Uji Efektivitas Antibakteri Ekstrak Daun Kamboja

Uji Efektivitas Antibakteri Ekstrak Daun Kamboja (Plumiera rubra) pada
Konsentrasi yang Berbeda Terhadap Pertumbuhan Aeromonas
hydrophila secara In Vitro
(Antibacterial Effectiveness Test Leaf Extract Frangipani (plumiera rubra) at different
concentrations on Growth of Aeromonas hydrophila In Vitro)
Wan Nita Ulfani Barus1, Hasan Sitorus2, Indra Lesmana2
1. Program studi Manajemen Sumberdaya Perairan, Fakultas Pertanian,
Universitas Sumatera Utara
2. Staff pengajar Program studi Manajemen Sumberdaya Perairan, Fakultas
Pertanian, Universitas Sumatera Utara
ABSTRACT
Indonesia the outbreaks of disease in red spotted fish is caused by
A.hydrophila bacteria. Many efforts have been made by the experts to address this
outbreak by both giving vitamins and giving probiotics and antibiotics. However a
prolonged uncontrolled usage and improper dosage may lead to negative impacts
to the species. Thus, the use of medicinal plants or fitofarmaka is a solution to
overcome these problems. This research aims to know the effectiveness of
Frangipani leaf extract (Plumeira rubra) on the growth of bacteria A. hydrophila
and to determine the minimum dose of Frangipani leaf extract necessary to inhibit
the growth of bacteria. The research was conducted at Laboratory of Fish
Quarantine, Quality Control and Fisheries Product Safety Level I, Medan I. The
research used a completely randomized experiment method with 6 treatment
levels and 3 replications. The research shows that, the Frangipani leaf extract
doses has highly significant effect on the growth of bacteria A .hydrophila, and
the minimum dose to inhibit the bacteria is 2 % with a clear zone diameter of 6.4
mm.
Key words : Effectiveness , Frangipani leaf extract, A. hydrophila
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Potensi perikanan budidaya di
Indonesia
cukup
besar,
baik
budidaya air tawar, air payau
maupun budidaya laut. Dalam dasa
warsa terakhir, hasil tangkapan per
satuan upaya (CPU) semakin
menurun akibat di beberapa kawasan
perairan Indonesia sudah mengalami
tangkap lebih (over fishing). Untuk
mengatasi hal tersebut, Kementerian
Kelautan Perikanan sejak tahun 2010
telah mengembangkan program
budidaya perikanan dengan 10
komoditas unggulan ikan budidaya.
Program ini dengan berbagai bantuan
dan kemudahan dalam penyediaan
sarana produksi dan pemasarannya,
telah mendorong berkembangnya
usaha budidaya di masayarakat mulai
dari teknologi tradisional plus hingga
teknologi budidaya intensif.
Dalam proses budidaya ikan oleh
masyarakat, salah satu masalah yang
dihadapi adalah terjadinya serangan
hama dan penyakit ikan. Menurut
Kordi
(2010), berkembangnya
penyakit ikan dalam proses budidaya
ikan pada dasarnya disebabkan
terjadinya
ketidak
seimbangan
interaksi faktor lingkungan, mikroba
air dan ikan. Ketidak seimbangan ini
dapat disebabkan perubahan kualitas
air menjadi buruk sehingga mikroba
pathogen berkembang dalam air dan
menyerang ikan budidaya.
Penyakit bakterial pada ikan
merupakan salah satu penyakit yang
dapat menimbulkan kerugian yang
tidak sedikit. Selain dapat mematikan
ikan,
penyakit
ini
dapat
mengakibatkan menurunnya kualitas
daging ikan yang terinfeksi. Bakteri
patogen
pada
ikan
dapat
menyebabkan infeksi primer atau
sekunder. Penyakit akibat infeksi
bacteria di Indonesia ternyata dapat
mengakibatkan kematian sekitar 50100% (Tanjung et.al., 2008).
Tujuan Penelitian
Adapun tujuan dari penelitian
ini adalah untuk mengetahui
efektivitas bakteristatik ekstrak daun
kamboja (Plumiera rubra) terhadap
pertumbuhan bakteri A. hydrophila,
dan
dosis
hambat
minimal
pertumbuhan bakteri secara in vitro
BAHAN DAN METODE
Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan
pada bulan Maret - April 2013.
Kegiatan ekstraksi daun kamboja
dilakukan di Laboratorium Kimia
Bahan Alam, Fakultas Matematika
Ilmu Pengetahuan Alam Universitas
Sumatera Utara, sedangkan proses
uji biokimia bakteri serta uji
antibakteri ekstrak daun kamboja
terhadap bakteri A. hydrophila
dilakukan di Balai Karantina Ikan
Pengendalian Mutu dan Keamanan
Hasil Perikanan Kelas I Medan.
Bahan dan Alat
Bahan
yang digunakan
adalah daun kamboja, Isolat Murni
Bakteri yang di dapat dari Balai
Karantina Ikan Pengendalian Mutu
dan Keamanan Hasil Perikanan
Kelas I Medan I, Media Umum
(TSA), akuades, alkohol 70%,
Larutan crystal violet, larutan Iodine
lugol, larutan safranin, reagen
oksidase, O/F basal medium, kertas
label, RS medium, larutan KOH 3%,
cakram disk, kertas cokelat/kertas
ubi, kertas label, plastik, alumunium
foil.
Alat yang digunakan adalah
: cawan petri, laminarflow, rak
tabung reasksi, pipet tetes, gelas
ukur, tabung reaksi. Bunsen,
incubator,
jarum ose, preparat,
sentripuse, micropore, erlenmeyer,
blender, kertas saring, pipet tetes,
refrigerator.
Prosedur Percobaan
Sterilisasi Alat
Alat-alat
yang
akan
disterilisasi dicuci terlebih dahulu
dengan menggunakan detergen
setelah itu dikeringkan. Sebelum
dimasukkan kedalam autoklaf,
cawan petri dibungkus dengan
kertas sampul dan tabung reaksi
ditutup dengan kapas, kemudian
dibungkus dengan kertas dan diikat.
Alat dimasukkan kedalam ranjang
autoklaf,
kemudian
autoklaf
dihidupkan dengan suhu 121 °C
selama 20 menit
Daun Kamboja
Daun Kamboja segar dicuci
dan dibersihkan kotoran lain dengan
menggunakan air bersih, kemudian
daun kamboja diblender sehingga
diperoleh air perasannya. Daun
Kamboja kemudian disaring dengan
menggunakan
centrifuse
dan
ditampung dalam erlenmeyer.
Pembuatan Media
Media ditimbang
8 g
kemudian dilarutkan dengan 200 ml
aquades dalam Erlenmeyer kemudian
dimasukkan kedalam autoclave
digital, kemudian Erlenmeyer ditutup
dengan
alumunium
foil
dan
disterilisasi menggunakan autoklaf
dengan suhu 1210C selama 15 menit.
setelah selesai media didinginkan di
waterbath, Setelah selesai media
TSA dituang kedalam petridist
didalam Laminary Flow agar tidak
terjadi kontaminasi.
Uji Biokimia Bakteri
Menurut Badan Standarisasi
Nasional Indonesia (2009), Uji ini
dilakukan untuk mengetahui sifat
atau karakteristik bakteri dengan
media. Adapun pelaksanaannya
sebagai berikut :
a. Pewarnaan Gram
Cara kerja dari pewarnaan
Gram yaitu suspensikan bakteri
dengan ose, kemudian letakkan pada
obyek dan difiksasi, tetesi dengan
larutan Gram A yang mengandung
kristal violet, kemudian tetesi dengan
larutan Gram B yang mengandung
lugol, tetesi dengan larutan Gram C
yang mengandung alkohol, dan yang
terakhir tetesi dengan larutan Gram
D yang mengandung safranin.
b. Uji Motilitas
Satu ose bakteri ditanam
secara tegak lurus di tengah Medium
SIM dengan cara ditusukkan,
diinkubasi pada suhu 37oC selama 24
jam. Bila timbul kekeruhan seperti
kabut menandakan bakteri bergerak.
c. Uji oksidase
Menguji
oksidase
sebelumnya disediakan kertas filter
yang telah ditetesi dengan reagent
oksidase dan ditempatkan dalam
petridisk dan disimpan dalam
freezer. Untuk pengujian diambil
sedikit
isolat
murni
bakteri
menggunakan
ose
steril
lalu
diletakkan ke kertas filter tersebut.
Selanjutnya
diamati
perubahan
warna yang terjadi, apabila menjadi
ungu maka dikatakan positif
menghasilkan
enzim
oksidase,
sebaliknya apabila tidak berubah
warna maka negatif.
d. Uji O/F
Ambil isolat murni bakteri
dengan
ose
steril
kemudian
diinokulasikan pada media O/F
dengan cara tusukan kemudian
disimpan pada inkubator. Setelah 24
jam penyimpanan, kemudian di
amati perubahan warna yang terjadi.
Jika kedua tabung media O/F
tersebut berubah menjadi kuning,
maka bakteri bersifat oksidatif. Jika
media tanpa parafin berubah menjadi
warna kuning dan media berparafin
berubah menjadi biru maka bakteri
bersifat oksidatif. Jika media
berparafin berubah menjadi kuning
dan media tanpa paraffin tetap
berwarna hijau, maka bakteri bersifat
fermentatif. Apabila keduanya tidak
mengalami perubahan maka bakteri
dikatakan negatif.
e. Uji Rimmler-Shotts (RS)
Isolat bakteri diambil dengan
jarum ose steril dan goreskan pada
media RS, Kemudian inkubasikan
pada suhu 37oC selama 18 jam
sampai dengan 24 jam kemudian
amati koloni yang tumbuh, apabila
bewarna kuning tanpa warna hitam
ditengah koloni berarti bersifat
positif A. hydrophila.
Pembuatan Agar Miring
Kedalam tabung reaksi steril
dimasukkan 3 ml media TSA steril,
didiamkan pada temperatur kamar
sampai sediaan memadat pada posisi
miring kira-kira 45 oC (Ditjen POM
diacu oleh Mierza, 2011).
Peremajaan Biakan Murni
Satu koloni bakteri diambil
dengan menggunakan jarum ose
steril, lalu ditanam pada media TSA
miring dengan cara menggoreskan
jarum ose yang mengandung bakteri
A. hydrophila kemudian diinkubasi
selama 18 - 24 jam pada suhu 3637oC dalam inkubator (Ditjen POM
diacu oleh Mierza, 2011).
Pembuatan Larutan Suspensi
Pembuatan
suspensi
dilakukan dengan cara mengambil 1
sampai 2 koloni A. hydrophila yang
dimasukkan ke dalam larutan NaCl
0,9%.
Kemudian,
kekeruhan
suspensi tersebut dibandi ngkan
dengan
larutan
standar
0,5
McFarland
secara berdampingan
dengan latar belakang garis-garis
bewarna hitam menggunakan mata
tanpa bantuan alat. Bila kekeruhan
suspensi tersebut tidak cocok dengan
turbiditas larutan standar maka dapat
ditambahkan koloni A. hydrophila
pada suspensi atau mengencerkan
suspensi
tersebut
dengan
menambahkan NaCl 0,9%.
Penanaman Bakteri
Penanaman
Bakteri
menggunakan metode cawan sebar
(spread plate) . Pada metode cawan
sebar, 1 ml suspensi bakteri yang
telah diencerkan disebar pada media
TSA
yang
telah
disiapkan.
Selanjutnya, suspensi dalam cawan
petri disebarkan dengan spreader
atau hockey stick pada suhu (37 oC)
selama 1-2 hari.
Uji Daya Hambat
Media padat yang telah
dipanaskan
hingga
mencair,
didinginkan sampai suhu ± 40OC,
dan dituang dalam cawan petri steril.
Kemudian ditambahkan 0,1 mL
larutan biakan aktif bakteri dan
dihomogenkan kemudian dibiarkan
hingga memadat. Kertas cakram
(diameter 5 mm) diresapkan dalam
ekstrak . Kertas cakram tersebut
kemudian
diletakkan
di
atas
permukaan
media
bakteri
menggunakan pinset dan ditekan
sedikit. Media bakteri yang sudah
dipasangi
bahan
antibakteri
O
diinkubasi pada suhu 37 C selama
18-24 jam. Pembacaan awal dapat
dilakukan setelah 6-8 jam.
Perhitungan Jumlah Sel Bakteri
Sediakan tabung reaksi yang
berisi konsentrasi ekstrak daun
kamboja sebanyak 6 tabung masingmasing 1 ml kemudian tambahkan
larutan yang berisi suspensi bakteri
sebanyak 1 ml pada masing- masing
tabung di inkubasi 24 jam,
kemudian lakukan pengenceran
bertingkat dari 10-1, dst. Kemudian
pipet 0,1 ml dari masing-masing
pengenceran dan letakkan pada
cawan petri yang berisi media
PCA 15 ml dengan teknik cawan
tuang, lakukan dengan memutar dari
kiri ke kanan, lakukan secara duplo
diinkubasi 24 jam. Cara menentukan
jumlah mikroorganisme per ml
suspensi dilakukan dengan jumlah
koloni terhitung dengan volume
suspensi yang diinokulasi dan dikali
dengan pengenceran yang digunakan
Analisis Data
Validasi Data
Untuk mengetahui apakah
data-data hasil percobaan homogen
atau tidak dan memenuhi asumsi
yang
telah
ditetapkan
maka
dilakukan analisis homogenitas
ragam galat dengan uji Barlett. Bila
uji signifikansi memperlihatkan
pengaruh nyata atau sangat nyata
maka dilanjutkan dengan Uji LSD
untuk mengetahui dosis ekstrak daun
kamboja yang mengasilkan daya
hambat
tertinggi
terhadap
pertumbuhan bakteri A. hydrophila.
terlihat buram dan masih terdapat
bintik-bintik).
Gambar 3. Zona hambat A.hydrophila
Perhitungan Populasi Bakteri
Berdasarkan
pengamatan
yang telah dilakukan selama
penelitian,
didapatkan
hasil
perhitungan
jumlah
bakteri
A.hydrophila
dengan
teknik
pengenceran sebelum dan sesudah
perlakuan ekstrak daun kamboja
yang diperlihatkan pada Tabel 4
Bakteri A. hydrophila
Sebelum
Setelah
Perlakuan Perlakuan
Perlakuan
(sel/ml)
(sel/ml)
F (10%)
72.0 x 10 4
18.5 x 10 4
4
E (8%)
72.0 x 10
21.0 x 10 4
D (6%)
72.5 x 10 4
26.0 x 10 4
4
C (4%)
72.5 x 10
31.0 x 10 4
B (2%)
72.5 x 10 4
33.5 x 10 4
4
A (0%)
72.0 x 10
297.5 x 10 4
Tabel 4. Populasi
Analisi Variansi
Analisi
yang digunakan
terhadap data yang dikumpulkan
adalah analisis variansi, data yang
dianalisis adalah data penghambatan
pertumbuhan bakteri A. hydrophila.
Analisis variansi terhadap data
penelitian didasarkan pada model
linear aditif Rancangan Acak
Lengkap dengan 6 perlakuan dan 3
ulangan.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil
Pengaruh Ekstrak Daun Kamboja
Terhadap Bakteri A. hydrophila
Berdasarkan
pengamatan
yang telah dilakukan selama
penelitian, terdapat daerah hambatan,
yaitu daerah yang benar-benar tidak
ditumbuhi bakteri dan zona yang
masih ditumbuhi oleh bakteri yang
Pemberian ekstrak daun
kamboja
bersifat
menghambat
pertumbuhan bakteri A.hydrophila,
seperti pada Gambar 3 diatas dapat
dilihat adanya zona hambat dari
ekstrak daun kamboja terhadap
bakteri A.hydrophila, hal ini selaras
dengan pernyataan Rolliana (2010)
yang mengatakan bahwa adanya
senyawa flavonoid yang terdapat
dalam daun kamboja berfungsi
sebagai penghambat pembelahan sel
bakteri melalui jalur transduksi dari
membran ke inti sel bakteri. Selain
flavonoid, beberapa senyawa yang
terkandung dalam daun kamboja
yang bersifat bakteristatik adalah
alkaloid, terpenoid, dan glikosid.
Menurut Saifudin (2006), senyawa
alkaloid merupakan salah satu
senyawa yang bersifat antibakteri
karena dapat merusak dinding sel
bakteri, sehingga pembelahan sel
terhambat.
Berdasarkan pada Tabel 4
tersebut diketahui semakin tinggi
ekstrak daun kamboja maka akan
semakin sedikit jumlah bakteri yang
hidup. Hal ini dapat terlihat pada
jumlah bakteri A.hydrophila pada
konsentrasi 10%, jumlah bakteri
hidup paling rendah, sementara pada
perlakuan yang tidak diberikan
ekstrak daun kamboja (kontrol),
pertumbuhan bakteri berlimpat ganda
setelah dilakukan inkubasi.
KESIMPULAN DAN SARAN
Kesimpulan
Berdasarkan hasil penelitian yang
telah
dilakukan
maka
dapat
disimpulkan :
1. Perlakuan dosis ekstrak daun
kamboja berpengaruh sangat
nyata
terhadap pertumbuhan
bakteri A. hydrophila .
2. Daya hambat terbesar dijumpai
pada perlakuan dosis ekstrak
10% dengan diameter zona
hambatnya 12.2 mm, sedangkan
dosis hambat minimal adalah 2 %
dengan zona hambat 6.4 mm.
3. Rata-rata
zona
hambat
pertumbuhan bakteri dengan
pemberian dosis ekstrak daun
kamboja mengalami penurunan
seiring dengan menurunnya dosis
ekstrak.
4. Dosis hambat minimum adalah 2
% dan populasi jumlah bakteri
A.hydrophila
yang
paling
rendah adalah pada konsentrasi
ekstrak daun kamboja 10%.
Saran
Berdasarkan penelitian yang
telah
dilakukan
maka
dapat
disarankan untuk melihat efektifitas
ekstrak daun kamboja dalam
pengendalian serangan bakteri A.
hydrophila pada kegiatan budidaya
ikan air tawar, maka perlu dilakukan
penelitian lanjutan secara in vivo.
DAFTAR PUSTAKA
KKP.
2010.
Program
Pengembangan
Perikanan
Budidaya
Nasional.
Direktorat Jenderal Perikanan
Budidaya. Jakarta.
Kordi, M. G.H. 2008. Budidaya
Perairan. PT. Citra Aditya
Bakti. Bandung
Mierza, V. 2011. Uji Antibakteri
Ekstrak Etanol dan Fraksi
Umbi Bawang Sabrang
(Eleutherine
Palmifolia
Merr.).
Tesis.
Fakultas
Farmasi
Universitas
Sumatera Utara. Medan.
Rolliana, E.R. 2010. Uji Toksisitas
Akut
(Plumeria
alba
L.)Terhadap Larva Artemia
salina Leach dengan Metode
Brine Shrimp Lethality Test
(BST). Skripsi. Fakultas
Kedokteran
UNDIP.
Semarang..
Saifudin, A. 2006. Alkaloid :
Golongan Paling Prospek
Menghasilkan Obat Baru.
Departemen Farmakologis.
Gorleus
Laboratory.
University Leiden. Jerman.
SNI,
2009. Badan Standarisasi
Nasional Indonesia. Jakarta.
Tanjung,N.K, Sudarno, dan Laksmi,
S. 2008. Efektifitas Ekstrak
Kulit Jeruk Lemon(Citrus
limonum) Terhadap Daya
Hambat
Pertumbuhan
Aeromonas
hydrophila
Secara In Vitro. Jurnal
Berkala Ilmiah Perikanan
Vol 3 No 1 April 2008.