UJI KOEKSISTENSI DUA ISOLAT BAKTERI RESISTEN

UJI KOEKSISTENSI DUA ISOLAT BAKTERI RESISTEN MERKURI DARI KALI MAS
SURABAYA
Putri Yoanna Patangga*, Maya Shovitri1, Aunurohim1
Program Studi Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
Institut Teknologi Sepuluh Nopember Surabaya
ABSTRAK
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui hubungan koeksistensi antara dua isolat bakteri
resisten merkuri dengan kode HgA3, HgS6 dan HgS13 dari Kali Mas Surabaya dengan metode
cakram kertas dan metode perhitungan populasi sel. Tanpa cekaman HgCl2, metode cakram kertas
menunjukkan bahwa isolat bakteri resisten merkuri HgA3 dan HgS13 (kombinasi I) serta HgS13 dan
HgS6 (kombinasi II) tidak berkoeksistensi pada 24 jam masa inkubasi karena terbentuknya zona
bening di sekeliling cakram kertas. Sebaliknya isolat HgS6 dan HgA3 (kombinasi III) menunjukkan
hubungan koeksistensi, karena tidak terbentuk zona bening dan terlihat pertumbuhan bakteri di
sekeliling cakram kertas. Parameter metode perhitungan populasi sel adalah populasi awal dan akhir
masa inkubasi. Hasil dari metode perhitungan populasi menunjukkan bahwa dua isolat bakteri
resisten merkuri pada ketiga kombinasi tidak berkoeksistensi setelah 24 jam masa inkubasi karena
rasio populasi akhirnya tidak seimbang jika dibandingkan rasio populasi awalnya. Dengan cekaman
10 ppm HgCl2, metode perhitungan populasi sel menunjukkan bahwa kedua isolat bakteri pada
kombinasi I (HgA3-HgS13), kombinasi II (HgS13-HgS6) dan kombinasi III (HgS6-HgA3) tidak
berkoeksistensi karena rasio populasi awal dan akhir anggota kombinasi setelah 24 jam masa
inkubasi tidak seimbang yaitu HgA3:HgS13 dari 4:3 menjadi 1:10 ; HgS13:HgS6 dari 3:9 menjadi
10:1 dan HgS6:HgA3 dari 9:4 menjadi 1:3.
Kata kunci: uji koeksistensi, kompetisi, zat antimikroba
ABSTRACT
This study aims to find out the coexistance relationship between two mercury resistant
bacteria isolates (HgA3, HgS13, HgS6) from the Kali Mas Surabaya with paper disc method and
counting population cell method. Parameter paper disk method is the clear zone. Without HgCl2 stres,
the paper disc method showed that isolate HgA3 and HgS13 in combination I are incoexistance after
24 hours incubation because of the clear zone which formed around paper disk. The same result
showed in combination II (HgS13-HgS6). But, isolate HgS6 and HgA3 showed coexistence
relationship because the clear zone isn’t formed and isolates growth around paper disk. Parameter
counting population cell method is the beginning and the end population after incubation. With HgCl 2
stress, counting population cell method showed that two isolates in combination I (HgA3-HgS13),
combination II (HgS13-HgS6) and combination III (HgS6-HgA3) are incoexistence because the
beginning and the end population ratio isolates in combination didn’t balance, HgA3: HgS13 from
4:3 become 1:10 ; HgS13:HGS6 from 3:9 become 10:1 and HgS6:HgA3 from 9:4 become 1:3.
Keywords: coexistence assay, competition, antimicrobial substance
*Corresponding Author Phone : 085733015426
email : [email protected]
1
Alamat sekarang : Prodi Biologi, FMIPA
Institut Teknologi Sepuluh Nopember, Surabaya
I PENDAHULUAN
Secara alami merkuri terdapat di alam
dalam konsentrasi yang kecil yaitu sekitar satu
nano gram per liter (Madigan et al., 1997).
Menurut Peraturan Pemerintah (PP) nomor 82
tahun 2001, konsentrasi merkuri dalam air
adalah < 0,001 ppm. Hal tersebut didukung
juga dengan keputusan Menkes RI no
907/menkes/sk/vii/2002 yang mensyaratkan
bahwa kandungan merkuri yang diperbolehkan
adalah 0.001 mg/l. Merkuri terdiri dari tiga
bentuk yaitu merkuri organik, merkuri
inorganik dan elenmental merkuri. Merkuri
inorganik terdapat dalam bentuk ion Hg2+ dan
ion Hg1+ dimana keduanya bersifat toksik
(Yanuar, 2009) sedangkan elemental merkuri
ion Hg0 bersifat tidak toksik terhadap
lingkungan (Yamaguchi., et al, 2007). Pada
konsentrasi tertentu ion Hg2+ berbahaya bagi
organisme tingkat tinggi dan organisme
tingkat rendah (Madigan et al., 1997).
Menurut Nofiani dan Gusrizal (2004) senyawa
merkuri dalam bentuk ion Hg2+ dapat terikat
pada residu sistein protein atau enzim sehingga
protein atau enzim kehilangan aktivitasnya.
Dari Kali Mas Surabaya yang
terkontaminasi merkuri sebesar 0,105 ppm
telah diperoleh 17 isolat bakteri resisten
merkuri dengan kode HgA3, HgA2, HgS11,
HgS12, HgS6, HgS4, HgS2, HgS10, HgS8,
HgS1, HgS5, HgS7, HgA1, HgA4, HgS14,
HgS3 dan HgS13. Berdasarkan karakter
biokimianya ketujuhbelas isolat tersebut
masuk ke dalam tujuh genus yang berbeda,
yaitu ada kecenderungan masuk ke genus
Providencia,
Neisseria,
Shigella,
Lampropedia, Serratia, Enterobacter dan
Bacillus (Shovitri et al1, 2., 2010, 2011).
Ketujuh belas isolat tersebut secara
individu mampu hidup pada 10 ppm HgCl2
dan mereduksi 43%-75% ion Hg2+ menjadi
ion Hg0 (Shovitri et al1, 2., 2010, 2011). Tetapi
ketika digabungkan, kemampuan isolat bakteri
tersebut menjadi lebih rendah dibandingkan
kemampuan individu, yaitu menjadi 39,45%78,78% (Shovitri et al2., 2011).
Penggabungan tersebut dilakukan
secara acak tiga hingga tujuh isolat
berdasarkan kemampuan reduksi individu
yaitu isolat dengan kemampuan reduksi yang
seimbang dan isolat dengan kemampuan
reduksi yang berbeda. Penurunan kemampuan
tersebut dapat disebabkan beberapa faktor,
yaitu antara lain adanya interaksi yang bersifat
negatif antar isolat bakteri resisten merkuri.
Menurut Atlas & Bartha (1998) kompetisi
dapat terjadi ketika dua populasi atau lebih
menggunakan nutrisi dan ruang pertumbuhan
yang sama.
Penelitian ini bertujuan untuk
mengetahui adanya hubungan koeksistensi
antara dua bakteri resisten merkuri dari Kali
Mas Surabaya dengan memperhatikan faktor
nutrisi, ruang dan jumlah anggota. Hal ini
mengacu pada penelitian Zeidan et al (2010)
yang telah berhasil menggabungkan dua
spesies penghasil gas H 2 Caldicellulosiruptor
sehingga menghasilkan gas H2 yang lebih
tinggi dengan sumber glukosa yang sama.
Menurut Zhang (2003) koeksistensi hanya
terjadi apabila kemampuan kompetisi antar
spesies adalah seimbang. Sebaliknya apabila
tidak seimbang, spesies yang lemah
kemampuan kompetisinya akan tereliminasi
oleh spesies yang kemampuan kompetisinya
lebih tinggi.
Kompetisi
menunjukkan
adanya
interaksi negatif antar dua populasi
mikroorganisme dimana kedua populasi
tersebut akan terpengaruh kehidupan dan
pertumbuhannya. Ketika salah satu populasi
mikroorganisme memproduksi zat antimikroba
untuk menghambat populasi lainnya maka
interaksi antar kedua populasi tersebut disebut
antagonisme (Atlas & Bartha, 1998).
Berdasarkan hal
tersebut,
maka
uji
koeksistensi dapat dilakukan dengan metode
dual plate assay (Basha and Ulaganathan,
2002), metode cross culture (Dhingra and
Sinclair,
1995
dalam
Lwin
and
Rhanamukaarachchi, 2006), metode agar well
difussion (Hassanein et al., 2009) dan metode
cakram kertas (Hatmanti et al., 2009;
Hassanein et al., 2009; Dhingra and Sinclair,
1995 dalam Lwin and Rhanamukaarachchi,
2006).
Metode cakram kertas merupakan
metode yang biasa digunakan untuk menguji
aktivitas antimikroba suatu antibiotik terhadap
mikroorganisme patogen penyebab penyakit.
Metode ini lebih dikenal dengan metode
Kirby-Bauer (Cappucino and Sherman, 2001;
Tortora et al., 2002). Metode cakram kertas
dapat juga dilakukan menggunakan suatu
silinder tidak beralas atau sumuran dan diisi
dengan antibiotik dalam jumlah tertentu,
disebut agar well difussion (Lay, 1994; Boyd,
1995). Kepekaan mikroorganisme patogen
terhadap antibiotik terlihat dari ukuran zona
bening yang terbentuk (Cappucino &
Sherman, 2001).
Dengan mengacu metode tersebut di
atas, uji koeksistensi antara dua isolat bakteri
resisten
merkuri
dilakukan
dengan
memodifikasi metode cakram kertas dimana
umumnya zat yang terkandung dalam cakram
kertas adalah antibiotik namun pada penelitian
ini yang terkandung dalam cakram kertas
adalah inokulum bakteri. Parameter yang
digunakan adalah zona bening (Hatmanti et
al., 2009). Zona bening adalah area bening di
sekeliling cakram kertas sebagai indikasi tidak
adanya atau terhambatnya pertumbuhan
mikroorganisme
akibat
ekskresi
zat
antimikroba oleh kompetitornya (Byod, 1995;
Atlas and Bartha, 1998).
Metode cakram kertas memiliki
kelebihan dan kelemahan. Kelebihannya
adalah mudah dilakukan, tidak memerlukan
peralatan khusus dan relatif murah (Murray,
2007). Sedangkan kelemahannya adalah
ukuran zona bening yang terbentuk tergantung
oleh kondisi inkubasi, inokulum, predifusi dan
preinkubasi serta ketebalan medium (Gillespie,
1994 and Murray, 2007). Apabila keempat
faktor tersebut tidak sesuai maka hasil dari
metode cakram kertas relatif sulit untuk
diintepretasikan (Gillespie, 1994). Selain itu,
metode cakram kertas ini tidak dapat
diaplikasikan pada mikroorganisme yang
pertumbuhannya lambat dan mikroorganisme
yang bersifat anaerob obligat (Byod, 1995).
Koeksistensi antara dua isolat bakteri
resisten merkuri juga dapat diketahui
melalui jumlah sel masing-masing isolat
bakteri sebelum dan sesudah masa
inkubasi pada rentang waktu tertentu.
Menurut Atlas & Bartha (1998) ketika dua
atau lebih populasi mikroorganisme dapat
tumbuh bersama pada satu tempat dan
medium maka akan dihasilkan jumlah sel
yang seimbang antara keduanya sesuai
dengan rasio awal dan akhir masa
inkubasinya. Berdasarkan hal tersebut, uji
koeksistensi juga dapat dilakukan dengan
menghitung populasi kedua isolat pada
awal dan akhir masa inkubasi.
II METODOLOGI
Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian dilakukan pada bulan
Juni 2010 hingga November 2010 di
Laboratorium
Mikrobiologi
dan
Bioteknologi Program Studi Biologi ITS
Surabaya.
Isolat Bakteri
Isolat bakteri adalah bakteri
resisten merkuri dari Kali Mas Surabaya
koleksi Laboratorium Mikrobiologi dan
Bioteknologi Institut Teknologi Sepuluh
Nopember Surabaya yaitu isolat dengan
kode HgA3, HgS6 dan HgS13 (Shovitri et
al1,2., 2010, 2011). Ketiga isolat tersebut
merupakan hasil skrining awal metode
cakram kertas.
Subkultur Isolat Bakteri Resisten
Merkuri
Subkultur
merupakan
proses
pemindahan mikroorganisme dari satu
medium kultur ke medium kultur lainnya
(Harley and Prescott, 2002). Sebelum
isolat bakteri resisten merkuri digunakan
terlebih dahulu dilakukan empat kali
subkultur. Subkultur pertama dilakukan
dengan menggunakan medium nutrient
agar (NA) miring yang mengandung 10
ppm HgCl2 sedangkan subkultur kedua
hingga keempat dilakukan dengan
menggunakan medium NA miring tanpa
HgCl2. Subkultur yang pertama dilakukan
dengan menginokulasikan secara aseptis
tujuh isolat bakteri resisten merkuri dari
stok kultur ke dalam medium nutrient agar
(NA) miring yang mengandung 10 ppm
HgCl2 (BactoTM, Jerman) kemudian
diinkubasikan pada suhu ruang (± 30°C)
hingga semua kultur tumbuh. Setelah
melakukan subkultur yang pertama maka
dilakukan subkultur kedua dengan
mengambil secara aseptis satu ose masingmasing isolat bakteri dari subkultur
pertama kemudian diinkubasi pada suhu
ruang (± 30°C) selama 24 jam. Setelah
melakukan subkultur yang kedua maka
dilakukan subkultur ketiga dengan
mengambil secara aseptis satu ose masingmasing isolat bakteri dari subkultur kedua
kemudian diinkubasi pada suhu ruang (±
30°C) selama 24 jam. Selanjutnya
dilakukan secara
subkultur keempat.
berurutan
hingga
Uji Koeksistensi
Pembuatan Starter Inokulum
Secara aseptis sebanyak satu ose
isolat bakteri resisten merkuri dari
subkultur keempat yang berumur 24 jam
diinokulasikan pada 10 ml medium
nutrient broth (NB) Merck®, Jerman
dalam erlenmeyer 25 ml kemudian diberi
label dan diinkubasi pada suhu ruang (±
30°C) dengan goyangan 100 rpm di atas
shaker (Health, H-M-SR®) selama 24 jam.
Uji Koeksistensi Metode Cakram
Kertas
Uji koeksistensi metode cakram
kertas dilakukan pada tiga kombinasi yaitu
kombinasi I (HgA3-HgS13), kombinasi II
(HgS13-HgS6) dan kombinasi III (HgS6HgA3). Pada metode ini, penanaman salah
satu bakteri anggota kombinasi dalam
cawan Petri dilakukan dengan dua cara
yaitu spread plate dan pour plate. Cara
spread
plate
dilakukan
dengan
menuangkan secara aseptis ±12 ml
medium NA (BactoTM, Jerman) ke dalam
cawan Petri steril dan didiamkan hingga
medium memadat. Setelah memadat,
secara aseptis sebanyak 1 ml starter
inokulum salah satu bakteri dari anggota
kombinasi ditambahkan pada medium NA
yang telah memadat tersebut lalu
disebarkan dengan menggunakan drilgasky
hingga merata. Secara aseptis tiga cakram
kertas steril diameter 6 mm dicelupkan
pada starter inokulum isolat anggota
kombinasi lainnya dan dibiarkan ± 1 menit
kemudian tiga kertas cakram steril tersebut
diambil dengan pinset steril dan diletakkan
di atas permukaan medium. Cawan Petri
diinkubasi dalam inkubator (Memmert,
BE-300®, Jerman) pada suhu 37°C selama
24 jam dan kemudian diamati ada tidaknya
zona bening.
Sedangkan cara pour plate
dilakukan dengan menambahkan secara
aseptis sebanyak 1 ml starter inokulum
bakteri salah satu anggota kombinasi
ditambahkan pada 12 ml medium NA yang
bersuhu ±50°C kemudian dihomogenkan
dengan menggoyang-goyangkan gelas
erlenmeyer. Selanjutnya medium beserta
inokulum bakteri dituangkan ke dalam
cawan Petri steril dan cawan Petri ditutup.
Sambil menunggu medium memadat,
secara aseptis tiga cakram kertas steril
diameter 6 mm dicelupkan pada starter
inokulum isolat anggota kombinasi lainnya
dan dibiarkan ± 1 menit. Setelah medium
NA memadat, tiga kertas cakram steril
tersebut diambil dengan pinset steril dan
diletakkan di atas permukaan medium.
Cawan Petri diinkubasi dalam inkubator
(Memmert, BE-300®, Jerman) pada suhu
37°C selama 24 jam dan kemudian diamati
ada tidaknya zona bening.
Koeksistensi
Metode
Perhitungan
Populasi Sel
Langkah pertama yang dilakukan
adalah menginokulasi secara aseptis satu
ose isolat yang berumur 24 jam ke dalam
100 ml medium nutrient broth (NB)
Merck®, Jerman yang mengandung 10
ppm HgCl2 pada erlenmeyer 250 ml
kemudian diberi label dan diinkubasi pada
suhu ruang (± 30°C) dengan goyangan 100
rpm di atas shaker (Health, H-M-SR®)
selama 24 jam. Jumlah sel tiap isolat
dihitung
dengan
menggunakan
Haemocytometer.
Langkah
selanjutnya
yaitu
penggabungan isolat bakteri resisten
merkuri yang terdiri dari tiga kombinasi
yaitu kombinasi I (HgA3-HgS13),
kombinasi
II
(HgS13-HgS6)
dan
kombinasi III (HgS6-HgA3). Secara
aseptis sebanyak 1 ml masing-masing
anggota kombinasi ditambahkan pada 98
ml ml medium nutrient broth (NB) yang
mengandung 10 ppm HgCl2 Merck®,
Jerman kemudian diberi label dan
diinkubasi pada suhu ruang (± 30°C)
dengan goyangan 100 rpm di atas shaker
(Health, H-M-SR®) selama 24 jam.
Setelah kombinasi bakteri berumur
24 jam maka perhitungan populasi sel
bakteri melalui cara langsung. Cara
langsung dilakukan dengan menghitung
secara langsung pada pengecatan Gram.
Secara aseptis, kombinasi bakteri yang
berumur 24 jam diambil sebanyak 1 ml
kemudian ditambahkan pada 9 ml akuades
steril dan dihomogenkan dengan vortex.
Biakkan yang telah diencerkan tersebut,
secara aseptis diambil dengan ose
kemudian dibuat preparat ulas sebanyak 3
buah untuk masing-masing kombinasi.
Preparat ulas diwarnai dengan pewarnaan
Gram kemudian dilakukan pengamatan
bentuk sel dan kelompok Gram secara
mikroskopis. Masing-masing preparat
diamati pada tujuh bidang pandang.
Jumlah sel anggota kombinasi tiap bidang
pandang dihitung kemudian dirata-rata.
Rata-rata jumlah sel anggota kombinasi
kemudian
dibandingkan.
Hasil
perbandingan
jumlah
sel
anggota
kombinasi
dijadikan
dasar
untuk
menentukan apakah kedua isolat bakteri
resisten merkuri tersebut berkoeksistensi
atau tidak berkoeksistensi.
rasio populasi akhir sel yang dihasilkan
seimbang jika dibandingkan dengan
rasio populasi awalnya maka kedua
isolat
tersebut
berkoeksistensi.
Sebaliknya apabila rasio populasi akhir
sel yang dihasilkan tidak seimbang jika
dibandingkan dengan populasi awalnya
maka kedua isolat tersebut tidak
berkoeksistensi.
III HASIL DAN PEMBAHASAN
Uji Koeksistensi Metode Cakram Kertas
Sebelum dilakukan uji koeksistensi
metode cakram kertas, terlebih dahulu
dilakukan skrining awal untuk memodifikasi
metode cakram kertas yang akan dilakukan.
Pada umumnya metode cakram kertas
digunakan untuk kepekaan antibiotik terhadap
suatu mikroorganisme (Tortora et al., 2002).
Dari skrining awal dapat diketahui bahwa
metode cakram kertas juga dapat digunakan
untuk uji koeksistensi pertumbuhan dua isolat
bakteri. Aplikasi metode cakram kertas
dilakukan tanpa cekaman HgCl2, dengan
asumsi bahwa pertumbuhan isolat akan
mengikuti pertumbuhan alaminya.
Rancangan Penelitian
Rancangan penelitian dilakukan
secara deskriptif. Data yang diperoleh
antara lain yaitu :
1. Ada tidaknya zona bening di sekeliling
cakram
kertas
yang
menunjukkan
hubungan koeksistensi antara dua isolat
bakteri resisten merkuri. Apabila terbentuk
zona bening di sekeliling satu atau lebih
cakram kertas, maka kedua isolat uji tidak
berkoeksistensi. Sebaliknya apabila pada
ketiga cakram kertas tidak terbentuk zona
bening,
maka
kedua
isolat
uji
berkoeksistensi.
2. Jumlah populasi sel bakteri dua isolat
bakteri resisten merkuri pada awal dan
akhir
masa
inkubasi
setelah
digabungkan selama 24 jam. Jumlah
populasi sel pada akhir masa inkubasi
diperoleh dengan cara merata-rata
jumlah sel anggota kombinasi pada
ketujuh bidang pandang di tiap
preparat. Hasil rata-rata jumlah populasi
kedua sel bakteri pada awal dan akhir
masa inkubasi dibandingkan. Apabila
Dari Tabel 4.1, terlihat bahwa pada
kombinasi III isolat HgS6 dan isolat HgA3
menunjukkan hubungan koeksistensi setelah
24 jam masa inkubasi dengan tidak
terbentuknya zona bening di sekeliling cakram
kertas dan terlihat pertumbuhan bakteri di
sekeliling cakram kertas (Gambar 4.1). Hasil
tersebut diperkuat dengan pengamatan pada
jam ke-48, dimana pada kombinasi III (HgS6HgA3), pertumbuhan bakteri di sekeliling
kertas cakram semakin melebar.
Tidak terbentuknya zona bening pada
kombinasi III (HgS6-HgA3) dan terlihatnya
pertumbuhan bakteri di sekeliling cakram
kertas menunjukkan bahwa kedua isolat yaitu
isolat HgS6 dan HgA3 mampu hidup bersama
pada medium tersebut. Kemampuan hidup
bersama antara dua isolat tersebut diduga
karena kemampuan kompetisi antara keduanya
seimbang. Menurut Zhang (2003) koeksistensi
dapat terjadi ketika kemampuan kompetisi
antara populasi yang berkompetisi adalah
seimbang.
Sebaliknya, dua isolat bakteri pada
kombinasi I (HgA3-HgS13) dan kombinasi II
(HgA13-HgS6) tidak berkoeksistensi setelah
24 jam dan 48 jam masa inkubasi karena
terbentuk zona bening di sekeliling cakram
kertas walaupun dengan diameter zona bening
yang tipis (Tabel 4.1 dan Gambar 4.1).
Zona bening yang terbentuk pada
kombinasi I (HgA3-HgS13) dan kombinasi II
(HgA13-HgS6) diduga merupakan indikasi
terhambatnya salah satu isolat bakteri anggota
kombinasi. Zona bening adalah area bening di
sekeliling cakram kertas sebagai indikasi tidak
adanya atau terhambatnya pertumbuhan
mikroorganisme
akibat
ekskresi
zat
antimikroba oleh kompetitornya (Byod, 1995;
Atlas & Bartha, 1998). Menurut Atlas &
Bartha (1998) kompetisi terjadi ketika dua atau
lebih populasi mikroorganisme menggunakan
sumber daya yang sama seperti ruang dan
nutrisi. Apabila pada kompetisi tersebut salah
satu populasi mikroorganisme mengeluarkan
substansi kimia ke sekitar lingkungan untuk
menghambat atau membunuh populasi
mikroorganisme lainnya maka hubungan
antara dua populasi tersebut disebut
antagonisme (Tortora et al., 2002).
Berdasarkan karakter biokimianya,
isolat HgS13 cenderung masuk ke genus
Bacillus (Shovitri et al1., 2010). Menurut Lee
et al (2010) banyak spesies dari genus Bacillus
mampu menghasilkan zat antimikroba seperti
bakteriosin, substansi yang mirip bakteriosin
dan antibakterial lipopeptida.
Beberapa
bakteriosin dan substansi mirip bakteriosin
yang diproduksi oleh genus Bacillus telah
dilaporkan
seperti
B.
brevis
AF01
memproduksi brevecin AF01 (Faheem et al.,
2007), B. cereus memproduksi cerein
(Naclerio et al., 1993), B. megaterium
memproduksi megacin BII (Stahl, 1989), B.
thuringinensis BMG1.7 memproduksi thuricin
7 (Cherif et al., 2001) dan B. subtilis
memproduksi subtilin (Danapathi et al., 2008)
serta subtilosin A (Thennarasu et al., 2005).
Umumnya, target dari aksi antimikroba
bakteriosin
adalah
membran
sel
(Klaenhammer et al., 1993 dalam Faheem et
al., 2007). Contoh subtilosin A yang
dihasilkan oleh B. subtilis mampu berinteraksi
dengan membran sel bakteri target. Tiga
mekanisme antimikroba yang mungkin terjadi
antara lain: (1) interaksi antara subtilosin A
dengan membran yang berfungsi sebagai
reseptor sehingga menyebabkan kematian sel
(2) ikatan dengan membran luar sel target
sehingga
meningkatkan
permeabilitas
membran sel target (3) ion yang memediasi
translokasi subtilosin A masuk ke dalam
membran sel target kemungkinan dapat
mengganggu
proses
kehidupan
sel
(Thennarasu et al., 2005; Shelburne et al.,
2007).
Mengacu dari hal tersebut di atas,
diduga isolat HgS13 mengeluarkan zat
antimikroba
yang
menghambat
atau
membunuh isolat HgA3 dan HgS6 pada
kombinasi I dan kombinasi II. Berdasarkan
karakter biokimianya, isolat HgA3 cenderung
masuk ke genus Providencia dan HgS6
cenderung masuk ke genus Lampropedia
(Shovitri et al1., 2010). Dugaan bahwa isolat
HgS13 mengeluarkan zat antimikrobia
didukung dengan belum ditemukannya laporan
yang menyebutkan bahwa genus Providencia
dan
Lampropedia
memproduksi
zat
antimikroba
yang
dapat
menghambat
pertumbuhan mikroorganisme lainnya.
4.2
Uji
Koeksistensi
Metode
Perhitungan Populasi Sel
Metode perhitungan populasi sel
dilakukan dengan asumsi bahwa penurunan
populasi salah satu isolat bakteri merupakan
indikasi adanya penghambatan pertumbuhan
akibat aktivitas isolat bakteri lainnya berupa
ekskresi zat antimikroba (Atlas & Bartha,
1998), maka pada metode ini populasi awal
dan akhir kedua isolate bakteri resisten
merkuri dihitung. Pada uji ini, kombinasi yang
dibentuk sama seperti pada metode cakram
kertas yaitu kombinasi I (HgA3-HgS13),
kombinasi II (HgS13-HgS6) dan kombinasi III
(HgS6-HgA3).
Pada metode ini dicoba dengan
cekaman 10 ppm HgCl2, dalam Shovitri et al1,2
(2010, 2011) disebutkan bahwa pertumbuhan
isolat uji lebih cepat ketika ditumbuhkan pada
medium yang mengandung HgCl2. Hal ini
menunjukkan bahwa HgCl2 merupakan zat
toksik
bagi
mikroorganisme
sehingga
mempengaruhi kecepatan pertumbuhannya.
Populasi awal anggota kombinasi
dihitung
dengan
haemacytometer
dan
diperoleh rasio populasi awal HgS13: HgA3:
HgS6 dalam 1 ml medium adalah 3: 4: 9
(Tabel 4.2). Untuk membuat kombinasi I
(HgA3-HgS13), diambil masing-masing 1 ml
biakan yang mengandung isolat HgA3 dan
HgS13. Hal yang sama dilakukan untuk
membuat kombinasi II (HgS13-HgS6) dan
kombinasi III (HgS6-HgA3).
Setelah masa inkubasi 24 jam,
populasi sel kedua isolat bakteri pada masingmasing kombinasi dihitung kembali dan
disebut sebagai populasi akhir. Populasi akhir
sel anggota kombinasi tidak dihitung dengan
haemocytometer karena isolat HgA3 dan
HgS13 berbentuk sama yaitu basil, sehingga
untuk membedakan kedua isolat tersebut harus
dilakukan pengecatan Gram terlebih dahulu.
Isolat HgA3 adalah Gram negatif, sedangkan
isolat HgS13 adalah Gram positif.
Perhitungan populasi akhir
sel
dilakukan dengan cara langsung yaitu dengan
menghitung populasi sel langsung dari
medium cair pertumbuhan. Tabel 4.2
menunjukkan populasi awal dan akhir isolat
uji. Dari tabel tersebut terlihat bahwa ketiga
kombinasi tidak berkoeksistensi karena setelah
24 jam masa inkubasi ketiga kombinasi
menunjukkan rasio rerata populasi akhir yang
tidak seimbang jika dibandingkan dengan rasio
populasi awalnya. Pada kombinasi I (HgA3HgS13), rasio antara dua isolat bakteri terlihat
berbeda jauh, dimana HgS13 tampak
mendominasi. Hal yang sama juga terjadi pada
kombinasi II (HgS13-HgS6). Sedangkan pada
kombinasi III (HgS6-HgA3) terlihat bahwa
rasio antara dua isolat bakteri tidak berbeda
jauh. Rerata populasi akhir tiap kombinasi dan
perhitungan jumlah sel tiap bidang pandang
kaca obyek.
Dari Tabel 4.2 terlihat bahwa pada
kombinasi I (HgA3-HgS13) dan II (HgS13HgS6), populasi sel isolat HgS13 lebih
mendominasi daripada isolat HgA3 dan HgS6.
Berdasarkan tedensi penurunan populasi akhir,
kembali diduga bahwa isolat HgS13
mengeluarkan
zat
antimikroba
yang
menghambat pertumbuhan isolat HgA3 dan
HgS6. Pola koeksistensi kombinasi I dan II ini
serupa dengan pola yang ditunjukkan pada
metode cakram kertas, yaitu berkoeksistensi
negatif (tidak dapat hidup bersama).
Sedangkan pada kombinasi III (HgS6HgA3) populasi sel isolat HgA3 lebih
mendominasi dibandingkan isolat HgS6 (Tabel
4.2). Pada penelitian yang dilakukan Shovitri
et al1 (2010) terlihat bahwa pada medium NB
yang
mengandung
10
ppm
HgCl2,
pertumbuhan isolat HgA3 lebih cepat daripada
HgS6.
Faktor
perbedaan
kecepatan
pertumbuhan diduga sebagai penyebab isolat
HgA3 lebih mendominasi populasi selnya
daripada isolat HgS6. Madigan et al (1997)
menyatakan bahwa hasil akhir kompetisi
dipengaruhi oleh kecepatan pengambilan
nutrisi, kecepatan metabolisme dan kecepatan
pertumbuhan masing-masing mikroorganisme.
IV KESIMPULAN
Kesimpulan
Berdasarkan hasil penelitian dapat
disimpulkan bahwa:
1. Tanpa cekaman HgCl2, metode cakram
kertas menunjukkan bahwa isolat bakteri
resisten merkuri HgA3 dan HgS13
(kombinasi I) serta HgS13 dan HgS6
(kombinasi II) tidak berkoeksistensi pada
2.
24
jam
masa
inkubasi
karena
terbentuknya zona bening di sekeliling
cakram kertas. Sebaliknya isolat HgS6
dan HgA3 (kombinasi III) menunjukkan
hubungan koeksistensi, karena tidak
terbentuk zona bening dan terlihat
pertumbuhan bakteri di sekeliling cakram
kertas.
Dengan cekaman 10 ppm HgCl2, metode
perhitungan populasi sel menunjukkan
bahwa kedua isolat bakteri pada tiga
kombinasi tidak berkoeksistensi karena
rasio populasi awal dan akhir anggota
kombinasi setelah 24 jam masa inkubasi
tidak seimbang yaitu HgA3:HgS13 dari
4:3 menjadi 1:10 ; HgS13:HgS6 dari 3:9
menjadi 10:1 dan HgS6:HgA3 dari 9:4
menjadi 1:3.
DAFTAR PUSTAKA
Atlas, R.M. and R. Bartha. 1998.
Microbial Ecology Fundamentals
and
Applications. Benjamin
Cummings Publishing Company Inc :
California
Basha, S and Ulagnathan, K. 2002.
Antagonism of Bacillus species (strain
BC121) towards Curvularia lunata.
Journal Current Science 82(12):
1457-1463
Byod, R.F. 1995. Basic Medical
Microbiology Five edition. Little
Brown Company Inc: Boston
Brenner, K., Y. Lingchong and F. H.
Arnold.
Engineering
Microbial
Consortia: A New Frontier in
Syntethic Biology. Trends in
Biotechnology 26(9): 483-489
Cherif, A., H. Ouzari., D. Daffonchio.,
H. Cherif., K.B. Slama., A. Hassen.,
S. Jaoua and
A.Baudabous. 2001. Thuricin: A
Novel Bacteriocin Produced By
Bacillus thuringiensis BMG1.7, A
New Strain Isolated From Soil.
Letters in Applied Microbiology 32:
243-247
Cappucino, J.G. and N. Sherman. 2001.
Microbiology:
A
Laboratory
Manual.
Benjamin
Cummings
Publishing: USA
Danapathi., T.G. Prabhakar and P,
Prabhakar.
2008.
Antibacterial
Activity of Bacillus subtilis Extract on
Pathogenic
Organism.
Journal
Veterinary and Animal Sciences
4(4): 150-153
Darmono. 1995. Logam dalam Sistem
Biologi Makhluk Hidup. UI press :
Jakarta
Dimas.
2008.
Kawasan
Utara
Menanggung
Semua
Beban
Pencemaran Sungai di Surabaya.
http://www.jawapos.co.id/metropolis/i
ndex.php?act=detail&nid=124334.
Diakses pada tanggal 18 Mei 2010
pada pukul 16.53 WIB
Dwijoseputro, D. 2005. Dasar-Dasar
Mikrobiologi. Djambatan: Jakarta
Faheem, F., S. Saeed and S.A. Rasool.
2007. Study on Brevecin AF01: A
Bacteriocin Like Inhibitory Substance
Active Against Methicilin Resistant
Staphylococcus aureus. Pak. J.Bot
39(4): 1293-1302
Fakhrizal. 2004. Mewaspadai Bahaya
Limbah domestik Dari Kali Mas
Surabaya.
http://www.ecoton.or.id/tulisanlengka
p.php?id=1566. Diakses pada tanggal
18 Mei 2010 pada pukul 16.47 WIB
Fardiaz, S. 1988. Fisiologi Fermentasi.
IPB : Bogor
Gillespie,
S.H.
1994.
Medical
Microbiology Illustrated. Butterwrth
Heinemann: London
Harley, J.P. and L.M. Prescott. 2002.
Laboratory
Exercises
in
Microbiology 5th Edition. The Mc
Graw Hill Companies : New York
Hassanein, W.A.,N.M. Awney., ElMougith and S. El-Dien. 2009.
Chracterization and Antagonistic
Activities of Metabolite Produced by
Pseudomonas
aeruginosa
Sha8.
Journal
of
Applied
Science
Research 5(4): 392-403
Hatmanti, A., R. Nuchsin dan J. Dewi.
2009. Screening Bakteri Penghambat
untuk Bakteri Penyebab Penyakit pada
Budidaya Ikan Kerapu dari Perairan
Banten dan Lampung. Jurnal
Makara Sains 13(1): 81-86
Irwan, S. 2005. Toksisitas dan
Transformasi
Merkuri.
http://www.chem-istry.org/materi_kimia/kimia_anorganik
1/khelasi-merkuri/toksisitas-dantransformasi-merkuri/. Diakses pada
tanggal 12 Februari 2010 pada pukul
14.08 WIB
Keputusan
Menkes
RI
No
907/menkes/sk/vii/2002
tentang
Syarat-Syarat dan Pengawasan
Kualitas Air Minum.
Lay, B.W. 1994. Analisis Mikroba di
Laboratorium. PT Raja Grafindo
Persada: Jakarta
Lee, N.K., I.C. Yeu., J.W. Park., B.S.
Kang and Y.T. Hamh. 2010.
Isolation and Characterization
of a Novel Analyte From Bacillus
subtilis SC-8 Antagonistic to
Bacillus cereus. Journal of
Bioscience
and
Bioengineering
110(3): 298-303
Leksono, A.S. 2007. Ekologi Pendekatan
Deskriptif
dan
Kuantitatif.
Bayumedia Publishing: Malang
Lwin, M and Rhanamukaarachchi, S.L.
2006. Development of Biological
Control of Ralstonia solanacearum
Through Antagonistic Microbial
Population. International Journal
Agri Biol 8(5): 657-660
Madigan, M.T., J. M. Martinko and J.
Parker. 1997. Brock Biology of
Microorganisms Eighth Edition.
Prentice Hall International Inc : New
Jersey
Majid. 2009. Senyawa Antibakteri dan
Mekanisme
Kerjanya.
http://majidundip.blogspot.com/2009/
08/senyawa-antibakteri-danmekanisme.html.
Diakses
pada
tanggal 26 Desember 2010 pada pukul
08.55 WIB
Mukred, A.M., A.A. Hamid., A. Hamzah
and
W.M.W
Yusoff.
2008.
Development of Three Bacterial
Consortium for the Bioremediumtion
of
Crude
Petrolum-Oil
in
Contaminated Water. Journal of
Biological Science 8 (4): 73-79
Murray,R.P., E.J. Baron., J.H. Jorgensen.,
M.L. Landry and M.A. Pfaller. 2007.
Manual of Clinical Microbiology 9th
Edition. ASM Press: USA
Naclerio, G., E. Ricca., M. Sacco and
M.D. Felice. 1993. Antimicrobial
Activity of a Newly Identified
Bacteriocin of Bacillus cereus.
Journal Applied and Environmental
Microbiology 59(12): 4313-4316
Nakamura, S.K., K. Sugiura., Y.Y.
Inomata.,
H.
Toki.,
K.
Venkateswaran., S. Yamamoto., H.
Tanaka and S. Harayama. 1996.
Construction of Bacterial Consortia
That Degrade Arabian Light Crude
Oil. Journal of Fermentation and
Bioengineering 82(6): 570-574
Nofiani, R. dan Gusrizal. 2004. Bakteri
Resisten Merkuri Spektrum Sempit
dari Daerah Bekas Penambangan
Emas Tanpa Izin (PETI) Mandor,
Kalimantan Barat. Jurnal Natur
Indonesia 6(2):67-74
Peraturan Pemerintah (PP) Republik
Indonesia Nomor 82 Tahun 2001
tentang Pengelolaan
Kualitas Air dan Pengendalian
Pencemaran Air.
Prescott, L.M., J. P. Harley and D.A.
Klein. 2002. Microbiology. The Mc
Graw Hill Companies : USA
Shelburne, C.E., F.Y.An., V. Dolphe., A.
Ramamoorthy., D.E. Lopatin and M.S.
Lantz. 2007. The Spectrum of
Antimicrobial Activity of The
Bacteriocin Subtilosin A. Journal of
Antimicrobial Chemotherapy 59:
297-300
Shovitri, M., E. Zulaika dan M.P.
Koentjoro1. 2010. Bakteri Tahan
merkuri dari Kali Mas Surabaya
Berpotensi
Sebagai
Agen
Bioremediumsi Merkuri. Diterima
Jurnal Hayati
Shovitri, M., E. Zulaika and M.P.
Koentjoro2. 2011. Reduction of Toxic
Mercuric Ion by Isolated Bacteria
From the Kali Mas Surabaya.
Accepted to IPTEK Journal
Stahl,
Sten.
1989.
A
New
Bacteriocinogenic Activity: Megacin
BII Encoded by Plasmid pSE 203 in
Strain of Bacillus megaterium.
Journal Arch Microbiol 151: 159165
Suharni, T.T., S.J. Nastiti dan A.E.S.
Soetarto. 2008. Mikrobiologi Umum.
Universitas Atma Jaya : Yogyakarta
Thennarasu,S., D.K. Lee., A. Poon., K.E.
Kawulka., J.C. Vederas and A.
Ramamoorthy.
2005.
Mebran
Permeabilization, Orientation, and
Antimicrobial
Mechanism
of
Subtilosin A. Journal Chemistry and
Physic of Lipid 137: 38-51
Tortora, G.J., B. Funke and C.I. Case.
2002.
Microbiology
An
Introduction. Pearson Education Inc :
san Fransisco
Waluyo, B. 2010. Kali Mas Tempo
Doeloe.
http://www.bestsurabayaproperty.com
/news/kalimas-tempo-doeloe/. Diakses
pada tanggal 20 Mei 2010 pada pukul
12.13 WIB
Waluyo, L. 2008. Teknik dan Metode
dasar dalam Mikrobiologi. UMM
press : Malang
Widowati, W., A. Sastiona dan R.J.
Rumampuk. 2008. Efek Toksik
Logam
(Pencegahan
dan
Penanggulangan Pencemaran). Andi
: Yogyakarta
Yamaguchi, A., D.G. Tamang and M.H.
Saier. 2007. Mercury Transport in
Bacteria. Journal Water Air Soil
Pollut 182:219-234
Yanuar, A. 2009. Toksisitas Merkuri di
Sekitar
Kita.
http://arry.yanuar.googlepages.com/m
ercuri.pdf. Diakses pada tanggal 20
Oktober 2009 pada pukul 14.40 WIB.
Zeidan, A.A ., P. Radstrom and E. W. J.
V Niel. 2010. Stable Coexistence
of Two Spesies Caldicellulosiruptor
in a de
novo
Constructed
Hydrogen – Producing Co - Culture.
Microbial Cell Factories 9(120): 113
Zhang, Zhibin. 2003. Mutualism or
Coorperation Among Competitors
Promote
Coexistence
and
Competitive
Ability.Ecological
Modelling 164:271-28