View/Open - Repository UNEJ
advertisement
Digital Repository Universitas Jember UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DAN PENETAPAN KADAR FLAVONOID TOTAL EKSTRAK DAN FRAKSI DAUN KENARI (Canarium indicum L.) SKRIPSI Oleh Lukmanto 102210101046 FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS JEMBER 2015 i Digital Repository Universitas Jember UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DAN PENETAPAN KADAR FLAVONOID TOTAL EKSTRAK DAN FRAKSI DAUN KENARI (Canarium indicum L.) SKRIPSI Diajukan guna melengkapi tugas akhir dan memenuhi salah satu syarat untuk menyelesaikan program strata satu pada Fakultas Farmasi (S1) dan mencapai gelar Sarjana Farmasi Oleh Lukmanto 102210101046 FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS JEMBER 2015 i Digital Repository Universitas Jember PERSEMBAHAN Skripsi ini saya persembahkan untuk : 1. Orang tuaku, terutama ibuku Sulikah atas segala kasih sayang, doa, didikan, dukungan dan pengorbanan yang tak terhitung jumlahnya yang tak akan pernah terbalaskan; 2. Nenek dan Kakekku, yang ikut memberikan kasih sayang dan pengorbanan yang tak terhitung jumlahnya; 3. Bapak dan Ibu guruku sejak sekolah dasar hingga perguran tinggi yang telah memberikan ilmu dan seluruh kemampuannya untuk mendidikku; 4. Almamaterku Fakultas Farmasi Universitas Jember; ii Digital Repository Universitas Jember MOTTO Allah akan meninggikan orang-orang yang beriman di antara kamu dan orang-orang yang diberi ilmu pengetahuan beberapa derajat. (terjemahan Surat Al-Mujadalah ayat 11)*) Karena sesungguhnya sesudah kesulitan itu ada kemudahan. Sesungguhnya sesudah kesulitan itu ada kemudahan. (terjemahan Surat Alam-Nasyroh ayat 5-6)*) Banyak kegagalan dalam hidup ini dikarenakan orang-orang tidak menyadari betapa dekatnya mereka dengan keberhasilan saat mereka menyerah. (Thomas Alva Edison) *)) *) Departemen Agama Republik Indonesia. 1998. Al Qur’an dan Terjemahannya. Semarang: PT Kumudasoro Grafindo *)) Kennelly, A.E. 1932. Biographical Memoir of Thomas Alva Edison 1847-1931. National Academy Biographical Memoirs, Vol. XV. iii Digital Repository Universitas Jember PERNYATAAN Saya yang bertanda tangan di bawah ini: Nama : Lukmanto NIM : 102210101046 menyatakan dengan sesungguhnya bahwa skripsi yang berjudul “Uji Aktivitas Antioksidan dan Penetapan Kadar Flavonoid Total Ekstrak dan Fraksi Daun Kenari (Canarium indicum L.)” adalah benar-benar hasil karya sendiri, kecuali jika dalam pengutipan substansi disebutkan sumbernya, dan belum pernah diajukan pada instansi manapun, serta bukan karya jiplakan. Saya bertanggung jawab atas keabsahan dan kebenaran isinya sesuai dengan sikap ilmiah yang harus dijunjung tinggi. Demikian pernyataan ini saya buat dengan sebenarnya, tanpa adanya tekanan dan paksaan dari pihak manapun serta bersedia mendapat sanksi akademik jika ternyata dikemudian hari pernyataan ini tidak benar. Jember, 15 April 2015 Yang menyatakan, Lukmanto NIM 102210101046 iv Digital Repository Universitas Jember SKRIPSI UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DAN PENETAPAN KADAR FLAVONOID TOTAL EKSTRAK DAN FRAKSI DAUN KENARI (Canarium indicum L.) Oleh Lukmanto 102210101046 Pembimbing Dosen Pembimbing Utama : Endah Puspitasari, S.Farm., M.Sc., Apt. Dosen Pembimbing Anggota : Lestyo Wulandari, S.Si., Apt. M.Farm v Digital Repository Universitas Jember PENGESAHAN Skripsi berjudul “Uji Aktivitas Antioksidan dan Penetapan Kadar Flavonoid Total Ekstrak dan Fraksi Dau Kenari (Canarium indicum L.)” telah diuji dan disahkan oleh Fakultas Farmasi, Universitas Jember pada : Hari : Rabu Tanggal : 15 April 2015 Tempat : Fakultas Farmasi, Universitas Jember Tim Pembimbing Dosen Pembimbing Utama, Dosen Pembimbing Anggota, Endah Puspitasari, S.Farm., M.Sc., Apt. NIP. 198107232006042002 Lestyo Wulandari, S.Si., Apt. M.Farm NIP. 197604142002122001 Tim Penguji Penguji I, Siti Muslichah, S.Si., M.Sc., Apt. NIP. 197305132005012001 Penguji II, Nia Kristiningrum, S.Farm., M.Farm., Apt. NIP. 198204062006042001 Mengesahkan, Dekan Fakultas Farmasi Universitas Jember Lestyo Wulandari, S.Si., Apt. M.Farm NIP. 197604142002122001 vi Digital Repository Universitas Jember RINGKASAN Uji Aktivitas Antioksidan dan Penetapan Kadar Flavonoid Total Ekstrak dan Fraksi Daun Kenari (Canarium indicum L.); Lukmanto, 102210101046; 2015; 49 halaman; Fakultas Farmasi, Universitas Jember. Sumber radikal bebas mudah dijumpai dalam lingkungan sehari-hari, seperti asap rokok, obat tertentu, makanan dalam kemasan, bahan aditif, dan lain-lain. Radikal bebas merupakan senyawa yang mengandung elektron tidak berpasangan yang sangat reaktif mencari pasangan elektronnya yang dapat bereaksi dengan molekul sel tubuh sehingga dapat menginduksi penyakit kanker, arteriosklerosis dan penuaan dini, disebabkan oleh kerusakan jaringan karena oksidasi. Radikal bebas ini dapat dinetralisir oleh antioksidan. Sumber antioksidan dapat berupa antioksidan sintetik maupun alami, namun antioksidan dari bahan sintetik memberikan efek samping yang cukup berbahaya bagi kesehatan sehingga dicari sumber antioksidan alami yang lebih aman untuk dikembangkan salah satunya dari tumbuhan. Penelitian sebelumnya mengungkapkan bahwa daun beberapa spesies genus Canarium L. mempunyai aktivitas antioksidan yang kuat. Kemungkinan daun kenari (Canarium indicum L.) juga berpotensi besar mempunyai aktivitas antioksidan, karena semakin dekat kekerabatan semakin banyak senyawa fitokimia yang mirip termasuk senyawa yang mempunyai aktivitas antioksidan. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui kandungan fitokimia, menguji aktivitas antioksidan, menetapkan kadar flavonoid total dan mengetahui hubungan kadar flavonoid total dengan aktivitas antioksidan ekstrak dan fraksi daun kenari. Serbuk kering daun kenari diekstraksi dengan ultasonikasi menggunakan pelarut etanol 96%, kemudian ekstrak dilarutkan campuran air dan etanol dan dilakukan ekstraksi cair-cair (fraksinasi) dengan pelarut n-heksana dan etil asetat. Pengukuran aktivitas antioksidan menggunakan metode DPPH dan penetapan kadar flavonoid vii Digital Repository Universitas Jember total menggunakan spektrofotometer UV-Vis dengan metode kolorimetri menggunakan pereaksi AlCl dengan standar kuersetin. Hasil penelitian menunjukkan ekstrak etanol, fraksi etil asetat dan fraksi etanol-air mempunyai aktivitas antioksidan yang sangat kuat dengan nilai IC berturut-turut adalah 25,294; 20,135; dan 28,806 μg/ml. Sedangkan fraksi n-heksana memiliki aktivitas antioksidan yang lemah dengan nilai IC 175,245 μg/ml. Kadar flavonoid total pada ekstrak etanol, fraksi n-heksana, fraksi etil asetat dan fraksi etanol-air berturut-turut adalah 2,624; 0,499; 3,846; dan 1,596 gram kuersetin ekuivalen per gram ekstrak/fraksi. Hubungan antara aktivitas antioksidan ekstrak dan fraksi daun kenari dengan kadar flavonoid totalnya diperoleh persamaan regresi linier y = -41,896 + 152,079; r² = 0.632. Hasil ini menunjukkan bahwa 63,2 % aktivitas antioksidan ekstrak dan fraksi daun kenari merupakan kontribusi dari senyawa flavonoid dan 36,8 % karena kehadiran metabolit sekunder yang mempunyai aktivitas antioksidan lainnya. viii Digital Repository Universitas Jember PRAKATA Puji syukur ke hadirat Allah SWT atas segala limpahan rahmat dan karuniaNya sehingga penulis dapat meyelesaikan skripsi yang berjudul “Uji Aktivitas Antioksidan dan Penetapan Kadar Flavonoid Total Ekstrak dan Fraksi Daun Kenari (Canarium indicum L.)”. Skripsi ini disusun sebagai prasyarat untuk memperoleh gelar sarjana farmasi pada Fakultas Farmasi Universitas Jember. Penyusunan skripsi ini tidak terlepas dari bantuan berbagai pihak. Oleh karena itu penulis ingin mengucapkan terima kasih kepada : 1. Ibu Lestyo Wulandari, S.Si., Apt. M.Farm selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas Jember; 2. Ibu Endah Puspitasari, S.Farm., M.Sc., Apt. selaku dosen pembimbing utama dan Ibu Lestyo Wulandari, S.Si., Apt. M.Farm selaku dosen pembimbing anggota yang telah bersedia memberikan bimbingan dan ilmu kepada penulis selama penelitian dan penulisan skripsi ini; 3. Ibu Siti Muslichah, S.Si., M.Sc., Apt. dan Ibu Nia Kristiningrum, S.Farm., M.Farm., Apt. selaku dosen penguji yang telah banyak memberikan bantuan, saran, waktu dan perhatiannya dalam penulisan skripsi ini; 4. Ibu Fransisca Maria C, S.Farm., Apt. dan Ibu Lidya Ameliana, S.Farm., M.Sc., Apt. selaku dosen pembimbing akademik yang telah membimbing penulis untuk menentukan SKS selama kuliah; 5. Seluruh bapak dan ibu dosen Fakultas Farmasi Universitas Jember yang telah memberikan ilmu yang bermanfaat bagi saya; 6. Teman-teman angkatan 2010, terima kasih untuk masa-masa indah dan kehangatan persahabatan kita; 7. Bu Widi dan Mbak Anggra selaku laboran laboratorium biologi, Bu Wayan dan Mbak Hani selaku laboran kimia, serta Mbak Indri dan Mbak Dinik yang telah membantu selama penulis melakukan penelitian; ix Digital Repository Universitas Jember 8. Taman Nasional Meru Betiri Jember yang telah memberikan bahan berupa daun kenari yang penulis butuhkan dalam penelitian ini; 9. Serta semua pihak yang tidak dapat disebutkan satu persatu. Penulis menyadari bahwa skripsi ini jauh dari sempurna, oleh karena itu penulis mengharapkan kritik dan saran untuk kesempurnaan skripsi ini. Akhirnya, penulis berharap semoga skripsi ini dapat bermanfaat. Jember, 15 April 2015 Penulis x Digital Repository Universitas Jember DAFTAR ISI Halaman HALAMAN JUDUL ............................................................................................ i HALAMAN PERSEMBAHAN ........................................................................... ii HALAMAN MOTTO .........................................................................................iii HALAMAN PERNYATAAN............................................................................. iv HALAMAN PEMBIMBINGAN ......................................................................... v HALAMAN PENGESAHAN ............................................................................. vi RINGKASAN .................................................................................................... vii PRAKATA ......................................................................................................... ix DAFTAR ISI ...................................................................................................... xi DAFTAR GAMBAR ......................................................................................... xv DAFTAR TABEL ............................................................................................ xvi DAFTAR LAMPIRAN .................................................................................... xvii BAB 1. PENDAHULUAN 1.1 Latar Belakang ......................................................................................... 1 1.2 Rumusan Masalah .................................................................................... 4 1.3 Tujuan ...................................................................................................... 4 1.4 Manfaat .................................................................................................... 4 BAB 2. TINJAUAN PUSTAKA 2.1 Tinjauan Kenari (Canarium indicum L.) ................................................... 5 2.1.1 Nama dan Sinonim .......................................................................... 5 2.1.2 Klasifikasi ....................................................................................... 5 2.1.3 Deskripsi.............................................................................................6 2.1.4 Kandungan Kimia ............................................................................ 8 2.1.5 Kegunaan ........................................................................................ 9 2.2 Ekstraksi .................................................................................................. 9 2.2.1 Ekstraksi dengan Menggunakan Pelarut ........................................... 9 xi Digital Repository Universitas Jember 2.2.1.1 Cara Dingin ....................................................................... 10 2.2.1.2 Cara Panas ......................................................................... 11 2.2.2 Cara Ekstraksi Lainnya .................................................................. 12 2.3 Ekstraksi Cair-cair (Partisi/Fraksinasi).................................................... 13 2.4 Radikal Bebas ........................................................................................ 14 2.5 Antioksidan ............................................................................................ 18 2.6 Uji Aktivitas Antioksidan ....................................................................... 19 2.6.1 Metode DPPH ............................................................................... 19 2.6.2 Metode FRAP ................................................................................ 20 2.6.3 Metode ABTS................................................................................ 21 2.6.4 Metode ORAC ............................................................................... 21 2.6.5 Metode CUPRAC .......................................................................... 22 2.7 Flavonoid ............................................................................................... 22 2.8 Spektrofotometri UV-Vis ....................................................................... 25 BAB 3. METODE PENELITIAN 3.1 Jenis Penelitian ....................................................................................... 27 3.2 Tempat dan Waktu Penelitian ................................................................. 27 3.3 Variabel Penelitian ................................................................................. 27 3.3.1 Variabel Bebas .............................................................................. 27 3.3.2 Variabel Tergantung ...................................................................... 27 3.3.3 Variabel Terkendali ....................................................................... 27 3.4 Definisi Operasional ............................................................................... 28 3.5 Bahan dan Alat yang Digunakan............................................................. 28 3.5.1 Bahan Uji ...................................................................................... 28 3.5.2 Alat Uji.......................................................................................... 29 3.6 Prosedur Penelitian ................................................................................. 29 3.6.1 Preparasi Sampel ........................................................................... 29 3.6.2 Persiapan Ekstrak .......................................................................... 29 3.6.3 Fraksinasi ...................................................................................... 29 xii Digital Repository Universitas Jember 3.6.4 Penapisan Fitokimia Ekstrak .......................................................... 30 3.6.4.1 Identifikasi Alkaloid .......................................................... 30 3.6.4.2 Identifikasi Saponin ........................................................... 30 3.6.4.3 Identifikasi Flavonoid ........................................................ 30 3.6.4.4 Identifikasi Polifenol dan Tanin ......................................... 31 3.6.4.5 Identifikasi Steroid ............................................................. 31 3.6.5 Pengujian Aktivitas Antioksidan dan Penetapan IC .................... 31 3.6.6.1 Pembuatan Larutan DPPH ................................................. 31 3.6.5.2 Penentuan Panjang Gelombang Maksimum DPPH............. 32 3.6.5.3 Pembuatan Larutan Larutan Kontrol .................................. 32 3.6.5.4 Penentuan Operating Time ................................................. 32 3.6.5.5 Pembuatan Larutan Uji ...................................................... 32 3.6.5.6 Pembuatan Larutan Vit.C ................................................... 33 3.6.5.7 Penentuan Aktivitas Antioksidan ....................................... 33 3.6.5.8 Penentuan Persentase Peredaman ....................................... 34 3.6.6 Analisis Kuantitatif Total Flavonoid .............................................. 34 3.6.6.1 Pembuatan Kurva Kalibrasi Kuersetin................................ 34 3.6.6.2 Penentuan Kadar Flavonoid Total ...................................... 34 3.7 Analisis Data .......................................................................................... 35 BAB 4. HASIL DAN PEMBAHASAN 4.1 Pembuatan Ekstrak Daun Kenari ............................................................ 36 4.2 Penapisan Fitokimia ............................................................................... 38 4.3 Uji Aktivitas Antioksidan ....................................................................... 39 4.3.1 Optimasi Panjang Gelombang DPPH ............................................. 39 4.3.2 Penentuan Waktu Optimum ........................................................... 40 4.3.3 Pengukuran Aktivitas Antioksidan ................................................. 41 4.4 Penetapan Kadar Flavonoid Total ........................................................... 45 BAB 5. KESIMPULAN DAN SARAN xiii Digital Repository Universitas Jember 5.1 Kesimpulan ............................................................................................ 49 5.2 Saran ...................................................................................................... 49 DAFTAR PUSTAKA ........................................................................................ 50 LAMPIRAN xiv Digital Repository Universitas Jember DAFTAR GAMBAR Halaman 2.1. Daun kenari................................................................................................... 7 2.2 Rumus bangun DPPH radikal dan non-radikal.............................................. 19 2.3 Struktur dasar flavonoid ............................................................................... 23 2.4 Tempat pengikatan trace metal pada flavonoid ............................................. 24 2.5 Peredaman ROS oleh flavonoid .................................................................... 24 4.1 Absorbansi DPPH dan sampel pada λ 400-600 nm ....................................... 40 4.2 Absorbansi rata-rata larutan DPPH 0,004% dengan penambahan larutan uji mulai menit ke 5 hingga ke 60 ..................................................... 41 4.3 Hubungan konsentrasi dengan persen peredaman DPPH (rata-rata ± SD) ekstrak dan fraksi daun kenari ............................................ 42 4.4 Struktur dasar flavonoid ............................................................................... 44 4.5 Korelasi linier antara aktivitas antioksidan IC dan kadar flavonoid total ekstrak dan fraksi daun kenari .............................................................. 47 xv Digital Repository Universitas Jember DAFTAR TABEL Halaman 4.1. Data rendemen ekstrak dan fraksi daun kenari ............................................. 37 4.2 Hasil uji penapisan fitokimia ekstrak etanol daun kenari............................... 38 4.3 Nilai IC ekstrak dan fraksi daun kenari ..................................................... 43 4.4 Hasil penetapan kadar flavonoid total ekstrak dan fraksi daun kenari ........... 46 xvi Digital Repository Universitas Jember DAFTAR LAMPIRAN Halaman A. Hasil penapisan fitokimia ekstrak etanol daun kenari..................................... 56 A.1 Uji alkaloid............................................................................................ 56 A.2 Uji steroid ............................................................................................. 57 A.3 Uji saponin ............................................................................................ 58 A.4 Uji flavonoid ......................................................................................... 59 A.5 Uji polifenol dan tanin ........................................................................... 60 B. Pengamatan absorbansi DPPH ....................................................................... 61 C. Pengamatan absorbansi sampel ...................................................................... 63 C.1 Pengamatan absorbansi ekstrak etanol daun kenari 40 μg/ml ................. 63 C.2 Pengamatan absorbansi fraksi n-heksana ekstrak etanol daun kenari 150 μg/ml .......................................................................... 65 C.3 Pengamatan absorbansi fraksi etil asetat ekstrak etanol daun kenari 40 μg/ml ............................................................................ 67 C.4 Pengamatan absorbansi fraksi etanol-air ekstrak etanol daun kenari 40 μg/ml ............................................................................ 69 D. Perhitungan ................................................................................................... 71 E. Penentuan panjang gelombang maksimum DPPH .......................................... 77 F. Penentuan operating time ............................................................................... 78 G. Data % peredaman DPPH ekstrak dan fraksi daun kenari .............................. 79 H. Regresi konsentrasi sampel terhadap % peredaman DPPH ............................ 80 H.1 Regresi konsentrasi ekstrak etanol daun kenari terhadap % peredaman DPPH .............................................................................. 80 H.2 Regresi konsentrasi fraksi n-heksana ekstrak etanol daun kenari terhadap % peredaman DPPH ............................................. 81 H.3 Regresi konsentrasi fraksi etil asetat ekstrak etanol daun kenari terhadap % peredaman DPPH ............................................. 82 xvii Digital Repository Universitas Jember H.4 Regresi konsentrasi fraksi etanol-air ekstrak etanol daun kenari terhadap % peredaman DPPH ............................................. 83 H.5 Regresi konsentrasi vitamin C terhadap % peredaman DPPH .............................................................................. 84 I. Kadar flavonoid total ...................................................................................... 85 I.1 Kalibrasi standar kuersetin ...................................................................... 85 I.2 Kadar flavonoid total sampel................................................................... 86 J. Korelasi kadar flavonoid total dengan aktivitas antioksidan daun kenari ......... 86 xviii Digital Repository Universitas Jember BAB 1. PENDAHULUAN 1.1 Latar Belakang Sumber radikal bebas mudah dijumpai dalam lingkungan kehidupan seharihari, seperti asap rokok, obat tertentu, makanan dalam kemasan, bahan aditif, dan lain-lain (Winarsi, 2007). Radikal bebas merupakan molekul atau fragmen molekul yang mengandung satu atau lebih elektron tidak berpasangan pada orbital atomnya. Radikal bebas ini berbahaya karena sangat reaktif mencari pasangan elektronnya untuk mencapai kestabilan (Valko et al., 2007). Radikal bebas dapat menyebabkan stres oksidatif yang memainkan peranan utama dalam perkembangan penyakit kronis dan degenaratif seperti kanker, arthritis, penuaan, gangguan autoimun, kardiovaskular dan penyakit neurodegeneratif (Pham-Huy et al., 2008). Sebenarnya radikal bebas penting artinya bagi kesehatan dan fungsi tubuh jika jumlahnya tidak berlebihan atau dalam keadaan seimbang seperti sebagai molekul pengatur relaksasi otot polos, meningkatkan fungsi imun dan menjaga homeostatis redoks (Droge, 2002). Kelebihan radikal bebas dalam tubuh dapat memacu timbulnya berbagai macam penyakit degeneratif dan kronis (Pham-Huy et al., 2008). Radikal bebas yang merusak tubuh dapat dinetralisir oleh senyawa antioksidan. Antioksidan merupakan senyawa yang dapat menghambat oksigen reaktif dan radikal bebas dalam tubuh. Senyawa antioksidan ini akan menyerahkan satu atau lebih elektron kepada radikal bebas sehingga menjadi bentuk molekul yang normal kembali dan menghentikan berbagai kerusakan yang ditimbulkan (Sasikumar et al., 2009). Tubuh manusia tidak mempunyai cadangan antioksidan dalam jumlah berlebih, sehingga jika terjadi paparan radikal bebas berlebih maka tubuh membutuhkan antioksidan eksogen (Hariyatmi, 2004). Sumber antioksidan dapat berupa antioksidan sintetik maupun alami. Antioksidan sintetik misalnya BHA (butylated hydroxy anisole), BHT (butylated hydroxy toluene), PG (propyl gallate), 1 Digital Repository Universitas Jember 2 dan TBHQ (tertiary butyl hydroquinone) (Widowati et al., 2005). Namun, antioksidan dari bahan sintetik memberikan efek samping yang cukup berbahaya bagi kesehatan. Hasil penelitian menunjukan bahwa antioksidan sintetik BHA dan BHT dapat meracuni binatang percobaan dan pada pemaparan yang lama dapat meningkatkan risiko karsinogenesis (Whysner et al., 1994). Oleh karena itu dicari sumber antioksidan alami yang lebih aman untuk dikembangkan. Salah satu sumber antioksidan alami berasal dari tumbuhan. Tumbuhan mengandung senyawa yang mempunyai aktivitas sebagai antioksidan salah satunya adalah senyawa flavonoid (Pietta, 2000). Flavonoid adalah golongan senyawa polifenol yang diketahui memiliki sifat antioksidan, antimikroba, antialergi, antivirus, antiinflamasi dan vasodilator (Pietta, 2000). Flavonoid terdapat dalam semua tumbuhan hijau sehingga pasti ditemukan pada setiap telaah ekstrak tumbuhan (Markham, 1988). Flavonoid adalah senyawa yang ditemukan pada buah-buahan, sayur-sayuran, dan beberapa minuman yang memiliki beragam manfaat biokimia dan efek antioksidan (Donald dan Cristobal, 2006). Indonesia dikenal sebagai mega biodervisity country, yaitu bangsa yang memiliki banyak keanekaragaman hayati. Di hutan tropis Indonesia terdapat sekitar 30.000 tumbuhan, diduga sekitar 9.600 spesies diketahui berkhasiat obat, dan sekitar 200 spesies diantaranya merupakan tumbuhan obat penting bagi industri obat tradisional. Saat ini, banyak orang yang kembali menggunakan bahan-bahan alam yang dalam pelaksanaannya membiasakan hidup dengan menghindari bahan-bahan kimia sintesis dan lebih mengutamakan bahan-bahan alami. Salah satunya adalah penggunaan tumbuhan untuk pengobatan (Kardinan dan Kusuma, 2004). Salah satu tumbuhan yang terdapat di Indonesia adalah kenari (Canarium indicum L.). Kenari banyak tumbuh di daerah Indonesia bagian timur, seperti Sulawesi Utara, Maluku dan pulau Seram (Thomson dan Evans, 2006). Tumbuhan kenari termasuk dalam genus Canarium L. Tanaman ini menghasilkan buah dan biji (kernel) yang biasanya dimanfaatkan sebagai bahan pelengkap kue (Dzarkasi et al., 2011). Kenari juga bermanfaat sebagai tumbuhan obat. Resin untuk mengobati ulser, buah untuk laksan, Digital Repository Universitas Jember 3 akar untuk mengobati sakit kepala, serta biji keringnya dimakan untuk menginduksi sterilitas (Quattrocchi, 2012). Tidak banyak penelitian yang dilakukan mengenai kenari. Dzarkasi et al. (2011) telah meneliti senyawa bioaktif pada biji kenari yang meyebutkan komponen terbanyak biji kenari adalah minyak serta biji kenari mengandung banyak senyawa fenol dan flavonoid dan memberikan aktivitas sebagai antioksidan. Limbono (2013) juga melakukan penelitian yang menyebutkan ekstrak etanol biji kenari memiliki daya antioksidan dengan harga IC sebesar 10.106,75 μg/ml. Sedangkan penelitian mengenai daun kenari belum pernah dilakukan, namun telah dilakukan beberapa penelitian mengenai aktivitas antioksidan pada daun beberapa spesies genus Canarium. Zhang dan Lin (2008) melaporkan daun C. album mengandung tanin yang memiliki aktivitas peredaman DPPH yang baik dengan IC sebesar 56,86 μg/ml. Mogana et al. (2011) melaporkan daun C. patentinervium Miq. memiliki aktivitas antioksidan sama bagusnya dengan asam askorbat dengan IC sebesar 2,93 μg/ml. Berdasarkan pendekatan kemotaksonomi kemungkinan daun C. indicum L. juga mempunyai aktivitas antioksidan. Berdasarkan fakta di atas, peneliti tertarik melakukan penelitian yang bertujuan untuk mengetahui kandungan fitokimia, menguji aktivitas antioksidan, menetapkan kadar flavonoid total dan mengetahui hubungan kadar flavonoid total dengan aktivitas antioksidan ekstrak dan fraksi daun kenari. Peneliti berharap hasil penelitian ini nantinya dapat bermanfaat untuk pengembangan ilmu pengetahuan dan dapat menemukan sumber antioksidan alami. Digital Repository Universitas Jember 4 1.2 Perumusan Masalah Berdasarkan latar belakang, maka masalah dalam penelitian ini dirumuskan sebagai berikut: 1. Apa sajakah kandungan fitokimia pada ekstrak etanol daun kenari? 2. Berapakah nilai aktivitas antioksidan ekstrak etanol daun kenari dan fraksinya dengan menggunakan metode DPPH yang dinyatakan dengan IC ? 3. Berapakah kadar kandungan flavonoid total pada ekstrak etanol daun kenari dan fraksinya? 4. Bagaimanakah hubungan kadar flavonoid total ekstrak etanol daun kenari dan fraksinya terhadap aktivitas antioksidan yang dihasilkan? 1.3 Tujuan Penelitian Tujuan yang diharapkan dari penelitian ini adalah: 1. Mengetahui kandungan fitokimia pada ekstrak etanol daun kenari. 2. Mengetahui aktivitas antioksidan ekstrak dan fraksi daun kenari dengan menggunakan metode DPPH. 3. Mengetahui kadar kandungan flavonoid total ekstrak dan fraksi daun kenari 4. Mengetahui hubungan kadar flavonoid total ekstrak dan fraksi daun kenari terhadap aktivitas antioksidan yang dihasilkan. 1.4 Manfaat Penelitian Manfaat yang diharapkan dapat diambil dari penelitian ini adalah: 1. Uji aktivitas antioksidan yang dilakukan dapat dijadikan sebagai salah satu upaya untuk mengembangkan daun kenari menjadi salah satu tanaman yang memiliki khasiat sebagai antioksidan. 2. Sebagai salah satu referensi/perbandingan dalam penelitian lebih lanjut. Digital Repository Universitas Jember BAB 2. TINJAUAN PUSTAKA 2.1 Tinjauan Kenari (Canarium indicum L.) 2.1.1 Nama dan Sinonim C. indicum L. memiliki beberapa sebutan nama. Penyebutan umum atau dalam bahasa Inggris di antaranya Blume Galip, C. Almond, C. Nut, Galip, Galip Nut, Almond Java, Java Olive, Kanari, Nangai Nut, Nut Ali. Penyebutan dalam bahasa daerah diantaranya, Indonesia: Jal, Jar (Ambon), Kanari Bagéa (Maluku), Kenari Ambon (Suku Sunda), Buah Kenari. Malaysia: Canari, Ngali, Nangai, Kenari, Pokok Kenari. Papua New Guinea: Baga, Galip, Galip Nut (General), Hinue (New Ireland), a ngallip lawele (New Britain). Kepulauan Solomon: Eghe (Pulau Savo), Nina, Ninge, Voia (Santa Cruz), Angari (Santa Ana), Ngari (Kausage, Simbo dan Varisi), Ngoeta (Marovo), Nolepo (Garciosa Bay), Nyia Nyinge (Ayiwo). Vanuatu: Nangai (Bislama), Bunnige, Punnige, Nige Kava. Perancis: Noix De Nangaille, Oli, Galap, La Nangaille, Noix De Kanari. Jerman: Indisces Kananaribaum, Kanarinuß, Galipnuß. India: Agarbati, Dhup (Hindi) (Lim, 2012). C. indicum ini dikenal juga dengan nama C. amboinense Hochr., C. commune L., C. mehenbethene Gaertn., C. moluccanum Blume, dan C. zephyrinum Rumphius (Thomson dan Evans, 2006). 2.1.2 Klasifikasi Tumbuhan C. indicum L. secara taksonomi mempunyai klasifikasi sebagai berikut (USDA, 2014) : Kingdom : Plantae Subkingdom : Tracheobionta Superdivisi : Spermatophyta Divisi : Magnoliophyta Klas : Magnoliopsida 5 Digital Repository Universitas Jember Subklas : Rosidae Ordo : Sapindales Famili : Burseraceae Genus : Canarium L. Jenis : Canarium indicum L. 6 2.1.3 Deskripsi Kenari merupakan tanaman asli Indonesia yang banyak tumbuh di daerah Indonesia bagian timur, seperti Sulawesi Utara, Maluku dan pulau Seram. Diduga, tanaman ini berasal dari Indonesia bagian timur. Beberapa sumber menyatakan bahwa tanaman kenari juga banyak dijumpai di beberapa negara seperti Thailand, Filipina, Kepulauan Fiji, dan Papua New Guinea. Penelitian intensif tentang asal-usul tanaman ini yang sebenarnya masih perlu dilakukan. Di Indonesia, tanaman ini masih merupakan tanaman hutan dan belum banyak dibudidayakan. Sumber lain menyatakan bahwa tanaman ini banyak dijumpai di daerah Malenesian (Kennedy dan Clarke, 2004; Thomson dan Evans, 2006). Genus Canarium L. termasuk dalam famili Burseraceae. Genus Canarium L. terdiri dari 75 spesies utama yang ditemukan di daerah tropis Asia dan Pasifik dan beberapa spesies di daerah Afrika tropis (Orwa et al., 2009). Dari spesies yang ada, spesies yang terdapat di Pasifik Barat dapat diklasifikasikan menjadi 2 kelompok, yaitu: (1) maluense (spesies: C. lamili, C. salomonense, C. harveyi) dan (2) vulgare (spesies: C. vulgare, C. indicum, C. ovatum) (Leenhouts, 1959; Yen, 1994; Keneddy dan Clarke, 2004). Kenyataan bahwa kemiripan ketiga spesies C. indicum L., C. vulgare, dan C. ovatum yang termasuk dalam kelompok vulgare juga dikemukakan oleh Thomson dan Evans (2006). Menurut Evans (1994) ketiga spesies yang dominan tersebut berbeda-beda asalnya C. vulgare dari Indonesia, C. ovatum dari Filipina, dan C. indicum L. berasal dari Indonesia, Papua New Guinea, Solomon, dan Vanuatu. Leenhouts (1959) mengemukakan bahwa C. indicum L. dan C. vulgare sangat mirip (overlap). Terutama jika didasarkan pada stipula dan morfologi buahnya (bentuk, Digital Repository Universitas Jember 7 ukuran, ketebalan shell, dan warna kulit buah). Namun demikian, C. indicum L. mempunyai produksi lebih tinggi dari spesies yang lain dan ukuran lebih besar sehingga paling sesuai untuk dijadikan komoditi komersil (Yen, 1994). Genus Canarium L. memiliki sekitar 100 spesies yang kebanyakan tumbuh di hutan lembab dataran rendah di daerah Melanesia (Kennedy dan Clarke, 2004). Namun demikian, spesies domestik yang paling banyak terdapat di Indonesia antara lain, C. lamili (Irian Jaya), C. vulgare (Sangihe Talaud, Sulawesi, Seram, Morotai, Tanimbar, dan Flores), dan C. indicum L. (Sulawesi utara, Ambon, Ternate, pulau Seram, dan Kai) (Leenhouts, 1959; Yen, 1994). Tempat tumbuh tanaman kenari umumnya di hutan primer dengan kondisi tanah bervariasi; berkapur, berpasir maupun tanah liat. Selain itu, tanaman ini tumbuh baik di dataran rendah sampai dataran tinggi dengan ketinggian 600 meter di atas permukaan laut. Saat matur ketinggiannya 40 sampai 50 meter dan diameter batang bagian bawah 1 – 1,5 meter (Thomson dan Evans, 2006). Daunnya majemuk menyirip ganjil terdiri dari 6 – 8 pasang berhadapan, lonjong, dan pangkal meruncing, berwarna terang sampai hijau gelap seperti pada Gambar 2.1. Daun tanaman kenari berukuran panjang daun 7 – 28 cm dan lebar 3,5 – 11 cm (Thomson dan Evans, 2006). Gambar 2.1. Daun kenari (C. indicum L.) Digital Repository Universitas Jember 8 Tanaman ini termasuk tanaman berbunga. Bunganya kecil berwarna putih kekuning-kuningan dengan mahkota berbentuk segi tiga. Tanaman ini menghasilkan buah dan biji (kernel) yang biasanya dimanfaatkan sebagai pangan camilan. Biji (kernel) tersebut mengandung lemak dan protein tinggi. Buah kenari berbentuk lonjong (ovoid) sampai agak bulat, dengan dimensi morfologi 2-4 x 3-6 cm, dan pada umumnya berwarna hijau pada saat masih mentah, berubah menjadi hijau tua agak kegelapan sampai kehitaman pada saat buah matang. Warna hitam terjadi karena degradasi klorofil pada kulit buah. Secara morfologi, buah kenari terdiri dari bagian kulit luar (exocarp), daging buah (mesocarp), dan bagian tempurung dan isinya (endocarp) (Thomson dan Evans, 2006). 2.1.4 Kandungan Kimia Belum ada sumber pustaka maupun penelitian mengenai kandungan kimia dari daun kenari. Namun berdasarkan studi literatur, telah banyak dilaporkan tentang kandungan kimia dari daun spesies genus Canarium L. lainnya, di antaranya pada C. schweinfurthii (Atile) mengandung saponin, tanin, glikosida jantung, steroid dan flavonoid sedangkan alkaloid dan antrakuinon tidak ada (Ngbede et al., 2008). Pada C. odontophyllum mengandung terpenoid, tanin, flavonoid, fenol dan saponin sedangkan alkaloid tidak ada (Basri dan Nor, 2014). Pada C. album mengandung flavonoid, triterpena dan seskuiterpena (Mogana et al., 2011). Pada C. bengalense mengandung sabinene, caryophyllene, epi-bisyclosesquiterpene (Thang et al., 2004). Pada C. parvum Leen mengandung β-caryophyllene, β-ocimene, germacrene D, αhumulene dan allo-ocimene (Thang et al., 2014). Penggunaan kandungan zat kimia sebagai salah satu cara untuk menentukan hubungan kekerabatan jenis (inter-specific) dan di bawah tingkat jenis (infra-specific) disebut kemotaksonomi (Stuessy, 1989). McNair (1935) menyatakan bahwa semakin dekat hubungan kekerabatan (taxa) menghasilkan kandungan kimia yang lebih mirip. Berdasarkan metode kemotaksonomi kemungkinan kandungan kimia daun kenari mirip pada spesies genus Canarium L. lainnya. Digital Repository Universitas Jember 9 2.1.5 Kegunaan Minyak kernel kenari umumnya digunakan untuk memasak, namun juga digunakan untuk obat terutama sebagai produk kosmetik dan perawatan kulit (Lim, 2012). Kernel kenari juga memiliki aktivitas antiinflamasi in vitro seperti yang ditunjukkan oleh penghambatan produksi prostaglandin (PGE 2) pada sel fibroblast 3T3 tikus Swiss Albino oleh minyak kernel (Leakey et al., 2008). Minyak kernel menghambat produksi PGE2 sebanding dengan aspirin (Lim, 2012). Ekstrak minyak kenari sudah diketahui sebagai agen antiinflamasi untuk melawan keriput dan hilangnya kekencangan kulit. Maestro et al. (2009) melaporkan bahwa produk kosmetik perawatan kulit kenari dimaksudkan untuk mencegah dan atau mengobati setidaknya salah satu tanda penuaan kulit. Di Kepulauan Solomon barat, kulit kayunya digunakan sebagai obat tradisional untuk sakit dada (Lim, 2012). Resin untuk mengobati ulser, buah untuk laksan, akar untuk mengobati sakit kepala, serta biji keringnya dimakan untuk menginduksi sterilitas (Quattrocchi, 2012). Berdasarkan studi literatur diketahui daun C. album memiliki aktivitas peredaman DPPH yang bagus dengan IC sebesar 56,86 μg/ml (Zhang dan Lin, 2008). Daun C. patentinervium Miq. memiliki aktivitas antioksidan sama bagusnya dengan asam askorbat dengan IC sebesar 2,93 μg/ml (Mogana et al., 2011). Berdasarkan metode kemotaksonomi kemungkinan daun C. indicum L. juga mempunyai aktivitas antioksidan. 2.2 Ekstraksi Ekstraksi adalah kegiatan penarikan kandungan kimia yang dapat larut sehingga terpisah dari bahan yang tidak terlarut dengan pelarut cair. Simplisia yang diekstraksi mengandung berbagai senyawa aktif yang dapat larut dan senyawa aktif yang tidak dapat larut seperti serat, karbohidrat, protein, dan lain-lain (Depkes RI, 2000). Metode ekstraksi yang digunakan dalam bidang farmasi meliputi pemisahan bagian aktif tanaman berkhasiat obat dari komponen yang tidak aktif dengan Digital Repository Universitas Jember 10 menggunakan pelarut selektif. Ketika bahan padat kontak dengan pelarut, komponen yang dapat larut dalam bahan padat berpindah menuju pelarut sehingga ekstraksi pelarut bahan tumbuhan obat menghasilkan perpindahan masa senyawa aktif yang larut menuju pelarut sesuai gradien konsentrasi. Laju perpindahan masa akan menurun jika konsentrasi senyawa aktif dalam pelarut tinggi sampai dicapai titik kesetimbangan yakni konsentrasi senyawa aktif dalam bahan dan pelarut sama (Handa et al., 2008). Prosedur ekstraksi bertujuan untuk mendapatkan senyawa yang diinginkan dan untuk menghilangkan komponen yang tidak diinginkan dari tanaman menggunakan pelarut yang selektif. Ekstrak yang diperoleh setelah distandardisasi dapat digunakan sebagai bahan obat-obatan seperti dalam bentuk tingtur atau ekstrak cair dan dapat diproses lebih lanjut untuk dibuat dalam bentuk sediaan seperti tablet dan kapsul. Tanaman yang diekstraksi mengandung campuran kompleks dari metabolit seperti alkaloid, glikosida, terpenoid, flavonoid dan lignan (Handa et al., 2008). Beberapa metode yang digunakan dalam ekstraksi bahan alam antara lain: 2.2.1 Ekstraksi dengan Menggunakan Pelarut 2.2.1.1 Cara Dingin a. Maserasi Maserasi adalah proses pengekstrakan simplisia dengan menggunakan pelarut dengan beberapa kali pengocokan atau pengadukan pada temperatur ruangan (kamar). Secara teknologi termasuk ekstraksi dengan prinsip metode pencapaian konsentrasi pada keseimbangan. Maserasi kinetik berarti dilakukan pengadukan yang kontinu (terus-menerus). Remaserasi berarti dilakukan pengulangan penambahan pelarut setelah dilakukan penyaringan maserat pertama dan seterusnya (Depkes RI, 2000). Kelemahan utama dari maserasi adalah prosesnya cukup memakan waktu yang lama, dapat berlangsung beberapa jam sampai beberapa minggu. Ekstraksi secara menyeluruh juga dapat menghabiskan sejumlah besar volume pelarut dan dapat berpotensi hilangnya metabolit. Selain itu, beberapa senyawa tidak terekstraksi secara Digital Repository Universitas Jember 11 efisien jika kurang terlarut dalam temperatur kamar. Di lain pihak, dikarenakan ekstraksi dilakukan pada temperatur kamar, maserasi tidak menyebabkan degradasi dari metabolit yang tidak tahan panas (Depkes RI, 2000). b. Perkolasi Perkolasi adalah cara penyarian yang dilakukan dengan mengalirkan cairan penyari melalui serbuk simplisia yang telah dibasahi. Pada perkolasi, serbuk tanaman direndam dalam pelarut pada sebuah alat perkolator, bentuknya seperti kerucut terbalik. Perkolasi cukup sesuai baik untuk ekstraksi pendahuluan maupun dalam jumlah besar. Bahan padat basah dimasukkan dalam jumlah yang tepat kemudian didiamkan selama sekitar 4 jam dalam keadaan tertutup. Setelah itu cairan penyari akan menetes melewati serbuk tanaman, mengganti pelarut yang keluar berupa ekstrak. Seperti pada maserasi, untuk mengekstrak secara menyeluruh dilakukan dengan penambahan pelarut yang baru (fresh solvent) dan semua ekstrak dikumpulkan. Untuk meyakinkan perkolasi sudah sempurna, perkolat dapat diuji adanya metabolit dengan reagen spesifik (Depkes RI, 2000; Handa et al., 2008). 2.2.1.2 Cara Panas a. Refluks Ekstraksi dengan pelarut pada temperatur titik didihnya selama waktu tertentu dan jumlah pelarut terbatas yang relatif konstan dengan adanya pendingin balik. Umumnya dilakukan pengulangan proses pada residu pertama sampai 3-5 kali sehingga dapat termasuk ekstraksi sempurna. Kekurangan yang utama dari metode ini adalah terdegradasinya komponen yang tidak tahan panas (Depkes RI, 2000). b. Soxhlet Soxhlet adalah ekstraksi dengan menggunakan pelarut yang selalu baru yang umumnya dilakukan dengan alat khusus sehingga terjadi ekstraksi secara kontinu dengan jumlah pelarut relatif konstan dengan adanya pendingin balik (Depkes RI, 2000). Ekstraksi soxhlet hanya diperlukan bila senyawa yang diinginkan memiliki kelarutan terbatas dalam suatu pelarut. Keuntungan dari metode ini adalah banyaknya Digital Repository Universitas Jember 12 bagian tanaman akan terlarut dengan kondisi pemanasan. Kelemahannya adalah tidak dapat digunakan untuk senyawa yang tidak tahan pemanasan karena pemanasan yang berkepanjangan dapat menyebabkan degradasi senyawa aktif (Nikhal et al., 2010). c. Digesti Digesti adalah maserasi kinetik (dengan pengadukan kontinu) pada temperatur yang lebih tinggi dari temperatur ruangan (kamar), yaitu secara umum dilakukan pada temperatur 40-50 °C (Depkes RI, 2000). d. Infusa Infusa adalah ekstraksi dengan pelarut air pada temperatur penangas air (bejana infus tercelup dalam penangas air mendidih, temperatur terukur 96-98 °C) selama waktu tertentu (15-20 menit) (Depkes RI, 2000). e. Dekok Dekok adalah infusa pada waktu yang lebih lama dan temperatur sampai titik didih air (Depkes RI, 2000). 2.2.2 Cara ekstraksi lainnya: a. Destilasi Uap Destilasi uap adalah ekstraksi senyawa kandungan menguap (minyak atsiri) dari bahan (segar atau simplisia) dengan uap air berdasarkan peristiwa tekanan parsial senyawa kandungan menguap dengan fase uap air dari ketel secara kontinu sampai sempurna dan diakhiri dengan kondensasi fase uap campuran (senyawa kandungan menguap ikut terdestilasi) menjadi destilat air bersama senyawa kandungan yang memisah sempurna atau memisah sebagian (Depkes RI, 2000). b. Ekstraksi berkesinambungan Proses ekstraksi yang dilakukan berulangkali dengan pelarut yang berbeda atau resirkulasi cairan pelarut dan prosesnya tersusun berturutan beberapa kali. Proses ini dilakukan untuk meningkatkan efisiensi (jumlah pelarut) dan dirancang untuk bahan dalam jumlah besar yang terbagi dalam beberapa bejana ekstraksi (Depkes RI, 2000). Digital Repository Universitas Jember 13 c. Superkritikal karbondioksida Penggunaan prinsip superkritik untuk ekstraksi serbuk simplisia, dan umumnya digunakan gas karbondioksida. Dengan variabel tekanan dan temperaur akan diperoleh spesifikasi kondisi polaritas tertentu yang sesuai untuk melarutkan golongan senyawa kandungan tertentu. Penghilangan cairan pelarut dengan mudah dilakukan karena karbondioksida menguap dengan mudah, sehingga hampir langsung diperoleh ekstrak (Depkes RI, 2000). d. Ekstraksi energi listrik Energi listrik digunakan dalam bentuk medan listrik, medan magnet serta electric-discharges yang dapat mempercepat proses dan meningkatkan hasil dengan prinsip menimbulkan gelembung spontan dan menyebarkan gelombang tekanan berkecepatan ultrasonik (Depkes RI, 2000). e. Sonikasi Getaran ultrasonik (> 20.000 Hz.) memberikan efek pada proses ekstrak dengan prinsip meningkatkan permeabilitas dinding sel, menimbulkan gelembung spontan (cavitation) sebagai stres dinamik serta menimbulkan fraksi interfase. Hasil ekstraksi tergantung pada frekuensi getaran, kapasitas alat dan lama proses ultrasonikasi (Depkes RI, 2000). 2.3 Ekstraksi Cair-cair (Partisi/Fraksinasi) Sebuah ekstrak kasar bahan alam umumnya mengandung campuran banyak senyawa kimia yang mempunyai sifat fisika dan kimia yang beragam. Strategi dasar untuk pemisahan senyawa ini adalah berdasarkan sifat fisika kimianya yang dapat dipisahkan ke dalam beberapa kelompok senyawa kimia (Sarker et al., 2006). Ada beberapa jenis metode pemisahan, ekstraksi pelarut atau disebut juga ekstraksi cair-cair merupakan metode pemisahan yang paling baik dan populer. Alasan utamanya adalah pemisahan ini dapat dilakukan dengan baik dalam skala mikro maupun makro. Selain itu, alat yang digunakan tergolong sederhana (Khopkar, 2003). Digital Repository Universitas Jember 14 Prinsip metode ini didasarkan pada distribusi zat terlarut dengan perbandingan tertentu antara dua pelarut yang tidak saling bercampur (Khopkar, 2003). Senyawa kimia akan terdistribusi dalam dua pelarut tergantung pada perbedaan koefisien partisinya. Teknik ini sangat efektif pada langkah awal pemisahan senyawa dari ekstrak bahan alam (Sarker et al., 2006). Kesempurnaan ekstraksi tergantung pada banyaknya ekstraksi yang dilakukan. Hasil yang baik diperoleh apabila jumlah ekstraksi yang dilakukan berulang-ulang dengan penambahan jumlah pelarut sedikit demi sedikit (Khopkar, 2003). 2.4 Radikal Bebas Radikal bebas merupakan molekul atau fragmen molekul yang mengandung satu atau lebih elektron tidak berpasangan pada orbital atomnya. Elektron tidak berpasangan menyebabkan radikal bebas mempunyai reaktifitas tinggi (Valko et al., 2007). Untuk mencapai kestabilan atom atau molekul radikal bebas akan bereaksi dengan molekul di sekitarnya untuk memperoleh pasangan elektron (Kohen dan Nyska, 2002). Radikal bebas oksigen lebih umum disebut reactive oxygen species (ROS) serta reactive nitrogen species (RNS) merupakan produk metabolisme seluler. ROS dan RNS keduanya dapat berperan ganda sebagai spesies yang merusak dan menguntungkan karena dapat membahayakan dan menguntungkan sistem kehidupan. Pada konsentrasi rendah atau sedang ROS dan RNS bermanfaat pada respon seluler dan fungsi imun sedangkan pada konsentrasi tinggi menyebabkan stres oksidatif yakni sebuah proses yang dapat merusak semua struktur sel. Stres oksidatif memainkan peranan utama dalam perkembangan penyakit kronis dan degenaratif seperti kanker, arthritis, penuaan, gangguan autoimun, kardiovaskular dan penyakit neurodegeneratif (Pham-Huy et al., 2008). Pembentukan ROS dan RNS dapat terjadi pada sel dengan dua cara, yaitu reaksi enzimatis dan non-enzimatis. Reaksi enzimatis yang menghasilkan radikal bebas misalnya pada rantai proses pernapasan, fagositosis, sintesis prostaglandin dan Digital Repository Universitas Jember 15 sistem sitokrom P450. Reaksi non-enzimatis yang menghasilkan radikal bebas misalnya dari reaksi oksigen dengan senyawa organik dan yang diprakarsai oleh radiasi pengion. ROS dan RNS dapat berasal dari sumber endogen dan eksogen. Radikal bebas endogen dihasilkan dari aktivasi sel imun, inflamasi, stres mental, olahraga yang berlebihan, iskemia, kanker dan penuaan. Radikal bebas eksogen berasal dari polusi udara atau air, asap rokok, alkohol, logam berat (Cd, Hg, Pb, Fe, As), obat-obatan tertentu (cylcosporine, tacrolimus, gentamycin, bleomycin), pelarut industri, makanan tertentu dan radiasi (Pham-Huy et al., 2008). ROS memiliki beberapa macam bentuk seperti superoksida (O• ), peroksil (ROO•), alkoksil (RO•), hidroksil (HO•) dan hidroperoksil (HO •), sedangkan RNS seperti nitrit oksida (NO•) dan peroksinitrit (ONOO ). 1. Radikal anion superoksida (O• ) Anion superoksida baik karena proses metabolisme dan aktivasi oksigen melalui radiasi fisika merupakan ROS primer dan dapat bereaksi dengan molekul lainnya menghasilkan ROS sekunder. Produksi superoksida banyak terjadi dalam sel mitokondria. Reaksi transport elektron mitokondria merupakan sumber utama ATP dalam sel mamalia. Selama transduksi energi, sejumlah kecil elektron bocor ke oksigen sebelum waktunya membentuk radikal oksigen superoksida (Pham-Huy et al., 2008). Superoksida memiliki sifat yang berbeda tergantung pada lingkungan dan pH. Superoksida mempunyai pKa 4,8 sehingga dapat berada dalam bentuk anion superoksida (O• ) dan pada pH rendah dalam bentuk hidroperoksil (HO •). Hidroperoksil lebih mudah menembus membran biologis daripada bentuk bermuatan. Hidroperoksil merupakan spesies yang penting walaupun dalam pH fisiologis superoksida banyak dalam bentuk bermuatan. Pada lingkungan hidrofilik, keduanya dapat bertindak sebagai agen pereduksi, misalnya pada reduksi ion ferik (Fe ) menjadi ion feros (Fe ), namun kapasitas pereduksi hidroperoksil lebih besar. Pada Digital Repository Universitas Jember 16 pelarut organik kelarutan anion superoksida lebih besar dan kemampuan mereduksi meningkat. Anion superoksida juga beraksi sebagai nukleofil kuat yang dapat menyerang muatan positif dan sebagai agen pengoksidasi dapat bereaksi dengan senyawa pendonor H . Reaksi terpenting radikal superoksida adalah dismutasi ditunjukkan pada reaksi 1. Dalam reaksi ini, superoksida bereaksi dengan superoksida lainnya, salah satu dioksidasi menjadi oksigen dan yang lain direduksi menjadi hidrogen peroksida (Kohen dan Nyska, 2002). HO •/O• + HO •/O• → H O + O (1) 2. Hidrogen peroksida H O Hidrogen peroksida adalah spesies reaktif non-radikal dan dapat dengan mudah berdifusi di antara sel hidup. H O secara efisen diubah menjadi air dengan enzim katalase, proses yang menentukan waktu paronya (Diplock et al., 1998). 3. Radikal hidroksil (HO•) Radikal hidroksil mempunyai reaktifitas paling tinggi, membuatnya menjadi radikal yang sangat berbahaya dengan waktu paruh in vivo sangat pendek sekitar 10 detik. Radikal HO• dapat terbentuk in vivo pada radiasi energi tinggi (misal: sinar X) dengan pemutusan homolitik molekul air atau H O endogen pada reaksi yang dikatalis logam. Sinar UV tidak cukup energi untuk memecah molekul air namun dapat memecah H O menjadi dua molekul radikal hidroksil (Diplock et al., 1998). 4. Radikal peroksil (ROO•) Radikal peroksil mempunyai waktu paro yang relatif lama dengan jarak difusi yang besar pada sistem biologi. Radikal peroksil dapat dihasilkan dari proses peroksidasi lipid yang diinisiasi dari abstraksi atom H polyunsaturated fatty acid (PUFA), radikal hidroksil dapat memulai pemanjangan reaksi ini. Produk lebih lanjut yang dihasilkan dari peroksidasi lipid adalah radikal alkoksil (RO•) dan hidroperoksida organik (ROOH) (Diplock et al., 1998). Digital Repository Universitas Jember 17 5. Molekul oksigen singlet ( O ) Oksigen singlet adalah ROS non-radikal yang diduga terbentuk pada jaringan yang terpapar cahaya. Waktu paruhnya sekitar 10 detik tergantung sifat matriks di sekitarnya. Oksigen singlet dapat berinteraksi dengan molekul lain dengan mentransfer energi aktivasinya atau penggabungan secara kimia.Target utama untuk reaksi kimia adalah ikatan rangkap misalnya pada PUFA atau basa guanin DNA (Diplock et al., 1998). 6. Radikal nitrit oksida (NO•) NO• adalah molekul kecil yang mengandung satu elektron tak berpasangan pada orbital antibonding ∗ sehingga merupakan radikal. NO• dihasilkan pada jaringan biologis oleh specific nitric oxide synthases (NOSs), yang memetabolisme arginine menjadi citrulline dengan pembentukan NO• melalui lima reaksi oksidatif elektron. Nitrit oksida merupakan radikal reaktif yang berlimpah, yang bertindak sebagai molekul sinyal biologis dalam berbagai proses fisiologis, termasuk neurotransmisi, pengatur tekanan darah, mekanisme pertahanan, relaksasi otot polos dan pengaturan sistem imun. NO• memiliki waktu paruh hanya beberapa detik dalam lingkungan berair (>15 detik) dan mempunyai stabilitas lebih besar pada lingkungan dengan konsentrasi oksigen rendah. NO• bereaksi dengan oksigen dan air membentuk nitrat dan anion nitrit. Kelebihan produksi spesies nitrogen reaktif disebut stres nitrosatif. Stres nitrosatif dapat menyebabkan reaksi nitrosilasi yang dapat mengubah struktur dan menghambat fungsi normal protein. Sel sistem imun memproduksi nitrit oksida dan anion superoksida selama proses terjadinya inflamasi, nitrit oksida dan anion superoksida dapat bereaksi menghasilkan sejumlah besar molekul yang lebih oksidatif yakni anion peroksinitrit (ONOO ) yang merupakan agen pengoksidasi kuat yang bisa menyebabkan fragmentasi DNA dan oksidasi lipid (Pham-Huy et al., 2008). Digital Repository Universitas Jember 18 2.5 Antioksidan Antioksidan adalah suatu zat yang pada konsentrasi rendah dibandingkan substrat yang teroksidasi yang secara sigifikan dapat menunda atau menghambat oksidasi substrat (Diplock et al., 1998). Peran antioksidan adalah menetralisir kelebihan radikal bebas untuk melindungi sel terhadap efek toksik radikal dan berkontribusi dalam pencegahan penyakit (Pham-Huy et al., 2008). Antioksidan dapat berasal dari dalam tubuh (antioksidan endogen) dan dari luar berasal dari makanan (antioksidan eksogen). Antioksidan endogen dalam sel dapat diklasifikasikan sebagai antioksidan enzim dan antioksidan non-enzim. Antioksidan enzim utama yang terlibat langsung dalam netralisasi ROS dan RNS adalah superoksida dismustase (SOD), katalase (CAT), glutathione peroxidase (GPx) dan glutathione reductase (GRx). Antioksidan non-enzim dibagi menjadi antioksidan metabolik dan antioksidan gizi. Antioksidan metabolik termasuk antioksidan endogen yang diproduksi dalam tubuh seperti asam lipoid, glutathione, L-arginine, koenzim Q10, melatonin, asam urat, bilirubin, protein pengkhelat logam, transferrin dan sebagainya. Sedangkan antioksidan gizi termasuk antioksidan eksogen yaitu senyawa yang tidak dapat diproduksi dalam tubuh dan harus diberikan melalui makanan atau suplemen seperti vitamin E, vitamin C, karotenoid, trace logam (selenium, magnesium, seng), flavonoid, asam lemak omega-3, omega-6 dan lain-lain (PhamHuy et al., 2008). Berdasarkan jenisnya, antioksidan dibagi menjadi dua golongan, yakni antioksidan sintetik yaitu antioksidan buatan manusia dan berguna untuk lemak, minyak, dan lipida yang terkandung di dalam makanan, misalnya BHA, BHT, propil galat, TBHQ dan antioksidan alami yaitu antioksidan yang berasal dari bagian-bagian tanaman dan berguna untuk mencegah oksidasi dan polimerisasi asam lemak tak jenuh (Widowati et al., 2005). Antioksidan dari bahan sintetik dapat memberikan efek samping yang cukup berbahaya bagi kesehatan. Hasil penelitian menunjukan bahwa antioksidan sintetik BHA dan BHT dapat meracuni binatang percobaan dan pada pemaparan yang lama dapat meningkatkan risiko karsinogenesis (Whysner et Digital Repository Universitas Jember 19 al., 1994). Antioksidan tidak hanya digunakan dalam industri farmasi, tetapi juga digunakan secara luas dalam industri makanan, industri petroleum, industri karet dan sebagainya (Tahir et al., 2003). Komponen antioksidan yang terdapat pada tanaman seperti karotenoid, flavanoid, fenol dan glucobrasicin bermanfaat bagi kesehatan yang dapat berfungsi sebagai antioksidan (Arnao et al.,1999). 2.6 Uji Aktivitas Antioksidan Untuk menentukan aktivitas antioksidan in vitro dapat dilakukan dengan bermacam metode, antara lain: 2.6.1 Metode DPPH (1,1-difenil-2-pikrilhidrazil) Merupakan salah satu metode uji aktivitas antioksidan yang populer dengan menggunakan radikal bebas stabil DPPH. Molekul DPPH (1,1-difenil-2- pikrilhidrazil) mempunyai karakter sebagai radikal bebas yang stabil karena adanya delokalisasi elektron pada keseluruhan molekul, sehingga molekul tidak mengalami dimerisasi tidak seperti dengan radikal bebas lain (Molyeneux, 2004). Delokalisasi juga memberikan warna ungu, ditandai dengan serapan pita sekitar 520 nm (Molyeneux, 2004). Ketika larutan DPPH dicampur dengan substansi yang dapat mendonorkan atom hidrogen, akan menghasilkan bentuk tereduksi (non-radikal) (Gambar 2.2) ditandai dengan hilangnya warna ungu (Molyeneux, 2004). 1. Radikal bebas DPPH 2. DPPH non-radikal Gambar 2.2. Rumus bangun DPPH radikal bebas (1) dan DPPH non-radikal (2) (Molyeneux, 2004). Digital Repository Universitas Jember 20 Mekanisme reaksi yang terjadi antara radikal DPPH (Z • ) dengan molekul donor (AH) digambarkan sebagai berikut: Z • + AH = ZH + A• Dimana ZH merupakan bentuk tereduksi DPPH (non radikal) dan A• adalah radikal baru yang dihasilkan dari reaksi ini. Radikal A• akan mengalami reaksi selanjutnya yang mengendalikan stoikiometri keseluruhan yaitu jumlah molekul DPPH yang tereduksi oleh molekul tersebut (Molyneux, 2004). Metode DPPH secara luas digunakan untuk menguji aktivitas antioksidan ekstrak tumbuhan maupun senyawa fenol isolat. Metode DPPH memberikan repeatibilitas yang baik dan sering digunakan (Teow, 2005; Thaipong et al., 2006). Namun, metode DPPH juga mempunyai kekurangan. Bondet et al. (1997) melaporkan bahwa banyak antioksidan fenol bereaksi lambat dengan DPPH, membutuhkan waktu 1 sampai 6 jam atau lebih. Selain itu, DPPH hanya bisa larut dalam pelarut organik dan pengaruh warna sampel pada DPPH menyebabkan penurunan aktivitas antioksidan (Arnao, 2000). Salah satu parameter yang digunakann untuk interpretasi hasil dari metode DPPH adalah nilai EC (inhibition (efficient concentration) penyebutan lainnya nilai IC concentration) adalah konsentrasi substrat yang menyebabkan berkurangnya aktivitas DPPH sebanyak 50%, semakin kecil nilainya menunjukkan aktivitas antioksidan semakin besar (Molyenux, 2004). Menurut Blois (2003), tingkat kekuatan antioksidan adalah sangat kuat (IC μg/ml), sedang (IC < 50 μg/ml), kuat (IC 101-150 μg/ml) dan lemah (IC 50-100 > 150 μg/ml). 2.6.2 FRAP (Ferric Reducing Antioxidant Power) Metode ini mengukur kapasitas antioksidan berdasarkan transfer elektron. Oksidan yang digunakan adalah probe terdiri dari garam besi, Fe(III) (TPTZ ) (2,4,6tripyridyls-triazine) (Teow, 2005). Metode ini mengukur kemampuan mereduksi ferric 2,4,6-tripyridyl-s-triazine (TPTZ) menjadi produk berwarna. Metode Digital Repository Universitas Jember 21 mendeteksi senyawa dengan potensial redoks kurang dari 0,7 V (potensial redoks Fe -TPTZ). Kekurangannya adalah hasil uji FRAP bisa sangat bervariasi tergantung pada skala waktu analisis, tidak relevan untuk mengukur aktivitas antioksidan secara mekanis dan fisiologis karena FRAP tidak mengukur antioksidan thiol seperti glutathione. Kelebihannya merupakan uji yang sederhana, cepat, murah, kuat dan tidak memerlukan peralatan khusus (Prior et al., 2005). 2.6.3 Metode ABTS 2,2’-azinobis (3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid) Metode ABTS menggunakan senyawa 2,2’-azobis (3-ethylbenzthiazoline-6sulfonic acid) sebagai sumber penghasil radikal bebas. Metode ini mengukur kemampuan antioksidan untuk meredam ABTS yang dihasilkan dalam fase air, hasilnya dibandingkan dengan pembanding trolox (analog vitamin E larut air). Dalam uji ini, kapasitas antioksidan diuji dengan mereaksikan senyawa uji dengan larutan ABTS yang menghasilkan penurunan warna larutan. ABTS dihasilkan dengan mereaksikan garam ABTS dengan agen pengoksidasi kuat seperti potasium permanganat atau potasium persulfat. Penurunan warna hijau-biru radikal ABTS karena donasi atom hidrogen diukur pada panjang gelombang karakteristik (Teow, 2005). Kelebihan metode ini adalah cepat, dapat dilakukan pada rentang pH yang luas serta dapat digunakan pada sistem larutan berbasis air maupun organik (Arnao et al., 1999). Kekurangannya adalah reprodusibilitasnya lebih jelek dibanding metode DPPH, ABTS perlu disimpan pada tempat gelap selama 12 jam untuk membentuk radikal bebas dari garam ABTS dan radikal ABTS tidak ditemukan dalam sistem fisiologis mamalia sehingga mempresentasikan sumber radikal non-fisiologis (Thaipong et al., 2006; Prior et al., 2005). 2.6.4 ORAC (Oxygen Radical Absorbance Capacity) Metode ORAC menggunakan senyawa radikal peroksil yang dihasilkan melalui larutan cair dari 2,2’-azobis-2-metil-propanimidamida. Antioksidan akan Digital Repository Universitas Jember 22 bereaksi dengan radikal peroksil dan menghambat degradasi pendaran zat warna. Kelebihan metode pengujian ORAC adalah kemampuannya dalam menguji antioksidan hipofilik dan lipofilik sehingga akan menghasilkan pengukuran lebih baik terhadap total aktivitas antioksidan (Teow, 2005). Kelemahan dari metode ini adalah membutuhkan peralatan yang mahal, waktu analisis yang lama (>1 jam), dan reprodusibilitasnya jelek karena reaksi ORAC sensitif dengan suhu (Thaipong et al., 2005; Prior et al., 2005). 2.6.5 Metode CUPRAC (Cupric Reducing Antioxidant Capacity) CUPRAC merupakan variasi dari metode FRAP dengan mengganti Fe dengan Cu. Prinsip dari metode CUPRAC adalah berdasarkan reduksi Cu(II) menjadi Cu(I) oleh senyawa pereduksi pada sampel. Uji CUPRAC menggunakan reagen neocuproine (2,9-dimethyl-1,10-phenanthroline). Kelebihannya adalah lebih bagus dibanding FRAP karena Cu (tembaga) bisa menguji antioksidan thiol dan reaksinya lebih cepat dibanding Fe (besi), sedangkan kekurangannya adalah waktu reaksi lama minimal 30-60 menit (Prior et al., 2005). 2.7 Flavonoid Flavonoid adalah senyawa fenolik yang ditemukan banyak tumbuhan berpembuluh, lebih dari 8000 jenis senyawa telah diketahui. Flavonoid umumnya ditemukan pada tumbuhan dalam bentuk glikosida dan berfungsi memberikan warna pada daun, bunga dan buah. Banyak penelitian mengungkapkan flavonoid mempunyai aktivitas biologis diantaranya sebagai antialergen, antivirus, antiinflamasi, vasodilator dan yang terkenal sebagai antioksidan. Flavonoid terbentuk pada tumbuhan dari asam amino aromatik fenilalanin, tirosin dan malonat (Pietta, 2000). Struktur dasar flavonoid adalah inti flavan yang terdiri dari 15 atom karbon yang membentuk tiga cincin (C6-C3-C6), yang berlabel A, B C seperti Gambar 2.3. Digital Repository Universitas Jember 23 Gambar 2.3. Struktur dasar flavonoid (Pietta, 2000) Kombinasi yang beragam pada rantai tiga karbon C3 yang menghubungkan dua cincin benzena struktur ini menjadi dasar pembagian golongan flavonoid menjadi flavonol, flavon, flavanon, flavanonol, katekin, antosianidin, leukoantosianidin, kalkon, dihidrokalkon, auron dan isoflavon (Robinson, 1995). Menurut Pietta (2000), mekanisme aktivitas antioksidan flavonoid ada dua, yaitu: 1. Flavonoid mengambat enzim yang bertangung jawab terhadap produksi anion superoksida, seperti xanthine oxidase dan protein kinase C. Flavonoid juga menghambat siklooksigenase, lipoksigenase, mikrosomal monoksigenase, glutathione S-transferase, mitochondrial succinoxidase dan NADH oksidase yang kesemuanya terlibat dalam pembentukan spesies oksigen reaktif. Sejumlah flavonoid mengkelat trace metal secara efisen yang berperan penting dalam metabolisme oksigen. Besi dan tembaga bebas adalah peningkat efektif pembentukan spesies oksigen reaktif, misalnya pada reduksi hidrogen peroksida yang menghasilkan radikal bebas hidroksil yang sangat reaktif ditunjukkan reaksi (1), dan tembaga yang memediasi oksidasi LDL (LH) ditunjukkan reaksi (2). H O + Fe (Cu ) → HO• + OH + Fe (Cu ) LH → L• → LOO• (1) (2) Tempat pengikatan trace metal pada flavonoid katekol adalah pada gugus 3’hidroksil, 4’-hidroksil pada cincin B heterosiklik dan gugus 3-hidroksil, 4-oxo dan gugus 5-hidroksil pada cincin A seperti Gambar 2.4. Digital Repository Universitas Jember Gambar 2.4. Tempat pengikatan trace metal (Me 24 ) pada flavonoid 2. Flavonoid mempunyai potensial redoks yang rendah (0,23 < E7 < 0,75 V) sehingga dapat secara termodinamika meredam oksidasi radikal bebas dengan potensial redoks sekitar 2,13-1,0 V, seperti radikal superoksida, peroksil, alkoksil dan hidroksil dengan mendonorkan atom hidrogen. Fl-OH + R° → Fl-O° + RH FL-OH adalah flavonoid, R° adalah radikal superoksida, peroksil, alkoksil dan hidroksil. Radikal aroksil Fl-O° dapat bereaksi dengan radikal aroksil kedua membentuk struktur stabil kuinon seperti Gambar 2.5. Gambar 2.5. Peredaman ROS (R° ) oleh flavonoid Analisis flavonoid pada suatu sampel dapat dilakukan dengan berbagai metode, diantaranya metode kolorimetri, kromatografi lapis tipis, kromatografi gas, kromatografi gas-spektrofotometri masa dan kromatografi cair performa tinggi. Meskipun metode kromatografi dengan kombinasi analisis absorbsi spektra dan Digital Repository Universitas Jember 25 spektrofotometri masa memberikan informasi pasti untuk analisis identifikasi dan kuantifikisai flavonoid, tetapi metode tersebut membutuhkan instrumen tertentu, standar yang autentik dan menghabiskan waktu. Berbeda dengan metode kolorimetri yang menarget struktur flavonoid adalah metode yang baik dan cocok untuk analisis rutin. Namun, metode kolorimetri tidak dapat mendeteksi semua jenis flavonoid, hanya untuk jenis flavon dan flavonol. Metode kolorimetri untuk menentukan kadar flavonoid dalam tumbuhan dibagi menjadi dua macam. Metode pertama merupakan metode kolorimetri menggunakan aluminum klorida berdasarkan pada pembentukan kompleks antara Aluminum klorida dengan gugus keton C-4 dan gugus hidroksil C-3 atau C-5 kelompok flavon dan flavonol yang menghasilkan warna kuning, serta membentuk kompleks asam labil dengan gugus orto-dihidroksil dalam cincin A atau B flavonoid (Chang et al., 2002). Metode kedua merupakan metode kolorimetri dengan DNP (2,4dinitrophenylhydrazine). Prinsip metode ini adalah reagen 2,4-dinitrophenylhydrazine yang bereaksi dengan karbonil keton dan aldehid untuk 2,4-dinitrophenylhydrazone sehingga menghasilkan warna merah (Chang et al., 2002). Metode kolorimetri menggunakan Aluminum klorida dipilih karena sederhana, cepat, dan mudah dilakukan. 2.8 Spektrofotometri Ultraviolet dan Tampak (Visibel) Spektrum tampak terdapat pada rentang panjang gelombang 400 nm (ungu) sampai 750 nm (merah), sedangkan spektrum ultraviolet terdapat pada rentang panjang gelombang 200 nm sampai 400 nm. Absorbansi cahaya ultraviolet atau cahaya tampak mengakibatkan suatu transisi elektronik yaitu promosi elektronelektron dari orbital keadaan dasar yang berenergi rendah ke orbital keadaan tereksitasi yang berenergi lebih tinggi. Energi yang terserap selanjutnya terbuang sebagai kalor, sebagai cahaya, atau tersalurkan dalam reaksi kimia (Fessenden dan Fessenden, 1995). Digital Repository Universitas Jember 26 Absorbsi energi direkam sebagai absorban. Absorban pada sutau panjang gelombang tertentu didefinisikan sebagai : A= log Dengan: A = absorbansi = Intensitas sinar yang datang I = Intensitas sinar yang ditransmisikan Absorban suatu senyawa pada suatu panjang gelombang tertentu bertambah dengan molekul yang mengalami transisi. Oleh karena itu absorban bergantung pada struktur elektronik senyawanya dan juga pada kepekatan sampel (Fessenden dan Fessenden, 1995). Output dari spektrofotometri UV-Vis dapat berupa spektra UV-Vis yang dapat digunakan sebagai informasi kualitatif dan dapat digunakan untuk analisis kuantitatif. Dari aspek kualitatif spektroskopi UV-Vis menghasilkan data berupa panjang gelombang maksimal, intensitas, efek pH, dan pelarut yang kesemuanya dapat dibandingkan dengan data yang sudah dipublikasikan sebelumnya. Dari aspek kuantitatif suatu berkas radiasi dikenakan pada larutan sampel (cuplikan) yang akan diiukur dan intensitas sinar radiasi yang diteruskan tersebut kemudian diukur besarnya. Intensitas atau kekuatan radiasi cahaya sebanding dengan jumlah foton melalui satu satuan luas penampang per detik (Gandjar dan Rohman, 2007). Digital Repository Universitas Jember BAB 3. METODE PENELITIAN 3. 1 Jenis Penelitian Uji aktivitas antioksidan ekstrak dan fraksi daun kenari (C. indicum L.) dengan metode DPPH ini adalah penelitian experimental laboratories. 3.2 Tempat dan Waktu Penelitian Penelitian ini dilakukan mulai bulan Juli tahun 2014 sampai bulan Januari 2015 di Laboratorium Fitokimia Bagian Biologi Fakultas Farmasi dan Laboratorium Kimia Analisis Fakultas Farmasi Universitas Jember. 3.3 Variabel Penelitian 3.3.1 Variabel Bebas Variabel bebas dalam penelitian ini adalah konsentrasi (% b/v) ekstrak dan fraksi daun kenari dalam pelarut etanol dan jenis pelarut untuk fraksinasi. 3.3.2 Variabel Tergantung Variabel tergantung dalam penelitian ini adalah persen inhibition concentration (IC ) ekstrak dan fraksi daun kenari serta kadar flavonoid total ekstrak dan fraksi daun kenari. 3.3.3 Variabel Terkendali Variabel terkendali dalam penelitian ini adalah lokasi pengambilan sampel, umur tanaman, cara pemanenan, metode ekstraksi, metode pengujian aktivitas antioksidan dan metode penetapan flavonoid total. 27 Digital Repository Universitas Jember 28 3.4 Definisi Operasional Definisi operasional dari penelitian ini adalah: a. Daun kenari adalah daun kenari yang diperoleh dari Taman Nasional Meru Betiri Jember, daun kenari yang digunakan merupakan daun yang cukup umur. Daun yang diambil mulai daun deretan kelima dari pucuk sampai deretan ketiga dari pangkal. Daun yang masih muda dan berwarna hijau kekuningan serta daun yang sudah layu dan mengering tidak digunakan pada penelitian ini. Daun diambil dari pohon yang sudah besar dan berbunga penuh pada bulan Juli tahun 2014. b. Ekstrak etanol daun kenari adalah ekstrak yang diperoleh dari ekstraksi simplisia daun kenari dengan metode ultrasonikasi selama satu jam dengan pelarut etanol 96% pada suhu 45 ºC. c. Fraksi ekstrak adalah fraksi n-heksana, fraksi etil asetat dan fraksi etanol-air yang diperoleh dari partisi (ekstraksi cair-cair) ekstrak etanol daun kenari yang dilarutkan dalam campuran pelarut etanol dan akuades hangat (1:1) menggunakan pelarut berturut-turut n-heksana dan etil asetat. d. Inhibition concentration (IC ) adalah nilai konsentrasi ekstrak dan fraksi daun kenari yang mampu meredam 50% radikal DPPH. e. Quercetine equivalent (QE) merupakan kadar flavonoid total pada ekstrak dan fraksi daun kenari yang dinyatakan dengan massa (gram) ekuivalen kuersetin per massa (gram) ekstrak/fraksi 3.5 Bahan dan Alat yang Digunakan 3.5.1 Bahan Uji Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah daun tumbuhan kenari yang diperoleh dari Taman Nasional Meru Betiri Jember, bahan kimia yang digunakan adalah etil asetat, n-heksana dan etanol 96% teknis yang telah diredestilasi, etanol p.a (pro analysis) (Merck), akuades (Brataco Chemica), Wagner LP, Mayer LP, besi (III) klorida, serbuk magnesium, asam klorida, natrium klorida, asam sulfat, Digital Repository Universitas Jember 29 alumunium klorida, potasium asetat, asam askorbat, DPPH (Sigma-Aldrich) dan kuersetin (Sigma-Aldrich). 3.5.2 Alat Uji Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah alat-alat gelas, neraca analitik, alat ultrasonic (Elmasonic S 180H), penangas air, mikropipet, corong Buchner, alumunium foil, kertas saring, kuvet, rotary evaporator (Heidolph) dan spektrofotometer (UV-Vis Hitachi U 1800). 3.6 Prosedur Penelitian 3.6.1 Preparasi Sampel Sampel daun diambil dan dikumpulkan, daun yang digunakan adalah daun cukup umur. Selanjutnya daun-daun tersebut disortir dan dicuci, kemudian daun-daun tersebut diiris tipis-tipis. Selanjutnya irisan daun dikeringanginkan selama 3 hari pada suhu kamar terhindar dari cahaya matahari langsung dan dihaluskan. 3.6.2 Persiapan Ekstrak Sebanyak 200 g serbuk daun kenari kering diultrasonikasi dalam 2000 ml etanol 96% selama 1 jam pada suhu 45 ºC. Filtrat yang diperoleh dipekatkan dengan rotary evaporator sehingga diperoleh ekstrak pekat etanol (Oktavia, 2011). 3.6.3 Partisi/Fraksinasi Ekstrak kental 15 g dilarutkan dalam 100 ml etanol pa dan ditambahkan 100 ml akuades hangat lalu dimasukkan ke dalam corong pisah, kemudian ditambah larutan n-heksana 200 ml, dikocok-kocok kuat dan didiamkan hingga terpisah sempurna. Fase n-heksana akan berada pada bagian atas dan fase etanol-air berada pada bagian bawah, kemudian dipisahkan. Fase etanol-airnya diekstraksi lagi dengan n-heksana sebanyak 2 kali. Fase etanol-air kemudian ditambahkan dengan etil asetat 200 ml, dikocok perlahan dan didiamkan hingga terpisah sempurna. Fase etil asetat Digital Repository Universitas Jember 30 akan berada pada bagian atas dan fase etanol-air berada pada bagian bawah, kemudian dipisahkan. Fase etanol-airnya diekstraksi lagi dengan etil asetat sebanyak 2 kali. Kemudian masing-masing fraksi dipekatkan (Sarker et al., 2006). 3.6.4 Penapisan Fitokimia Ekstrak 3.6.4.1 Identifikasi Alkaloid Ekstrak sebanyak 0,3 gram ditambah 5 ml HCl 2 N, dipanaskan di atas penangas air selama 2-3 menit, sambil diaduk. Setelah dingin ditambah 0,3 gram NaCl, diaduk rata kemudian disaring. Filtrat yang diperoleh ditambah 5 ml HCl 2 N dan dibagi menjadi tiga bagian yang disebut sebagai larutan IA, IB dan IC. Larutan IA ditambah pereaksi Mayer, larutan IB ditambah dengan pereaksi wagner dan larutan IC dipakai sebagai blangko. Adanya kekeruhan atau endapan menunjukkan adanya alkaloid (Depkes RI, 1995a). 3.6.4.2 Identifikasi Saponin Sebanyak 0,3 gram ekstrak dimasukkan ke dalam tabung reaksi, kemudian ditambahkan 10 ml air suling, dikocok kuat-kuat selama 30 detik. Tes buih positif mengandung saponin bila terjadi buih yang stabil selama lebih dari 30 menit dengan tinggi 3 cm di atas permukaan cairan (Depkes RI, 1995a). 3.6.4.3. Identifikasi Flavonoid Sebanyak 2 mg ekstrak kental dilarutkan dalam 1 ml etanol (95%) P. Kemudian ditambahkan 0,1 gram serbuk magnesium P dan 10 tetes asam klorida pekat. Jika terjadi warna merah jingga sampai merah ungu menunjukkan adanya flavonoid. Jika warna kuning jingga menunjukkan adanya flavon, kalkon dan auron (Fansworth, 1996). Digital Repository Universitas Jember 31 3.6.4.4. Identifikasi Polifenol dan Tanin Sebanyak 0,3 gram ekstrak ditambah 10 ml akuades panas, diaduk dan dibiarkan sampai temperature kamar, lalu ditambahkan 3-4 tetes NaCl 10%, diaduk dan disaring. Filtrat dibagi menjadi tiga bagian masing-masing ± 4 ml dan disebut sebagai larutan IA, IB dan IC (Depkes RI, 1995a). a. Larutan IC diberi beberapa tetes larutan FeCl3 , kemudian diamati terjadi perubahan warna. Jika terjadi warna hijau kehitaman menunjukkan adanya senyawa polifenol. b. Larutan IA digunakan sebagai blangko, larutan IB ditambahkan dengan sedikit larutan gelatin dan 5 ml larutan NaCl 10%. Jika terjadi endapan putih menunjukkan adanya tanin. 3.6.4.5. Identifikasi Senyawa Steroid Sebanyak 0,2 gram ekstrak dilarutkan dalam 10 ml etanol, lalu dibagi menjadi dua bagian masing-masing 5 ml, disebut sebagai larutan IA dan IB. Larutan IA digunakan sebagai blangko, sedangkan larutan IIB ditambah 1-2 ml H SO pekat melalui dinding tabung reaksi. Adanya steroid tak jenuh ditandai dengan timbulnya cincin berwarna merah (Depkes RI, 1995a). 3.6.5. Pengujian Aktivitas Antioksidan dan Penetapan IC Pengujian aktivitas antioksidan dan penetapan IC Fraksi fraksi dilakukan dengan menggunakan metode DPPH (2,2-difenil-1-pikrilhidrazil) secara spektrofotometri UV-Visibel. 3.6.5.1 Pembuatan larutan DPPH Ditimbang sebanyak 10 mg DPPH dan dilarutkan dengan etanol dalam labu 10 ml sehingga diperoleh larutan dengan konsentrasi 1000 μg/ml. Kemudian dipipet 2 ml dilarutkan etanol hingga 50 ml sehingga diperoleh konsentrasi 0,004% atau Digital Repository Universitas Jember 32 40 μg/ml atau 0,10 mM. Larutan dijaga pada suhu rendah, terlindung dari cahaya untuk segera digunakan. 3.6.5.2 Penentuan Panjang Gelombang Maksimum DPPH Larutan DPPH 0,004% (40 μg/ml) ditentukan spektrum serapannya menggunakan spektrofotometer UV pada panjang gelombang 400 nm hingga 800 nm kemudian ditentukan panjang gelombang maksimumnya. 3.6.5.3 Pembuatan Larutan Kontrol Pembuatan larutan kontrol dilakukan dengan cara etanol p.a dipipet sebanyak 200 µL kemudian dimasukkan ke dalam vial dan ditambahkan 800 µL larutan DPPH lalu dikocok sampai homogen dan diukur absorbansinya pada panjang gelombang maksimumnya. 3.6.5.4 Penentuan Operating Time Larutan DPPH ditambahkan kedalam larutan ekstrak uji dan larutan vitamin C 30 μg/ml dan 7 μg/ml (Vit. C) (4:1), dihomogenkan, lalu diamati absorbansinya pada panjang gelombang maksimum DPPH, dengan interval waktu 5 menit hingga diperoleh absorbansi yang stabil yaitu tidak terlihat adanya penurunan absorbansi sampai waktu 60 menit (1 jam). 3.6.5.5 Pembuatan Larutan Uji Ekstrak dan Fraksi Sebanyak 25 mg masing-masing ekstrak dan fraksi daun kenari dilarutkan dengan 10 ml etanol pa dalam labu ukur 10 ml sehingga diperoleh konsentrasi 2500 μg/ml (larutan induk). Kemudian dilakukan pengenceran dengan memipet 1,6 ml dari larutan induk masing-masing (kecuali fraksi n–heksana) dilarutkan etanol hinga 10 ml dalam labu ukur sehingga diperoleh konsentrasi 400 μg/ml. Kemudian dipipet 1; 0,75; 0,5 dan 0,25 ml larutan induk 400 μg/ml masing-masing ke dalam labu ukur 10,0 ml, ditambahkan etanol p.a hingga tanda batas sehingga diperoleh konsentrasi Digital Repository Universitas Jember 33 10, 20, 30 dan 40 μg/ml. Larutan uji fraksi n-heksana dibuat dengan cara memipet 0,3; 0,4; 0,5 dan 0,6 dari larutan induk 2500 μg/ml dilarutkan etanol hingga 10 ml dalam labu ukur sehingga diperoleh konsentrasi 75, 100, 125 dan 150 μg/ml. 3.6.5.6 Pembuatan Larutan Vitamin C sebagai Pembanding a. Pembuatan larutan induk 1 vitamin C konsentrasi 2000 μg/ml Sebanyak 20 mg vitamin C ditimbang dan dilarutkan dalam 10 ml etanol p.a kemudian dikocok hingga homogen. b. Pembuatan larutan vitamin C konsentrasi 3, 5, 7 dan 9 μg/ml Dipipet 0,2 ml larutan induk 1 masukkan ke dalam labu ukur 10,0 ml didapatkan konsentrasi 40 μg/ml disebut larutan induk 2 vitamin C. Dipipet 0,75; 1,25; 1,75 dan 2,25 ml larutan induk 2 vitamin C masing-masing ke dalam labu ukur 10,0 ml, ditambahkan etanol p.a hingga tanda batas. Selanjutnya dipipet 200 µL masingmasing ke dalam 5 vial dan ditambahkan 800 µL larutan DPPH 0,004% dikocok hingga homogen kemudian diinkubasi pada suhu kamar pada operating time. c. Serapan dari larutan tersebut diukur pada panjang gelombang maksimum DPPH. 3.6.5.7 Penentuan Aktivitas Antioksidan Penentuan aktivitas antioksidan dilakukan berdasarkan metode Molyneux (2003) dengan modifikasi. Dipipet 800 µL larutan DPPH 0,004 % ditambah dengan 200 µL masing-masing larutan uji ekstrak dan fraksi konsentrasi 10, 20, 30 dan 40 μg/ml (fraksi n–heksana: 75, 100, 125 dan 150 μg/ml). Campuran didiamkan selama waktu operating time yang telah diperoleh. Larutan ini kemudian diukur absorbansinya pada panjang gelombang maksimum DPPH. Blangko yang digunakan adalah larutan ekstrak dengan etanol 1:4 (200 µL ekstrak : 800 µL etanol). Sebagai kontrol digunakan larutan DPPH dengan etanol 4:1(800 µL DPPH : 200 µL etanol). Sebagai pembanding digunakan vitamin C konsentrasi 3, 5, 7 dan 9 μg/ml dengan perlakuan yang sama dengan larutan uji. Digital Repository Universitas Jember 34 3.6.5.8 Penentuan Persentase Peredaman Persen peredaman dihitung menggunakan rumus : % Inhibisi = – x 100% Setelah didapatkan presentasi inhibisi dari masing-masing konsentrasi, kemudian ditentukan persamaan y = bx + a dengan perhitungan secara regresi linear dimana x adalah konsentrasi (μg/ml) dan y adalah presentase inhibisi (%). Aktivitas antioksidan dinyatakan dengan Inhibition Concentration 50% (IC ) yaitu konsentrasi sampel yang dapat meredam radikal DPPH sebanyak 50%. Nilai IC didapatkan dari nilai x setelah mengganti y = 50. 3.6.6 Analisis Kuantitatif Flavonoid Total (Chang et al., 2002). 3.6.6.1 Pembuatan Kurva Kalibrasi Kuersetin Larutan baku dibuat dengan menimbang 20 mg kuersetin, dilarutkan dengan etanol sampai 10 ml. Satu seri konsentrasi larutan kuersetin dalam etanol dibuat dari larutan baku, yaitu dengan konsentrasi: 5, 10, 15, 20 dan 25 µg/ml. Kemudian masing-masing dipipet 0,5 ml dilarutkan 1,5 mL etanol ditambahkan 0,1 mL AlCl 10% ditambahkan 0,1 mL potasium asetat 1M ditambakan 2,8 mL akuades, didiamkan 30 menit diukur absorbansinya pada panjang gelombang 415 nm, blangko dibuat sama dengan larutan standar dengan mengganti AlCl 10% dengan akuades. Dari data ini persamaan regresi antara konsentrasi kuersetin dengan serapan dibuat. 3.6.6.2 Penentuan Kadar Flavonoid Total Penentuan kadar flavonoid total dilakukan dengan spektrofotometri menggunakan reagen aluminium klorida sesuai prosedur Chang et al. (2002). Sebanyak 0,5 ml larutan ekstrak dengan konsentrasi 200 μg/ml dilarutkan 1,5 mL etanol ditambahkan 0,1 mL AlCl 10% ditambahkan 0,1 mL potasium asetat 1M ditambakan 2,8 mL akuades, didiamkan 30 menit diukur absorbansinya pada panjang gelombang 415 nm, blangko dibuat sama dengan larutan uji dengan mengganti AlCl Digital Repository Universitas Jember 35 10% dengan akuades. Dibuat perhitungan rata-rata dua kali pengukuran dan kandungan flavonoid dinyatakan dengan kesetaraan pembanding baku kuersetin. 3.7 Analisis Data Seluruh analisis dilakukan dua kali replikasi. Data ditunjukkan sebagai ratarata ± standar deviasi. Aktivitas antioksidan ditunjukkan dengan nilai IC yang diperoleh dari persamaan regresi konsentrasi larutan uji dengan persen peredaman DPPH. Nilai flavonoid total diperoleh dari substitusi nilai absorbansi sampel pada persamaan regresi kurva standar kuersetin dinyatakan dengan gram kuersetin ekuivalen tiap gram ekstrak sampel. Korelasi antara kadar flavonoid total dengan aktivitas antioksidan diperoleh dengan menggunakan persamaan regresi antara flavonoid total dengan nilai IC masing-masing sampel ekstrak. Digital Repository Universitas Jember BAB 4. HASIL PENELITIAN DAN PEMBAHASAN 4.1 Pembuatan Ekstrak Daun Kenari Bahan tumbuhan yang digunakan dalam penelitian ini adalah daun kenari yang berasal dari Taman Nasional Merubetiri Jember. Daun kenari yang digunakan adalah daun yang berwarna hijau, daun yang masih muda dan kering tidak digunakan. Daun kenari yang telah dikeringkan kemudian dibuat serbuk dengan penggilingan untuk memperluas permukaan bahan agar pada tahap ekstraksi interaksi antara pelarut pengekstraksi dan bahan yang diekstraksi menjadi lebih efektif (Harborne, 1996). Serbuk kering daun kenari sebanyak 200 g kemudian diultrasonikasi dengan 2000 ml etanol 96% selama satu jam pada suhu 45 ºC, kemudian disaring dengan corong Buchner dan filtrat yang diperoleh dipekatkan dengan rotary evaporator sehingga diperoleh ekstrak kental etanol. Metode ekstraksi ultrasonikasi digunakan karena ultrasonikasi memanfaatkan gelombang ultrasonik dengan frekuensi rendah 20-40 kHz yang menyebabkan proses kavitasi untuk membantu difusi pelarut ke dalam dinding sel tanaman sehingga proses perpindahan masa senyawa bioaktif dari dalam sel tanaman ke pelarut menjadi lebih cepat yang menyebabkan waktu ekstraksi lebih singkat (Ashley et al., 2001). Etanol dipilih sebagai pelarut pengekstraksi karena etanol merupakan pelarut universal dengan indeks polaritas 5,2 (Snyder et al., 1997), sehingga berbagai senyawa baik polar maupun nonpolar seperti alkaloid, flavonoid, saponin, tanin, steroid dan terpenoid yang terkandung pada daun kenari dapat tertarik ke dalam pelarut serta toksisitasnya lebih rendah dibanding metanol (Tiwari et al., 2011). Etanol dengan konsentrasi 96 % dengan 4 % air dipilih sebagai pelarut pengekstraksi karena menghasilkan ekstrak yang mempunyai aktivitas antioksidan yang tinggi dibandingkan dengan menggunakan pelarut etanol 70 % maupun air (Elleanore, 2013). 36 Digital Repository Universitas Jember 37 Sebagian ekstrak kental etanol yang diperoleh kemudian difraksinasi. Prinsip metode ini didasarkan pada distribusi zat terlarut dengan perbandingan tertentu antara dua pelarut yang tidak saling bercampur (Khopkar, 2003). Sebanyak 15 g ekstrak etanol dilarutkan dengan campuran etanol dan air hangat (1:1) kemudian dilakukan pemisahan partisi (fraksinasi) menggunakan corong pisah dengan pelarut n-heksana dengan jumlah yang sama, setelah didiamkan akan terjadi dua fase, fase n-heksana akan berada di atas karena memiliki berat jenis lebih kecil yaitu 0,660 sedangkan fase etanol-air akan berada di bawah karena memiliki berat jenis lebih besar yaitu 0,996 (Depkes RI, 1995b). Kedua fase kemudian dipisahkan dan dilakukan fraksinasi ulang pada fase etanol-air sebanyak dua kali. Fase etanol-air kemudian difraksinasi lagi dengan pelarut etil asetat, akan terbentuk dua fase, fase etil asetat akan berada di atas karena memiliki berat jenis lebih kecil dari air yaitu 0,902 (Depkes RI, 1995b). Kedua fase kemudian dipisahkan dan dilakukan fraksinasi ulang pada fase etanol-air sebanyak dua kali. Masing-masing fraksi kemudian diuapkan dengan rotary evaporator sehingga diperoleh fraksi n-heksana, fraksi etil asetat dan fraksi etanolair. Hasil rendemen masing-masing ekstrak dan fraksi dapat dilihat dalam Tabel 4.1. Tabel 4.1 Data rendemen ekstrak dan fraksi daun kenari Nama ekstrak/fraksi Bobot ekstrak (g) Rendemen ekstrak (%) Ekstrak etanol 96 % Fraksi n-heksana Fraksi etil asetat Fraksi etanol-air 19,14 0,86 5,43 12,18 9,57 5,733 36,20 81,20 Fraksinasi dalam penelitian ini menggunakan beberapa pelarut yang mempunyai kepolaran berbeda. N-heksana bersifat non-polar dengan tujuan untuk menghilangkan lemak dan mengekstraksi senyawa-senyawa yang bersifat non-polar seperti asam lemak, sterol, kumarin, dan beberapa terpenoid. Etil asetat dengan tingkat kepolaran menengah digunakan untuk mengekstraksi senyawa dengan polaritas menengah seperti flavonoid, tanin dan beberapa alkaloid. Pemilihan etil Digital Repository Universitas Jember 38 asetat sebagai pelarut didasarkan pada asumsi bahwa etil asetat mampu menggabungkan gugus polar dan non-polar sehingga komponen pada ekstrak yang bersifat polar dan non-polar dapat terekstrak. Air merupakan pelarut yang bersifat polar digunakan untuk mengekstraksi senyawa yang bersifat polar seperti flavonoid, glikosida, tanin dan beberapa alkaloid (Sarker et al, 2006). 4.2 Penapisan Fitokimia Analisis fitokimia adalah salah satu cara untuk mengetahui kandungan metabolit sekunder pada suatu tanaman. Senyawa-senyawa yang diperiksa keberadaannya adalah alkaloid, steroid, saponin, flavonoid, tanin dan senyawa fenolik. Penapisan dilakukan pada ekstrak etanol daun kenari. Hasil uji fitokimia ekstrak etanol kenari dapat dilihat pada Lampiran A dan Tabel 4.2. Tabel 4.2. Hasil uji penapisan fitokimia ekstrak etanol daun kenari Senyawa yang diuji Pereaksi Alkaloid Mayer, wagner Steroid H SO Saponin Uji buih Tanin Serbuk magnesium dan HCl pekat NaCl 10 % Polifenol FeCl Flavonoid Hasil Tidak terbentuk endapan/kekeruhan Tidak terbentuk cincin merah di permukaan Terbentuk buih yang stabil selama 30 menit Keterangan + Terbentuk warna merah ungu + Terbentuk endapan putih Terbentuk warna hijau kehitaman + + Berdasarkan hasil penapisan fitokimia pada ekstrak etanol daun kenari yang diperoleh, diketahui mempunyai banyak persamaan dengan kandungan fitokimia genus Canarium L. lainnya yakni mengandung flavonoid, polifenol, tanin, saponin dan sama-sama tidak terkandungnya senyawa alkaloid. Pada C. schweinfurthii (Atile) mengandung saponin, tanin, glikosida jantung, steroid dan flavonoid sedangkan alkaloid dan antrakuinon tidak ada (Ngbede et al, 2008). Pada C. odontophyllum Digital Repository Universitas Jember 39 mengandung terpenoid, tanin, flavonoid, fenol dan saponin sedangkan alkaloid tidak ada (Basri dan Nor, 2014). Pada C. album mengandung flavonoid, triterpena dan seskuiterpena (Mogana et al., 2011). Semakin dekat hubungan kekerabatan (taxa) menghasilkan kandunga kimia yang lebih mirip (McNair, 1935). Terdapatnya senyawa tanin, polifenol dan flavonoid mendukung ekstrak daun kenari memiliki potensi sebagai sebagai antioksidan karena senyawa polifenol, flavonoid dan tanin dalam beberapa tanaman mempunyai korelasi yang signifikan dengan aktivitas antioksidan (Heim et al., 2002; Robinson, 1995). 4.3 Uji Aktivitas Antioksidan 4.3.1 Optimasi Panjang Gelombang DPPH Optimasi ini bertujuan untuk mencari panjang gelombang yang memberikan absorbansi DPPH maksimal. Pada penelitian ini, dilakukan pengamatan absorbansi larutan kontrol DPPH 0,004% dan larutan uji sampel konsentrasi tertinggi pada panjang gelombang 400-800 nm, seperti yang terlihat pada Gambar 4.1. Hasil penelitian menunjukkan bahwa panjang gelombang maksimum larutan DPPH 0,004% adalah 516 nm. Berdasarkan hasil spektra sampel, diketahui bahwa pada panjang gelombang maksimum larutan DPPH 0,004% (516 nm) fraksi nheksana dan ekstrak etanol memberikan nilai absorbansi sehingga pada pengukuran antioksidan penelitian ini digunakan blangko campuran ekstrak uji dengan etanol sebagai pengganti larutan DPPH untuk menghilangkan pengaruh absorbansi sampel. Data pengamatan panjang gelombang DPPH dan ekstrak uji dapat dilihat pada Lampiran C. Digital Repository Universitas Jember 40 2 Absorbansi 1.5 DPPH 0,004 % Ekstrak etanol 40 μg/ml 1 Fraksi n-heksana 150 μg/ml 0.5 Fraksi etil asetat 40 μg/ml Fraksi etanol-air 40 μg/ml 0 400 450 500 550 600 Panjang gelombang (nm) Gambar 4.1 Absorbansi DPPH dan sampel ekstrak pada panjang gelombang (λ) 400-600 nm 4.3.2 Penentuan Waktu Optimum Pada tahap ini ditentukan waktu optimum inkubasi sampel dengan larutan DPPH untuk bereaksi sempurna. Sampel ekstrak dan fraksi serta pembanding vitamin C direaksikan dengan larutan DPPH dan diamati absorbansinya pada panjang gelombang 516 nm mulai menit ke 0 sampai menit ke 60 dengan selang waktu 5 menit. Waktu reaksi dikatakan optimum jika reaksi terjadi sampai membentuk plateau (Molyneux, 2004). Nilai waktu optimum inkubasi selama 30 menit merupakan waktu yang sering digunakan dalam mereaksikan DPPH (Molyneux, 2004). Hasil penelitian menunjukkan bahwa pada menit ke-30, absorbansi larutan uji ekstrak etanol, fraksi etil asetat, fraksi etanol-air dan vitamin C relatif konstan, sedangkan fraksi n-heksana absorbansinya konstan pada menit ke-35 sehingga pada uji aktivitas antioksidan semua sampel selanjutnya dilakukan pada menit ke-30 dan menit ke-35 untuk fraksi n-heksana (Gambar 4.2). Digital Repository Universitas Jember 41 0.9 0.8 Absorbansi 0.7 0.6 Ekstrak etanol 0.5 Fraksi n-heksana 0.4 Fraksi etil asetat 0.3 Fraksi etanol-air 0.2 Vit.C 0.1 0 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Waktu (menit) Gambar 4.2 Absorbansi rata-rata larutan DPPH 0,004 % dengan penambahan larutan uji mulai menit ke 5 hingga ke 60 4.3.3 Pengukuran Aktivitas Antioksidan Pengujian aktivitas antioksidan ekstrak dilakukan dengan menggunakan metode DPPH. Metode DPPH dipilih karena sederhana, mudah, cepat, peka, reprodusibel dan hanya memerlukan sedikit sampel (Blois, 2003). Prinsip dari metode DPPH adalah senyawa antioksidan akan mendonorkan atom hidrogennya pada radikal DPPH sehingga akan menyebabkan DPPH menjadi bentuk tereduksi yang bersifat non-radikal. DPPH dalam bentuk non-radikal akan kehilangan warna ungunya yang mana pemudaran warna ini dapat ditunjukkan dengan penurunan serapan dari DPPH pada panjang gelombang maksimum yang diukur menggunakan spektrofotometer UV-Vis (Molyeneux, 2004). Pengukuran penurunan serapan DPPH pada larutan uji dihitung terhadap serapan kontrol yakni larutan DPPH dengan pelarut tanpa sampel. Digunakan blangko berupa larutan uji ekstrak ditambahkan etanol Digital Repository Universitas Jember 42 pengganti larutan DPPH untuk menghilangkan pengaruh absorbansi sampel pada setiap pengukuran sampel uji. Berdasarkan data penurunan absorbansi DPPH pada larutan uji, dapat dihitung peredaman DPPH (%) seperti yang terlihat pada Lampiran G. Setelah itu, diperoleh hubungan antara konsentrasi larutan uji dan persen peredaman DPPH. Hasil regresi linier menunjukkan adanya korelasi yang baik antara konsentrasi larutan uji dengan % peredaman DPPH. Hal ini ditunjukkan dengan nilai r yang mendekati 1 dan semua nilai r hitung sampel uji > r tabel dengan signifikasi 0,05 yakni 0,950 yang berarti semakin besar konsentrasi larutan uji, semakin besar pula persen peredamannya seperti yang terlihat pada Lampiran H dan Gambar 4.3. 100 Peredaman DPPH (%) 90 80 70 60 Ekstrak etanol 50 Fraksi n-heksana 40 Fraksi etil asetat 30 Fraksi etanol-air 20 Vit. C 10 0 0 20 40 60 80 100 120 140 Konsentrasi (µg/mL) Gambar 4.3 Hubungan konsentrasi dengan persen peredaman DPPH (rata-rata ± SD) ekstrak dan fraksi daun kenari Untuk menyatakan aktivitas antioksidan ekstrak daun kenari, digunakan nilai IC sebagai parameter karena IC menunjukkan nilai konsentrasi yang mampu meredam 50 % radikal bebas DPPH (Molyneux, 2004). Nilai IC diperoleh dari Digital Repository Universitas Jember 43 mensubstitusi nilai y dari persamaan regresi linear antara konsentrasi larutan uji dengan persen peredaman DPPH dengan nilai 50, sehingga diperoleh nilai x (IC ). Semakin kecil IC , maka semakin besar daya peredamannya. Menurut Blois (2003), tingkat kekuatan antioksidan adalah sangat kuat (IC μg/ml), sedang (IC 101-150 μg/ml), lemah (IC penelitian, diperoleh IC Replikasi 1 Ekstrak etanol 2 Fraksi nheksana 50-100 > 150 μg/ml). Berdasarkan hasil seperti yang terlihat pada Tabel 4.3. Tabel 4.3 Nilai IC Sampel < 50 μg/ml), kuat (IC 1 2 1 Fraksi etil asetat 2 1 Fraksi etanol-air 2 1 Vit. C 2 ekstrak dan fraksi daun kenari Persamaan regresi y = 1,540x + 10,987 r² = 0,996; r = 0,998 y = 1,537x + 11,184 r² = 0,996; r = 0,998 y = 0,358x – 12,864 r² = 0,999; r = 0,999 y = 0,362x - 13,311 r² = 0,999; r = 0,999 y = 2,193x + 5,829 r² = 0,997; r = 0,998 y = 2,185x + 6,018 r² = 0,997; r = 0,998 y = 1,503x + 6,660 r² = 0,983; r = 0,991 y = 1,515x + 6,375 r² = 0,985; r = 0,992 y = 6,749x + 5,620 r² = 0,999; r = 0,999 y = 6,744x + 5,815 r² = 0,999; r = 0,999 IC (μg/ml) rata-rata ± SD 25,294 ± 0,055 175,245 ± 0,499 20,135 ± 0,009 28,806 ± 0,042 6,564 ± 0,016 Berdasarkan hasil penelitian menunjukkan bahwa secara umum keempat ekstrak mempunyai aktivitas antioksidan, meskipun fraksi n-heksana memiliki IC di atas 150 μg/ml. Ekstrak etanol, fraksi etanol-air dan fraksi etil asetat mempunyai aktivitas yang sangat kuat sebagai antioksidan dengan IC masing-masing 25,294 μg/ml, 28,806 μg/ml dan 20,135 μg/ml. Aktivitas terkuat dimiliki oleh fraksi etil Digital Repository Universitas Jember 44 asetat, kemudian ekstrak etanol, fraksi etanol-air dan fraksi n-heksana dengan aktivitas terendah. Bila keempat ekstrak tersebut dibandingkan dengan kontrol positif vitamin C, IC vitamin C lebih kecil daripada keempat ekstrak tersebut. Hal ini disebabkan karena vitamin C yang digunakan merupakan senyawa murni yang terbukti mempunyai aktivitas antioksidan bila dibandingkan dengan ekstrak yang terdiri dari berbagai komponen. Menurut Khokhar dan Apenten (2003), kemungkinan aktivitas antioksidan dipengaruhi oleh kehadiran gugus hidroksil (OH). Aktivitas antioksidan juga sangat tergantung pada jumlah dan konfigurasi gugus OH yang ada pada suatu molekul (Heim et al., 2002). Flavonoid merupakan senyawa golongan fenolik yang mempunyai aktivitas sebagai antioksidan (Pietta, 2000). Keberadaan gugus hidroksil pada senyawa fenol dan flavonoid menimbulkan aktivitas antioksidan (Egwaikhide dan Gimba, 2007). Hal ini dapat disebabkan karena atom oksigen pada gugus hidroksil mempunyai pasangan elektron bebas yang cukup untuk menghambat reaktivitas atom reaktif penyusun senyawa radikal bebas (Egwaikhide dan Gimba, 2007). Flavonoid akan memberikan aktivitas antioksidan jika gugus OH pada posisi orto C 3’,4’, OH pada C-3, fungsi okso pada C-4, ikatan rangkap C-2 dengan C-3. Gugus OH pada posisi orto C 3’,4’ (cincin B) mempunyai pengaruh terbesar terhadap aktivitas atioksidan flavonoid. Flavonoid yang memiliki gugus OH pada C-3 dan ikatan rangkap C-2 dengan C-3 memiliki aktivitas antioksidan lebih tinggi dibandingkan dengan flavonoid yang hanya memiliki gugus OH pada C-3 serta flavonoid aglikon akan memiliki aktivitas antioksidan lebih tinggi dibandingkan dengan flavonoid glikosida (Heim et al., 2002). Gambar 4.4. Struktur dasar flavonoid (Heim et al., 2002) Digital Repository Universitas Jember 45 Berdasarkan hasil penelitian, diketahui fraksi etil asetat memberikan aktivitas antioksidan paling kuat, dengan IC sebesar 20,135 μg/ml sehingga diperlukan penelitian lebih lanjut untuk mengetahui senyawa mana yang memberikan aktivitas antioksidan pada fraksi etil asetat, misalnya dengan cara menggunakan metode pemisahan kromatografi kolom kemudian menguji aktivitas antioksidan setiap fraksi yang dihasilkan. Fraksi teraktif dapat dikarakterisasi senyawa apa yang dikandungnya. Hasil penelitian menunjukkan bahwa fraksi etil asetat mempunyai aktivitas antioksidan yang sangat kuat dengan IC sebesar 20,135 μg/ml, sehingga perlu dilakukan pengembangan formulasi yang tepat agar dapat dimanfaatkan secara optimal sesuai tujuan penelitian untuk mencari bahan alam yang berpotensi sebagai sumber antioksidan. Perlu juga dilakukan uji aktivitas antioksidan pada daun spesies genus Canarium L. lainnya yang belum pernah dilakukan karena kemungkinan juga berpotensi memiliki aktivitas antioksidan karena semakin dekat hubungan kekerabatan (taxa) menghasilkan kandungan kimia yang lebih mirip, termasuk senyawa yang mempunyai aktivitas sebagai antioksidan (McNair, 1935). 4.4 Penetapan Kadar Flavonoid Total Pada penetapan kadar flavonoid total, masing-masing ekstrak dan fraksi daun kenari direaksikan dengan AlCl dan potasium asetat sehingga larutan berwarna kuning. Hal ini disebabkan pembentukan kompleks asam yang stabil dengan gugus keton pada C-4 atau gugus hidroksil pada C-3 atau C-5 dari flavon dan flavonol, sehingga terbentuk larutan kuning (Chang et al., 2002). Kandungan flavonoid total dinyatakan dalam masa ekivalen kuersetin tiap gram ekstrak. Hasil pengukuran flavonoid total dapat dilihat pada Lampiran I. Dari data tersebut, dibuat kurva kalibrasi kuersetin yang menghasilkan persamaan y = 0,006x - 0,054 (r = 0,993; r = 0,986), dengan y merupakan nilai absorbansi dan x merupakan kadar kuersetin. Dari persamaan kurva kalibrasi didapat nilai r = 0,993 yang lebih besar dari nilai r tabel dengan signifikasi 0,05 yaitu 0,878 sehingga ada korelasi bermakna antara absorbansi Digital Repository Universitas Jember 46 dengan konsentrasi dan persamaan regresi tersebut dapat digunakan (Gandjar dan Rohman, 2007). Kemudian ditentukan kadar flavonoid total dengan memasukkan nilai absorbansi sampel pada persamaan kurva. Hasilnya dapat dilihat pada Tabel 4.4. Tabel 4.4. Hasil penetapan kadar flavonoid total ekstrak daun kenari Sampel Kadar g QE/g ekstrak ± SD Ekstrak etanol 2,624 ±0,012 Fraksi n-hesana 0,499 ± 0,023 Fraksi etil asetat 3,846 ± 0,006 Fraksi etanol-air 1,596 ± 0,006 Berdasarkan hasil penetapan kadar flavonoid total sampel, diketahui fraksi etil asetat memiliki kadar flavonoid total tertinggi, kemudian ekstrak etanol, fraksi etanolair dan fraksi n-heksana mempunyai kadar flavonoid total terendah. Diduga hasil ini mempengaruhi besar aktivitas antioksidan yang dihasilkan yang menunjukkan aktivitas antioksidan terbesar dimiliki fraksi etil asetat, kemudian ekstrak etanol, fraksi etanol-air dan fraksi n-heksana mempunyai aktivitas terendah. Diduga bahwa senyawa-senyawa yang berperan sebagai antioksidan dalam tanaman ini adalah flavonoid yang bersifat semi polar sehingga cenderung berada dalam etil asetat, seperti katekin dan proantosianidin (Robinson, 1995). Jumlah gugus hidroksil dan jenis substituen pada struktur flavonoid yang mempengaruhi kelarutannya, semakin banyak gugus hidroksil yang dimiliki menyebabkan semakin besar kelarutannya dalam air, begitu pula sebaliknya semakin sedikit gugus hidroksil dan semakin banyak substituen yang bersifat kurang polar seperti gugus metoksi menyebabkan kelarutan flavonoid menurun (Akowuah et al., 2005). Nilai kadar flavonoid total masing-masing sampel yang telah ditentukan, dikorelasikan terhadap nilai IC masing-masing sampel dengan menggunakan persamaan regresi linier untuk mengetahui korelasi antara keduanya. Berdasarkan hasil korelasi, diperoleh persamaan regresi linier seperti pada Gambar 4.4. Digital Repository Universitas Jember 47 IC 50 (µg/mL) 200 180 160 140 120 100 y = -41,896x + 152,079 r² = 0,632 80 60 40 20 0 0 1 2 3 4 5 Flavonoid Total (g kuersetin ekuivalen/g ekstrak) Gambar 4.4. Korelasi linier antara aktivitas antioksidan IC ekstrak dan fraksi daun kenari (y) dan kadar flavonoid total (x) Berdasarkan hasil dari regresi linier diketahui korelasi antara IC (y) dan kadar flavonoid total (x) ekstrak dan fraksi daun kenari yang mempunyai koefisien korelasi r² = 0,632 (y = -41,896 + 152,079). Hal ini menunjukkan bahwa 63,2 % aktivitas antioksidan dari ekstak dan fraksi daun kenari karena kontribusi kehadiran senyawa flavonoid. Juga dapat disimpulkan bahwa aktivitas antioksidan ekstrak dan fraksi daun kenari tidak hanya karena adanya senyawa flavonoid, aktivitas antioksidan juga dapat berasal dari adanya metabolit sekunder yang bersifat antioksidan seperti minyak volatil, karotenoid dan vitamin, sehingga 36,8 % aktivitas antioksidan yang dihasilkan ekstrak dan fraksi daun kenari dipengaruhi kehadiran senyawa selain flavonoid (Javanmardi et al., 2003). Kandungan senyawa polifenol, tanin dan saponin yang diketahui melalui penapisan fitokimia pada daun kenari juga berkontribusi pada aktivitas antioksidan yang dihasilkan karena telah diketahui senyawa polifenol, tanin dan saponin mempunyai aktivitas antioksidan (Heim et al., 2002; Robinson, 1995). Digital Repository Universitas Jember 48 Flavonoid, polifenol, tanin dan saponin yang terkandung dalam daun kenari pada penelitian ini mempunyai aktivitas antioksidan karena dapat mendonorkan atom hidrogen pada radikal DPPH. Menurut Molyneux (2004), ketika larutan DPPH dicampur dengan substansi yang dapat mendonorkan atom hidrogen, DPPH akan menjadi bentuk tereduksi ditandai dengan perubahan warna ungu DPPH. DPPH digambarkan dengan Z • dan molekul yang dapat mendonorkan atom H dengan AH, reaksi yang tejadi adalah: Z • + AH = ZH + A• Dimana ZH merupakan bentuk tereduksi DPPH (non radikal) dan A• adalah radikal baru yang dihasilkan dari reaksi ini. Radikal A• akan mengalami reaksi selanjutnya yang mengendalikan stoikiometri keseluruhan yaitu jumlah molekul DPPH yang tereduksi oleh molekul tersebut (Molyneux, 2004). Digital Repository Universitas Jember 49 BAB 5. KESIMPULAN DAN SARAN 5.1 Kesimpulan Berdasarkan penelitian yang telah dilakukan dapat diambil kesimpulan sebagai berikut: a. Ekstrak etanol daun kenari mengandung senyawa flavonoid, polifenol, tanin dan saponin serta tidak mengandung senyawa alkaloid dan steroid. b. Ekstrak etanol, fraksi n-heksana, fraksi etil asetat, dan fraksi etanol-air daun kenari memiliki aktivitas antioksidan dengan IC berturut turut 25,294 ± 0,055; 175,245 ± 0,4999; 20,135 ± 0,009 dan 28,806 ± 0,0424 μg/ml. c. Kandungan flavonoid total ekstrak dan fraksi daun kenari yang dinyatakan dengan massa ekivalen kuersetin, keempat ekstraknya yakni ekstrak etanol, fraksi nheksan, fraksi etil asetat, dan fraksi etanol-air masing-masing memiliki kadar sebesar 2,624 ± 0,012; 0,499 ± 0,023; 3,846 ± 0,006 dan 1,596 ± 0,006 gram ekuivalen kuersetin per gram ekstrak, korelasi aktivitas antioksidan dengan kadar flavonoid ekstrak dan fraksi daun kenari diperoleh nilai r² = 0,632. 5.2 Saran Berdasarkan penelitian yang telah dilakukan, penulis menyarankan: a. Perlu dilakukan pemurnian fraksi etil asetat dari ekstrak etanol daun kenari dengan metode pemisahan yang sesuai untuk mengetahui senyawa murni yang berperan sebagai antioksidan. b. Perlu dilakukan pengembangan formulasi yang tepat dari fraksi etil asetat ekstrak etanol daun kenari. c. Perlu dilakukan uji aktivitas antioksidan pada daun spesies genus Canarium lainnya yang belum pernah dilakukan. Digital Repository Universitas Jember DAFTAR PUSTAKA Akowuah, G.A., Ismail, Z., Norhayati, I., & Sadikin, A. 2005. The Effect of Different Extraction Solvents of Varying Polarities on Polyphenols of Orthosiphon stamineus and Evaluation of Free Radical-Scavenging Activity. Food Chemistry. Vol. 93: 311. Arnao, M.B. 2000. Some Methodological Problems in The Determination of Antioxidant Activity Using Chromogen Radicals: A Practical Case. Trends Food Sci.Technol. Vol. 11: 419-421. Arnao, M.B., Cano, A. & Acosta, M. 1999. Method to Measure The Antioxidant Activity in Plant Material. A Comparative Discussion. Free Radical Res. Vol. 31: 89- 96. Ashley, K., Andrews, R.N., Cavazos, L., & Demange, M. 2001. Ultrasonic Extraction as a Sampel Preparation Technique for Elemental Analysis by Atomic Spectrometry. Journal of Analytic Spectrometry. Vol. 16: 1147-1153. Basri, D.F. & Nor, N.H.M. 2014. Phytoconstituent Srceening and Antibacterial Activity of the Leaf Extracts from Canarium odontophyllum Miq. American Journal of Plant Science. Vol. 5: 2878-2888. Blois, MS. 1958. Antioxidant Determinations by The Use of A Stable Free Radical. Nature. Vol. 181: 1199-1200. Chang, C.C., Yang, M.H., Wen, H.M., & Chern, J.C. 2002. Estimation of Total Flavonoid Content in Propolis by Two Complementary Colorimetric Methods Journal of Food and Drug Analysis. Vol. 10: 178-182. Departemen Kesehatan Republik Indonesia. 1995a. Materia Medika Indonesia Jilid VI. Jakarta: Departemen Kesehatan Republik Indonesia. Departemen Kesehatan Republik Indonesia. 1995b. Farmakope Indonesia Edisi VI. Jakarta: Departemen Kesehatan Republik Indonesia. Departemen Kesehatan Republik Indonesia. 2000. Parameter Standar Umum Ekstrak Tumbuhan Obat Cetakan Pertama. Jakarta: Departemen Kesehatan Republik Indonesia. 50 Digital Repository Universitas Jember 51 Diplock, A.T., Charleux, J.L., Willi, G.C., Kok, F.J., Evans, C.R., Roberfroid, M., Stahl, W., & Ribes, J.V. 1998. Functional Food Science and Defence Against Reactive Oxidative Species. Suppl. Vol. 1: 77-112. Djarkasi, G.S.S., Nurali, E.J.N., Sumual, M.F., & Lalujan, L.E. 2011, Analysis of Bioactive Compound C. Nut (C. indicum L). Skripsi. Universitas Sam Ratulangi in cooperation with USAID – Texas A&M University. Donald, R.B. & Cristobal, M. 2006. Antioxidant Activities of Flavonoids. J. Agric. Vol. 52: 125-757. Droge, W. 2002. Free Radicals in The Physiological Control of Cell Function. Physiol. Rev. Vol. 82: 47-95. Egwaikhide, P.A & Gimba, C.E. 2007. Analysis of the Phytochemical Content and Anti-microbial Activity of Plectranthus glandulosis Whole Plant. Middle-East Journal of Scientific Research. Vol 2 (3-4):135-138. Elleanore, Y. 2013. Analisis Fitokimia dan Aktivitas Antioksidan Ekstrak Daun Sengon (Paraserianthes falcataria (L) Nielsen) Menggunakan Metode DPPH. Skripsi. Bogor: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam IPB. Evans, B. 1994. Overview of resource potential for indigenous nut production dalam South Pacific Indigenous Nuts. Edited by Steven, M.L., R.M. Bourke, and B.R. Evans. Canberra: ACAR. Fansworth, N.R. 1996. Biological and Phytochemical Screening of Plants. Journal of Pharmaceutical Science. Vol. 55 (3): 257-259. Fessenden, R.J. & Fessenden, J.S. 1995. Kimia Organik, Jilid II, diterjemahkan oleh Pudjaatmaka, A.H., edisi ke 3. Jakarta: Erlangga. Gandjar, I. G. & Rohman, A. 2007. Kimia Farmasi Analisis. Yogyakarta: Pustaka Pelajar. Handa, S.S., Khanuja, S.P.S., Longo G., & Rakes, D.D. 2008. Extraction Technologies for Medicinal and Aromatic Plants. Trieste: International Centre for Sciences and High Technology. Harborne, J.B. 1996. Metode Fitokimia: Penentuan Cara Modern Menganalisis Tumbuhan, penerjemah Padmawinata, K., Soediro, I. Bandung: ITB Press. Digital Repository Universitas Jember 52 Hariyatmi. 2004. Kemampuan Vitamin E Sebagai Antioksidan Terhadap Radikal Bebas Pada Lanjut Usia. MIPA. Vol. 14 (1): 52-60. Heim, K.E., Tagliaferro, A.R., & Bobilya, D.J. 2002. Flavonoid Antioxidants: Chemistry, Metabolism and Structure-Activity Relationships. Journal of Nutritional Biochemistry. Vol. 13: 572 -584. Javanmardi, J., Stushnoff, C., Locke, E., & Vivanco, J.M. 2003. Antioxidant Activity and Total Phenolic Content of Iranian Ocimum accessions. Food Chemistry. Vol. 83: 547-550. Kardinan, A. & Kusuma, F.R. 2004. Meniran: Penambah Daya Tahan Tubuh Alami. Jakarta: Agromedia Pustaka. Kennedy, J. & Clarke, W. 2004. Cultivated Landscapes of the Southwest Pasific. Canberra: Resource Management in Asia-Pasific Program. Khokhar, S.M. & Apenten, O.R.K. 2003. Iron Binding Characteristics of Phenolic Compounds: Some Tentative Structure–Activity Relations. Food Chemistry. Vol. 81 (1): 133–140. Khopkar, S.M. 2003. Konsep Dasar Kimia Analitik. Jakarta: UI Press. Kohen, R. & Nyska, A. 2002. Invited Review: Oxidation of Biological Systems: Oxidative Stress Phenomena, Antioxidants, Redox Reactions, and Methods for Their Quantification. Toxicol Pathol. Vol. 30: 620. Leakey, R., Fuller, S., Treloar, T., Stevenson, L., Hunter, D., Nevenimo, T., Binifa, J., & Moxon, J. 2008. Characterization of Tree-to-Tree Variation in Morphological, Nutritional and Medicinal Properties of Canarium indicum Nuts. Agroforest Syst. Vol. 73: 77-87. Leenhout, P.W. 1959. Revision of the the Burseraceae of the Malaysian Area in Woder Sense. C. Stickm. Blumea. Vol. 9 (2): 275-647. Lim, T.K. 2012. Edible Medicinal and Non-medicinal Plants Volume 1, Fruits. New York: Springer Science+Business Media. Limbono, S. 2013. Daya Antioksidan Ekstrak Etanol Biji Kenari (Canarium indicum L.) dengan Metode DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl). Calyptra: Jurnal Ilmiah Mahasiswa Universitas Surabaya. Vol. 2 (2). Digital Repository Universitas Jember 53 Maestro, Y., Saintingny, G., & Bernard, F.X. 2009. Cosmetic Use of An Active Agent Capable of Stimulating Tensin 1 Expression. Alexandria: United States Patent Application Publication. Markham, K.R. 1988. Cara Mengidentifikasi Flavonoid (Terjemahan). Bandung : ITB. McNair, J.B. 1935. Angiosperm Phylogeny on Chemical Basis. Bull Torrey Bot.Club. Vol. 62: 515-32. Mogana, R., Jin, K.T., & Wiart, C. 2011. In Vitro Antimicrobial, Antioxidant Activities and Phytochemical Analysis of Canarium patentinervium Miq. From Malaysia. Biotechnology Research International. Vol. 2011. Molyneux, P. 2003. The Use of the Stable Free Radical Diphenylpicrylhydrazyl (DPPH) for Estimating Antioxidant Activity. Songklanakarin J. Sci. Technol. Vol. 26 (2): 211-219. Ngbede, J., Yakbu, R.A., & Nyam, D.A. 2008. Pytochemical Screening for Active Compound in Canarium shweinfurthii (Atile) Leaves from Jos North, Plateau State, Nigeria. Research Journal of Biological Science. Vol. 3 (9): 1076-1078. Nikhal, S.B., Dambe, P.A., Ghongade, D.B., & Goupale, D.C. 2010. Hidroalcoholic Extraction of Mangifera Indica (Leaves) by Soxhletion. International Journal of Pharmaceutical Science. Vol. 2 (1): 30-32. Oktavia, J.D. 2011. Pengoptimuman Ekstraksi Flavonoid Daun Salam (Syzgium polyanthum) dan Analisis Sidik Jari dengan Kromatografi Lapis Tipis. Skripsi. Bogor: Fakultas MIPA IPB. Orwa, C., Mutua, A., Kindt, R., Jamnadass, R., & Anthony, S. 2009. Agroforestree Database: A Tree Reference and Selection Guide Version 4.0. [serial on line]. http://www.worldagroforestry.org/sites/treadbs/treedatabase.asp [15 Mei 2014]. Pham-Huy, L.A., He, H., & Pham-Huy, C. 2008. Free Radicals, Antioxidants in Disease and Health. Intenational Journal of Biomedical Science. Vol. 4 (2): 8996. Pietta, P.G. 2000. Flavonoids and Antioxidant. J. Nat. Prod. Vol. 63: 1035-1042. Prior, R.L., Wu, X., & Schaich, K. 2005. Standardized Methods for Determination of Antioxidant Capacity and Phenolics in Foods and Dietary Supplements. Journal of Aggricultural and Food Chemistry. Vol. 53: 4290-4302. Digital Repository Universitas Jember 54 Quattrocchi, U. 2012. CRC World Dictionary of Medicinal and Poisonous Plants: Common names, Scientific names, Eponyms, Synonyms, and Etymology. Boca Raton: CRC Press. Robinson, T. 1995. Kandungan Organik Tumbuhan Tinggi (Penerjemah Kosasih Padmawinata). Bandung: ITB. Sarker, D., Latif Z., Gray, I., & Alexander. 2006. Natural Product Isolation. New Jersey: Humana Press. Sasikumar, J.M., Maheshu, V., & Jayadev, R. 2009. In Vitro Antioxidant Activity of Methanolic Extracts of Berberis Tinctoria Lesch. Root and Root Bark. Journal of Herbal and Toxicology. Vol. 3 (2): 53-58. Snyder, C.R., Kirkland, J.J., & Glajach, J.L. 1997. Practical HPLC Method Development, Second Edition. New York: John Wiley and Sons. Stuessy, T.F. 1989. Plant Taxonomy. The Systematic Evaluation of Comparative Data. New York: Columbia University Press. Tahir, I., Wijaya, K., & Widyaningsih, D. 2003. Terapan Analisis Hansch Untuk Aktivitas Antioksidan Senyawa Turunan Flavon/Flavonol. Seminar on Chemometrics. Yogyakarta: Departemen Kimia Universitas Gadjah Mada. Teow, C.C. 2005. Antioxidant Activity and Bioactive Compounds of Sweetptatoes. Thesis. Raleigh: Food Science Faculty of North Carolina State Unversity. Thaipong, K., Boonprakob, U., Crosby, K., Cisneroz-Zevallos, L., & Byrne, H, D. 2006. Comparison of ABTS, FRAP, and ORAC Assays for Estimating Antioxidant Activity from Guajava Fruit Extracts. J. of Food and Analysis. Vol. 19: 669-675. Thang, T.D., Dai, D.N., Luong, N.X., & Ogunwande, I.A. 2014. Constituents of Essential Oils from the Leaves, Stem barks and Resins of Canarium parvum Leen., and Canarium tramdenanum Dai et Yakovl. (Burseraceae) Grown in Vietnam. Natural Product Research: Formerly Natural Product Letters. Vol. 28 (7): 461-466. Thang, T.D., Luu, H.V., & Dung, N.X. 2004. Chemical Composition of the Leaf Oil of Canarium bengalense Roxb. from Vietnam. J Essent Oil Bear Plants. Vol. 7 (1): 43–48. Digital Repository Universitas Jember 55 Thomson, L.A.J & Evans, B. 2006. C. indicum var. indicum and C. harveyi (C. nut), ver 2.1. Species Profiles for Pacific Island Agroforestry. [serial on line]. www.agroforestry.org/images/pdfs/Canarium canariumnut.pdf. [14 Mei 2014]. Tiwari, P., Kumar, B., Kaur, M., & Kaur, H. 2011. Pythochemical Screening and Extraction: A Review. Int. Pharm. Sci. Vol. 1: 1-9. United States Department of Agriculture. 2014. Canarium indicum L. [serial on line]. http://plants.usda.gov/core/profile?symbol=CAIN42 [14 Mei 2014]. Valko, M., Leibfritz, D., Moncol, J., Cronin, M.T.D., Mazur, M., & Telser, J. 2007. Review Free Radical Antioxidants in Normal Physiological Functions and Human Disease. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. Vol. 39: 44-84. Whysner, J., Wang, C.X., Zang, E., Iatropoulos, M.J., & Williams, G.M.1994. Dose Response of Promotion by Butylated Hydroxyanisole in Chemically Initiated Tumours of the Rat Forestomach. Fd Chem. Toxic. Vol. 32 (3): 215-222. Widowati, W., Safitri, R., Rumumpuk, R., & Siahaan, M. 2005. Penapisan Aktivitas Superoksida Dismutase pada Berbagai Tanaman. Universitas Kristen Maranatha Bandung, MKU, Universitas Padjadjaran Bandung, Fakultas MIPA, Universitas Negeri Menado, Fakultas MIPA Universitas Advent Indonesia Bandung, Fakultas MIPA. Vol. 5 (1): 33–48. Winarsi, H. 2007. Antioksidan Alami dan Radikal Bebas. Yogyakarta: Kanisius. Yen, D.E. 1994. Melanesian Arboriculture: Historical Perspective with Emphasis on Genus C. dalam South Pacific Indigenous Nuts. Edited by Steven, M.L., R.M. Bourke, and B.R. Evans. Canberra: ACIAR. Zhang, L.L., & Lin, Y.M. 2008. Tanins from Canarium album with Potent Antioxidant Activity. Journal of Zhejiang University SCIENCE B. Vol. 9 (5): 407-415. Digital Repository Universitas Jember 56 LAMPIRAN A. HASIL PENAPISAN FITOKIMIA EKSTRAK ETANOL DAUN KENARI A1. UJI ALKALOID a b c Keterangan : a. Blangko larutan ekstrak etanol daun kenari tanpa pereaksi b. Ekstrak etanol dengan pereaksi mayer hasil negatif alkaloid (tidak ada endapan/kekeruhan) c. Ekstrak etanol dengan pereaksi wagner hasil negatif alkaloid (tidak ada endapan/kekeruhan) Digital Repository Universitas Jember A2. UJI STEROID a b Keterangan : a. Blangko larutan ekstrak etanol daun kenari tanpa pereaksi b. Larutan ekstrak dengan pereaksi H SO pekat hasil negatif steroid 57 Digital Repository Universitas Jember A3. UJI SAPONIN Keterangan : Ekstrak mengandung saponin ditandai dengan buih yang stabil lebih dari 30 menit. 58 Digital Repository Universitas Jember 59 A4. UJI FLAVONOID Keterangan : Ekstrak dalam pelarut etanol dengan penambahan serbuk magnesium dan asam klorida pekat hasil positif flavonoid ditandai terjadinya warna merah ungu. Digital Repository Universitas Jember A5. UJI POLIFENOL DAN TANIN a b c Keterangan : a. Blangko larutan ekstrak etanol daun kenari tanpa pereaksi b. Larutan uji dengan pereaksi FeCl hasil positif polifenol (warna hijau kehitaman) c. Larutan uji dengan pereaksi NaCl 10 % hasil positif tanin (endapan putih) 60 Digital Repository Universitas Jember LAMPIRAN B. PENGAMATAN ABSORBANSI DPPH 0,004 % 61 Digital Repository Universitas Jember 62 Digital Repository Universitas Jember LAMPIRAN C. PENGAMATAN ABSORBANSI SAMPEL C1. ABSORBANSI EKSTRAK ETANOL DAUN KENARI 40 μg/mL 63 Digital Repository Universitas Jember 64 Digital Repository Universitas Jember 65 C2. ABSORBANSI FRAKSI N-HEKSANA EKSTRAK ETANOL DAUN KENARI 150 μg/mL Digital Repository Universitas Jember 66 Digital Repository Universitas Jember 67 C3. ABSORBANSI FRAKSI ETIL ASETAT EKSTRAK ETANOL DAUN KENARI 40 μg/mL Digital Repository Universitas Jember 68 Digital Repository Universitas Jember 69 C.4 ABSORBANSI FRAKSI ETANOL-AIR EKSTRAK ETANOL DAUN KENARI 40 μg/mL Digital Repository Universitas Jember 70 Digital Repository Universitas Jember 71 LAMPIRAN D. PERHITUNGAN 1. % Rendemen ekstrak dan fraksi obot ekstrak yang didapat % Rendemen ekstrak = , Fraksi etil asetat = , Fraksi air = , , x 100 % x 100 % x 100% = 9,57 % Fraksi n-heksana = obot fraksi yang didapat % Rendemen fraksi = Ekstrak etanol = x 100% = 5,733 % x 100% = 36,20 % x 100% = 81,20 % 2. Perhitungan konsentrasi DPPH = 0,1 % x 0,1 % = 0,004 % 3. Perhitungan konsentrasi larutan uji ekstrak dan fraksi daun kenari (2x replikasi) Larutan uji ekstrak etanol, fraksi etil asetat dan fraksi air: x 1000 x 1000 = 2500 μg/ml Diencerkan , x 2500 μg/ml = 400 μg/ml x 400 μg/ml = 40 μg/ml , x 400 μg/ml = 30 μg/ml Digital Repository Universitas Jember , x 400 μg/ml = 20 μg/ml , x 400 μg/ml = 10 μg/ml Larutan uji fraksi n-heksana : x 1000 x 1000 = 2500 μg/ml Diencerkan , x 2500 μg/ml = 75 μg/ml , x 2500 μg/ml = 100 μg/ml , x 2500 μg/ml = 125 μg/ml , x 2500 μg/ml = 150 μg/ml 4. Perhitungan konsentrasi pembanding vitamin C (2 x replikasi) . x 1000 x 1000 μg/ml = 2000 μg/ml Diencerkan , x 2000 μg/ml = 40 μg/ml , , , , x 20 μg/ml = 3 μg/ml x 20 μg/ml = 5 μg/ml x 20 μg/ml = 7 μg/ml x 20 μg/ml = 9 μg/ml 72 Digital Repository Universitas Jember 73 5. Perhitungan Uji Aktivitas Antioksidan Rumus : % Inhibisi = x 100 % Contoh perhitungan : % Inhibisi = , , , x 100 % = 92,512 % Setelah didapatkan presentasi inhibisi dari masing-masing konsentrasi, kemudian ditentukan persamaan y = bx + a dengan perhitungan secara regresi linear dimana x adalah konsentrasi (μg/ml) dan y adalah presentase inhibisi (%). Nilai IC didapatkan dari nilai x setelah mengganti y = 50. Contoh perhitungan: Nilai IC fraksi etil asetat y = 2,193x + 5,829 50 = 2,193x + 5,829 = 20,142 μg/ml x Nilai IC fraksi etil asetat adalah 20,142 μg/ml 6. Penetapan Kadar Flavonoid Total 0,5 mL sampel uji dilarutkan 1,5 mL etanol ditambahkan 0,1 mL AlCl 10% ditambahkan 0,1 mL potasium asetat 1M ditambakan 2,8 mL akuades, didiamkan 30 menit diukur absorbansinya pada panjang gelombang 415 nm, blangko dibuat sama dengan larutan uji dengan mengganti AlCl 10% dengan akuades (Khatiwora et al., 2010). 7. Pembuatan AlCl 10% : = 10 % 8. Pembuatan potasium asetat : Molar = x ( ) ; Mr potasium asetat = 98,15 Digital Repository Universitas Jember , 74 =1M 9. Pembuatan larutan standar kuersetin : x 1000 μg/ml = 4000 μg/ml , , , , , x 4000 μg/ml = 500 μg/ml x 500 μg/ml = 20 μg/ml x 500 μg/ml = 40 μg/ml x 500 μg/ml = 40 μg/ml x 500 μg/ml = 60 μg/ml x 500 μg/ml = 100 μg/ml 10. Pembuatan larutan ekstrak uji 200 μg/ml (ekstrak etanol, fraksi n-heksana, fraksi til asetat, fraksi air) 2x replkasi : , x 1000 μg/ml = 5000 μg/ml x 5000 μg/ml = 200 μg/ml 11. Pengamatan absorbansi standar kuersetin Konsentrasi 20 40 60 80 100 Absorbansi Replikasi 1 Replikasi 2 0,068 0,071 0,174 0,171 0,351 0,359 0,417 0,420 0,560 0,568 Digital Repository Universitas Jember 75 12. Pengamatan absorbansi sampel ekstrak dan fraksi daun kenari Jenis sampel Ekstrak etanol Fraksi nheksana Fraksi etil asetat Fraksi etanol-air kosentrasi replikasi Absorbansi 200 200 200 200 200 200 200 200 1 2 1 2 1 2 1 2 0,260 0,262 0,004 0,008 0,407 0,408 0,138 0,137 Persamaan regresi kurva standar kuersetin: y 1 = 0,0061x– 0,0541 r = 0,993; r = 0,983 y 2 = 0,0062 x – 0,0621 r = 0,991; r = 0,982 Digunakan persamaan regresi pertama (y = 0,0061x– 0,0541 r = 0,983) Berdasarkan persamaan yang telah didapatkan, dapat diketahui nilai x atau kandungan flavonoid total larutan uji ekstrak dan fraksi daun kenari ekuivalen kuersetin dengan memasukkan nilai absorbansi sampel ekstrak dan fraksi daun kenari ke y. Berikut contoh penghitungannya: Y = 0,006x – 0,054 0,260 = 0,006x – 0,054 x = 52,333 µg QE/mL larutan uji Kemudian dapat dicari kadar dalam 5 mL larutan uji, selanjutnya dapat dicari kadar dalam larutan pengenceran dan larutan induk sampel sehingga dapat dicari kadar flavonoid total massa ekuivalen kuersetin per massa penimbangan sampel. Berikut contoh perhitungannya: Kadar dalam dalam 5 mL larutan uji = 52,333 µg QE/mL x 5 mL = 261,665 µg QE Kadar dalam larutan pengenceran = 261,665 µg QE x , = 2.616,65 µg QE Digital Repository Universitas Jember Kadar dalam larutan induk 5000 μg/ml = 2.616,65 µg QE x QE , Kadar tiap gram ekstrak = , = 2,616 g QE/g ekstrak 13. Perhitungan Simpangan Deviasi SD = ( ) ( ) , ) Contoh : SD = ( , = 0,012 ( , , ) , 76 = 130.832,5 µg Digital Repository Universitas Jember 77 LAMPIRAN E. PENENTUAN PANJANG GELOMBANG MAKSIMUM DPPH Absorbansi 2 1.5 DPPH 0,004 % Ekstrak etanol 40 μg/ml Fraksi n-heksana 150 μg/ml Fraksi etil asetat 40 μg/ml Fraksi etanol-air 40 μg/ml 1 0.5 0 400 450 500 550 Panjang gelombang (nm) 600 Digital Repository Universitas Jember LAMPIRAN F. PENENTUAN OPERATING TIME Absorbansi rata-rata Waktu Ekstrak Fraksi n- Fraksi etanol heksana Fraksi air Vitamin C etil asetat 5 0,294 0,798 0,177 0,420 0,399 10 0,292 0,789 0,166 0,410 0,396 15 0,290 0,780 0,108 0,339 0,390 20 0,288 0,760 0,104 0,334 0,387 25 0,287 0,705 0,087 0,330 0,379 30 0,286 0,671 0,082 0,322 0,360 35 0,286 0,621 0,082 0,322 0,360 40 0,286 0,621 0,082 0,322 0,360 45 0,286 0,621 0,082 0,322 0,360 50 0,286 0,621 0,081 0,321 0,360 55 0,285 0,620 0,081 0,321 0,360 60 0,285 0,620 0,080 0,321 0,360 0.9 0.8 Absorbansi 0.7 0.6 Ekstrak etanol 0.5 0.4 Fraksi n-heksana 0.3 Fraksi etil asetat 0.2 Fraksi air 0.1 Vit.C 0 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Waktu (menit) 78 Digital Repository Universitas Jember 79 LAMPIRAN G. DATA PERSEN PEREDAMAN DPPH EKSTRAK DAN FRAKSI DAUN KENARI Sampel Konsentrasi (µg⁄ml) Eks. 10 Etanol 20 Absorbansi % Peredaman DPPH Kontrol Sampel Sampel Sampel Sampel DPPH Rep.1 Rep.2 Rep.1 Rep.2 0,785 0,783 25,592 25,782 0,593 0,595 43,577 43,602 0,464 0,462 56,018 56,208 40 0,286 0,284 72,787 72,798 Frak. 75 0,906 0,905 13,796 13,891 n-hek 100 0,805 0,809 23,406 23,026 -sana 125 0,719 0,718 31,588 31,684 150 0,621 0,618 40,913 41,198 Frak. 10 0,777 0,776 26,351 26,445 Etil 20 0,513 0,511 51,374 51,564 asetat 30 0,290 0,294 72,512 72,133 40 0,079 0,080 92,512 92,417 Frak. 10 0,805 0,808 23,406 23,121 Etanol- 20 0,676 0,675 35,680 35,775 air 30 0,539 0,537 48,715 48,905 40 0,324 0,323 69,172 69,267 3 0,787 0,785 25,402 25,592 0,635 0,633 39,810 40,000 0,492 0,491 53,364 53,459 0,360 0,358 65,876 6,066 30 Vit. C 5 7 9 1,055 1,051 1,055 1,051 1,055 Digital Repository Universitas Jember 80 LAMPIRAN H. REGRESI KONSENTRASI (μg⁄mL) EKSTRAK DAN FRAKSI DAUN KENARI TERHADAP PERSEN PEREDAMAN DPPH (%) LAMPIRAN H1. REGRESI KONSENTRASI (µg⁄mL) EKSTRAK ETANOL DAUN KENARI TERHADAP PERSEN PEREDAMAN DPPH (%) Replikasi 1 80 y = 1,540x + 10,987 r² = 0,996 70 60 50 40 30 20 10 0 0 10 20 30 40 50 40 50 Replikasi 2 80 y = 1,537x + 11,184 r² = 0,996 70 60 50 40 30 20 10 0 0 10 20 30 Digital Repository Universitas Jember 81 LAMPIRAN H2. REGRESI KONSENTRASI (µg⁄ml) FRAKSI N-HEKSANA EKSTRAK ETANOL DAUN KENARI TERHADAP PEREDAMAN DPPH (%) Replikasi 1 45 y = 0,358x - 12,864 r² = 0,999 40 35 30 25 20 15 10 5 0 0 20 40 60 80 100 120 140 160 140 160 Replikasi 2 50 45 y = 0,362x - 13,311 r² = 0,999 40 35 30 25 20 15 10 5 0 0 20 40 60 80 100 120 Digital Repository Universitas Jember 82 LAMPIRAN H3. REGRESI KONSENTRASI (µg⁄ml) FRAKSI ETIL ASETAT EKSTRAK ETANOL DAUN KENARI TERHADAP PEREDAMAN DPPH (%) Replikasi 1 100 y = 2,193x + 5,829 r² = 0,997 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 0 10 20 30 40 50 40 50 Replikasi 2 100 y = 2,185x + 6,018 r² = 0,997 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 0 10 20 30 Digital Repository Universitas Jember 83 LAMPIRAN H4. REGRESI KONSENTRASI (µg⁄ml) FRAKSI ETANOL-AIR EKSTRAK ETANOL DAUN KENARI TERHADAP PEREDAMAN DPPH (%) Replikasi 1 80 70 y = 1,503x + 6,660 r² = 0,983 60 50 40 30 20 10 0 0 10 20 30 40 50 40 50 Replikasi 2 80 y = 1,515x + 6,375 r² = 0,985 70 60 50 40 30 20 10 0 0 10 20 30 Digital Repository Universitas Jember 84 LAMPIRAN H5. REGRESI KONSENTRASI (µg⁄ml) VITAMIN C TERHADAP PEREDAMAN DPPH (%) Replikasi 1 70 y = 6,749x + 5,620 r² = 0,999 60 50 40 30 20 10 0 0 2 4 6 8 10 8 10 Replikasi 2 70 y = 6,744x + 5,815 r² = 0,999 60 50 40 30 20 10 0 0 2 4 6 Digital Repository Universitas Jember 85 LAMPIRAN I. KADAR FLAVONOID TOTAL I.1 KALIBRASI STANDAR KUERSETIN Konsetrasi (μg/ml ) 20 40 60 80 100 Absorbansi 0,068 0,174 0,351 0,417 0,560 0.6 y = 0,006x - 0,054 r² = 0,986 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 0 20 40 60 80 Kurva kalibrasi standar kuersetin 100 120 Digital Repository Universitas Jember 86 I2. KADAR FLAVONOID TOTAL SAMPEL Sampel n Ekstrak etanol Fraksi n-heksana Fraksi etil asetat Fraksi etanol-air 2 2 2 2 LAMPIRAN J. KORELASI Kadar flavonoid total rata-rata (g QE/g ekstrak) ± SD 2,624 ±0,012 1,596 ± 0,006 3,846 ± 0,006 0,499 ± 0023 KADAR FLAVONOID TOTAL DENGAN IC 50 (µg/mL) AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DAUN KENARI 200 180 160 140 120 100 80 60 40 20 0 y = -41,896x + 152,079 r² = 0,632 0 1 2 3 4 Flavonoid Total (g kuersetin ekuivalen/g ekstrak) 5
