yang mengandung antibiotik tetrasiklin dan ampisilin.
Setelah diinkubasi selama semalam diperoleh kultur E. coli TOP10F’ [pPIC3,5K-SEC4].
Penambahan antibiotik bertujuan untuk seleksi koloni transforman. E. coli TOP10F’
yang telah mengandung plasmid rekombinan pPIC3.5K-SEC4 akan resisten terhadap
antibiotik ampisilin karena vektor pPIC3.5K memiliki gen pengode resistensi kanamicin/
ampisilin. Selain itu transforman juga resisten terhadap antibiotik tetrasiklin karena
E.coli TOP10F’ membawa gen pengode resisten tetrasiklin, sehingga, hanya E.coli yang
mengandung plasmid rekombinan pPIC3.5K-SEC4 yang akan tumbuh.
Plasmid
rekombinan
pPIC3,5K-SEC4
diisolasi
dari
E.
coli
TOP10F’
menggunakan High Pure Plasmid Isolation Kit (Roche). Sebagai pembanding digunakan
plasmid pPIC3.5K yang diisolasi dengan metode yang sama. Hasil isolasi plasmid
pPIC3.5K dan pPIC3,5K-SEC4 dari E. coli TOP10F’ dikarakterisasi dengan agarosa 1%
(b/v). Plasmid pPIC3,5K-SEC4 mempunyai ukuran ~9615 pb. Hasil isolasi ditunjukkan
pada Gambar 5.7.
1 2
3
Gambar 5.7 Hasil isolasi plasmid pPIC3,5K-SEC4 dengan High Pure Plasmid Isolation
Kit (Roche). (lajur 1) plasmid pPIC3,5K, (lajur 2) Ladder DNA 1 kb, (lajur
3) plasmid pPICK3.5K-SEC4.
Pada Gambar 5.7 terlihat pita DNA plasmid pada gel agarosa membentuk lebih
dari satu pita. Adanya beberapa pita pada satu jalur menunjukkan DNA plasmid berhasil
diisolasi. DNA plasmid memiliki konformasi superkoil yang berbeda-beda seperti
42
supercoiled monomer, supercoiled dimer, nicked circular, dan lain-lain (Jazwinski and
Edelman, 1982), sehingga akan menghasilkan beberapa pita DNA pada gel agarose. Pita
plasmid pPIC3.5K terletak lebih bawah dibandingkan plasmid pPICK3.5K-SEC4.
Menurut literatur gen SEC4 P. pastoris dari NCBI (nomor akses: XM_002492307.1)
memiliki 615 bp nukleotida dan mendapat tambahan plasmid pPICK3.5K yang memiliki
ukuran ~9000 pb, sehingga ukuran pPICK3.5K-SEC4 menjadi ~9615 pb. Hasil ini
menguatkan dugaan bahwa transforman E. coli TOP10F’ telah membawa plasmid
rekombinan pPIC3.5K-SEC4.
Vektor pPIC3.5K merupakan vektor ekspresi untuk P. pastoris berukuran 9004
bp. Vektor P. pastoris pada umumnya dirancang sebagai plasmid integrasi untuk
mencegah masalah ketidakstabilan plasmid selama pertumbuhan jangka panjang. Kaset
ekspresi diintegrasi ke genom P. pastoris pada lokus spesifik untuk menghasilkan
transforman yang stabil secara genetik. Integrasi dapat dilakukan dengan dua cara. Cara
yang paling sederhana adalah dengan memotong vektor pada sisi yang unik dalam gen
penanda (seperti HIS4) atau pada fragmen promotor AOX1 (Romanos, 1995; Gaffar,
2010). Pemotongan vektor P. pastoris dalam urutan yang sama dengan genom inang,
akan menstimulasi peristiwa rekombinasi homolog yang merupakan target yang efisien
untuk integrasi vektor ke lokus genom (Cregg & Madden, 1988).
Vektor pPIC3.5K sendiri memiliki sisi restriksi yang unik untuk melinearkan
vektor pada lokus AOX1 dan HIS4 untuk integrasi yang efisien kedalam genom P.
pastoris. Pada penelitian ini, linearisasi dilakukan pada lokus HIS4 karena lokus AOX1
telah terintegrasi gen ALP1. Terdapat tiga sisi restriksi unik yang dimiliki vektor
pPIC3.5K agar menjadi linier yaitu SacI (dari Streptomyces achromogenes), SalI (dari
Streptomyces albus), dan BspEI (dari Bacillus species) (Invitrogen, 2006). Pada
penelitian ini digunakan enzim restriksi BspEI untuk melinierkan plasmid pPIC3.5KSEC4 pada lokus HIS4. Enzim BspEI ini memiliki sisi pemotongan 5’T↓CCGGA3’
(BioLabs, 2007). Gen SEC4 tidak memiliki sisi pengenal BspEI sehingga gen SEC4
tidak terpotong. Hasil linierisasi plasmid pPIC3,5K─SEC4 oleh enzim BspEI ditunjukkan
pada Gambar 5.8.
43
1
2
~ 9615 pb
10.000 bp
6000 bp
3000 bp
1500 bp
1000 bp
750 bp
500 bp
Gambar 5.8 Hasil linierisasi plasmid pPIC3.5K─SEC4. Lajur 1 Ladder DNA 1 kb, lajur 2
pPIC3.5K─SEC4/BspEI.
5.4 Uji Kualitatif P. pastoris WT-78 dan WT-68
Uji kualitatif perlu dilakukan untuk memastikan bahwa koloni P. pastoris yang
akan dipakai mengekspresikan α-amilase. Uji kualitatif P. pastoris dilakukan dengan
menggunakan media YPD (yeast-peptone-dextrose) padat yang ditambah pati. Hasil
pengamatan (Gambar 5.9) menunjukkan bahwa koloni P. pastoris [ALP1-78] dan P.
pastoris [ALP1-68] mampu mensekresikan α-amilase keluar sel. Hal ini ditunjukkan oleh
adanya daerah bening di sekeliling koloni P. pastoris setelah dilakukan penambahan
larutan KI/I2. Daerah bening tersebut terbentuk karena tidak adanya pati yang
membentuk kompleks dengan KI/I2 karena pati telah dihidrolisis oleh -amilase yang
disekresikan oleh P. pastoris, sedangkan daerah biru menunjukkan adanya pati yang
masih tersisa dalam media pertumbuhan sehingga membentuk kompleks dengan iodium.
1
2
Gambar 5.9 Hasil uji aktivitas -amilase secara kualitatif dalam media padat yang
mengandung 2% pati dan 0,5% metanol. (1) P. pastoris [ALP1-78], (2)
[ALP1-68].
44
5.5 Transformasi P. pastoris menggunakan pPIC3.5K–SEC4 dengan metode
EasyCompTM (Invitrogen).
Vektor rekombinan pPIC3,5K─SEC4 yang telah linier kemudian digunakan untuk
mentransformasi P. pastoris[ALP1-68] dan [ALP1-78] dengan Metode EasyComp™
(Invitrogen). Prosedur transformasi dilakukan mengikuti prosedur Invitrogen. Kemudian
transforman P. pastoris [ALP1-68/SEC4] dan [ALP1-78/SEC4] ditumbuhkan pada
media YPDS (yeast-peptone-dextrose-sorbitol) padat dan di inkubasi selama 3 hari,
sehingga diperoleh koloni P. pastoris [ALP1-78/SEC4] dan [ALP1-68/SEC4] yang dapat
dilihat pada Gambar 5.10.
1
2
Gambar 5.10 Koloni P. pastoris [ALP1-SEC4] hasil transformasi. (1) P. pastoris [ALP168/SEC4], (2) P. pastoris [ALP1-78/SEC4].
Hasil transformasi yang ditumbuhkan pada media YPDS padat tidak
ditemukan koloni tunggal, maka koloni hasil transformasi diambil menggunakan jarum
oase lalu digores ulang pada media YPDS padat untuk memperoleh koloni tunggal.
Hasil pertumbuhan pada media YPDS tidak ditemukan koloni tunggal dikarenakan
konsentrasi dari transforman terlalu pekat, sehingga koloni-koloni tunggal tidak
terbentuk. Gambar hasil pertumbuhan transfoman Pichia pastoris pada media YPDS
dapat dilihat pada Gambar 5.11.
45
Gambar 5.11 Koloni P. pastoris [ALP1/SEC4] pada media YPD padat.
5.6 Seleksi dan Karakterisasi Transforman P. pastoris
a. Uji Resistensi Terhadap Geneticin
Hasil uji geniticin yang dilakukan terhadap P. pastoris [ALP1-SEC4]
menunjukkan bahwa transforman P. pastoris resisten terhadap geniticin (2,5mg/mL).
Transforman P. pastoris [ALP1-SEC4] ditumbuhkan pada media YPD cair selama
semalam, kemudian densitas optiknya diukur dan diperoleh sebesar 2,653 untuk P.
pastoris [ALP1-78/SEC4] dan 2,578 untuk P. pastoris [ALP1-68/SEC4]. Kemudian
ditambahkan antibiotik geneticin dengan konsentrasi akhir 2,5 mg/mL ke dalam kultur,
lalu diinkubasi selama semalam (16-18 jam), kemudian diukur OD-nya sebesar 2,664
untuk [ALP1-78/SEC4] dan 2,581 untuk [ALP1-68/SEC4]. Adanya produk gen resisten
kanamisin dari Tn903 yang dibawa oleh plasmid pPIC3.5K menyebabkan P. pastoris
resistens terhadap geniticin (Invitrogen, 2004), sehingga tranforman P. pastoris akan
resisten terhadap antibiotik geneticin yang artinya gen pengode resisten terhadap
geneticin telah terintegrasi ke genom P. pastoris.
b. Seleksi Fenotif His+ Pada Transforman P. pastoris
Seleksi
fenotif
His+
transforman
P.
pastoris
dilakukan
dengan
cara
menumbuhkan koloni tunggal P. pastoris pada media YPD cair selama semalam,
kemudian dipindahkan ke media YPD padat yang telah mengandung Histidin dengan
konsentrasi 0,004 mg/mL dan media YPD padat yang tidak mengandung histidin.
Kemudian diinkubasi selama 2-3 hari pada suhu 30ºC. Transformasi menggunakan
plasmid [pPIC3.5K─SEC4] akan merubah fenotip P. pastoris [ALP1-68]/His- maupun P.
pastoris [ALP1-78] His- menjadi His+ karena vektor ekspresi pPIC3.5K yang digunakan
membawa lokus HIS4. HIS4 mengode histidinol dehidrogenase yang merupakan salah
satu enzim yang terlibat dalam biosintesis histidin. Galur His+ akan dapat tumbuh pada
46
media yang tidak mengandung histidin sedangkan galur His - tidak dapat tumbuh pada
media yang tidak mengandung histidin. Gambar 5.12 menunjukan bahwa transforman P.
pastoris [ALPI-78/SEC4] maupun [ALPI-68/SEC4] dapat tumbuh pada media yang tidak
mengandung histidin, sehingga fenotipnya adalah His+.
YPD padat dengan
histidin
YPD
2 padat tanpa
histidin
1
2
Gambar 5.12 Seleksi fenotif His+. 1 merupakan P. pastoris dengan penambahan
Histidin, 2 merupakan P. pastoris tanpa penambahan Histidin
5.7. Ekspresi -amilase oleh P. pastoris rekombinan
a. Peremajaan P. pastoris Rekombinan
Koloni hasil transformasi yang telah ditumbuhkan pada media YPD padat
selanjutnya diremajakan dalam media YPD cair. Peremajaan ini dilakukan untuk
memperoleh koloni yang lebih muda dengan densitas optik P. pastoris masih berada
pada fase log pertumbuhan sekitar 10-12 (Triana,2010). Kultur diinkubasi selama 16-18
jam pada suhu 28-30°C dan kecepatan pengocokan 185 rpm. Gambar 5.13 menunjukkan
sel P. pastoris yang telah diremajakan.
1
2
Gambar 5.13 Hasil peremajaan P. pastoris (1) [ALPI-68/SEC4] dan (2) [ALPI-78/SEC4]
.
47
b. Induksi Ekspresi α-Amilase oleh P. pastoris Rekombinan
P. pastoris [ALP1] yang diperoleh dari hasil penelitian (Gaffar 2011) digunakan
sebagai pembanding untuk mempelajari pengaruh ko-ekspresi SEC4 terhadap level
sekresi α-amilase. Koloni P. pastoris ditumbuhkan pada media YPD cair dan diambil
sebanyak 1 mL dan dimasukkan ke dalam 10 mL media BMGY (Buffered Glycerolcomplex Medium: ekstrak ragi 1% (b/v), bakto pepton 2% (b/v), kalium fosfat 100 mM
pH 6, YNB 1,34% (b/v), biotin 4x10-5% (b/v), gliserol 1% (v/v)) menggunakan labu 100
mL. Komponen yang terdapat pada media ini berperan dalam mengontrol pH media,
menurunkan aktivitas protease dan meningkatkan biomassa (Invitrogen, 2004). Media
BMGY ini mengandung gliserol karena sel P. pastoris dengan cepat dapat mencapai
densitas sel yang tinggi pada kultur yang mengandung gliserol. Media BMGY tidak
mengandung metanol karena pada fase pertumbuhan ini hanya bertujuan untuk
memperbanyak sel P. pastoris sehingga metanol sebagai penginduksi belum
ditambahkan. Inkubasi dilakukan pada suhu 28-30°C dengan kecepatan 200 rpm agar sel
dapat tumbuh optimal. Kultur yang diinkubasi selama 16-18 jam mencapai OD600
(densitas optik yang diukur menggunakan spektrofotometer UV-Vis pada λ600) sekitar 910. Hasil ini sangat tinggi bagi beberapa mikroorganisme namun tidak bagi P. pastoris.
Inokulum dari media BMGY disentrifugasi untuk memisahkan supernatan dan
pelet. Supernatan didekantasi dan pelet sel P. pastoris diresuspensi dalam 25 mL media
BMMH (buffered minimal methanol histidine: YNB 1,34% (b/v), kalium fosfat 100 mM
pH 6, biotin 4x10-5% (b/v), metanol 1% (v/v), histidin 0,004%) menggunakan labu 250
mL. Labu ditutup dengan kapas steril dan inkubasi dilanjutkan dengan pengocokan.
Inkubasi dilakukan pada suhu 28-30°C dengan kecepatan pengocokan 185 rpm,
pertumbuhan di atas 32oC selama fase induksi dapat mengganggu ekspresi protein dan
dapat menyebabkan kematian sel (Invitrogen, 2004). Induksi dilakukan dengan
menambahkan metanol dengan konsentrasi akhir 0,75% setiap 24 jam, pada jam ke 24,
36, 72, 96, 120, dan 144. Pengambilan sampel dilakukan setiap jam induksi dengan
mengambil 1 mL kultur hasil ekspresi dipindahkan ke dalam tabung mikro 1,5 mL.
Sampel disentrifugasi pada kecepatan maksimum selama 2-3 menit pada suhu ruang.
Supernatan dipindahkan ke tabung lain, supernatan dan pelet disimpan pada pendingin
-20C sampai siap untuk diuji.
48
c. Densitas Optik Selama Masa Ekspresi
Densitas optik dapat menunjukkan tingkat pertumbuhan sel. Spektrofotometer
digunakan untuk analisis ini, densitas optik diukur pada panjang gelombang 600 nm.
Gambar 5.14 di bawah ini menunjukkan densitas optik P. pastoris [ALPI-68/SEC4] dan
P. pastoris [ALPI-78/SEC4] selama waktu induksi. OD tertinggi diperoleh pada jam ke72, yaitu 24,15 pada P. pastoris [ALPI-78/SEC4] dan 22,95 pada P. pastoris [ALPI68/SEC4] .
30
Densitas Optik
25
20
15
[ALPI78/SEC4]
10
[ALPI68/SEC4]
5
0
0
24
48
72
96
Waktu (Jam)
120
144
Gambar 5.14 Densitas optik P. pastoris [ALPI-68/SEC4] dan [ALPI-78/SEC4] yang
ditumbuhkan pada media yang mengandung 0,75% metanol sebagai
penginduksi.
5.8 Aktivitas α-Amilase Hasil Ekspresi
Metode penentuan aktivitas α-amilase dilakukan dengan metode DNS (Asam 3,5Dinitrosalisilat). Sampel diambil tiap 24 jam dari kultur BMMH, kemudian disentrifugasi
untuk memisahkan supernatan dan pelet sel. Supernatan yang mengandung α-amilase di
tentukan aktivitasnya dengan metoda DNS, dimana pada prinsipnya metode DNS
menciptakan suasana alkali agar gula pereduksi dapat mereduksi asam 3,5-dinitrosolisilat
(DNS) membentuk senyawa 3-amino-5-nitrosalisilat, yang menyerap cahaya secara kuat
pada panjang gelombang 500 nm (Shaw et al., 1995).
Pada metode DNS ini, satu unit aktivitas enzim α-amilase didefenisikan sebagai
sejumlah enzim yang dapat menghasilkan 1 µmol gula pereduksi dalam waktu 10 menit
(Miller, 1959). Amilase akan bekerja memotong substrat pati sehingga dihasilkan
beberapa produk berupa oligosakarida, maltosa dan glukosa yang merupakan gula
49
pereduksi. Berdasarkan prosedur uji aktivitas metode DNS proses pemanasan bertujuan
untuk mengaktivasi reaksi reduksi oksidasi antara gula pereduksi yang terbentuk setelah
reaksi enzimatik dengan DNS sehingga gugus aldehid bebas pada gula pereduksi akan
teroksidasi menjadi gugus karboksilat. Hasil reaksi reduksi oksidasi di atas akan
mengubah DNS yang semula berwarna kuning menjadi berwarna coklat, sehingga
semakin banyak gula pereduksi yang dihasilkan pada reaksi enzimatik, maka warna
larutan setelah pemanasan juga akan semakin coklat pekat. Setelah itu diukur serapannya
pada panjang gelombang 500 nm yang merupakan panjang gelombang optimum untuk
senyawa DNS yang telah tereduksi menjadi berwarna coklat (Gambar 5.15).
1
2
Gambar 5.15 Hasil reaksi penentuan aktivitas dengan metoda DNS, (1) [ALPI-78/SEC4],
(2) [ALPI-68/SEC4]
Gambar 5.16 merupakan kurva hasil uji aktivitas α-amilase P. pastoris [ALPI78/SEC4] dan P. pastoris [ALPI-68/SEC4] dengan pembanding P. pastoris [ALPI-78]
dan P. pastoris [ALPI-68] dengan metode DNS. Berdasarkan gambar 5.16 dapat
disimpulkan bahwa aktivitas α-amilase S. filbuligera R64 pada P. pastoris [ALPI68/SEC4] dan P. pastoris [ALPI-78/SEC4] meningkat dua kali lipat bila dibandingkan
dengan hasil ekspresi pada P. pastoris [ALP1-78] dan P. pastoris [ALP1-68]. Aktivitas
tertinggi diperoleh pada jam ke 72 yaitu sebesar 522,1022 U/mL untuk [ALP1-68/SEC4]
dan 543,7005 U/mL untuk [ALP1-78/SEC4].
50
Aktivitas ( U/ml )
600
550
500
450
400
350
300
250
200
150
100
50
0
[ALPI68/SEC4]
[ALPI-68]
0
24
48
72
96
Waktu ( Jam)
120
144
Gambar 5.16 Hasil uji aktivitas amylase dengan metode DNS dari P. pastoris [ALPI
78/SEC4] dan P. pastoris [ALPI-68/SEC4] dengan pembanding P.
pastoris [ALPI-78] dan P. pastoris [ALPI-68]
Aktivitas tinggi seiiring dengan tingginya densitas sel selama masa induksi
(Gambar 5.15). Pengukuran pada panjang gelombang 600 nm (OD600) menunjukkan
bahwa densitas sel P. pastoris [ALP1-SEC4] ketika dipanen dari media BMGY berada
pada kisaran nilai 10-23. Nilai OD600 10 merupakan nilai densitas optik yang sangat
tinggi bagi sejumlah mikroorganisme, namun hal ini tidak berlaku bagi P. pastoris.
P. pastoris mampu untuk hidup pada densitas sel yang lebih tinggi lagi (Inan & Meagher,
2001).
Hasil ko-ekspresi protein Sec4 terhadap ekspresi α-amilase S. fibuligera oleh
P. pastoris sesuai dengan hasil yang diperoleh penelitian-penelitian lain yang juga
meneliti pengaruh ko-ekspresi protein Sec4 terhadap ekspresi protein rekombinan.
Penelitian yang dilakukan Shi-Hwei dan koleganya (2004) menunjukkan bahwa
overekspresi
protein Sec4
dapat
menghasilkan peningkatan produksi protein
glukoamilase pada Rhizopus Oryzae. Dalam studi yang dilakukan oleh Shi-Hwei dan
koleganya ini, dilaporkan peningkatan produksi glukoamilase hingga dua kali lipat
dengan melakukan manipulasi genetik yang melibatkan overekspresi SEC4.
5.9 Kadar Protein
Kadar protein ditentukan dengan metoda Lawry. Larutan standar protein BSA
(Bovine Serum Albumin) dibuat dalam bufer fosfat 20 mM dengan konsentrasi (25, 50, 75,
51
100, 125, 150, 200, dan 300) μg/mL. Metoda Lowry dapat mengukur kandungan protein
sampel yang rendah. Uji Lowry menggunakan reaksi Biuret dimana Cu2+ (dalam suasana
basa) yang terdapat pada pereaksi C bereaksi dengan ikatan peptida pada protein
menghasilkan warna biru. Vorteks dilakukan agar larutan tercampur sempurna sehingga
larutan yang ada didalamnya dapat bereaksi dengan baik. Kemudian ditambah dengan
pereaksi D (larutan fosfomolibdat-fosfowolframat) dikocok dan didiamkan selama 30
menit. Larutan fosfomolibdat-fosfowolframat yang merupakan kompleks campuran
garam anorganik ini (pereaksi D) akan bereaksi dengan residu tirosin dan triptopan pada
protein menghasilkan warna biru-hijau. Karena kandungan kedua macam asam amino
tersebut bervariasi pada berbagai macam protein, maka intensitas warna yang
ditimbulkan per miligram proteinpun berbeda (Sudarmadji, 1984). Kemudian diukur
serapannya pada λ750 nm karena panjang gelombang tersebut adalah panjang gelombang
maksimum untuk BSA sebagai larutan standar protein. Hasil penelitian menunjukkan
bahwa kadar protein terbesar diperoleh pada jam ke-72 dimana kadar protein [ALP178/SEC4] sebesar 13,63 mg/mL dan kadar protein [ALP1-78] sebesar 12,72 mg/mL
sedangkan kadar protein [ALP1-68/SEC4] sebesar 14,54 mg/mL dan kadar protein
[ALP1-68] sebesar 13,63 mg/mL . Adanya ko-ekspresi protein Sec4 berpengaruh
terhadap besarnya kadar protein.
Tabel 5.1 bberikut ini memperlihatkan perbandingan hasil ekspresi α-amilase S.
fibuligera R64 pada P. pastoris [ALPI-68] dan P. pastoris [ALPI-78 ] dengan ko-ekspresi
protein Sec4 atau tanpa ko-ekspresi. Hasil yang diperbandingkan meliputi OD600 pada
saat induksi, aktivitas, kadar protein dan aktivitas spesifik.
Tabel 5.1 Pengaruh ko-ekspresi protein Sec4 terhadap level ekspresi -amilase oleh
20,55
22,95
19,38
24,15
Aktivitas
Spesifik (U/mg)
Tingkat
Pertumbuhan
Sel (OD600)
72
72
72
72
Aktivitas
(U/mL)
Waktu Induksi
Optimum (Jam)
[ALP1-68]
[ALP1-68/SEC4]
[ALP1-78]
[ALP1-78/SEC4]
Kadar Protein
(mg/mL)
Pichia pastoris
P. pastoris [ALPI-78/SEC4] dan P. pastoris [ALPI-68/SEC4]
13,63
14,54
12,72
13,63
321,36
485,47
315,46
503,18
23,57
33,38
24,80
36,91
52
Level sekresi merupakan jumlah atau banyaknya α-amilase yang disekresikan
keluar sel. Untuk mengetahui peningkatan level sekresi, maka seharusnya ditentukan
aktifitas dan kadar protein secara intraselular dan ekstraselular. Dalam peneltian ini
hanya dilakukan pengukuran aktivitas enzim α-amilase dan kadar protein secara
ekstraselular (pada supernatan). Shi wei et al., pada tahun 2004 juga melakukan hal yang
sama.
Pada Tabel 5.1 terdapat aktivitas spesifik. Aktivitas spesifik adalah banyaknya
aktivitas enzim dalam setiap miligram protein. Aktivitas spesifik merupakan salah satu
parameter yang menunjukkan kualitas enzim.
Perhitungan aktivitas spesifik:
Aktivitas spesifik (U/mg) =
Aktivitas (U/mL)
Kadar Protein (mg/mL)
Berdasarkan data yang diperoleh, aktivitas spesifik yang diperoleh tidak terlalu
besar, hal ini berarti kualitas enzim α-amilase yang disekresikan tidak terlalu bagus. Hal
ini didukung juga kadar protein yang dihasilkan cukup besar. Aktifitas spesifik P.
pastoris [ALPI-68/SEC4] pada penelitian ini sebesar 485,47 U/mL, sedangkan kadar
protein yang diekspresikan sebesar 14,54 mg/mL dan aktifitas spesifik
P. pastoris
[ALPI-78/SEC4] sebesar 503,18 U/mL, sedangkan kadar protein diekspresikan sebesar
13,63 mg/mL. Menurut teori, P. pastoris merupakan ragi yang mampu memproduksi
protein heterolog dengan tingkat ekspresi yang tinggi (Cereghino & Cregg, 2000) dan
mensekresikan sangat sedikit proteinnya sendiri (Glick & Pasternak, 2003). Namun,
pada peneltian ini kadar protein yang dihasilkan cukup besar. Hal ini berarti terdapat
protein lain yang disekresikan oleh P. pastoris selain α-amilase yang menyebapkan kadar
protein lebih besar.
Dengan adanya ko-ekspresi protein Sec4 dalam P. pastoris maka akan
meningkatkan jumlah SEC4 secara intraselular. Sec4p berperan sebagai transport vesikel
untuk menargetkan vesikel sekresi ke membran plasma pada proses pasca-Golgi dalam
sekresi protein pada ragi dan selanjutnya protein akan disekresikan ke luar sel.
Peningkatan level Sec4p dalam suatu inang ekspresi, akan meningkatkan jumlah protein
asing yang disekresikan.
53
BAB VII. KESIMPULAN DAN SARAN
7.1 Kesimpulan
Berdasarkan hasil penelitian yang telah dilakukan dapat diambil kesimpulan :
1. Gen SEC4 Pichia pastoris berhasil diamplifikasi dengan metode PCR dari genom
P. pastoris dan disubkloning dengan vektor pJET1.2 dalam Escherichia coli.
2. Hasil penentuan urutan nukleotida menunjukkan bahwa urutan nukleotida gen
SEC4 hasil subkloning memiliki homologi 100% dengan urutan nukleotida gen
SEC4 nomor aksesi XM_002492307.1 (NCBI).
3. Gen SEC4 P. pastoris telah berhasil dikonstruksi dalam vektor ekspresi untuk
P. pastoris (pPIC3.5K-SEC4) dan dikloning dalam E. coli.
4. Transforman P. pastoris [ALP1-SEC4] telah berhasil diperoleh
5. Hasil analisis aktivitas a-amilase menunjukkan ko-ekspresi Sec4p meningkatkan
level sekresi a-amilase 2x lipat dibanding tanpa ko-ekspresi.
7. 2
1.
Saran
Perlu dilakukan penentuan aktivitas -amilase intraselular untuk mengetahui level
-amilase intraselular.
2.
Perlu dilakukan karakterisasi Sec4p intraselular P. pastoris untuk mengetahui
peningkatan konsentrasi Sec4p dalam P. pastoris.
54
DAFTAR PUSTAKA
Brennwald, P. 2000. Reversal of Fortune: Do Rab GTPases Act on the Target
Membrane? The Journal of Cell Biology. 149(1):1–3.
Campbell, N. A., Reece, J. B., & Mitchell, L. G. 2002. Biologi, Edisi Kelima, Jilid I.
Erlangga. Jakarta.
Chavrier, P., Vingron, M., Sander, C., Simons, K. & Zerial, M. 1990. Molecular Cloning
of YPT1/SEC4-Related cDNAs from an Epithelial Cell Line. Molecular And
Cellular Biology. 10(12): 6578-6585
Cregg, J. M. & Madden, K. R. 1988. Development of the metylotrophic yeast Pichia
pastoris, as a host system for the production of foreign protein. Dev. Ind.
Microbiol. 29:33-41.
Cregg, J. M., Barringer, K. J., Hessler, A. Y., & Madden, K. R. 1985. Pichia pastoris as
a host system for tansformation. Mol. Cell. Biol. 5:3376-3385
Fermentas, 2010. Molecular Biology Catalog and Product Application Guide. Canada.
Gaffar, S. 2011. Pengaruh Kombinasi Manipulasi Genetik terhadap Tingkat Sekresi αamilase S. fibuligera R64 dalam Pichia pastoris. Disertasi Program Pasca Sarjana
Universitas padjadjaran. Bandung.
Gaffar, S. 2010a. Bioteknologi Molekul, Aplikasi dan Teori. Widya Padjadjaran.
Bandung.
Gaffar, S. 2010b. Produksi Protein Rekombinan dalam Sistem Ekspresi Pichia pastoris.
UNPAD PRESS.
Glick, B. R., & Pasternak , J. J. 2003. Molecular biotechnology, principles and
applications of recombinant DNA. ASM press. Washington DC.
Grosshans, B. L., Andreeva, A., Gangar, A., Niessen, S., Yates, J. R., Brennwald, P., &
Novick, P. J. 2006a. The yeast lgl family member Sro7p is an effector of the
secretory Rab GTPase Sec4p. The Journal of Cell Biology. 172(1):55–66.
Grosshans, B. L., Ortiz, D. & Novick, P. J. 2006b. Rabs and their effectors: Achieving
specificity in membrane traffic. PNAS. 103(32):11821–11827.
Grote, E., Carr, C. M. & Novick, P. J. 2000. Ordering the Final Events in Yeast
Exocytosis. The Journal of Cell Biology. 151(2):439–451.
Grote, E. & Novick, P. J. 1999. Promiscuity in Rab–SNARE Interactions. Molecular
Biology of the Cell. 10:4149–4161.
Guo, W., Roth, D., Walch-Solimena, C. & Novick, P. J. 1999. The exocyst is an effector
for Sec4p, targeting secretory vesicles to sites of exocytosis. The EMBO Journal.
18(4):1071–1080.
Invitrogen. 2004. A manual of methods for expresion of recombinant proteins in Pichia
Pastoris. California.
Koolman, J., & Roehm, K. H. 2005. Color Atlas of Biochemistry. Second Edition.
Thieme Stuttgart. New York.
Lipschutz, J. H. & Mostov, K. E. 2002. Exocytosis: The Many Masters of the Exocyst.
Current Biology. 12:R212–R214.
Lodish, H., Berk, A., Matsudaira, P., Kaiser, Krieger, Scott, Zipursky, S. L. & Darnell, J.
2003. Molecular Cell Biology. Fifth edition. W.H.Freeman & Co Ltd.
Madigan, M. T., Martinko, J. M., & Brock, T. D. 2006. Brock Biology of
Microorganisms. 11th Ed. Pearson Prentice Hall. New Jersey.
Oliveira, D.L., Nakayasu, E. S., Joffe, L. S., Guimara˜es, A. J., & Sobreira, T. J. P. 2010.
Characterization of Yeast Extracellular Vesicles: Evidence for the Participation of
55
Different Pathways of Cellular Traffic in Vesicle Biogenesis. PLoS ONE 5(6):
e11113.
Orlando, K. & Guo, W. 2009. Membrane Organization and Dynamics in Cell Polarity.
Biol. 1:a001321.
Romanos, M. A. 1995. Advances in the use of Pichia pastoris for high-level gene
expression. Curr. Opin. Biotechnol. 6:527-533
Rothman, J. E. 1996. The protein machinery of vesicle budding and fusion. Protein
Science. 5:185-194.
Salminen, A. & Novick, P. J. 1989. The Sec15 Protein Responds to the Function of the
GTP Binding Protein, Sec4, to Control Vesicular Traffic in Yeast. The Journal of
Cell Biology. 109:1023-1036.
Shi-Hwei, L., Wei-I, C., Chia-Chin, S., & Chang, M. D. 2004. Improved secretory
production of glucoamylase in Pichia pastoris by combination of genetic
manipulations. Biochemical and Biophysical Research Communications.
326:817–824
Takai, Y., Sasaki, T., & Matozaki, T. 2001. Small GTP-Binding Proteins. Physiological
Reviews. 81:1.
Thomas, G. H. 2009. Intracellular Compartments-Exocytosis, Endocytosis, and the
Lysosome. https://wikispaces.psu.edu/display/230/Intracellular+CompartmentsExocytosis,+Endocytosis, and+the+Lysosome#Intracellular
Compartments-Exocytosis%2CEndocytosis%2CandtheLysosome-Exocytosis
Walworth, N. C., Goud, B., Alisa, K. K. & Novick, P. J. 1989. Mutational analysis of
SEC4 suggests a cyclical mechanism for the regulation of vesicular traffic. The
EMBO Journal. 8(6)1685 – 1693.
56
LAMPIRAN 1
INSTRUMEN PENELITIAN
No. Nama Alat
Kegunaan
1.
Thermocycler
Polymerase Chain Reaction
2.
Automatic DNA sequencer
Sekuensing DNA
3.
Sentrifugasi
Pemisahan
4.
Spektrofotometer
Pengukuran konsentrasi DNA
5.
Elektroforesis DNA
Karakterisasi DNA
6.
SDS-PAGE
Karakterisasi protein
7.
Autoklaf
Sterilisasi
8.
shaker inkubator
Pertumbuhan kultur
9.
Vacuum concentrator
Pemekatan DNA
10.
Water Bath
Inkubasi
11.
Oven inkubator
Pertumbuhan kultur
57
LAMPIRAN 2
EVALUASI CAPAIAN LUARAN KEGIATAN
Ketua
Perguruan Tinggi
Judul
Waktu kegiatan
: Shabarni Gaffar
: Universitas Padjadjaran
: Pengaruh Ko-ekspresi Sec4p Pichia pastoris
Terhadap Tingkat Sekresi -Amilase
Saccharomycopsis fibuligera oleh Pichia pastoris
rekombinan
: Tahun ke 1 dari rencana 2 tahun
Luaran yang direncanakan dan capaian tertulis dalam proposal awal
Artikel jurnal ke-1
Nama jurnal yang dituju impact
factor untuk jurnal, judul artikel
Status naskah
- Draft artikel
- Sudah dikirim ke jurnal
- Sedang ditelaah
- Sedang direvisi
- Revisi sudah dikirim ulang
- Sudah diterima
- Sudah terbit
1. Seminar
2.
3.
4.
5.
Nama Jurnal
Terakreditasi
Nama jurnal
bereputasi
Internasional
Jurnal Natur Indonesia
V
Ekspresi protein faktor
sekresi, Sec4p, dalam
Pichia pastoris dan
pengaruhnya terhadap
tingkat produksi protein
rekombinan oleh Pichia
pastoris.
Shabarni Gaffar, Siti N. Inayah dan Yeni W. Hartati,
Konstruksi vektor ekspresi rekombinan yang
mengandung protein faktor sekresi Pichia pastoris dan
kloning dalam Escherichia coli. Seminar Nasional
Unpak-Unpad, Bogor, 28 Juni 2013. Proceeding sudah
terbit ISBN 978-602-14503-1-4
-
HKI
TGG
Rekayasa social
Pembelajaran/pemberdayaan
masyarakat
6. Buku Ajar
7. Lainnya
JIKA LUARAN YANG DIRENCANAKAN TIDAK
ALASANNYA:
TERCAPAI,
URAIKAN
Bandung, November 2013
Ketua Peneliti
Dr. Shabarni Gaffar, M.Si
58
LAMPIRAN 3
SERTIFIKAT SEMINAR NASIONAL
Hasil penelitian ini telah di seminarkan pasa seminar Nasional, dan proceedingnya sudah
terbit.
59
LAMPIRAN 4
ABSTRAK SEMINAR NASIONAL
60
LAMPIRAN 5
Penentuan Serapan Standar Glukosa
Tabel L1. Penentuan serapan standar glukosa dengan metoda DNS
Absorbansi
Konsentrasi glukosa (mM)
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
4,5
5
5,5
6
6,5
0,9
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
Absorbansi
0,066
0,141
0,178
0,288
0,334
0,392
0,478
0,572
0,612
0,696
0,748
0,825
y = 0,1389x - 0,0766
R² = 0,9971
0
1
2
3
4
5
6
7
Konsentrasi Glukosa (mM)
Gambar L.1 Kurva standar glukosa. 50 μL glukosa dengan berbagai konsentrasi
ditambah 50 μL reagen DNS, dididihkan selama 10 menit, setelah dingin
volume dicukupkan menjadi 1 mL dengan penambahan ddH2O.
Absorbansi diukur pada panjang gelombang 500 nm.
61
LAMPIRAN 6
Penentuan Aktivitas -amilase dengan Metoda DNS
Tabel L.2 Aktivitas P. pastoris [ALP1-68/SEC4]
Jam ke-
A500
[Glukosa]
0
24
48
72
96
120
144
0,06
0,142
0,241
0,286
0,207
0,201
0,191
0,983441
1,573794
2,286537
2,610511
2,041757
1,99856
1,926566
Aktivitas
(U/mL)
196,6883
314,7588
457,3074
522,1022
408,3513
399,712
385,3132
OD600
13,05
19,25
21,75
22,95
19,85
18,41
18,05
Tabel L.3 Aktivitas P. pastoris [ALP1-68]
Jam ke0
24
48
72
96
120
144
A500
0,018
0,052
0,123
0,147
0,118
0,085
0,063
[Glukosa]
0,681066
0,925846
1,437005
1,609791
1,401008
1,163427
1,00504
Aktivitas (U/mL)
136,2131
185,1692
287,401
321,9582
280,2016
232,6854
201,0079
OD600
11,35
13,35
18,55
20,55
18,15
15,65
13,37
Aktivitas
150,612
177,9698
281,6415
314,7588
226,9258
198,1281
192,3686
OD600
10,15
13,1
16,87
19,38
16,15
15,35
14,06
Tabel L.4 Aktivitas P. pastoris [ALP1-78]
Jam ke0
24
48
72
96
120
144
A500
0,028
0,047
0,119
0,142
0,081
0,061
0,057
[Glukosa]
0,75306
0,889849
1,408207
1,573794
1,134629
0,990641
0,961843
Tabel L.5 Aktivitas P. pastoris setelah transformasi [ALP1-78/SEC4]
Jam ke0
24
48
72
96
120
144
A500
0,06
0,114
0,208
0,301
0,276
0,192
0,133
[Glukosa]
0,983441
1,37221
2,048956
2,718503
2,538517
1,933765
1,508999
Aktivitas
196,6883
274,442
409,7912
543,7005
507,7034
386,7531
301,7999
OD600
14,05
16,05
20,9
24,15
22,7
20,1
17,25
62
Contoh Perhitungan Konsentrasi Glukosa
[glukosa]
= Absorbansi + 0,0766
0,1389
= 0,114 + 0,0766
0,1389
= 1,37221 mmol
Perhitungan aktivitas α-amilase:
Aktivitas
=
[glukosa]
10 menit
dengan : [glukosa] =
x 1000 µL x Fp
Venzim
konsentrasi glukosa hasil pemotongan enzim sampel yang
didapatkan dari plot serapan sampel ke dalam kurva baku
glukosa (µmol)
V enzim =
volume enzim yang digunakan dalam reaksi enzimatik (mL)
FP
faktor pengenceran
=
Contoh perhitungan :
Aktivitas (U/mL)
=
[glukosa]
10 menit
x 1000 µL x Fp
Venzim
= 1,37221 x 1000μL x 100
10 menit
50μL
= 274,442 U/mL
63
LAMPIRAN 7
PENENTUAN KADAR PROTEIN
Pembuatan kurva baku
Penentuan kadar protein dilakukan dengan metode Lowry dimana 0,1 mL sampel
ditambah 2,5 mL reagen Cu-Alkalis*. Kemudian divorteks dan dibiarkan selama 10
menit. Setelah 10 menit, campuran reaksi ditambah 0,25 mL reagen Follin-Ciocalteu,
dikocok, didiamkan 30 menit. Absorbansi diukur dengan spektrofotometer pada 750
nm.
Dimana,
Reagen A: 2% Na2CO3 dalam 0,1 N NaOH
Reagen B: 0,5% CuSO4. 5H2O dalam 1% K-Na-Tartrat (garam Rocelle)
*Cu-Alkalis : Campuran Reagen A : Reagen B (50 : 1)
Tabel L.6 Kurva Standar Protein
BSA
(g/mL)
Absorbansi
(750)
0
0,000
25
0,039
50
0,073
75
0,110
100
0,136
125
0,171
150
0,192
200
0,233
300
0,326
64
0,4
y = 0,0011x + 0,02
R² = 0,9843
Absorbansi (750)
0,35
0,3
0,25
0,2
0,15
0,1
0,05
0
0
50
100
150
200
250
300
350
Konsentrasi BSA (μg/mL)
Gambar L.2 Kurva Baku BSA
Contoh Perhitungan Kadar Protein
Dengan menggunakan metode regresi linear diperoleh persamaan garis :
Y = 0,0011X + 0,02
Dimana Y : serapan sampel
X : kadar protein (mg/mL)
Kadar protein(mg/mL) = absorbansi - 0,02
0,0011
= 0,031 – 0,02
0,0011
= 10,00 mg/mL
Uji Kadar protein sampel
Tabel L.7 Kadar protein supernatan P. pastoris [ALP1-68]
Absorbansi (l750)
0,031
0,033
0,034
0,035
0,032
0,031
0,028
Kadar protein (mg/mL)
10,00
11,81
12,72
13,63
10,90
10,00
7,27
65
Tabel L.8 Kadar protein supernatan P. pastoris [ALP1-68/SEC4]
Absorbansi (l750)
0,028
0,031
0,034
0,036
0,033
0,032
0,03
Kadar protein (mg/mL)
7,27
10,00
12,72
14,54
11,81
10,90
9,09
Tabel L.9 Kadar protein supernatan P. pastoris [ALP1-78]
Absorbansi (l750)
0,024
0,028
0,031
0,034
0,032
0,03
0,025
Kadar protein (mg/mL)
3,63
7,27
10,00
12,72
10,90
9,09
4,54
Tabel L.10 Kadar protein supernatan P. pastoris [ALP1-78/SEC4]
Absorbansi (l750)
0,029
0,031
0,032
0,035
0,033
0,03
0,028
Kadar protein (mg/mL)
8,1818
10,00
10,90
13,63
11,81
9,09
7,27
66
LAMPIRAN 8
BIODATA KETUA DAN ANGGOTA PENELITI
KETUA PENELITI:
A. Identitas Diri
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Nama Lengkap (dengan
gelar)
Jabatan Fungsional
Jabatan Struktural
NIP/NIK/ Identitaslain
NIDN
Tempat dan tanggal lahir
Alamat Rumah
8.
9.
Nomor Telepon/ Faks/ Hp
Alamat Kantor
10.
11.
12.
Nomor Telepon/ Faks
Alamat e-mail
Lulusan yang telah
dihasilkan
13.
Mata kuliah yang diampu
Dr. Shabarni Gaffar, M.Si
(Perempuan)
Asisten Ahli
19710425 200501 2 001
00225047105
Batang Buo, 25 April 1971
Komp. Anggrek Residence B12A, Jl Rumah
Sakit, Ujung Berung, Bandung.
081573019025
Jl. Raya Bandung-Sumedang Km 21 Jatinangor,
45363
022-7794391/ 022-7794391
[email protected]
S1 = 18 orang
S2 = 0
S3 = 0
1. Biokimia I
2. Biokimia II
3. Bioteknologi
4. Teknik Penelitian Biokimia
5. Bioinformatika
B. Riwayat Pendidikan
Nama Perguruan
Tinggi
Bidang Ilmu
Tahun Masuk-Lulus
JudulSkripsi/Thesis/
Disertasi
Nama Pembimbing/
Promotor
S-1
Unand
S-2
ITB
S-3
Unpad
Kimia
1990-1995
Analisis parameter
pembentuk kerak
serta kualitas air
untuk injeksi uap di
stasiun pengumpul
pusat I, III dan V,
PT. Caltex Pacific
Indonesia,Duri.
Dr. Admin Alief
Biokimia
1996-1998
Varian normal
fragmen 0,4 kB
daerah D-loop
DNA mitokondria
manusia Indonesia
Biokimia
2006-2011
Pengaruh kombinasi
manipulasi genetik
terhadap tingkat
sekresi -amilase S.
fibuligera R64 dalam
Pichia pastoris
Dr. Achmad
Saifuddin Noer
Prof. O. Suprijana
Prof. Soetijoso
Soemitro
Dr. Dessy Natalia
Dr. Toto Subroto
67
C. Pengalaman Penelitian Dalam 5 Tahun Terakhir
No
Tahun
Judul Penelitian
1.
2007
2.
2008
3.
2009
5.
2010
6.
2011
Peningkatan sekresi α-amilase melalui
manipulasi peptida sinyal dalam Pichia
pastoris
Produksi -amilase S. fibuligera dengan
Peptida Sinyal Termodifikasi Dalam P.
pastoris
Penambahan faktor pelipatan protein
(PDI1) untuk meningkatkan sekresi αamilase dalam Pichia pastoris
Koekspresi Protein Disulfida Isomerase
(PDI1) untuk meningkatkan sekresi αamilase dalam Pichia pastoris
Koekspresi Protein Disulfida Isomerase
(PDI1) untuk meningkatkan sekresi αamilase dalam Pichia pastoris
Pendanaan
Sumber
Jumlah (Juta
Rp)
PHB Dikti
41,(ketua)
Reaserch Grant
IMHERE
(ketua)
PHB Dikti
Tahun 1
(ketua)
PHB Dikti
Tahun 2
(ketua)
PHB Dikti
Tahun 3
(ketua)
30,-
22,5,-
35,-
35,5,-
D. Pengalaman Pengabdian Kepada Masyarakat Dalam 5 Tahun Terakhir
Pendanaan
No.
1
Tahun
2008
Judul Pengabdian Kepada Masyarakat
Sumber
Pembinaan kreativitas melalui peningkatan budaya
minat baca dalam sarana dan prasarana taman
bacaan kampung Rancakemit, kecamatan Solokan
Jeruk, Kabupaten Bandung
LPPM
Unpad
Jml (Juta Rp)
5,-
E. Pengalaman Penulisan Artikel Ilmiah Dalam Jurnal Dalam 5 Tahun Terakhir
No.
Judul Artikel Ilmiah
1
Phylogenetics analysis of marine and coastal species
using 18S rRNA sequence
Deteksi urutan pendek DNA Salmonella Typhi
berdasarkan sinyal guanin target secara voltammetri
Pengaruh konsentrasi penginduksi metanol serta
sumber karbon sorbitol dan manitol terhadap
produksi -amilase Saccharomycopsis fibuligera
R64 dalam Pichia pastoris.
2
3
Volume/
Nomor/Tahun
Volume 11,
no.2, 2009
Volume 11,
no.3, 2009
Volume 5 No.3,
2012
Nama Jurnal
Bionatura
Bionatura
Jurnal
Kimia
Terapan
Indonesia
F. Pengalaman Penyampaian Makalah Secara Oral Pada Pertemuan / Seminar
Ilmiah Dalam 5 Tahun Terakhir
1
Nama Pertemuan Ilmiah
/ Seminar
International Seminat on
Chemistry
Judul Artikel Ilmiah
Signal Peptide Modification of -
Waktu dan
Tempat
November 2008,
Kimia Unpad,
68
2
Seminar hasil penelitian
unggulan Unpad
kelompok Ilmu Alam
3
Seminar nasional Unpakunpad
amylase Gene (ALPI) and
construction of pPICZA-MSALPI
plasmid for improving secretory
production of a-amilase in Pichia
pastoris
Ekspresi dan sekresi -amilase
Saccharomycopsis fibuligera R64
dalam Pichia pastoris rekombinan
menggunakan dua jenis peptida
sinyal
Konstruksi vektor ekspresi
rekombinan yang mengandung
protein faktor sekresi Pichia pastoris
dan kloning
dalam Escherichia coli
Bandung
22 Oktober 2010,
Unpad, Bandung
28 Juni 2013,
Universitas
Pakuan, Bogor
G. Pengalaman Penulisan Buku dalam 5 Tahun Terakhir
No
Judul Buku
1
Produksi protein rekombinan dalam
sistem ekspresi P. pastoris (ISBN 978602-8743-23-5)
Bioteknologi molekul, konsep dan
aplikasi. ISBN: 978-602-8323-46-8.
2
2010
Jumlah
Halaman
176
2010
93
Tahun
Penerbit
Unpad Press
Widya
Padjadjaran
H. Pengalaman Perolehan HKI Dalam 5 – 10 Tahun Terakhir
No.
Judul/Tema HKI
Tahun
Jenis
1
Produksi protein rekombinan dalam sistem ekspresi
P. pastoris (ISBN 978-602-8743-23-5)
2013
Buku
Nomor P/ID
2
Semua data yang saya isikan dan tercantum dalam biodata ini adalah benar dan
dapat dipertanggungjawabkan secara hukum. Apabila di kemudian hari ternyata
dijumpai ketidaksesuaian dengna kenyataan, saya sanggup menerima risikonya.
Demikian biodata ini saya buat dengan sebenarnya untuk memenuhi salah satu
persyaratan dalam pengajuan Penelitian Hibah Bersaing.
Bandung, November 2013
Pengusul,
SHABARNI GAFFAR
69
Anggota Peneliti :
A. Identitas Diri
1.
2.
3.
Nama Lengkap (dengan gelar)
Jabatan Fungsional
Jabatan Struktural
4.
5.
6.
7.
8.
9.
NIP/NIK/ Identitaslain
NIDN
Tempat dan tanggal lahir
Alamat Rumah
Nomor Telepon/ Faks/ Hp
Alamat Kantor
10
11.
12.
Nomor Telepon/ Faks
Alamat e-mail
Lulusan yang telah dihasilkan
13
Mata kuliah yang diampu
Dr. Yeni Wahyuni Hartati
(Perempuan)
Lektor
Koordinator dan Kepala Laboratorium Kimia
Dasar
19710924 199802 2 001
0024097101
Garut, 24 September 1971
Jl. Merkuri Utara No. 8, Margahayu Raya Bandung
022-7561080/ - / 08122132349
Jl. Raya Bandung-Sumedang Km 21 Jatinangor,
45363
022-7794391/ 022-7794391
[email protected]
S1 = 7 orang
S2 = 1 orang
S3 = 1. Kimia dasar
2. Analisis kimia
3. Teknik pengukuran Kimia
4. Kapita Selekta Kimia Analitik
5. Analisis Instrumentasi dan Biosensor
B. Riwayat Pendidikan
Nama Perguruan
Tinggi
Bidang Ilmu
Tahun Masuk-Lulus
JudulSkripsi/Thesis/
Disertasi
Nama Pembimbing/
Promotor
S-1
Universitas
Padjadjaran
Kimia
1990-1995
Penentuan Rotenon
dalam Biji Tephrosia
vogelii secara
Kromatografi Lapis
Tipis -Densitometri
S-2
ITB
Prof. Dr. Ir.
Roekmiati
Tjokronegoro
 Prof. Dr.
Akhmaloka,
 Dr. Muliawati
Sindumartha
Biokimia
1996-1999
Studi Struktur
Fungsi Gen Sup-45
Saccharomyces
cerevisiae Sensitif
Paromomisin
S-3
Universitas
Padjadjaran
Kimia Analisis
2005-2009
Biosensor
Voltammetri Untuk
Penentuan Urutan
Spesifik dan Mutasi
Basa Tunggal pada
fragmen DNA
 Prof. Dr. Muljadji
Agma,
 Prof. Dr. Siti
Rochani,
 Prof. Dr. Husein
H. Bahti
70
C. Pengalaman Penelitian Dalam 5 Tahun Terakhir
No
1
Tahun
2011
Judul Penelitian
Pengembangan Biosensor DNA Tanpa
Indikator Eksternal untuk Deteksi
Bakteri Patogen dalam Sampel Darah
(Tahun I)
2
2009-2010
Pengembangan Biosensor DNA Tanpa
Indikator Eksternal untuk Deteksi
Mutasi Titik (Point Mutation) DNA
Mitokondria pada Pasien Diabetes
Mellitus Tipe 2
3
2008-2009
Studi Deteksi Urutan Spesifik DNA dan
Mutasi Basa Tunggal pada Urutan DNA
secara Biosensor DNA Voltammetri
mengggunakan Elektrode Grafit
4
2007
Isolasi dan karakterisasi gen pengode
fruktosil transferase dari bakteri asam
laktat susu fermentasi di Kabupaten
Garut.
Pendanaan
Jumlah (Juta
Sumber
Rp)
Hibah
37.5
Bersaing
(Ketua)
Hibah
Bersaing
(Ketua)
50 +45
Hibah
Penelitian
Doktor,
DIKTI
(Ketua)
DIPA Unpad
(Ketua)
32,5
5
D. Pengalaman Pengabdian Kepada Masyarakat Dalam 5 Tahun Terakhir
Pendanaan
No.
1
Tahun
2008
Judul Pengabdian Kepada Masyarakat
Sumber
Sosialisasi Pembuatan Sabun Mandi Cair Dengan
Lendir Lidah Buaya (Aloe vera Linn)
BLU
Unpad
Jml (Juta Rp)
3,-
E. Pengalaman Penulisan Artikel Ilmiah Dalam Jurnal Dalam 5 Tahun Terakhir
No.
1
Judul Artikel Ilmiah
Deteksi Urutan Pendek DNA Salmonella Typhi
Berdasarkan Sinyal Guanin Target Secara
Voltammetri
Volume/
Nomor/Thn
Vol 11 No 3,
November
2009
Nama Jurnal
Bionatura, Unpad
F. Pengalaman Penyampaian Makalah Secara Oral Pada Pertemuan / Seminar
Ilmiah Dalam 5 Tahun Terakhir
No
1
Nama Pertemuan
Ilmiah / Seminar
Seminar Nasional XIII
Jaringan Kerjasama
Kimia Indonesia,
Yogyakarta, 15 Juli
2010
Judul Artikel Ilmiah
Penentuan Kandungan Basa Guanin dan
Adenin dalam Urutan DNA secara
Voltammetri Menggunakan Elektrode Grafit
Pensil
Waktu dan
Tempat
2010,
Yogyakarta
71
2
International Seminar
on Chemistry, 2008
UNPAD
Electrochemical DNA hybridization sensors
for sequences recognition on graphite
electrodes
2008, Unpad
3
The second
International
Conference on
Mathematics and
Natural Sciences
1st Regional
2008, ITB
Conference on
Biosensor and
Biodiagnostics 2008,
Kuala Lumpur,
Seminar
MalaysiaNasional
Himpunan Kimia
Indonesia SNHKI
2008
Seminar Nasional
Himpunan Kimia
Indonesia SNHKI
2007
Electrochemical DNA Biosensor for the
Detection of Short DNA Sequences Related
to the Salmonella typhi
2008, ITB
Single Base Mismatch Detection on the
mtDNA A3243G Mutattion Using DNA
Biosensor Based on Meldola’s Blue as the
Hybridization Indicator
2008, Kuala
Lumpur
Deteksi Hibridisasi DNA Secara
Elektrokimia Pada Elektrode Pensil Grafit
Dengan Interkalator Redoks-aktif Meldola’s
Blue
2008,
Denpasar
4
5
7
2007, Jakarta
Biosensor Elektrokimia untuk Deteksi
Urutan DNA Tanpa Indikator Hibridisasi
G. Pengalaman Penulisan Buku dalam 5 Tahun Terakhir
No
1
Judul Buku
Tahun
Biosensor Elektrokimia Untuk Deteksi
Urutan Spesifik DNA
ISBN 978-979-3985-84-8
2010
Jumlah
Halaman
158
Penerbit
Unpad Press
H. Pengalaman Perolehan HKI Dalam 5 - 10 Tahun Terakhir
–
No.
Judul/Tema HKI
Tahun
Jenis
Nomor
P/ID
1
Semua data yang saya isikan dan tercantum dalam biodata ini adalah benar dan
dapat dipertanggungjawabkan secara hukum. Apabila di kemudian hari ternyata
dijumpai ketidaksesuaian dengna kenyataan, saya sanggup menerima risikonya.
Demikian biodata ini saya buat dengan sebenarnya untuk memenuhi salah satu
persyaratan dalam pengajuan Penelitian Hibah Bersaing.
Bandung, November 2013
Pengusul,
YENI WAHYUNI HARTATI
72
Download