Optimasi Isolasi dan Amplifikasi ITS DNA Ribosomal Fungi

Prosiding Semirata FMIPA Universitas Lampung, 2013
Optimasi Isolasi dan Amplifikasi ITS DNA Ribosomal Fungi
Karbolitik Isolat Zona Inti Cagar Biosfer Giam Siak KecilBukit Batu
Titania Tjandrawati Nugroho1), Evariati Rambe1), Arfa Dewi1), Reni M. Fitri1),
Harni Sepryani1), Fajar Restuhadi2), Yuli Haryani1)
1)Jurusan Kimia, FMIPA, Universitas Riau; 2)Jurusan Agroteknologi, FAPERTA,
Universitas Riau, Jln. Raya Soebrantaas Km 12,5 , Pekanbaru 28293.
[email protected]; [email protected]
Abstrak. LBKURCC20, LBKURCC21, LBKURCC22, LBKURCC27, LBKURCC28,
LBKURCC29, LBKURCC30, LBKURCC34 merupakan fungi karbolitik koleksi
laboratorium Biokimia FMIPA Universitas Riau. Fungi-fungi tersebut telah berhasil diisolasi
dan dimurnikan dari tanah zona inti hutan cagar biosfer Giam Siak Kecil-Bukit Batu Riau,
menggunakan media selektif penghasil karbohidrase tertentu. Identifikasi secara morfologi
isolat-isolat tersebut telah dilakukan, tetapi masih perlu dilakukan analisis filogenetik
molekuler untuk menentukan hubungan kekerabatan hingga tingkat spesies yang lebih tepat.
Hal ini dikarenakan identifikasi morfologi fungi secara tepat baru dapat dilaksanakan hingga
tingkat genus. Sebelum dapat dilakukan analisis filogenetik molekuler berdasarkan sekeuens
DNA ribosomal (rDNA) pada daerah ITS (Internal Transcribed Spacer region), terlebih
dahulu harus dilakukan optimasi isolasi DNA dan amplifikasi ITS rDNA tersebut. Optimasi
ini perlu dilakukan, supaya diperoleh produk amplifikasi PCR ITS rDNA yang cukup baik,
untuk menghasilkan sekuens DNA yang optimal untuk analisis filogenetik. Isolasi DNA
kromosomal dilakukan menggunakan kit Wizard Genomic ex Promega Co. (Madison, USA)
dari miselia kultur dengan umur bervariasi. Keberhasilan isolasi dan amplifikasi DNA
dengan PCR bergantung pada konsentrasi isolat DNA templat yang cukup, primer, dan
temperatur annealling. Hasil penelitian menunjukkan bahwa masing-masing isolat DNA
fungi yang berhasil diisolasi dengan baik berasal dari umur miselia kultur yang bervariasi
mulai dari 1 hingga 3 hari, yaitu sebelum timbul spora, tetapi dalam jumlah miselia yang
cukup. Primer untuk amplifikasi ITS rDNA terbaik adalah pasangan primer ITS-4 dan ITS-5,
kecuali untuk Penicillium sp. LBKURCC34. Temperatur annealing bervariasi bergantung
pada galur dan pasangan primernya, tetapi berada pada rentang antara 44oC s/d 49oC.
Kata Kunci. ITS rDNA, Trichoderma, Penicillium.
PENDAHULUAN
Trichoderma dan Penicillium merupakan
fungi filamen dengan anggota spesies yang
memiliki potensi bioteknologi yang tinggi.
Hal ini karena kemampuan berbagai
spesiesnya untuk menghasilkan enzimenzim
industri,
maupun
untuk
kemampuannya menghasilkan berbagai
senyawa bioaktif [1-3].
Usaha bioprospecting untuk mengisolasi galur-galur
baru Trichoderma dan Penicillium terus
dilakukan, karena kemampuan yang sangat
beragam, baik dari segi kwantitas maupun
sifat enzim yang dihasilkan. Salah satu
kawasan yang potensial untuk menemukan
galur atau species baru Trichoderma dan
Penicillium penghasil enzim karbohidrase
tinggi adalah tanah hutan gambut yang kaya
selulosa dan sisa-sisa serangga [4,5]. Di
antara hutan gambut yang belum banyak
dieksplorasi adalah hutan gambut zona inti
cagar biosfer Giam Siak Kecil-Bukit Batu
(GSKBB) di Riau [6]. Dalam rangka
penemuan
galur
lokal
Indonesia
Trichoderma dan Penicillium penghasil
Semirata 2013 FMIPA Unila |407
Titania Tjandrawati Nugroho dkk: Optimasi Isolasi dan Amplifikasi ITS DNA Ribosomal
Fungi Karbolitik Isolat Zona Inti Cagar Biosfer Giam Siak Kecil-Bukit Batu
karbohidrase tinggi, telah diisolasi 8 isolat
fungi dari tanah hutan gambut primer dan
sekunder di zona inti cagar biosfer Giam
Siak Kecil-Bukit Batu, Riau. Kedelapan
isolat tersebut merupakan fungi karbolitik
pemecah selulosa atau kitin. Dua isolat
telah diidentifikasi secara morfologi sebagai
Trichoderma spp. (LBKURCC22 dan 28),
sedangkan sisanya merupakan spesiesspesies Penicillium (LBKURCC20, 21, 27,
29, 30 dan 34). Identifikasi secara
morfologi baru dapat menentukan genus
dari isolat-isolat tersebut. Untuk penentuan
spesies, diperlukan identifikasi molekuler.
Salah satu cara identifikasi spesies fungi
secara molekuler adalah menggunakan
sekuens DNA ribosomal (rDNA) pada
daerah ITS (Internal Transcribed Spacer
region). Daerah ITS rDNA yang baik untuk
diagnostik identifikasi spesies dan analisis
filogenetik adalah daerah ITS-1 dan ITS-2
yang bersama-sama mengapit daerah 5.8S
rDNA fungi.
Sebelum dapat dilakukan analisis
filogenetik molekuler berdasarkan sekeuens
DNA ribosomal (rDNA) pada daerah ITS
(Internal Transcribed Spacer), terlebih
dahulu harus dilakukan optimasi isolasi
DNA dan amplifikasi ITS rDNA tersebut.
Optimasi ini perlu dilakukan, supaya
diperoleh produk amplifikasi Polymerase
Chain Reaction (PCR) ITS rDNA yang
cukup baik, untuk menghasilkan sekuens
DNA yang baik untuk analisis filogenetik.
Keberhasilan isolasi dan amplifikasi DNA
dengan PCR bergantung pada konsentrasi
isolat DNA templat yang cukup, primer,
dan temperatur annealing.
Terdapat
beberapa primer untuk ITS rDNA, yaitu 2
pasang yang mencakup keseluruhan daerah
ITS-1, ITS-2 dan 5,8S rDNA, dan masingmasing satu pasang primer yang mencakup
hanya daerah ITS-1 atau ITS-2 [8]. Untuk
keberhasilan identifikasi secara molekuler
menggunakan
sekuens
ITS
rDNA,
diperlukan
hasil
amplifikasi
yang
setidaknya memungkinkan sekuensing ITS1 dan ITS-2 dari rDNA.
Pemilihan
408|Semirata 2013 FMIPA Unila
pasangan yang tepat dengan kondisi
temperatur
annealing
akan
sangat
mempengaruhi keberhasilan PCR. Makalah
ini memaparkan hasil optimasi isolasi DNA
menggunakan
Wizard®
Genomic
Purification kit, yang bergantung pada
umur kultur fungi.
Makalah ini juga
membahas keberhasilan amplifikasi ITS
rDNA dari segi pemilihan pasangan primer
dan temperatur annealing PCR.
METODE PENELITIAN
Fungi yang digunakan untuk penelitian
ini merupakan isolat fungi penghasil
selulase dan kitinase dari cagar biosfer
Giam Siak Kecil-Bukit Batu, Riau dan
dikoleksi di Laboratorium Biokimia,
FMIPA, Universitas Riau, dengan kodekode galur LBKURCC20, LBKURCC21,
LBKURCC22,
LBKURCC27,
LBKURCC28,
LBKURCC29,
LBKURCC30, LBKURCC34.
Kultur fungi dipelihara pada media PDA
dengan variasi waktu panen. Pada umur
kultur tertentu, miselia dipanen dari media
agar, dan DNA diekstraksi dari 100 mg
miselia menggunakan Wizard® Genomic
Purification kit (Promega Cat. No. A1120)
dengan
memecahkan
dinding
sel
menggunakan enzim litikase Artrhobacter
luteus (SIGMA-Aldrich, Cat. No. L2524).
PCR dilakukan menggunakan Thermal
Cycler Techne TC-312 Amplifikasi
digunakan dengan pasangan-pasangan
primer sesuai deskripsi [8], yaitu untuk
primer forward digunakan primer-primer
ITS1, ITS3 atau ITS5, sedangkan untuk
primer-primer reverse digunakan primer
ITS2 atau ITS4. Amplifikasi PCR
dilakukan dalam volume 50 µL, yang
mengandung 3 µL templat DNA, masingmasing primer 0,4 µM, 200 µM dNTP, dan
2,5 U GoTaq™ Flexi DN Polymerase
(Promega Cat. No. M8291) dalam bufer
PCR
menggunakan
MgCl2
hingga
konsentrasi akhir 1,5 mM. PCR dilakukan
dengan hot start 5 menit pada 95oC, diikuti
Prosiding Semirata FMIPA Universitas Lampung, 2013
35 siklus: denaturasi 1,5 menit pada 94oC,
annealing 1 menit pada variasi temperatur
44oC s/d 49oC, dan pemanjangan rantai
selama 3 menit pada temperatur 72oC.
Setelah 35 siklus, dilakukan reaksi
pemanjangan rantai akhir selama 5 menit.
Hasil PCR dianalisis secara elektroforesis
dengan gel agarosa 1,2% (berat/volume)
dalam bufer 1xTAE, diwarnai dengan
Etidium Bromida, dan difoto dengan
kamera digital SONY DSC-W80. Ukuran
fragmen
ditentukan
dengan
membandingkan terhadap standar1 Kb
Ladder (Promega Cat. No. G571A).
HASIL DAN PEMBAHASAN
Isolasi DNA kromosomal dari sel fungi
relatif mudah dilakukan menggunakan
Wizard® Genomic Purification kit, dan
enzim Litikase untuk memecahkan dinding
sel fungi. Akan tetapi umur kultur fungi
pada media PDA sangat menentukan
keberhasilan isolasi DNA kromosomal.
Hal ini terlihat dari variasi umur kultur
berbagai galur isolat fungi zona inti tanah
hutan cagar biosfer GSKBB yang dapat
memberikan hasil isolasi DNA kromosomal
yang baik (Tabel 1). Untuk galur-galur
yang pertumbuhannya sangat cepat, dan
cepat membentuk spora, maka umur kultur
optimum untuk isolasi DNA kromosomal
fungi adalah 1 (satu) hari, seperti yang
ditunjukkan Penicillium sp. LBKURCC27.
Untuk galur yang pertumbuhannya lambat,
maka umur kultur optimum untuk isolasi
DNA kromosomal fungi adalah 3 (tiga)
hari, seperti yang ditunjukkan Penicillium
sp. LBKURCC20 dan Trichoderma sp.
LBKURCC22. Analisis morfologi koloni
menunjukkan bahwa apabila spora telah
tumbuh subur (Gambar 1B.), maka sulit
sekali memecahkan dinding sel fungi. Hal
ini akan menyulitkan isolasi DNA
kromosomal fungi, dan konsentrasi DNA
yang diperoleh tidak cukup untuk
memberikan pita pada elektroforesis.
Sebaliknya, apabila pertumbuhan kultur
belum cukup banyak, maka jumlah miselia
A)
B)
GAMBAR 23. Kultur Penicillium sp. LBKURCC20
pada media PDA. Panel A) Umur kultur 3 hari,
dengan miselia putih tanpa spora; B) Umur kultur 4
hari, dengan miselia telah dipenuhi spora hijau.
yang diperoleh akan kurang untuk isolasi
DNA optimal. Morfologi koloni yang
optimal untuk isolasi DNA ditunjukkan
oleh Gambar 1A, yaitu morfologi koloni
kultur Penicillium sp. LBKURCC20
berumur 3 hari yang belum ditumbuhi
spora, tetapi cukup padat ditumbuhi miselia
yang terlihat sebagai benang-benang putih.
Gambar 1B adalah morfologi koloni kultur
Penicillium sp. LBKURCC20 berumur 4
hari yang telah ditumbuhi banyak spora
hijau.
Hasil optimasi PCR untuk amplifikasi
daerah ITS rDNA fungi isolat GSKBB
dengan
berbagai
pasangan
primer
ditunjukkan Tabel 2. DNA ribosomal dari
semua kultur fungi isolat dalam penelitian
ini tidak berhasil diamplifikasi dengan
pasangan
primer
ITS1-ITS4
(tidak
ditunjukkan dalam tabel). DNA ribosomal
semua
kultur,
kecuali
Penicillium
LBKURCC34 berhasil diamplifikasi secara
PCR menggunakan pasangan primer ITS5ITS4, pada suhu annealing antara 44oC s/d
47oC. Berarti dapat disimpulkan bahwa
primer ITS1 kurang homolog dengan
sekuens pada bagian 18S rDNA yang
mengawali ITS-1 dari DNA ribosomal
semua fungi isolat hutan zona inti GSKBB.
Rata-rata rDNA yang dapat diamplifikasi
Semirata 2013 FMIPA Unila |409
Titania Tjandrawati Nugroho dkk: Optimasi Isolasi dan Amplifikasi ITS DNA Ribosomal
Fungi Karbolitik Isolat Zona Inti Cagar Biosfer Giam Siak Kecil-Bukit Batu
dengan pasangan primer ITS5-ITS4 adalah
624 s/d 664 pb. Ini sesuai dengan daerah
yang mencakup sebagian 18S rDNA, ITS-1,
5,8S rDNA, ITS-2 dan sebagian dari 28S
rDNA fungi pada umumnya.
Apabila rDNA fungi isolat GSKBB
berhasil
diamplifikasi
menggunakan
pasangan
primer
ITS5-ITS4,
yang
merupakan primer-primer eksternal rDNA
fungi, maka tidak perlu lagi dilakukan
amplifikasi PCR menggunakan pasangan
primer ITS5-ITS2 dan ITS3-ITS4, karena
primer-primer ITS2 dan ITS3 merupakan
primer-primer internal rDNA fungi. Oleh
karena itu, amplifikasi rDNA menggunakan
pasangan primer ITS5-ITS2 dan ITS3-ITS4
hanya dilakukan untuk Penicillium sp.
LBKURCC34 dan Trichoderma sp.
LBKURCC22, yang semula pada suhu
45oC tidak memberikan produk PCR
dengan primer ITS5-ITS4. Meskipun suhu
annealing diturunkan hingga 44oC, produk
PCR primer ITS5-ITS4 untuk rDNA
Penicillium sp. LBKURCC34 tetap tidak
diperoleh. Hal berbeda ditemukan untuk
Trichoderma sp. LBKURCC22 ketika suhu
annealing diturunkan ke 44oC. Pada suhu
annealing 44oC, dapat diperoleh produk
PCR untuk rDNA Trichoderma sp.
LBKURCC22, menggunakan pasangan
primer ITS5-ITS4, dengan ukuran 652 pb.
Ukuran produk PCR amplifikasi rDNA
Trichoderma
sp.
LBKURCC22
menggunakan ITS5-ITS2 berhasil pada
suhu annealing 45oC dengan ukuran produk
yang spesifik untuk daerah yang mencakup
sebagian 18S rDNA, ITS-1, dan sebagian
5,8S rDNA, yaitu 384 pb.
Amplifikasi rDNA Penicillium sp.
LBKURCC34 berhasil dilakukan dengan
baik menggunakan pasangan primer ITS3ITS4, pada suhu annealing 44oC, dengan
produk spesifik berukuran 270 pb, yang
mencakup daerah 5,8S rDNA, ITS-2 dan
sebagian 28S rDNA. Meskipun produk
PCR rDNA Penicillium sp. LBKURCC34
dapat diperoleh untuk pasangan primer
ITS5-ITS2 pada suhu annealing 47OC
dengan ukuran spesifik 278 pb, terdapat dua
produk PCR non-spesifik, dengan ukuran
603 pb dan 502 pb. Kedua produk nonspesifik ini tidak dapat dihilangkan,
meskipun suhu annealing dinaikkan hingga
49oC. Meskipun demikian untuk keperluan
sekuensing, kedua produk non-spesifik
tidak akan mengganggu, selama dilakukan
proses pemurnian pita spesifik 278 pb.
Pemurnian pita spesifik 278 pb dapat
dilakukan, dengan memisahkan produkproduk PCR ITS5-ITS2 Penicillium sp.
LBKURCC34 secara elektroforesis, dan
memotong keluar agar pita 278 pb. Produk
PCR 278 pb ini kemudian akan dapat
dielusi keluar potongan agar sehingga
akhirnya diperoleh produk PCR ITS5-ITS2
rDNA yang spesifik dan murni.
TABEL 5. Umur kultur optimum untuk isolasi DNA
kromosomal fungi.
Spesies:
Galur:
Umur Kultur
(hari)
Penicillium sp.
LBKURCC20
3
Penicillium sp.
LBKURCC21
2
Trichoderma
LBKURCC22
3
sp.
Penicillium sp.
LBKURCC27
1
Trichoderma
LBKURCC28
1
sp.
Penicillium sp.
LBKURCC29
3
Penicillium sp.
LBKURCC30
3
Penicillium sp.
LBKURCC34
2.5
TABEL 6. Hasil optimasi PCR amplifikasi daerah ITS rDNA fungi isolat GSK-BB dengan berbagai
pasangan primer
Suhu
Ukuran produk PCR dari pasangan primer:
Spesies & Galur
annealing
ITS5-ITS4
ITS5-ITS2
ITS3-ITS4
(oC)
o
Penicillium sp. LBKURCC20
45 C
664 pb
t.d.
t.d.
Penicillium sp. LBKURCC21
45oC
658 pb
t.d.
t.d.
Trichoderma sp. LBKURCC22
45oC
t.d.
384 pb
t.d.
410|Semirata 2013 FMIPA Unila
Prosiding Semirata FMIPA Universitas Lampung, 2013
Penicillium sp. LBKURCC27
Trichoderma sp. LBKURCC28
44oC
45oC
47oC
45oC
47oC
45oC
47oC
47oC
652 pb
604 pb
604 pb
702 pb
624 pb
624 pb
624 pb
654 pb
t.a.
t.d.
t.d.
t.d.
t.d.
270 pb
t.d.
t.d.
t.d.
t.d.
t.d.
t.d.
t.d.
t.d.
t.d.
603 pb
t.d.
502 pb
278 pb
44oC
t.a.
t.d.
270 pb
49oC
t.d.
603 pb
t.d.
502 pb
278 pb
Keterangan: t.d. = tidak dilakukan PCR dengan pasangan primer tersebut. t.a. = tidak ada produk hasil PCR
dengan pasangan primer tersebut.
Penicillium sp. LBKURCC29
Penicillium sp. LBKURCC30
Penicillium sp. LBKURCC34
Amplifikasi
rDNA
semua
galur
Trichoderma sp. isolat tanah zona inti
GSKBB memberikan produk PCR dengan
pasangan primer ITS5-ITS4 yang baik
dengan ukuran 624 pb dan 652 pb. Hal ini
konsisten dengan bar code yang telah
diciptakan untuk spesies-spesies dari genus
Trichoderma . Untuk Penicillium sp. juga
diperoleh produk PCR rDNA yang baik
untuk pasangan primer ITS5-ITS4, kecuali
untuk Penicillium sp. LBKURCC34.
Identifikasi spesies dan analisis filogenetik
fungi filamen tidak hanya dapat dilakukan
dengan sekuens-sekuens ITS rDNA, tetapi
dapat dilakukan juga dengan sekuenssekuens tef1, cal1, chit18-5 dan rbp2 [9].
Untuk Penicillium telah juga diciptakan bar
code yang khusus untuknya, dan
kemungkinan dapat memberikan analisis
identifikasi yang lebih tepat [10].
Meskipun demikian, penggunaan sekuens
ITS rDNA merupakan langkah pertama
untuk identifikasi spesies fungi secara
molekuler.
Tentunya semakin banyak
metode dan sekuens yang digunakan untuk
verifikasi spesies, akan semakin baik, tetapi
berarti memerlukan biaya yang lebih tinggi.
KESIMPULAN
DNA kromosomal fungi isolat tanah
zona inti GSKBB yang berhasil diisolasi
dengan baik berasal dari umur miselia
kultur yang bervariasi mulai dari 1 hingga 3
hari, yaitu sebelum timbul spora, tetapi
dalam jumlah miselia yang cukup. Primer
untuk amplifikasi ITS rDNA terbaik adalah
pasangan primer ITS-4 dan ITS-5, kecuali
untuk Penicillium sp. LBKURCC34.
Daerah ITS rDNA Penicillium sp.
LBKURCC34
dapat
diamplifikasi
menggunakan pasangan primer ITS5-ITS2
dan ITS3-ITS4. Temperatur annealing
bervariasi bergantung pada galur dan
pasangan primer yang digunakan, tetapi
berada pada rentang antara 44oC s/d 49oC.
UCAPAN TERIMA KASIH
Penelitian ini dibiayai Dana Hibah Guru
Besar Lembaga Penelitian Universitas Riau
a.n. Titania T. Nugroho, sesuai Surat
Perjanjian Pelaksanaan Hibah Program
Penelitian
Guru
Besar
105/UN.19.2/PL/2012, tanggal 3 April
2012, berdasarkan DIPA Universitas Riau
tahun
2012,
Nomor:
0680/02304.2.16/04/2012
DAFTAR PUSTAKA
Barreiro, C., Martin, J. F., Garcia-Estrada,
C. (2012). Proteomics shows new faces
for the old Penicillin Produces
Penicillium chrysogenum. Journal of
Biomedicine and Biotechnology. Vol.
Semirata 2013 FMIPA Unila |411
Titania Tjandrawati Nugroho dkk: Optimasi Isolasi dan Amplifikasi ITS DNA Ribosomal
Fungi Karbolitik Isolat Zona Inti Cagar Biosfer Giam Siak Kecil-Bukit Batu
2012, Article ID
10.1155/2012/105109.
105109,
doi:
Berrin, J., Navarro, D., Couturier, M.,
Olive, C., Grisel, S., Haon, M., Taussac,
S., Lechat, C., Courtecuisse, R., Favel,
A., Coutinho, P. M., Lesage-Meessen.
(2012). Exploring the natural fungal
biodiversity of tropical and temperate
forests toward improvement of biomass
conversion. Appl. Environ. Microbiol.,
Vol. 78, Issue 18, July 2012 p. 6483 –
6490.
Gal-Hemed, I., Atanasova, L., KomonZelazowska, M. K., Druzhinina, I. S.,
Viterbo, A., Yarden, O. Marine isolates
of Trichoderma spp. As potential
halotolerant agents of biological control
for arid-zone agriculture. (2011). Appl.
Environ. Microbiol., Vol. 77, Issue 15,
August 2011 p. 5100-5109.
Hoyos-Carvajal, L., Orduz, S., & Bissett, J.
(2009). Genetic and
metabolic
biodiversity of Trichoderma from
Colombia and adjacent neotropic
regions.
Fungal
Genetics
and
Biology,Vol. 46, May 2009 p. 615 - 631.
Kubicek, C. P., Komon-Zelazowska, M., &
Druzhinina, I. S. (2008). Fungal genus
Hypocrea/Trichoderma: from barcodes
to biodiversity. J. Zhejiang Univ. Sci. B.,
Vol. 9, Issue 10, October 2008 p. 753 763.
Liu, G., Zhang, L., Wei, X., Zou, G., Qin,
Y., Ma, L., Li, J., Zheng, H., Wang, S.,
412|Semirata 2013 FMIPA Unila
Wang, C., Xun, L., Zhao, G-P., Zhou, Z.,
Qu, Y. (2013). PLOS One, Vol. 8,
February 2013 p. e55185.
Schuster, A., & Schmoll, M. (2010).
Biology
and
biotechnology
of
Trichoderma.
Appl.
Microbiol.
Biotechnol., Vol. 87, May 2010 p. 787799.
Seifert, K. A., Samson, R. A., deWaard, J.
R., Houbraken, J., Levesque, C. A.,
Moncalvo, J-M., Louis-Seize, G.,
Hebert, P. D. N. (2007). Prospects for
fungus identification using CO1 DNA
barcodes, with Penicillium as a test case.
Proc. Nat. Acad. Sci., Vol. 104, Issue
10., March 2007 p. 3901-3906.
Sukara, E., & Purwanto, Y. (2009).
Biosphere reserve: The management of
conservation areas for sustainable
economic development. The 3rd
Humanosphere
Science
School:
Scientific Exploration and Sustainable
Management of Peat and Land
Resources in Giam Siak Kecil-Bukit Batu
Biosphere Reserve, Riau. (pp. 1-20).
Pekanbaru. August 2009.
White, T., Bruns, T., Lee, S., & Taylor, J.
(1990). Amplification and direct
sequencing of fungal ribosomal RNA
genes for phylogenetics. Dalam: M.
Innis, D. Gelfand, J. Sninsky, & T.
White (Eds.), PCR protocols: A guide to
methods and applications (pp. 315-322).
San Diego: Academic Press.