BAB III METODE PENELITIAN A. Jenis Penelitian

BAB III
METODE PENELITIAN
A. Jenis Penelitian
Jenis penelitian yang dilakukan adalah penelitian
deskriptif. Penelitian
deskriptif adalah penelitian yang mendeskripsikan suatu gambaran yang sistematis
dengan fakta-fakta yang didapatkan (Nazir, 1988).
B. Populasi dan Sampel
1. Populasi yang digunakan dalam penelitian ini adalah 30 individu ikan Gurame
(Osphronemus gouramy) yang diambil dari kota Tasikmalaya dan Sukabumi
2. Sampel yang digunakan adalah DNA genome ikan gurame (Osphronemus
gouramy)
3. Sequence gen MC1R dari Ordo Perciformes yang diperoleh dari GenBank
NCBI. Daftar species ikan dari Ordo Perciformes yang digunakan
sebagaimana dipaparkan pada Tabel 3.1
C. Waktu dan Lokasi Penelitian
Penelitian ini dimulai pada bulan Januari 2015 sampai dengan September
2015 yang dilaksanakan di Laboratorium Mikrobiologi Gedung JICA FPMIPA A
dan Laboratorium Bioteknologi Departemen Pendidikan Biologi Gedung
FPMIPA B Universitas Pendidikan Indonesia, Jalan Dr. Setiabudhi No.299
Bandung.
D. Alat dan Bahan
Alat dan bahan yang digunakan dalam penelitian ini terdapat pada
Laboratorium Mikrobiologi Departemen Pendidikan Biologi FPMIPA UPI. Daftar
alat dan bahan terlampir dalam Lampiran 1.
E. Alur Penelitian dan Langkah Kerja
Penelitian ini dilakukan menjadi tiga tahap penelitian, yaitu tahap persiapan
dan tahap penelitian diantaranya sebagai berikut
20
Nilamsari Kurniasih Indrawan, 2015
ISOLASI DAN AMPLIFIKASI GEN PARSIAL MELANOCORTIN - 1 RECEPTOR (MC1R) PADA IKAN
GURAME (Osphronemus gouramy)
Universitas Pendidikan Indonesia | repository.upi.edu | perpustakaan.upi.edu
21
1. Tahap Persiapan
Tahap persiapan meliputi persiapan alat dan bahan yang akan dilakukan dalam
proses penelitian. Alat-alat yang bersih dan bahan yang digunakan, dibungkus
menggunakan plastik tahan panas dan disterilisasi menggunakan autoclave selama
15-20 menit pada suhu 121ºC dengan tekanan. Alat dan bahan yang digunakan
terlampir pada Lampiran 1. Kegiatan penelitian di lakukan Laboratorium
Mikrobiologi Departemen Pendidikan Biologi FPMIPA UPI.
2. Tahap Penelitian
a. Mengumpulkan sequence gen MC1R dari berbagai jenis ikan Infraclassis
Teleostei
Primer dibuat dengan menganalisa sequence gen MC1R dari GenBank
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Sequence gen yang dibuat primernya berasal dari
gen MC1R Infraclassis Teleostei, Ordo Perciformes yang tertera pada Tabel 3.1
syarat pembuatan primer dari sequence sekerabat sebanyak minimal lima spesies.
Pada penelitian ini total jumlah species yang digunakan sebanyak 11 species.
Sequence DNA dikumpulkan dengan format FASTA umtuk multiple alignment
(pensejajaran banyak sequence) dengan menggunakan aplikasi software Clustal X.
Tabel 3.1 Daftar species ikan Ordo Perciformes untuk desain Primer Degenerate
No.
Nama Ikan
Nomor GenBank
1
Takifugu rubripes_t24
AB437783.1
Nomor
GI
189068473
2
Takifugu chinensis_k22
AB437805.1
189068993
3
4
Takifugu sp_01
Takifugu chinensis_k24
AB437812.1
AB437807.1
189069007
189068997
5
6
Takifugu sp_s1
Takifugu rubripes
AB437808.1
AY227791.1
189068999
29165373
7
Tetraodon nigroviridis
AY332238.1
33867666
8
Poecilia reticulata
AB563501.1
322803513
9
Xhiphophorus maculatus
DQ866828.1
113206523
10
Paralichthys
EU365367.1
165988231
Nilamsari Kurniasih Indrawan, 2015
ISOLASI DAN AMPLIFIKASI GEN PARSIAL MELANOCORTIN - 1 RECEPTOR (MC1R) PADA IKAN
GURAME (Osphronemus gouramy)
Universitas Pendidikan Indonesia | repository.upi.edu | perpustakaan.upi.edu
22
11
Dicentrarchus
FN377856.1
270377196
b. Desain Pasanngan Primer Degenerate Gen MC1R
Hasil pensejajaran kemudian dibuat pasangan primer degeneratenya dengan
mengakses laman Primaclade (http://primaclade.org/cgi-bin/primaclade.cgi). Hasil
amplikon diperkirakan 400-800 bp. Didapatkan beberapa kandidat primer yang
terdapat pada Bab 4 Hasil dan Pembahasan (Tabel 4.2).
c. Isolasi DNA Genome Ikan Gurame (Osphronemus gouramy)
1. Isolasi DNA Kromosom
Isolasi DNA genome ikan gurame
dari 30 jenis ikan gurame di daerah
Sukabumi dan Tasikmalaya menggunakan metode lisis CTAB 2x. Daging atau
jaringan ikan gurame dengan ukuran luas 1 cm2 yang sudah dihancurkan
dimasukan ke dalam larutan 500 µl buffer lysis CTAB (Buffer (-) CTAB +
SDS10% + CTAB perbandingan (0,7:0,3:0,1, pH 8,0) pada tabung eppendorf,
ditambahkan 7 µl SDS 20% dan β-mercaptoetanol, dihomogenasi sehingga larut
dan merata, lalu tabung diinkubasi pada suhu 60°C selama satu jam, setelah
inkubasi ditambahkan 10 µl Proteinase K (10mg/ml) kemudian diinkubasi selama
12-15 jam pada suhu 65°C. Proses sebelumnya dilanjutkan dengan inkubasi lalu
Potassium Asetat 5 M sebanyak 1/10 volume awal ditambahkan ke dalam tabung,
dihomogenkan dan diinkubasi di dalam freezer pada suhu 20°C selama 20 menit.
Tabung yang sudah diinkubasi, disentrifugasi dengan kecepatan 15.000 rpm
selama 10 menit, setelah disentrifugasi terbentuk 2 lapisan, lapisan supernatan dan
protein.
Supernatan diambil secara hati-hati dan dipindahkan ke pada tabung
eppendorf
yang baru, lalu ditambahkan RNAse 10mg/ml sebanyak 1/100x
volume cairan. Setelah itu, tabung diinkubasi pada suhu 37°C selama satu jam.
Tabung diekstraksi dengan CIAA (Kloroform:Isoamil Alkohol ; 24:1) sebanyak ½
x volume total, lalu larutan dihomogenasi dengan cara dibolak-balikan minimal
sebanyak 50 kali, hingga larut, dan berwarna putih susu. Proses ini dilanjutkan
dengan sentrifugasi pada kecepatan 15.000 rpm selama 10 menit, hingga terdapat
tiga lapisan. Larutan pertama cairan berisi DNA, kedua protein dan ketiga
Nilamsari Kurniasih Indrawan, 2015
ISOLASI DAN AMPLIFIKASI GEN PARSIAL MELANOCORTIN - 1 RECEPTOR (MC1R) PADA IKAN
GURAME (Osphronemus gouramy)
Universitas Pendidikan Indonesia | repository.upi.edu | perpustakaan.upi.edu
23
kloroform. Lapisan pertama dipindahkan pada tabung eppendorf baru, lalu
ditambahkan sodium asetat 3M sebanyak 1/10 x volume total pada tabung baru
tersebut, lalu dihomogenkan.
Ethanol absolute yang dingin sebanyak 2x volume total ditambahkan,
kemudian dihomogenkan hingga terlihat putih awan, setelah itu diinkubasi pada
suhu -20°C selama satu malam. Pada keesokan setelah proses inkubasi, akan
dilanjutkan dengan sentrifugasi larutan pada 15000 rpm selama 10 menit,
sehingga terdapat pelet berwarna putih yang mengandung DNA, ethanol dibuang
secara hati-hati, setelah itu dibilas menggunakan alkohol 70% sebanyak 1 x
volume total, lalu alkohol dibuang kembali. Pelet dikeringkan di dalam oven
selama kurang lebih 15 menit, setelah kering dilarutkan ke dalam Buffer TE (10
mM Tris/1mM EDTA) larutan tersebut adalah larutan stok DNA simpan pada
suhu -20°C. DNA genome yang sudah diisolasi dicampurkan dalam 1 tabung,
masing-masing diambil 1µl menjadi 1 tabung mikrotube. DNA bulk atau Mix
DNA dan akan menghasilkan konsentrasi yang sesuai diinginkan (Karsinah et al.,
2002). Proses ini merupakan tahapan yang dilakukan pada koleksi penelitian
sebelumnya (Kusumawaty, Tahun, belum dipublikasikan).
2. Pengukuran Konsentrasi DNA
Pengukuran konsentrasi DNA dengan metode spektrofotometri. DNA murni
dapat menyerap cahaya UV karena adanya basa purin dan pirimidin. Pita ganda
DNA dapat menyerap UV pada 260 nm, sedangkan kontaminan protein atau fenol
akan menyerap cahaya pada 280 nm, sehingga kemurnian dapat diukur dengan
dengan menghitung nilai absorbansi 260 nm dibagi dengan nilai absorbansi 280
nm (Å260/Å280). Rumus sebagai berikut (Fatchiyah, 2002) :
[DNA] = Å260 x 50 x faktor pengenceran
d. Amplifikasi dengan Metode PCR dan Elektroforesis
DNA genome ikan gurame yang diisolasi diamplifikasi dengan metode PCR.
Komposisi PCR yang digunakan terdiri dari Dreamtaq Green PCR MasterMix 2x
didalamnya terdapat dATP, dCTP, dGTP dan dTTP, 0,4 mM masing-masing,
MgCl2 4mM, Dreamtaq Green DNA Polymerase dan Dreamtaq Green Buffer,
Nilamsari Kurniasih Indrawan, 2015
ISOLASI DAN AMPLIFIKASI GEN PARSIAL MELANOCORTIN - 1 RECEPTOR (MC1R) PADA IKAN
GURAME (Osphronemus gouramy)
Universitas Pendidikan Indonesia | repository.upi.edu | perpustakaan.upi.edu
24
Primer degenerate yang terdapat pada Tabel 4.1, Taq DNA Polymerase, 1 µl
DNA template ikan gurame (DNA stok diencerkan 20x dan 200x kemudian
(diambil 1µl), dan air deion ditambahkan hingga volume 12,5µl. Bahan tersebut
dimasukan ke dalam tabung khusus untuk alat Thermal cycler dengan program
Gene Amplyfied PCR System 9700 (Scientific, 2011).
Pembuatan komposisi PCR dilakukan dengan keadaan dingin dengan
konposisi terdapat pada Tabel 3.2 Polymerase, dan DNA template, dilakukan
dengan cara divorteks (sebelum ditambahkan seluruh bahan), dan menjentik-jentik
tabung dengan cepat dan hati-hati, disentrifugasi lalu dimasukan ke dalam mesin
PCR, yang sudah diprogram sesuai dengan primer yang sudah dirancang. Setelah
itu DNA amplifikasi di elektroforesis pada gel agarosa 1%, dengan tegangan 100
volt selama 40 menit buffer TAE 1 x (larutan buffer TAE 10x diencerkan dalam
deion dengan perbandingan 1:19 (v/v) Sampel DNA dicampurkan dengan larutan
Loading dye, 5:2 (v/v), sebelum dimasukan ke dalam sumur gel. Disamping
sampel DNA, dimasukan marker lambda Hind III/ Eco R1 yang merupakan
larutan DNA yang sudah diketahui ukurannya .gel agarosa yang sudah
dielektroforesis direndam dengan pewarnaan pada larutan ethidium bromida (10
µg.ml) selama dua menit. Kemudian dibilas menggunakan aquades selama 6
menit, gel agarosa diamati pada UV transiluminator.
Tabel 3.2. Komposisi reaksi PCR DreamTaq Green PCR Master Mix 2x
Komponen
Volume (50 µl
reaksi)
Konsentrasi
akhir
Volume akhir
(10 µl reaksi)
DreamTaq Green
PCR Master Mix 2x
25 µl
1x
5 µl
Primer Forward
0.1-1.0 µM
0.5 µM
0,5 µl
Primer Reverse
0.1-1.0 µM
0.5 µM
0,5 µl
Sample DNA
10 pg- 1 µg
10 ng
0,5 µl
Nuclease-free water
sampai 50 µl
Sampai 10 µl
Jumlah
50 µl
10 µl
Nilamsari Kurniasih Indrawan, 2015
ISOLASI DAN AMPLIFIKASI GEN PARSIAL MELANOCORTIN - 1 RECEPTOR (MC1R) PADA IKAN
GURAME (Osphronemus gouramy)
Universitas Pendidikan Indonesia | repository.upi.edu | perpustakaan.upi.edu
25
95ºC
95ºC
3’
30”
51,2ºC
72ºC
72ºC
45”
10’
30”
10ºC
∞
35 siklus
Gambar 3.1 Program PCR Primer Degenerate Non Nested
95ºC
95ºC
3’
30”
52,8ºC
72ºC
72ºC
45”
10’
30”
10ºC
∞
35 siklus
Gambar 3.2 Program PCR Primer Degenerate Nested
e. Sequencessing DNA dan Analisis Urutan Gen MC1R
Sequencessing (urutan) hasil amplifikasi dengan metode PCR 2 sampel, yaitu
sampel ikan gurame dari primer degenerate non nested dan primer degenerate
nested dilakukan dengan reaksi 2 arah pasangan primer menggunakan mesin
sequencer BigDye Applied Biosystem yang tersedia pada Macrogen, Korea
(www.macrogen.com). Analisa urutan merupakan ringkasan dari seluruh metode
yang sudah dilakukan untuk mengetahui basa nukleotida dan dibandingkan
kesamaannya dengan urutan lainnya.
Nilamsari Kurniasih Indrawan, 2015
ISOLASI DAN AMPLIFIKASI GEN PARSIAL MELANOCORTIN - 1 RECEPTOR (MC1R) PADA IKAN
GURAME (Osphronemus gouramy)
Universitas Pendidikan Indonesia | repository.upi.edu | perpustakaan.upi.edu
26
f. Perancangan Primer Spesifik dari Sequence Gen MC1R
Perancangan primer spesifik dilakukan dengan penjajaran hasil sequencessing
gen MC1R yang didapatkan dari GenBank (www.ncbi.nih.nlm.gov), untuk
mendapatkan daerah sequence yang lestari menggunakan program DNAbaser,
dan Clustal X untuk mendapatkan primer forward dan reverse, primer dirancang
dengan syarat primer standar.
g. Uji Validasi Primer Spesifik Stok DNA Genome Ikan Gurame
(Osphronemus gouramy) dan Stok Sampel cDNA Ikan Gurame
(Osphronemus gouramy)
Setelah perancangan primer spesifik, uji validasi primer menggunakan
amplifikasi dengan metode PCR dan elektroforesis seperti sebelumnya, kepada
stok DNA Genome ikan gurame dan stok cDNA ikan gurame (Osphronemus
gouramy) yang telah terinfeksi Aeromonas hydrophila Strain A2 (Kusumawaty,
2014) sumber belum dipublikasikan
h. Analisis Data Bioinformatika dan Karakterisasi Pohon Filogenetik
Hasil uji penelitian deksriptif data dan dokumentasi dikumpulkan. Hasil
sequencesing berupa basa nukleotida sequence diurutkan dengan cara Alignment
dan Contig menggunakan aplikasi Clustal X dan diurutkan basa nukleotida
sequence gen MC1R menggunakan aplikasi DNABaser. Sequence yang sudah
baik di BLAST untuk mengetahui kebenaran gen yang dimiliki dengan dan
mengetahui kesamaan jenis yang dimiliki oleh jenis ikan lainnya, BLAST ini
diakses di blast.ncbi.nlm.nih.gov. Sequences jenis ikan yang ada pada hasil
BLAST dibuat format FASTA dan di alignment menggunakan aplikasi Clustal X,
untuk mencari daerah homologi dan gap yang dimiliki oleh sequence untuk
dianalisis. Sequence yang sudah di alignment dianalisis dengan aplikasi SMART
untuk mengetahui struktur domain dan membuat pohon filogenetik untuk
mengkarakterisasi gen dan mengetahui kekerabatan serta validasi sequence gen
MC1R dengan menggunakan metode Neighbour-Joining menggunakan aplikasi
MEGA v.5 (Dharmayanti, 2011)
Nilamsari Kurniasih Indrawan, 2015
ISOLASI DAN AMPLIFIKASI GEN PARSIAL MELANOCORTIN - 1 RECEPTOR (MC1R) PADA IKAN
GURAME (Osphronemus gouramy)
Universitas Pendidikan Indonesia | repository.upi.edu | perpustakaan.upi.edu
27
F. Alur Penelitian
Gambar 3.3 Diagram Alur Penelitiam
Nilamsari Kurniasih Indrawan, 2015
ISOLASI DAN AMPLIFIKASI GEN PARSIAL MELANOCORTIN - 1 RECEPTOR (MC1R) PADA IKAN
GURAME (Osphronemus gouramy)
Universitas Pendidikan Indonesia | repository.upi.edu | perpustakaan.upi.edu