19. paper makalah

UJI SITOTOKSISITAS DAN EFEK EKSTRAK SPONS LAUT Aaptos suberitoides
TERHADAP SEL KANKER PAYUDARA (T47D) SECARA IN VITRO
CYTOTOXICITY TEST AND EFFECT OF Aaptos suberitoides EXTRACT ON BREAST
CANCER CELL LINE T47D IN VITRO
Awik Puji D.N1, Sukardiman2, Tri wahyu Ningsih3
1.
Department of Biology, Faculty of Mathematic and Natural Science,Sepuluh Nopember Institute of
Technology
2. Pharmaceutical Facult, Airlangga University Surabaya
3. Alumni of Department of Biology, Faculty of Mathematic and Natural Science,Sepuluh Nopember
Institute of Technology
ABSTRACT
The main purpose of this reseach is to determine the effect of A.suberitoides extract on breast
cancer cell line T47D in vitro, that using cytotoxicity test. The activity of A.suberitoides extract to inhibit
the growth of cancer cell was determined by MTT assay. After the LC50 calculated, the cell proliferation
kinetic profiles were observed by doubling time test at 24th, 48th, and 72th hours and the IC50 calculated.
Apoptosis studies were done by double staining test using acridine orange and ethidium bromide. The
study was used Completely Randomized Design with 5 treatment group, there are group I (treatment), II (
control cell ), III ( positive control), IV (medium control) and V ( cosolven control ), with three times
duplication. The concentration of extract that use 7.5 ; 15 ; 30 ; 60 ; 120 ; 240 ; 480 ; 960 and 1920
µg/mL. The concentration of cisplatin, medicine cancer that use 2, 4, 8 dan 16 µg/mL. The data was
analyzed with ANOVA and be continued by LSD test.
The result of this research shows that A.suberitoides extract have not cytotoxic activity on breast
cancer cell line T47D with LC50 = 528.828 µg/mL at cytotoxicity test with MTT assay based NCI
(National Cancer Institut) criterion, that a compound was said to have sitotoksisitas's effect that poten if
that compound have point LC50 ≤ 20 πg/mL. At doubling time test, A. suberitoides extract are not able to
inhibit proliferation of breast cancer cell line T47D with IC50 = 194.487 µg/mL based criterion of
Kamuhabwa et al. (2000), that extract has to assess IC 50 = 100 µg / ml can say to have antiproliferasi's
potencies. And A.suberitoides can induction apoptotic on breast cancer cell line T47D with activity as big
as 19.23 %.
Key Words: A.suberitoides, T47D breast cancer cell, Cytotoxicity test
PENDAHULUAN
Kanker merupakan penyebab utama
kematian diseluruh dunia. Dari 58 juta kematian di
seluruh dunia dalam tahun 2005, tercatat 7.6 juta
(13%) diantaranya disebabkan oleh kanker (WHO,
2006 dalam Moeljopawiro, 2007). Jenis penyakit
kanker yang paling umum dijumpai adalah kanker
payudara. Kanker payudara merupakan penyebab
utama kematian pada wanita di berbagai belahan
dunia.
Spons merupakan salah satu komponen
biota penyusun ekosistem terumbu karang yang
mempunyai potensi bioaktif. Spons termasuk
organisme multiseluler sesil dan merupakan
invertebrata laut dengan tingkat taksonomi paling
rendah. (Hooper, 1997). Spons juga menghasilkan
metabolit sekunder yang tinggi serta memiliki
kemampuan untuk mensintesis bermacam-macam
komponen organik seperti polyketida, alkaloid,
peptid dan terpene (Sjorgen, 2006 dalam
Nurhayati, 2009). Komponen organik tersebut
dapat digunakan sebagai bahan obat- obatan
(Amir dan Budiyanto, 1996 dalam Nurhayati,
2009). Spons juga menghasilkan toksin dan
mempunyai prospek untuk dimanfaatkan dalam
bidang pengobatan. Telah dilaporkan pula bahwa
sebagian senyawa yang diisolasi dari spons
mempunyai aktivitas toksik yang tinggi terhadap
makhluk hidup. Isolat dari spons telah dilaporkan
memiliki aktivitas antibakteri, antikanker dan
1
antiparasit (Amir dan Budiyanto, 1996 dalam
Nurhayati, 2009).
Senyawa bioaktif yang dihasilkan spons
laut merupakan sumber senyawa –senyawa baru
yang memiliki aktivitas farmakologis sehingga
dapat digunakan sebagai obat karena memiliki
sifat toksik sehingga dapat digunakan untuk
membunuh sel kanker (Astuti et al, 2005).
Kebutuhan obat baru sebagai senyawa antikanker
semakin mendesak, karena obat-obatan yang
dipakai selama ini memiliki efektivitas rendah dan
harga yang mahal. Pencarian sumber-sumber baru
untuk menghasilkan senyawa antikanker terus
dilakukan antara lain dari senyawa bioaktif yang
dihasilkan organisme laut termasuk spons
(Setyowati et al, 2007). Senyawa bioaktif yang
akan digunakan sebagai produk farmasi untuk
antikanker harus diujikan terlebih dahulu pada
hewan percobaan dengan uji sitotoksik. Uji
sitotoksik merupakan salah satu pengembangan
metode untuk memprediksi keberadaan seyawa
yang bersifat toksik pada sel yang merupakan
syarat mutlak untuk obat-obat antikanker
(Kurnijasanti et al, 2008).
Sebelas spesies spons yang diambil dari
daerah perairan Pantai Pasir Putih Situbondo
memiliki senyawa bioaktif yang berpotensi
sebagai antikanker (Nurhayati et al., 2008). Hasil
uji sitotoksisitas dengan metode Brine Shrimp Test
(BST) menunjukkan bahwa Aaptos suberitoides
memiliki tingkat toksisitas yang paling tinggi
dengan nilai LC50 sebesar 134.136 ± 36.611 ppm,
sehingga spesies spons A. suberitoides merupakan
kandidat yang baik untuk antikanker (Nurhayati et
al, 2008). A. suberitoides dapat menghasilkan
senyawa alkaloid aaptamin (benzo 1,6naphthyridin yang berpotensi sebagai senyawa
antikanker (Aoki et al., 2006), yang bekerja
dengan mekanisme apoptosis (Mayer, 2008) dan
antioksidan (Makarchenko, 2004). Setelah tahap
praskrining terhadap senyawa antikanker dengan
metode BST, maka perlu dilanjutkan dengan uji
sitotoksisitas menggunakan sel kanker secara in
vitro. Untuk itu, perlunya uji sitotoksisitas spons
laut A. suberitoides pada sel kanker payudara
(T47D), sehingga diketahui potensi sitotoksik
spons laut A. suberitoides.
METODE PENELITIAN
Spons A.suberitoides diperoleh dari
perairan Pecaron, Pantai Pasir Putih Situbondo,
Jawa Timur. Sel T47D yang diujikan merupakan
koleksi dari LPPT UGM.
Ekstraksi Spons Laut
Ekstraksi spons dilakukan dengan metode
yang dilakukan oleh Harada dan Kamei (1997)
dan Horikawa et al (1999). Spons diambil ,
dipotong-potong menggunakan pisau selanjutnya
ditambahkan alkohol pada potongan spons untuk
mencegah tumbuhnya jamur. Potongan spons
dikeringanginkan selama 1 minggu hingga kering.
Selanjutnya potongan spons yang telah kering
dihaluskan
dengan
menggunakan
blender
sehingga terbentuk ekstrak kasar. Ekstrak kasar
yang telah didapat kemudian dimaserasi. Ekstrak
kasar spons dimasukkan ke dalam maserator
dengan kapasitas 2,5 kg. Ekstrak kasar spons
direndam dalam etanol sampai seluruh ekstrak
spon terendam, campuran disaring dan dihasilkan
ekstrak spons. Filtrat spons yang telah didapat
dievaporasi. Proses selanjutnya yaitu pengadukan
filtrat dengan stiring magnetic mulai dari pelarut
polar hingga pelarut non polar. Filtrat diaduk
dengan pelarut kloroform dengan perbandingan
1:5. pengadukan dilakukan dengan replikasi 3 kali
selama 2 jam untuk tiap kali replikasi. Dari proses
tersebut akan didapatkan filtrat dan supernatan.
Filtrat yang diperoleh dievaporasi untuk
menghilangkan etanol. Hasil yang diperoleh
merupakan ekstrak kloroform yang selanjutnya
digunakan dalam uji sitotoksisitas.
Uji Sitotoksisitas Metode MTT assay
Suspensi sel kanker payudara (T47D)
sebanyak 100 µL dengan kepadatan 3 x 104
sel/100 µL media didistribusikan ke dalam
sumuran- sumuran pada 96-well plate dan
diinkubasikan selama 24 jam. Setelah diinkubasi,
ke dalam sumuran dimasukkan 100 µL larutan uji
pada berbagai seri konsentrasi. Sebagai kontrol
positif ditambahkan 100 µL medium kultur,
kemudian 100 µL cisplatin pada berbagai seri
konsentrasi ke dalam sumuran yang telah berisi
100 µL suspensi sel. Sebagai kontrol sel
ditambahkan 100 µL medium kultur ke dalam
sumuran yang berisi 100 µL suspensi sel dan
sebagai kontrol pelarut ditambahkan 100 µL
DMSO ke dalam sumuran yang berisi 100 µL
medium kultur dan 100 µL suspensi sel dengan
delusi yang sesuai dengan delusi konsentrasi
larutan uji, kemudian diinkubasi selama 24 jam
dalam inkubator dengan aliran 5% CO2 dan 95%
O2. Pada akhir inkubasi, media kultur dibuang lalu
ditambahkan 10 µL larutan MTT (5 mg/mL PBS),
dan medium diganti dengan 190 µL medium
RPMI 1640 komplit. Kemudian sel diinkubasi
selama 3-4 jam. Reaksi MTT dihentikan dengan
2
penambahan reagen stopper SDS (100 µL).
Microplate kemudian dibungkus dengan tissue
dan diinkubasi selama 1 malam pada suhu kamar
dan ruangan gelap. Sel yang hidup bereaksi
dengan MTT membentuk warna ungu. Hasil
pengujian dibaca dengan ELISA reader pada
panjang gelombang 595 nm (Ola at al., 2008; Mae
et al., 2000 dalam Dheta, 2009).
Pengamatan Kinetika Proliferasi Sel ( Uji
Doubling Time)
Suspensi sel kanker payudara (T47D)
sebanyak 100 µL dengan kepadatan 3 x 104
sel/100 µl media didistribusikan ke dalam
sumuran-sumuran pada 96-well plate dan
diinkubasi selama 24 jam dalam incubator dalam
suhu 37°C dan dialiri 5% CO2. Selanjutnya
ditambahkan 100 µL larutan uji dengan 3 variasi
konsentrasi yaitu pada LC50 dan 2 konsentrasi
dibawah LC50 pada uji sitotoksisitas tersebut di
atas, kemudian inkubasi dilanjutkan dengan
variasi waktu 24, 48 dan 72 jam. Pada setiap akhir
inkubasi, medium kultur dibuang dan ke dalam
masing- masing sumuran ditambahkan 10 µL
larutan MTT (5 mg/mL PBS) dan medium diganti
dengan menambahkan 190 µL medium RPMI
1640 komplit kedalamnya. Kemudian sel
diinkubasi selama 3-4 jam sampai terbentuk
formazon. Reaksi MTT dihentikan dengan
penambahan reagen stopper SDS (100 µL).
Microplate yang berisi suspensi sel diseker ± 5
menit kemudian dibungkus dengan tissue dan
diinkubasi selama 1 malam pada suhu kamar dan
ruangan gelap. Sel yang hidup bereaksi dengan
MTT membentuk warna ungu. Hasil pengujian
dibaca dengan ELISA reader pada panjang
gelombang 595 nm. Hasil absorbansi yang terbaca
dikonversi ke dalam % (persentase) kehidupan
(viabilitas) sel (Dhiani et al., 2006 dalam Dheta,
2009).
Uji Apopotosis dengan Metode Double Staining
Sel yang telah dipanen dipuasakan
sebelum perlakuan menyamakan umur sel seperti
pada uji aktifitas proliferasi. Sel kanker yang akan
dipuasakan dimasukkan ke dalam plate 24 well
yang berisi coverslip, masing-masing sebanyak
500 µL dengan kepadatan 3x104 sel/100 µL
media, kemudian sel diinkubasi selama 24 jam
dalam inkubator CO2 370C. Selanjutnya sel diberi
perlakuan dengan 500 µL ekstrak spons laut A.
suberitoides dengan 3 variasi konsentrasi yaitu
pada LC50 dan 2 konsentrasi dibawah LC50 pada
uji sitoktoksisitas tersebut di atas. Sebagai kontrol
sel, ditambahkan 500 µL media kultur RPMI,
kontrol positif ditambah 500 µL cisplatin pada
konsentrasi LC50 dan 2 konsentrasi dibawah LC50
dan kontrol pelarut ditambah 500 µL DMSO pada
konsentrasi LC50 dan 2 konsentrasi dibawah LC50,
kemudian sel diinkubasi selama 24 jam dalam
incubator. Pada akhir inkubasi, medium dibuang
dan coverslip dikeluarkan dari sumuran,
diletakkan pada gelas benda Poly-L-Lysine secara
merata dan dibuat rangkap dua. Sebanyal 5 µL
larutan staining ditambahkan pada permukaan
coverslip tersebut, kemudian didiamkan ± 2 menit
agar larutan berinteraksi dengan sel. Sel segera
diamati di bawah mikroskop flouresen dengan
perbesaran dengan perbesaran 100 x dan hasil
pengamatan difoto dengan kamera digital. Sel
yang hidup akan berflurosen hijau dengan
acridine orange dan sel yang mati akan
berflurosen oranye dengan ethidium bromide
(Dhiani et al., 2006; Nururlita & Mahdalena, 2006
dalam Dheta 2009). Jumlah sel yang mengalami
apoptosis dihitung untuk tiap lapang pandang
dengan jumlah minimal 100 sel (Spector, 1998
dalam Sukardiman, 2005).
Analisis Data
Uji Sitotoksisitas dengan Metode MTT assay
Data yang diperoleh dari hasil pembacaan
ELISA reader (λ = 595 nm) berupa absorbansi
masing-masing sumuran dikonversikan dalam %
kematian sel dengan rumus:
Keterangan :
Abs
= Absorbansi
Kemudian dianalisis dengan program
SPSS Windows 16.0 menggunakan uji One Way
ANOVA. Analisis statistik ditentukan hipotesis
statistik sebagai berikut :
Ho = Tidak ada pengaruh penambahan ekstrak
spons A.suberitoides pada sel T47D
dibandingkan dengan kontrol negatif pelarut
DMSO
Ha = Ada pengaruh penambahan ekstrak spons
A.suberitoides pada sel T47D dibandingkan
dengan kontrol negatif pelarut DMSO
Pengambilan kesim-pulan jika harga Fhitung
> Ftabel maka Ho ditolak, sedangkan jika harga
Fhitung < Ftabel maka Ho diterima dengan derajad
kepercayaan 0,95 (α = 0,05). Jika ada perbedaan
3
bermakna, perhitungan dilanjutkan dengan uji
LSD.
Untuk mengetahui harga LC50 ditentukan
dengan menggunakan analisis persen probit pada
program SPSS Windows 16.0. Prinsip pengolahan
data pada program ini adalah mengkorelasi antara
persen kematian sel dengan konsentrasi ekstrak.
Pengamatan Kinetika Proliferasi Sel
Data yang diperoleh dari hasil pembacaan
ELISA reader berupa absorbansi masing-masing
sumuran dikonversikan dalam % kehidupan sel
(viabilitas) dengan rumus:
Difference (LSD). Kedua uji tersebut dilakukan
pada taraf kepercayaan 95% dengan menggunakan
program SPSS Windows 16.0.
Pengamatan Apoptosis
Data apoptosis berupa data kualitatif yang
diperoleh dari hasil pengamatan morfologi sel
menggunakan mikroskop flouresens. Sel yang
hidup akan berflouresen hijau dengan acridine
orange dan sel yang mati akan berflouresens
orange dengan ethidium-bromide.
Perhitungan
sel
yang
mengalami
apoptosis dihitung dengan rumus:
% Apoptosis =
Jumlah sel apoptosis x 100%
∑ Total sel
HASIL
Berdasarkan data tersebut dibuat profil
hubungan antara persentase sel hidup dan waktu
inkubasi, kemudian dibuat persamaan regresi
linier. Slope dari persamaan ini menggambarkan
kinetika pertumbuhan sel. Data absorbansi dan
persentase sel hidup selanjutnya dilakukan analisis
varian satu arah (ANOVA) (α = 0,05) untuk
mengetahui adanya perbedaan yang signifikan
antar kelompok perlakuan pada setiap waktu
inkubasi, dimana hasil uji bermakna jika diperoleh
harga p ≤ 0.05. Jika terdapat perbedaan yang
nyata, dilanjutkan dengan uji Least Significant
Uji Sitotoksisitas Ekstrak Spons Laut
A.suberitoides Terhadap Sel Kanker Payudara
(T47D) dengan Metode MTT assay
Hasil pengukuran dengan menggunakan
ELISA reader menunjukkan bahwa persentase
kematian sel T47D terus meningkat sebanding
dengan kenaikan konsentrasi ekstrak yang
diberikan. Kematian sel terbesar terdapat pada
pemberian konsentrasi ekstrak 480 µg/ml yaitu
sebesar
97,649
%
(Tabel
1).
Tabel 1. Persentase kematian sel T47D dengan perlakuan ekstrak spons laut A.suberitoides
Seri Ekstrak ke1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Konsentrasi (µg/ml)
7.5
15
30
60
120
240
480
960
1440
1920
Persen Kematian Sel (%)
5.356
8.208
10.212
20.655
22.582
32.062
97.649
96.686
90.559
86.551
Gambar 1. Hasil uji sitotoksisitas ekstrak A.suberitoides terhadap sel T47D dengan metode MTT assay
4
Gambar 2. Hasil uji sitotoksisitas cisplatin terhadap sel T47D dengan metode MTT assay
Tabel 2. Persentase kematian sel T47D dengan perlakuan DMSO
Persen Kematian Sel
Konsentrasi (µg/ml)
(%)
0.95
29.364
0.72
-0.578
0.475
6.821
Tabel 3. Persentase kematian sel T47D dengan perlakuan cisplatin
Konsentrasi (µg/ml) Persen Kematian Sel
(%)
2
9.818
4
8.155
8
7.878
16
52.652
Adapun persentase kematian dari sediaan
kontrol negatif DMSO adalah 6.821 % (Tabel 2)
dan pada kontrol positif obat kanker cisplatin
dimulai pada konsentrasi 2 µg/mL dengan
persentase kematian sebesar 9.818%. Persentase
kematian sel T47D terus meningkat sampai
dengan konsentrasi tertinggi yaitu 16 µg/mL
sebesar 52.652 %, sejalan dengan kenaikan
konsentrasi cisplatin (Tabel 3). Nilai LC50 pada uji
sitotoksisitas ekstrak spons laut A.suberitoides
terhadap sel T47D adalah 528.828 µg/mL
(Gambar 1), sedangkan pada obat kanker cisplatin
sebesar 16.818 µg/mL (Gambar 2).
Efek Ekstrak Spons Laut A.suberitoides
Terhadap Proliferasi Sel Kanker Payudara
(T47D)
Konsentrasi yang digunakan adalah pada
LC50 dan 2 konsentrasi dibawah LC50 yaitu
528.828 µg/mL, 264.414 µg/mL dan 132.207
µg/mL dari hasil uji sitotoksisitas dengan waktu
inkubasi 24 jam, 48 jam, dan 72 jam. Hasil uji
Doubling time pada inkubasi 72 jam terjadi
penurunan persentase sel yang hidup pada
berbagai konsentrasi ekstrak dengan IC50 sebesar
194.487 µg/mL (Tabel 4). Sedangkan pemberian
cisplatin pada uji doubling time signifikan
terhadap kehidupan sel T47D selama periode
inkubasi, dan didapatkan IC50 sebesar 28.569
µg/mL (Tabel 5).
Pengaruh Ekstrak Spons Laut A.suberitoides
Terhadap Apoptosis Sel Kanker Payudara
(T47D)
Hasil pengamatan dibawah mikroskop
flourosen memperlihatkan bahwa sel T47D yang
hidup akan berflouresen hijau dengan Acridine
orange dan sel yang mati berflouresen orange
dengan Ethidium bromide (Gambar 3). Hasil uji
apoptosis sel T47D, cisplatin menunjukkan
persentase apoptosis yang paling tinggi
dibandingkan dengan ekstrak, DMSO serta
kontrol (Gambar 4). Ekstrak spons laut
A.suberitoides mampu menginduksi apoptosis
pada sel kanker T47D dengan aktifitas sebesar
19.23 %.
5
Tabel 4. Persentase kehidupan sel T47D dengan perlakuan ekstrak spons laut A.suberitoides pada uji
Doubling time
Konsentrasi
Persentase Kehidupan Sel (%)
(µg/ml)
Waktu Inkubasi (jam)
24
48
72
528.828
53,757
61,649
32,258
264.414
57,161
67,881
47,177
132.207
63,470
74,804
56,048
Tabel 5. Persentase kehidupan sel T47D dengan perlakuan cisplatin pada uji Doubling time
Konsentrasi
Persentase Kehidupan Sel (%)
(µg/ml)
Waktu Inkubasi (jam)
24
48
72
16.818
57.880
48.242
32,258
8.409
75.924
42.674
47,177
4.205
56.860
48.388
56,048
a
b
c
e
d
Gambar 3. Sel T47D dengan perlakuan ekstrak spons A.suberitoides pada konsentrasi LC50 setelah
diwarnai dengan acridine orange-ethidium bromide (florescent microscope perbesaran 100 x), a) sel
mulai mengalami apoptosis dengan kondensasi kromatin, b) sel yang mengalami blebbing, c) merupakan
tahap akhir apoptosis d) sel yang mengalami nekrosis dan e) sel T47D normal
Gambar 4. Perbandingan persentase apoptosis sel T47D oleh perlakuan Kontrol, LC50 ekstrak, LC50
cisplatin dan DMSO
PEMBAHASAN
Hasil pengamatan dengan menggunakan
mikroskop menunjukkan sel T47D yang hidup
tampak seperti berserabut berwarna gelap dan
saling berdempet dengan sel lain yang berada
disekitarnya, ditunjukkan oleh panah berwarna
kuning. Warna gelap dan berserabut yang nampak
pada pengamatan merupakan kristal formazon.
Kristal-kristal formazon tersebut dapat menembus
membran sel dan terakumulasi di dalam sel sehat.
Jumlah produk formazan secara langsung
6
proposional dengan jumlah sel hidup. Semakin
banyak sel hidup maka semakin banyak sel yang
aktif melakukan metabolisme sehingga jumlah
produk formazan yang terbentuk juga semakin
banyak. Semakin banyak produk formazan yang
terakumulaasi ini menyebabakan intensitas warna
ungu meningkat dalam plate.
Sedangkan sel T47D yang mati karena
perlakuan pemberian ekstrak yang tinggi (1920
µg/ml), tampak bulat dan cenderung tersebar
ataupun soliter, ditunjukkan oleh panah berwarna
merah. Sel yang mati tidak dapat terwarnai oleh
garam MTT sehingga tidak membentuk warna
ungu seperti pada sel hidup. Mitokondria sel mati
pada uji sitotoksisitas metode MTT ini tidak
mampu berespirasi sehingga tidak menghasilkan
enzim suksinat reduktase tetrazolium yang dapat
(A)
(D)
(E)
mereduksi reagen MTT menjadi produk formazan.
Akibatnya pada sel mati tidak terbentuk formazan
yang berwarna ungu, tetapi warnanya tetap kuning
seperti medium. Pada kontrol sel terlihat jumlah
sel yang berwarna gelap dan berserabut lebih
banyak di banding dengan perlakuan lainnya.
Penampakan sel pada kontrol DMSO tertinggipun
(0,95%) juga terlihat tidak berdampak signifikan
terhadap jumlah sel yang mati. Pada kenampakan
sel T47D dengan perlakuan ekstrak, dapat dilihat
jumlah sel yang berwarna gelap dan berserabut
secara berangsur-angsur turun dari konsentrasi
pemberian ekstrak tertinggi (1920 µg/ml) hingga
ekstrak terendah (7.5 µg/ml). Hal ini dapat
diindikasikan
bahwa
pemberian
ekstrak
berpengaruh terhadap jumlah kematian sel secara
kualitatif.
(B)
(C)
(F)
Gambar 5. Pembentukan kristal formazon setelah pemberian MTT pada sel T47D. (A) Kontrol sel, (B) Kontrol
DMSO 0.95%, (C) Konsentrasi ekstrak 1920 µl/ml, (D) Konsentrasi ekstrak 120 µl/ml, (E) Konsentrasi ekstrak 30
µl/ml, (F) Konsentrasi ekstrak 7.5 µl/ml
Hasil pengukuran dengan menggunakan
ELISA reader menunjukkan bahwa persentase
kematian sel T47D terus meningkat sebanding
dengan kenaikan konsentrasi ekstrak yang
diberikan. Kematian sel terbesar terdapat pada
pemberian konsentrasi ekstrak 480 µg/ml yaitu
sebesar 97,649 % (Tabel 1), sedangkan persentase
kematian dari sediaan kontrol negatif DMSO
adalah 6.821 % (Tabel 2). Hasil penelitian
tersebut kemudian dianalisis menggunakan SPSS
windows 16.0 dengan program One Way
ANOVA dan program analisis persen probit.
Dari analisis uji One Way ANOVA (α =
0.05) menunjukkan hasil yang signifikan dan
diperoleh Fhitung sebesar 197.160 µg/ml.
Sedangkan Ftabel sebesar 2.30, karena harga Fhitung
lebih besar daripada harga Ftabel maka terdapat
pengaruh
penambahan
ekstrak
spons
A.suberitoides pada sel T47D dibandingkan
dengan kontrol negatif pelarut DMSO.
Untuk mengetahui perbedaan bermakna
dilanjutkan dengan analisis LSD (Least
Significant Difference). Dari hasil perhitungan
diperoleh nilai LSD sebesar 7.253 (Lampiran 41).
Karena rata-rata nilai LSD lebih besar daripada
nilai LSD hitung, maka terdapat perbedaan
bermakna dari masing-masing kelompok.
7
Perhitungan nilai LC50 ditentukan dengan
menggunakan analisis persen probit pada program
SPSS Windows 16.0. LC50 digunakan sebagai
parameter
untuk
mengevaluasi
potensi
sitotoksisitas ekstrak spons laut A.suberitoides
terhadap sel T47D. Untuk melakukan uji
sitotoksisitas terhadap ekstrak, NCI (National
Cancer Institute) menetapkan suatu standar
bahwa harga LC50 adalah ≤ 20 µg/mL (Suffness,
1991). Karena harga LC50 dari ekstrak
A.suberitoides diperoleh pada konsentrasi
528.828 µg/mL, maka dapat dikatakan bahwa
ekstrak spons A.suberitoides tidak mempunyai
aktivitas sitotoksik terhadap sel kanker payudara
(T47D) berdasarkan kriteria yang ditetapkan oleh
NCI (National Cancer Institut).
Sebagai kontrol positif digunakan
cisplatin. Cisplatin secara klinis digunakan
sebagai obat kanker termasuk juga kanker
payudara (T47D), sehingga secara tidak langsung
dapat dibandingkan dengan ekstrak spons
A.suberitoides. Cisplatin (cisplatinum atau cis
diamminedichloroplatinum (II)) merupakan obat
kemoterapi kanker yang berbasis logam platinum.
Cisplatin bekerja sebagai anti kanker dengan cara
menempelkan diri pada DNA (deoxyribonucleic
acid) sel kanker dan mencegah pertumbuhannya.
Jika senyawa ini terlarut dalam air, ligan kloro
pada cisplatin diganti satu persatu oleh ligan air
(aqua) melalui reaksi hidrolisis. Selanjutnya
ikatan Pt-OH2 yang terdapat dalam senyawa
kompleks monoaquaplatina dan diaquaplatina
yang terbentuk akan jauh lebih reaktif, sehingga
kompleks tersebut akan lebih mudah bereaksi
dengan ligan donor beratom nitrogen pada basa
DNA (Putra, 2008).
Kontrol
positif
bertujuan
untuk
mengevaluasi keberhasilan uji sitotoksisitas
sebagai bukti terjadinya efek sitotoksik. Hasil uji
sitotoksisitas dengan perlakuan cisplatin pada
berbagai konsentrasi dapat dilihat pada lampiran
2. Pada hasil penelitian, cisplatin dapat
menyebabkan kematian sel T47D yang dimulai
pada konsentrasi 2 µg/mL dengan persentase
kematian sebesar 9.818%. Persentase kematian
sel T47D terus meningkat sampai dengan
konsentrasi tertinggi yaitu 16 µg/mL sebesar
52.652 %, sejalan dengan kenaikan konsentrasi
cisplatin. Hasil uji One Way ANOVA (α = 0.05)
adalah signifikan, menunjukkan harga Fhitung lebih
besar daripada harga Ftabel (Fhitung =30.626 dan
Ftabel = 3.48) berarti terdapat pengaruh
cisplatin
pada
sel
T47D
penambahan
dibandingkan dengan kontrol negatif pelarut
DMSO.
Untuk mengetahui perbedaan bermakna
dilanjutkan dengan analisis LSD (Least
Significant Difference). Dari hasil perhitungan
diperoleh nilai LSD sebesar 9.825 . karena nilai
LSD lebih besar daripada nilai LSD hitung, maka
terdapat perbedaan bermakna dari masing-masing
kelompok dengan metode MTT assay.
Perhitungan
nilai
LC50
cisplatin
ditentukan dengan menggunakan analisis persen
probit pada program SPSS Windows 16.0 dan
diperoleh pada konsentrasi 16.818 µg/mL. LC50
dengan perlakuan cisplatin ini lebih rendah
daripada LC50 dengan perlakuan ekstrak spons
A.suberitoides.
Efek Ekstrak Spons Laut A.suberitoides
Terhadap Proliferasi Sel Kanker Payudara
(T47D)
Uji doubling time dilakukan untuk mengetahui
pengaruh pemberian ekstrak spons A.suberitoides
terhadap proliferasi sel T47D. Konsentrasi yang
digunakan adalah pada LC50 dan 2 konsentrasi
dibawah LC50 yaitu 528.828 µg/mL, 264.414
µg/mL dan 132.207 µg/mL dari hasil uji
sitotoksisitas dengan waktu inkubasi 24 jam, 48
jam, dan 72 jam. Uji ini dilakukan dengan metode
MTT assay, kemudian dihitung prosentase sel
yang hidup (viabel). Hasil uji doubling time
ekstrak dapat dilihat pada tabel 4. Pada tabel
tersebut tampak bahwa setelah pemberian ekstrak
dan penginkubasian selama 24 jam terjadi
penurunan persentase sel yang hidup pada
berbagai konsentrasi ekstrak dengan IC50 sebesar
194.487 µg/mL. Akan tetapi hasil uji LSD (α =
0,05) menunjukkan perbedaan yang nyata antara
konsentrasi 528.828 µg/mL dengan 264.414
µg/mL serta 264.414 µg/mL dengan 132.207
µg/mL. Perbedaan yang tidak nyata terlihat antara
konsentrasi 528.828 µg/mL dengan 132.207
µg/mL Hal ini menunjukkan bahwa ekstrak spons
A. suberitoides telah berinteraksi dengan sel
T47D
untuk menghambat pertumbuhan sel
tersebut.
Data yang diperoleh dari uji doubling
time pada perlakuan ekstrak A. suberitoides
selanjutnya dibuat profil hubungan antara
persentase sel hidup dan waktu inkubasi, dimana
nilai X adalah waktu inkubasi dan nilai Y adalah
persen kehidupan sel kanker payudara T47D.
Kemudian dibuat persamaan regresi linier,
sehingga dapat dihitung IC50 berdasarkan
8
persamaan garis yang diperoleh. Nilai IC50
merupakan nilai konsentrasi dosis bahan uji yang
menghambat pertumbuhan sel sebanyak 50 %.
Nilai IC50 dalam penelitian ini menunjukkan nilai
konsentrasi ekstrak spons A. suberitoides yang
menghasilkan hambatan pertumbuhan sel T47D
sebesar 50 % dari populasi.
Berdasarkan pengertian tersebut, maka nilai Y
dapat ditentukan yaitu 50.
Dari persamaan garis (Gambar1) diperoleh nilai,
Y = -0.078 X + 65.17
Y = 50,
Maka 50 = - 0.078 X + 65.17
X = 50 – 65.17 = 194.487
-0.078
Maka nilai konsentrasi ekstrak spons A.
suberitoides yang menghasilkan hambatan
pertumbuhan sel T47D sebesar 50 % dari
populasi, yakni sebesar 194.487 µg/mL. Sehingga
dapat disimpulkan bahwa dosis IC50 ekstrak
spons A. suberitoides adalah 194.487 µg/mL.
Uji doubling time juga dilakukan pada
kontrol positif, yakni cisplatin untuk melihat
pengaruh antiproliferatif obat kanker cisplatin
terhadap pertumbuhan sel kanker T47D.
Konsentrasi yang digunakan juga merupakan
konsentrasi LC50 dan 2 konsentrasi dibawah LC50
yaitu 16.818 µg/mL; 8.409 µg/mL; dan 4.205
µg/mL dari hasil uji sitotoksisitas dengan waktu
inkubasi 24 jam, 48 jam, dan 72 jam. Pemberian
cisplatin pada sel T47D pada uji doubling time
juga memberikan hasil yang signifikan terhadap
persentase kehidupan sel T47D selama periode
inkubasi.
Hasil uji LSD menunjukkan adanya beda
nyata antara kelompok perlakuan. Hingga
inkubasi 72 jam, persentase sel yang hidup
menurun. Hal ini menunjukkan bahwa cisplatin
mempunyai kemampuan menghambat proliferasi
sel T47D dengan peningkatan konsentrasi obat
dan penambahan waktu inkubasi.
Data yang diperoleh dari uji doubling
time pada perlakuan cisplatin selanjutnya dibuat
profil hubungan antara persentase sel hidup dan
waktu inkubasi, dimana nilai X adalah waktu
inkubasi dan nilai Y adalah persen kehidupan sel
kanker payudara T47D. Kemudian dibuat
persamaan regresi linier, sehingga dapat dihitung
IC50 berdasarkan persamaan garis yang diperoleh.
Nilai IC50 merupakan nilai konsentrasi dosis
bahan uji yang menghambat pertumbuhan sel
sebanyak 50 %. Nilai IC50 dalam penelitian ini
menunjukkan nilai konsentrasi ekstrak spons A.
suberitoides yang menghasilkan hambatan
pertumbuhan sel T47D sebesar 50 % dari
populasi. Berdasarkan pengertian tersebut, maka
nilai Y dapat ditentukan yaitu 50.
Dari persamaan garis (Gambar2)
diperoleh nilai,
Y = -0.51 X + 64,57
Y = 50,
Maka 50 = - 0.51 X + 64.57
X = 50 – 64.57 = 28.569
-0.51
Maka nilai konsentrasi cisplatin yang
menghasilkan hambatan pertumbuhan sel T47D
sebesar 50 % dari populasi, yakni sebesar 28.569
µg/mL. Sehingga dapat disimpulkan bahwa dosis
IC50 cisplatin adalah 28.569 µg/mL.
Nilai IC50 dalam penelitian ini
menunjukkan nilai konsentrasi ekstrak spons A.
suberitoides yang menghasilkan hambatan
pertumbuhan sel T47D sebesar 50 % dari
populasi, yakni sebesar 194.487 µg/mL. Nilai
tersebut juga menunjukkan apakah ekstrak spons
tersebut bersifat antiproliferatif terhadap sel
T47D. Sedangkan nilai IC50 cisplatin sebesar
28.569 µg/mL, hal ini menunjukkan bahwa
cisplatin memiliki aktivitas yang lebih tinggi
dalam menghambat proliferasi sel kanker
payudara T47D.
Nilai IC50 cisplatin jauh lebih rendah
dibandingkan IC50 ekstrak. Nilai IC50 yang rendah
menunjukkan aktivitas penghambatan proliferasi
sel yang baik karena dengan konsentrasi yang
sangat sedikit sudah dapat menghambat
proliferasi sel sebesar 50%. Hal ini disebabkan
karena cisplatin bekerja sebagai anti kanker
dengan cara menempel diri pada DNA
(deoxyribonucleic acid) sel kanker dan mencegah
pertumbuhan sel kanker. Oleh karena itu nilai
IC50 nya lebih rendah dibandingkan ekstrak
karena cisplatin cenderung menyembuhkan
kanker melalui penghambatan proliferasi sel
kanker.
Menurut Kamuhabwa et al. (2000), jika
ekstrak memiliki nilai IC50 ≤ 100 µg/ml dapat
dikatakan memiliki potensi antiproliferasi.
Sedangkan menurut Mans et al. (2000) batas
ambang yang ditetapkan untuk bahan alam yang
dapat dikembangkan sebagai antikanker yaitu ≤
50 µg/ml ( Mans et al., 2000). Berdasarkan kedua
acuan diatas, dapat dikatakan bahwa ekstrak
etanol spons A. suberitoides dengan nilai IC50
sebesar 194.487 µg/mL belum signifikan dalam
9
menghambat proliferasi sel T47D sehingga perlu
upaya fraksinasi dan isolasi bahan bioaktifnya.
Pengaruh Ekstrak Spons Laut A.suberitoides
Terhadap Apoptosis Sel Kanker Payudara
(T47D)
Kematian sel T47D akibat perlakuan
ekstrak spons A.suberitoides dapat diketahui juga
melalui uji apoptosis. Konsentrasi yang
digunakan untuk uji apoptosis adalah 528.828
µg/mL, 264.414 µg/mL dan 132.207 µg/mL
(ekstrak), serta 16.818 µg/mL; 8.409 µg/mL; dan
4.205 µg/mL (cisplatin).
Metode
yang
digunakan
adalah
doublestaining DNA dengan menggunakan
ethidium bromide-acridine orange. Kedua macam
zat warna ini digunakan secara bersamaan karena
dapat menghasilkan warna kontras, sehingga
mempermudah pengamatan dibawah mikroskop
fluorosen. Pengamatan terhadap morfologi sel
harus dilakukan dengan segera karena jika larutan
doublestaining terlalu lama berinteraksi dengan
sel, maka sel yang hidup akan mati. Hal ini
disebabkan karena etidium bromide bersifat
toksik, sehingga dalam penelitian hanya
digunakan konsentrasi yang sangat kecil 5 µL.
Ethidium bromide dalam konsentrasi kecil akan
dilawan oleh antibodi sel hidup.
Ethidium
bromide-acridine
orange
mampu menembus membran sel dan berinteraksi
dengan DNA sel. Hasil pengamatan di bawah
mikroskop fluorosen memperlihatkan bahwa sel
T47D yang hidup akan berfluoresen hijau dengan
acridine orange sedangkan sel yang mati
berfluoresen oranye dengan ethidium bromide.
Ethidium
bromide
hanya
dapat
menembus membran sel mati karena terjadi
penurunan integritas membran sel mati sehingga
tidak permeabel terhadap senyawa yang masuk,
sedangkan acridine orange mengandung gugus
kation sehingga dapat berinteraksi dengan DNA
sel hidup yang bersifat anionik membentuk garam
terdisosiasi (Nurulita & Mahdalena, 2006 dalam
Meye, 2009)
Hasil uji induksi apoptosis ekstrak spons
A.suberitoides terhadap sel T47D menunjukkan
bahwa ekstrak tersebut memiliki kemampuan
untuk menginduksi apoptosis pada sel T47D.
Pada gambar 3 a dibawah, tampak sel yang
mengalami apoptosis dengan inti yang
terfragmentasi dan terbentuknya tonjolan-tonjolan
pada sel yang menunjukkan mulainya apoptosis
(apoptotic body) (Gambar 3 b). Sel yang
mengalami nekrosis (Gambar 3 d) bentuknya
bulat seperti pada sel normal namun tetap
berwarna oranye. Diduga, senyawa aaptamin
yang terkandung dalam sponge A. suberitoides
inilah yang berperan dalam memicu apoptosis sel
T47D dengan perlakuan pemberian ekstrak.
Pada penelitian ini diperoleh persentase
apoptosis yang disebabkan oleh ekstrak dan
cisplatin berturut-turut 19.23 % dan 22.53 %
(Gambar 4). Jumlah apoptosis dengan perlakuan
ekstrak terhitung lebih kecil dari cisplatin karena
senyawa dalam cisplatin telah terbukti
menghambat proliferasi sel dengan cara
apoptosis. Sedangkan ekstrak masih mengandung
senyawa-senyawa yang dapat bekerja sinergis
membentuk apoptosis atau bahkan menghambat
apoptosis. Meskipun demikian, masih dapat
dikatakan bahwa senyawa yang terkandung dalam
ekstrak spons A. suberitoides dapat memacu
apoptosis pada sel kanker T47D. Sehingga dapat
disimpulkan bahwa ekstrak spons laut
A.suberitoides mampu menginduksi apoptosis
pada sel kanker T47D dengan aktifitas sebesar
19.23 %. Diduga senyawa aaptamin yang
terkandung dalam spons A. suberitoides dapat
menginduksi gen p53 sebagai regulator apoptosis
untuk mengendalikan kematian sel T47D secara
terprogram.
KESIMPULAN
Berdasarkan
penelitian
yang
telah
dilakukan menunjukkan bahwa :
1. Ekstrak spons laut A.suberitoides tidak
mempunyai aktivitas sitotoksik terhadap sel
kanker payudara T47D dengan harga LC50
sebesar 528.828 µg/mL pada uji sitotoksisitas
dengan metode MTT assay berdasarkan
kriteria yang ditetapkan oleh NCI (National
Cancer Institut) bahwa suatu senyawa
dikatakan memiliki efek sitotoksisitas yang
poten bila senyawa tersebut mempunyai nilai
LC50 ≤ 20 πg/mL.
2. Ekstrak spons laut A.suberitoides belum
signifikan dalam menghambat proliferasi sel
T47D dengan nilai IC50 sebesar 194.487
µg/mL pada uji Doubling Time berdasarkan
kriteria yang ditetapkan oleh Kamuhabwa et
al. (2000), jika ekstrak memiliki nilai IC50 ≤
100 µg/ml dapat dikatakan memiliki potensi
antiproliferasi.
3. Ekstrak spons laut A.suberitoides mampu
menginduksi apoptosis pada sel kanker T47D
dengan aktifitas sebesar 19.23 %.
10
SARAN
1. Perlu dilakukan fraksinasi dan isolasi pada
ekstrak spons laut A.suberitoides
2. Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut dengan
uji in vivo untuk menambah informasi ilmiah
tentang efek toksisitas ekstrak spons laut
A.suberitoides terhadap hewan uji, sehingga
komponen kimiawi yang terkandung di
dalamnya dapat dijadikan sebagai salah satu
agen antikanker.
UCAPAN TERIMA KASIH
Pada
kesempatan
ini
penulis
mengucapkan terimakasih kepada Ibu Awik
Puji Dyah Nurhayati, S.Si, M.Si beserta Prof. Dr.
Drs. Sukardiman, Apt, MS selaku dosen
pembimbing yang bersedia meluangkan waktu
untuk bimbingan. Ibu Dra. Dian Saptarini, M.Sc,
Ibu Dra. Nurlita Abdulgani, M.Si beserta Ibu
Ir.Sri Nurhatika, MP sebagai Dosen Penguji dan
Ibu Dra. Dian Saptarini, M. Sc. selaku Ketua
Jurusan Biologi FMIPA ITS. Bapak M. Muryono,
M.Si selaku Koordinator Tugas Akhir Jurusan
Biologi FMIPA ITS. Ibunda tercinta, kakakku
tersayang serta mas Uun yang selalu memberikan
motivasi, do’a dan dukungan baik material
maupun spiritual selama ini dan teman-teman
angkatan 2006 yang banyak membantu, serta
kepada semua pihak yang telah membantu
penelitian ini.
KEPUSTAKAAN
Abcam. 2007. T47D (Human ductal breast
epithelial tumor cell line) Whole Cell
Lysate
(ab14899)
datasheet.<URL:http://www.abcam.com/
index.html?datasheet=14899,
diakses
Februari 2007
Ahmad, T, Panrerengi, A. Suryati, E. 2000.
“Potensi Sponge Penghasil Bakterisida
dan Fungisida Alami Belum Banyak
Dimanfaatkan”.
Warta
Penelitian
Perikanan Indonesia 8, 3 : 34-45
Alatas, Zubaidah. 2007. Faktor Genetik
dalam Karsinogenesis yang Diinduksi
oleh Radiasi Pengion. PTKMR-BATAN.
Anonim.2008.
Senyawa
Metabolit
Sekunder.
<URL:http://www.invivogen.com/family.
php?ID=2-19&ID_cat=12>
Anonim.2009.BenzoPiren.<URL:http://www
.pharmastate.com/staticgallery/
pathologybenzopiren/m>
Anonim. 2009. Conective Tissue .
<URL:http://www.visualhistology.com>
Anonim. 2010. Fibrosarcoma. <URL:http://
www.pathconsultddx.com>
Aoki, S., Dexin K., Hideaki S., Yoshihiro S.,
Toshiyuki S., Andi S., and Motomasa K.
2006. Aaptamin, a Spongean Alkaloid,
Activates p21 Promoter in a p53Independent Manner. Biochemical and
Biophysical Research Communications
342 (2006)101-106
Arrozi, Hanifah. 2006. Uji Sitotoksisitas In
Vitro Fraksi Aktif Bahan Kinca
(Limonia accidissima Auct non L)
Hasil Pemisahan dengan Kolom
Vacuum Cair Pada Sel Hela. UGM :
Yogyakarta
Astuti, P., Alam, G., Tahir, A., and
Wahyuono, S., 2002. “Toxicity Studies of
Sponges Collected from Barrang Lompo
Island Against Artemia salina Leach”. J.
Trad. Med 7, 21 : 19-23.
Astuti, Puji. 2005. “Uji Sitotoksik Senyawa
Alkaloid dari Spons Petrosia sp :
Potensial
Pengembangan
Sebagai
Antikanker”.
Majalah
Farmasi
Indonesia 16 , 1 : 58-62.
“Selective
Badisa, ,R.B.
et.al.
2006.
Anticancer
Activity
of
Pure
Licamichauxiioic-B Acid in Cultured Cell
Lines”. Pharmaceutical Biology 44, 2 :
141-145
Bavelender, Gerrit. 1988. Dasar-dasar
Histologi. Erlangga. Jakarta
Ben Best. 2006. Cancer Death Causes &
Prevention.
<http://benzo/Hasil%20Penelusuran%20
Gambar%20Google%20untuk%20httpww
w_benbest_comhealthBenzoPyr_gif_files
/cancer.htm>
Belo, A.V. 2004. “Inhibition of Inflammatory
Angiogenesis By Distant Subcutaneous
Tumor in Mice”. Life Science 74 : 28272837
11
Beyersman, Detmar. 2002. “Effect of
Carcinogenic Metal on Gene Expression”.
Toxicology Letters 127 : 63-68
Brannon, Heather. 2007. “Skin Anatomy”.
Journal of Histology 184, 11
Burdall, E.S., Hanby M.A., Landsdown,
R.J.M., dan Speirs, V. 2003. Bereast
Cancer Cell Line, Breast Cancer Res.
5(2): 89-95.
Coutinho, A., Chanas, B., Souza, T.
Frugrulhetti, I., dan Epifanio. 2002. “Anti
HSV-1 Alkaloids from a Feeding
Deterrent Marine Spongse of The Genus
Aaptos”. Heterocycles 57 : 1265-1272
Dewi, Rahmawati Nirmala. 2005. Uji
Aktivitas
Antikanker
Senyawa
Andrografolida dari Isolat Herba
Sambiloto (Andrographis paniculata
Nees)
terhadap
Sel
Kanker
Fibrosarcoma Mencit secara In Vivo.
Skripsi Sarjana Fakultas Farmasi Unair
Dheta, Ermelinda Meye. 2009. Sitotoksisitas
dan Efek Ekstrak Etanol Kulit Buah
Jambu Mente (Anacardium occidentale
L.) Terhadap Sel Mieloma. Fakultas
Biologi UGM. Yogyakarta
Doyle, A., Griffith, S .J . B., 2000. Cell and
Tissue Culture for Medical Research,
49, John Willey and Sons, Ltd., New
York
Freshney, R.I. 1986. Animal Cell Culture, A
Practical Approach 1st Ed. IRL Press;
Washington D.C.
Guillen, David and Cockerell, Clay. 2001.
“Cutaneous and Subcutaneous Sarcoma”.
Clinics in Dermatology 19: 262-268
Hanahan, D., and Weinberg, R. A., 2000,
“The Hallmarks of Cancer”. Cell 100, 5770
Hanani, E., Mun’im, A. dan Sekarini. 2005.
”Identifikasi Senyawa Antioksidan dalam
Spons Callyspongia sp dari Kepulauan
Seribu”. Majalah Ilmu Kefarmasian II,
3 : 127 – 133
Herlinawati. 1998. Pengaruh Pemberian
Isometamidium dan Kombinasinya
dengan Potassium Tartrat terhadap
Histopatologi Ginjal Tikus Putih
(Rattus norvegicus) yang Diinfeksi
Trypanosoma
evansi
Isolat
Banyuwangi. Skripsi Sarjana Fakultas
Kedokteran Hewan Unair
Heti, Dany. 2008. Uji Sitotoksik Ekstrak
Etanol 70% Herba Sisik Naga
(Drymoglossum piloselloides Presl.)
Terhadap Sel T47D. Fakultas Farmasi
Universitas Muhamadiyah Surakarta:
Surakarta
Hossfeld, D.K., 1990, D.K.,Sherman, C.D.,
Love, R.R., Bosch, F.X (Eds), Manual of
Clinical Oncology, Fifth edition.,
Spinger-Verlag,
Berlin,
Heidelberg,
Germany
Huang. J, Bay.B.H, Tan.P.H. 2000. “Nuclear
Morphology In Breast Cancer”. Medical
Hypotheses 55, 1 : 26-28
Jasin, Maskuri. 1992. Zoologi Invertebrata.
Sinar Wijaya: Surabaya
Jesudason, M.D, Muthusami J.C, Subhasini
M.D,
Ramakrishna
M.D.
2005.
”Histologicaly
Benign
Pleomorphic
Adenoma with Subcutaneous Metastase”.
Otolaryngology Head and Neck
Surgery 133 : 985-986
Kamuhabwa, A., Nshimo, C. & de Witte, P.
2000. “Cytotoxicity of Some Medicinal
Plant Extracts Used in Tanzanian
Tradisional
Medicine”.
J.
Ethnopharmacol.70 : 143-149
Larghi, E., Obrist, B., and Kaufman, T. 2008.
A formal total synthesis of the marine
alkaloid aaptamine.Tetrahedron Volume
64, Issue 22
Lenny, Sovia. 2006. Senyawa Terpenoid
dan Steroida. Karya Ilmiah Departemen
Kimia FMIPA Universitas Sumatra Utara.
Medan
Mader, Sylvia. 2001. Biology, Seventh
Edition. Mc Graw Hill Higher Education.
New York
Makarchaenko, A. dan Utkina, N. 2004.
Antiradical Activity of Alkaloids from
Marine
Sponges.
International
Conference on Natural Products and
Physiologically
Active
Substances
(ICNPAS-2004) September 12-17, 2004,
Novosibirsk, Russia
12
Mayer, A., Gustafson, K. 2008. ”Marine
Pharmacology in 2005–2006: Antitumour
and Cytotoxic Compounds”. European
Journal Of Cancer 44 : 2357–2387
Meiyanto, E., and Septisetyani, E. P. 2005.
“Efek Antiproliferatif dan Apoptosis
Fraksi Fenolik Ekstraketanolik Daun
Gynura Procumbens terhadap Sel HeLa”.
Artocarpus 5 , 2 : 74-80
Meyer, B, N., N. R Ferrigni, J. E. Putnam, L.
B. Jacobsen, D. E. Nichols, J. L.
McLaughlin., 1982. “Brine Shrimp; A.
Convinient General Bioassay for Active
Plant Constituent”.Planta Med. 45: 31-34
Moeljopawiro, S., M.R. Anggela, D.
Ayuningtyas, B. Widaryanti, Y.Sari, dan
I.M.Budi. 2007. “Pengaruh Sari Buah
Merah (Pandanus conoideus Lamk.)
Terhadap Pertumbuhan Sel Kanker
Payudara dan Sel Kanker Usus Besar”.
Berkala Ilmiah Biologi 6, 2 : 121 - 130
Muniarsih T, dan Rachmaniar R. 1999.
“Isolasi Substansi Bioaktif Antimikroba
dari Spons Asal Pulau Pari Kepulauan
Seribu”.
Prosidings
Seminar
Bioteknologi Kelautan Indonesia I .
Jakarta 14 – 15 Oktober 1998
Murray, Robert K, dkk. 2003. Biokimia
Harper. Penerbit Buku Kedokteran EGC:
Jakarta
Nurlaila, Ika dan Hadi, Miftachul. 2009.
Kanker: Pertumbuhan, Terapi dan
Nanomedis. Biophysics Group, Physics
Research
Centre
LIPI.
Nanotech
Indonesia
Nurhayati, Awik Puji Dyah. 2009. Skrining,
Isolasi, dan Evaluasi In Vivo
Antikanker dari Spons Laut. LPPM ITS
Pamilih, H. 2009. Uji Sitotoksik Ekstrak
Etil Asetat Herba Bandotan (Ageratum
Conyzoides L.) Terhadap Sel Kanker
Payudara
(T47D)
Dan
Profil
Kromatografi Lapis Tipis. Fakultas
Farmasi UMS, Surakarta
Powers, Barbara and Dernell, William. 1998.
“Tumor Biology and Patology”. Clinical
Techniques in Small Animal Practice
13, 1 : 97-102
Romihmohtarto, K. dan Juwana S. 1999.
Biologi Laut. Ilmu Pengetahuan
tentang Biota Laut. Pusat Penelitian dan
Pengembangan Oseanologi-LIPI. Jakarta.
hlm 115 – 128.
Ruppert EE, and Barnes RD. 1991.
Invertebrates Zoology. Sixth Edition.
Rundle, A., Tang D., Hibshoosh H.,
Estabrook A., Schanabel F., Cao W.,
Grumet S., and Perera F,. 2000.“ The
Relationship Between Genetic Damage
from Polycyclic Aromatic Hydrocarbons
in Breast Tissue and Breast Cancer“.
Carcinogenesis 2, 7 :1281-1289
Sanif R. 2001. Sinopsis Onkologi
Ginekologi. Sub bagian Onkologi
Ginekologi
Bagian
Obstetri
dan
Ginekologi FKUI/RSUPN dr. Cipto
Mangun kusumo. Jakarta; 45-63
Setyowati, Erna. 2005. “Isolasi Senyawa
Sitotoksik Spons Kaliapsis“. Majalah
Farmasi Indonesia 18, 4 : 183-189.
Shaari , Khozirah, et al. 2008. ”Cytotoxic
Aaptamines from Malaysian Aaptos
aaptos”. Mar Drugs 7, 1 : 1–8.
Shimada.H, Uchida. M, Okawara.T. 2005.
”Inhibitory Effect of Flavonoids on The
Reduction of Progesterone to 20αhydroxiprogesterone in Rat Liver”.
Journal of Steroid Biochemistry and
Molecular Biology 93 : 73-79
Smith, John B dkk. 1988. Pemeliharaan,
Pembiakan dan Penggunaan Hewan
Percobaan di Daerah Tropis. UI Press.
Jakarta.
Suffness, M., and J. M. pezzuto. 1991.
“Assays Related to Cancer Drug
Discovery’,
Methods
in
Plant
Biochemistry ; Assays for Bioactivity.
Vol. 6. London Academic Press, 71-133
Sukardiman, Abdul Rahman, Wiwied
Ekasari, dan Sismindari. 2005. “Induksi
Apoptosis Senyawa Andrografolida dari
Sambiloto (Andrographis paniculata
Nees) Terhadap Kultur Sel Kanker”.
Media Kedokteran Hewan 21, 3
Sukardiman, Ekasari. W, Hapsari. P.P. 2006.
“Aktivitas Antikanker dan Induksi
Apoptosis Fraksi Klorofom Daun Pepaya
13
(Carica papaya L) terhadap Kultur Sel
Kanker Mieloma”. Media Kedokteran
Hewan 22, 2 : 104-111
Suparno. 2005. Kajian Bioaktif Spons Laut
(Porifera:
Demospongiae)
Suatu
Peluang
Alternatif
Pemanfaatan
Ekosistem Karang Indonesia Dalam
Bidang Farmasi. IPB: Bogor
Susilawati, Sri. 2006. Pengaruh Tepung
Tempe terhadap Ukuran Jaringan
Kanker Mammae dan Gambaran
Mikroanatomi Hepar Mencit (Mus
musculus)
Galur
C3H
setelah
Ditransplantasi Sel Adenocarcinoma
Mammae. Universitas Negeri Semarang
Syaifudin, Mukh. 2007. “Gen Penekan
Tumor p53 Kanker dan Radiasi Pengion”.
Buletin Alara 8, 3 : 119 – 128
Tadjudin, M.K. 2006. Apoptosis Pada
Glioma Otak. Simposium: Apoptosis
Charming to Death FK UI
Tsukamoto Sachiko; Yamanokuchi Rumi;
Yoshitomi Makiko; Sato Kohei; Ikeda
Tsuyoshi; Rotinsulu Henki; Mangindaan
Remy E P; de Voogd Nicole J; van Soest
R W M; Yokosawa Hideyoshi. 2010.
“Aaptamine, an Alkaloid From The
Sponge Aaptos suberitoides , Fungtions
as a Proteasome Inhibitor”. Bioorganic
Medicinal Chemistry Letters 20 , 11 :
3341-3
Van Soest, R.M.W. 1989. “The Indonesian
Sponge
Fauna:
Status
Report”.
Netherland Journal of Sea Research 23,
2 : 223-230
Widodo, Nanang. 2007. Isolasi dan
Karakterisasi Senyawa Alkaloid yang
Terkandung dalam Jamur Tiram Putih
(Pleurotus ostreotus). Jurusan Kimia
FMIPA Universitas Negeri Semarang.
Semarang
Widyastuti, Shanti. 2008. Uji Toksisitas
Ekstrak Daun Iprih (Ficus glabella
Blume) terhadap Artemia salina Leach
dan Profil Kromatografi Lapis Tipis.
Jurusan
Farmasi
Universitas
Muhamadiyah Surakarta
Yana,
Sumpena.
Dkk.
2009.
“Uji
Mutagenisitas Benzo(a) piren dengan
Metode ikronukleus pada SumsumTulang
Mencit Albino (Mus musculus”). Cdk
167 36, 1 : 76-85
Yuwono,
Triwibowo.
2005.
Biologi
Molekular. Erlangga, Jakarta
Zakaria, Fransiska R. 2001. ”Pangan dan
Pencegahan Kanker”. Jurnal Teknologi
dan Industri Pangan
14
15
16