LAPORAN PRAKTIKUM BIOTEKNOLOGI “ISOLASI DNA

LAPORAN PRAKTIKUM BIOTEKNOLOGI
“ISOLASI DNA KASAR”
Disusun Oleh:
Nama
NIM
Kelompok
Asisten
: Ika Nursa’adah
: 115040213111009
: Kamis, 07.30 WIB
: Sony Eko .P
PROGRAM STUDI AGROEKOTEKNOLOGI
FAKULTAS PERTANIAN
UNIVERSITAS BRAWIJAYA
MALANG
2012
BAB I
PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
DNA merupakan materi genatik yang yang mengkode semua
informasi yang dibutuhkan untuk proses metabolisme dalam setiap
organisme. Molekul DNA ini terikat membentuk kromosom, dan
ditemukan di nukleus, mitokondria dan kloroplas. DNA yang
menyusun kromosom ini merupakan nukleotida rangkap yang
tersusun heliks ganda (double helix), dimana basa nitrogen dan
kedua ”benang” polinukleotida saling berpasangan dalam pasangan
yang tetap melalui ikatan hidrogen dan antara nukleotida yang satu
dengan nukleotida yang lain dihubungkan dengan ikatan fosfat.
Isolasi DNA adalah suatu tekhnik yang digunakan untuk
memperoleh DNA murni, yaitu tanpa protein dan RNA dari suatu
sel dalam jaringan. Pada proses isolasi DNA ini, sel eukariotik
harus dihancurkan terlebih dahulu melalui cara mekanik dan
enzimatis. Hal ini disebabkan membran sel dari membran inti
sebagian besar tersusun atas lipida, Oleh karena itu pada praktikum
ini digunakan detergen untuk mengikat atau menurunkan tegangan
permukaannya.
1.2 Tujuan
Mahasiswa atau praktikan dapat mengetahui macam metode isolasi
DNA, mengetahui tahap isolasi DNA, serta mengetahui manfaat
isolasi DNA
1.3 Manfaat
Memberikan pengetahuan kepada mahasiswa cara melakukan
isolasi DNA dengan bahan yang sederhana.
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
1.1 Definisi Isolasi DNA
1. Isolasi DNA merupakan langkah mempelajari DNA.salah satu
prinsip isolasi DNA yaitu dengan sentrifugasi.sentrifugasi
merupakan teknik untuk memisahkan campuran berdasarkan
berat molekul komponennya.molekul yang mempunyai berat
molekul besar akan berada di bagian bawah tabung dan molekul
ringan akan berada pada bagian atas tabung (Mader, 1993).
2. DNA issolation is the use of DNA for analysis or manipulation
usually requires that it is isolated and purified to a certain
extent.
Terjemahan:
Isolasi DNA merupakan kegunaan DNA untuk dianalisa atau
dimanipulasi yang harus diisolasi terlebih dahulu dan murni
kandungannya (Wilson, Keith and John, 2010).
1.2 Macam metode isolasi DNA
1. Teknik Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD)
Teknik pengujian polimorfisme DNA berdasarkan pada
amplifikasi dari segmen-segmen DNA acak yang menggunakan
primer tunggal yang sekuen nukleotidanya ditentukan secara
acak. Primer tunggal ini biasanya berukuran 10 basa. PCR
dilakukan pada suhu anealing yang rendah yang memungkinkan
primer menempel pada beberapa lokus pada DNA. Aturan
sederhana untuk primer adalah terdiri atas 18- 28 susunan basa
dengan persentase G+C 50-60% (Subandiyah,2006).
2. Metode CTAB
Menghasilkan pita DNA yang berukuran tebal dan dapat
memisahkan DNA dari polisakarida karena adanya perbedaan
karakteristik kelarutan (differensial of solubility). Disamping
deperoleh fragmen DNA, dengan metode CTAB juga akan
diperoleh RNA dengan pita tipis yang terletak jauh berada di
bawah pita DNA. Keberadaan pita RNA tergantung bahan yang
diekstraksi (Prasetyo, 2008).
3. Phenol:chloroform
Mengunakan senyawa Phenol-choloroform-isoamyl alcohol,
Metode standard untuk ekstraksi DNA,Akhir-akhir ini
ditinggalkan, karena sifat toksik phenol.
4. SaltingOut
enggunakan garam konsentrasi tinggi (NaCl 6 M), untuk
medenaturisasi protein menggunakan Proteinase K untuk
denaturasi protein.
5.
Guanidine isothiocyanate
Metode ini lebih cepat dibanding dua metode sebelumnya,
Thiocyanate bersifat toksik, untuk lisis dinding sel ,
Memerlukan chloroform untuk denaturasi protein.
6. Silica Gel
Silica gel dapat mengikat DNA dengan perantaraan
garam/buffer tertentu (NaI), Cepat, tetapi recovery DNA kurang
(Barnum 2005).
7.
PCR (Polymerase Chain Reaction)
Merupakan suatu teknik perbanyakan (amplifikasi) potongan
DNA secara in vitro pada daerah spesifik yang dibatasi oleh dua
buah primer oligonukleotida. Primer yang digunakan sebagai
pembatas daerah yang diperbanyak adalah DNA untai tunggal
yang urutannya komplemen dengan DNA templatnya. Proses
tersebut mirip dengan proses replikasi DNA secara in vivo yang
bersifat semi konservatif (Giri, 2004).
2.3 Tahap isolasi DNA
1. Isolasi jaringan
Tahap pertama yang dilakukan yaitu mengisolasi jaringan
yang ingin digunakan.
2. Pelisisan dinding dan membran sel
Tahap selanjutnya yaitu melisiskan dinding dan membran sel
dengan cara penggerusan (homogenasi), sentrifugasi dengan
kecepatan lebih dari 10.000 rpm atau dengan menggunakan
larutan pelisis sel atau buffer ekstraksi. Inti sel harus dilisiskan,
karena substansi gen yang diinginkan ada didalamnya.
Penambahan larutan pelisis sel ini bertujuan untuk melisiskan
sel yang tidak mengandung DNA agar sel yang mengandung
inti sel dapat diisolasi atau dipisahkan dari komponenkomponen sel lainnya yang tidak berfungsi.
3. Pengekstraksian dalam larutan
Selanjutnya supernatan yang terbentuk dibuang dan
kemudian dilakukan ekstraksi di dalam larutan. Hal tersebut
bertujuan agar didapat ekstrak.
4. Purifikasi
Tahap ini bertujuan untuk membersihkan hasil ekstrak dari
zat-zat lainnya. Pada larutan tersebut kemudian diberikan
RNAse dan diinkubasi selama 10 menit pada suhu 65°C. Hal
tersebut bertujuan untuk mengoptimalkan kerja enzim yang
sangat dipengaruhi oleh temperatur. Penambahan RNAse
berguna untuk menyingkirkan kontaminasi RNA sehingga DNA
dapat diisolasi secara utuh.
5. Presipitasi
Tahap terakhir, yaitu presipitasi bertujuan untuk
mengendapkan protein histon, sehingga untai-untai DNA tidak
lagi menggulung (coiling) dan berikatan dengan protein histon,
yang menyebabkan DNA menjadi terlihat. Tahap presipitasi
dilakukan dengan cara meneteskan larutan presipitasi protein
dan kemudian divortex yang bertujuan untuk menghomogenkan
larutan. Larutan presipitasi protein terdiri atas amonium asetat
yang jika berikatan dengan protein mengakibatkan terbentuknya
senyawa baru dengan kelarutan lebih rendah, sehingga
menyebabkan protein mengendap. Larutan tersebut kemudian
disentrifugasi kembali selama 5 menit dengan kecepatan 13.000
rpm. Prinsip utama sentrifugasi adalah memisahkan substansi
berdasarkan berat jenis molekul dengan cara memberikan gaya
sentrifugal sehingga substansi yang lebih berat akan berada di
dasar, sedangkan substansi yang lebih ringan akan terletak di
atas ( Fauziah, 2010)
2.4 Manfaat isolasi DNA
Isolasi DNA diperlukan untuk analisis genetik, yang digunakan
untuk tujuan ilmiah, medis, atau forensik. Para ilmuwan
menggunakan DNA di sejumlah aplikasi, seperti pengenalan DNA
ke dalam sel dan binatang atau tanaman, atau untuk tujuan
diagnostik. Dalam obat aplikasi yang terakhir adalah yang paling
umum. Di sisi lain, ilmu forensik perlu memulihkan DNA untuk
identifikasi individu (bagi pemerkosa misalnya, pencuri kecil,
kecelakaan, atau korban perang), penentuan ayah, dan pabrik atau
identifikasi hewan (Anggie, 2011).
BAB III
METODELOGI
3.1 Alat, Bahan dan Fungsi
3.1.1 Alat :
1. Pisau
2. Timbangan
3. Mortar dan pestle
4. Beaker glass
5. Spatula
6. Pipet
7. Tabung reaksi
8. Kertas label
9. Rak tabung reaksi
3.1.2
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
: mengupas dan memotong Mangga
: menimbang bahan
:menghaluskan mangga
:mencampur bahan
: mengaduk bahan
:mengambil bahan/ekstrak
:tempat ekstrak diamati
: memberi tanda
:menyangga tabung reaksi
Bahan
Mangga arum manis: bahan untuk isolasi
Detergen Bukrim : meluruhkan dinding sel
Rinso cair
: meluruhkan dinding sel
Rinso bubuk
: meluruhkan dinding sel
Aquades
: pelarut
Garam
: memisahkan benang-benang DNA
Alkohol dingin
: melihat DNA yang berupa benang
Halus dan putih
3.2 Cara Kerja
Kupas manga arum manis
Timbang mangga 5 gram
Haluskan dengan mortar
Masukkan dalam beaker glass
Tambah aquades 50 ml
Tambah garam & detergen @2,5 gram
Aduk hingga homogen biarkan 10 menit
Ekstrak bahan
Ambil 5ml dengan pipet
Masukkan tabung reaksi
Masukan etanol dingin 0.6 ml
Amati supernatant setelah 10 menit
3.3 Analisa Perlakuan
Tahap yang dilakukan pertama kali yaitu kupas kulit manga
timbang mangga arum manis 5gr dengan 3x penimbangan. Setelah
itu haluskan mangga dengan mortar. Setelah selesai di haluskan
masukkan dalam gelas beaker. Gelas beaker digunakan untuk
mencampur mangga dengan bahan yang lain. Tambahkan aquades (
50 ml), tambahkan garam dan deterjen masing-masing 2,5 gram,
lalu aduk bahan hingga homogen.dengan dibiarkan 10 menit.
Detergen berguna untuk meluruhkan membrane dan dinding sel.
Setelah bahan homogen ambil ekstrak bahan 5 ml dengan pipet,
lalu masukkan tabung reaksi.setelah itu beri ethanol dingin 0,6 ml.
Ethaonol dingin digunakan untuk mempresipitasi DNA. Amati
supernatan warna dan gumpalan yang terjadi.
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Hasil Dokumentasi
1. Bukrim
2. Rinso bubuk
3. Rinso cair
4.2 Pembahasan
Berdasarkan praktikum yang telah dilakukan,dapat disimpulkan
bahwa jenis detergen berpengaruh penuh terhadap isolasi DNA.
Dari data diketahui bahwa deterjeb bukrim memberikan pengaruh
yang paling besar dalam isolasi DNA. Pada rinso bubuk dan riso
cair endapan tidak terlihat secara benar. Hal itu dimungkinkan pada
saat pengambilan sampel tidak mengambil larutan bagian tengah,
sehingga yang diamati kurang begitu jelas pada rinso bubuk dan
riso cair . Kandungan senyawa kimia bukrim untuk melisiskan sel
terdapat dalam konsentrasi yang tinggi.
Apabila sampel pada rinso bubuk dan rinso cair dapat diamati,
Kandungan detergen tersebut berbeda, misalnya lauryl sulfat yang
dapat berfungsi sama dengan dodesil sulfat dan disodium EDTA,
serta kandungan zat pewarna dan zat aktif pemutih yang biasanya
ada dalam detergen.
Menurut Jamilah (2005: 95) diantara detergen bubuk,
detergen cair,dan padat,detergen bubuk menghasilkan warna yang
paling baik, yaitu putih, detergen krim memberikan warna yang
kurang baik karena menyebabkan warna filtrat mendekati warna
detergen, sehingga isolasi DNA yang dihasilkan berwarna sama
atau hampir sama dengan filtrat. Sementara pada isolat yang
dihasilkan dari filtrat yang menggunakan detergen cair tidak
menunjukkan adanya prespitasi DNA yang baik, kalaupun ada,
konsentrasi dan viskositasnya sangat rendah. Pernyataan Jamilah
tersebut dapat kita berikan pada isolasi DNA yang terjadi pada
buah dengan konsentrasi air tinggi. Selain itu semakin encer filtrat,
maka DNA yang terpresipitasi akan semakin sedikit.
BAB V
PENUTUP
5.1 Kesimpulan
Pada praktikum isolasi DNA kasar didapatkan hasil bahwa jenis
detergen berpengaruh penuh terhadap isolasi DNA. Detergen yang
mempunyai daya rusak paling besar yaitu detergen Bukrim. Pada
rinso bubuk dan riso cair endapan tidak terlihat secara benar. Hal
itu dimungkinkan pada saat pengambilan sampel tidak mengambil
larutan bagian tengah, sehingga yang diamati kurang begitu jelas
pada rinso bubuk dan riso cair . Kandungan senyawa kimia bukrim
untuk melisiskan sel terdapat dalam konsentrasi yang tinggi.
Apabila sampel pada rinso bubuk dan rinso cair dapat diamati,
Kandungan detergen tersebut berbeda, misalnya lauryl sulfat yang
dapat berfungsi sama dengan dodesil sulfat dan disodium EDTA,
serta kandungan zat pewarna dan zat aktif pemutih yang biasanya
ada dalam detergen.
5.2 Saran
Sudah baik ^_^
DAFTAR PUSTAKA
Anggie,2011.Manfaat
Isolasi
DNA.
http://anggiemyblog.blogspot.com/2011/04/laporan-isolasi-dna.html
diakses tanggal 30 november 2012
Barnum, Susan R. 2005. Biotechnology an Introduction, 2nd edition.
USA : Thomson Brooks/Cole.
Fauziah, L. 2010. Isolasi DNA. Available on http://misspurplepharmacy.blogspot. com/2010/01/isolasi-dna.html.
Diakses tanggal 28 november 2012.
Giri-Rahman EA . 2004. Regulasi Ekspresi Gen Pada Organisme
Bakteri. Bandung : KPP Bioteknologi Bandung.
Jamilah. 2005. Pengaruh Berbagai Macam Detergen, Penambahan
Enzim, dan Ekstrak Nanas (Ananas comusus (L) Merr)
Terhadap Hasil Isolasi DNA Berbagai Macam Buah
Sebagai Topik Praktikum Matakuliah Genetika. Skripsi
tidak diterbitkan. Malang: Universitas Negeri Malang
Mader,S.S.1993.Biology.Wm.C Brown Publishers: Lowa
Prasetyo, A. 2008. Karakterisasi virus pada tanaman jarak pagar
(Jatropha curcas L.). Fakultas Pertanian Universitas
Gadjah Mada. Skripsi.(Tidak Dipublikasikan)
Wilson,keith and john walker,2010.Principles and Techniques of
Biochemistry
and
molecular
Biology.Cambridge
University Press,New York.