EFEK JUS DAUN MAHKOTA DEWA (Phaleria macrocarpa

EFEK JUS DAUN MAHKOTA DEWA (Phaleria macrocarpa) SEBAGAI
ANTIMODIFIKASI PROTEIN PLASMA AKIBAT REAKSI GLIKOSILASI In Vitro
EFFECT OF MAHKOTA DEWA LEAF JUICE (Phaleria macrocarpa) AS ANTIPROTEIN
MODIFICATION BY GLYCATION OF PLASMA PROTEIN In Vitro
Bambang Setiawan, Eko Suhartono
Bagian Kimia Kedokteran-Kelompok Studi Radikal Bebas dan Pemanfaatan Bahan Alam, Fakultas
Kedokteran Universitas Lambung Mangkurat, Banjarbaru
ABSTRAK
Mahkota dewa (Phaleria macrocarpa) merupakan tanaman asli Indonesia yang digunakan sebagai tanaman
obat. Penelitian tentang penggunaan mahkota dewa sebagai antipenuaan masih jarang dilakukan. Tujuan
penelitian ini untuk mengetahui mekanisme antioksidatif mahkota dewa dan potensinya sebagai
antipenuaan in vitro. Mekanisme antioksidatif yang diukur meliputi chelating logam, scavenging H2O2 dan
antioksidan total. Potensi antipenuaan dilakukan dengan mengukur aktivitas antiglikasi. Aktivitas chelating
logam, scavenging H2O2 dan antioksidan total berturut-turut adalah 15,929%, 33,752%, 24,761%.
Mekanisme antioksidatif tersebut mampu menghambat reaksi glikosilasi dengan aktivitas sebesar 91,434%.
Disimpulkan, bahwa jus daun mahkota dewa berpotensi sebagai penghambat reaksi glikosilasi penyebab
penuaan.
Kata-kata kunci: chelating logam, scavenging H2O2, antioksidan total, penuaan
ABSTRACT
Mahkota dewa (P. macrocarpa) is an Indonesian plant as herbal medicine. Certain research to find out the
effect of mahkota dewa as antiaging was very rare. Aims of this study were to know antioxidantive
mechanism activity of mahkota dewa and its potency as an antiaging in vitro. Three measured
antioxidantive mechanism were metal chelating, H2O2 scavenging, and total antioxidant activity. Antiaging
potency was measured by antiglycation activity. Activity of metal chelating, H2O2 scavenging, and total
antioxidant activity mahkota dewa are 15.929%, 33,752%, 24.761%. It’s antioxidative mechanism could
inhibit glycosylation with activity 91.434%. Concluded, Phaleria macrocarpa leave juice has potency as
antiaging caused by glycocylation reaction.
Key words: metal chelating, H2O2 scavenging, total antioxidant activity, aging
PENDAHULUAN
Modifikasi protein adalah protein yang
strukturnya mengalami perubahan, ditandai
oleh pembentukan senyawa dikarbonil, ikatan
silang, fluoresensi, dan lain-lain (Suhartono
dkk, 2004). Modifikasi protein pasca translasi
dapat terjadi melalui reaksi fosforilasi,
deamidasi, karbamilasi, rasemisasi, oksidasi
dan glikosilasi (Ramalho dkk, 1996). Reaksi
glikosilasi adalah reaksi nonenzimatik yang
diawali oleh ikatan antara gugus aldehid dari
glukosa dengan amino terminal-N pada
protein (Suhartono dkk, 2006). Di dalam
plasma, reaksi ini akan membentuk senyawa
dikarbonil dan Advanced Glycation End
Product (AGEs) sebagai produk modifikasi
protein yang terakumulasi pada berbagai organ
selama proses penuaan normal (Mary dkk,
2004).
Senyawa dikarbonil dan AGEs
merupakan senyawa sitotoksik yang terbentuk
akibat ketidakseimbangan antara prooksidan
dan antioksidan. Mekanisme prooksidatif ini
melibatkan reaktivitas H2O2 dan ion logam
sebagai
katalisator
reaksi
glikosilasi
(Coleman, 2000; Lapolla dkk., 2005). Dengan
kata lain, untuk menghambat pembentukan
senyawa dikarbonil dan AGEs diperlukan
bahan antioksidan yang bersifat scavenging
H2O2 dan chelating logam. Senyawa
antioksidan dapat diperoleh dari makanan
maupun bahan alam pada tanaman, misalnya
mahkota dewa (P. macrocarpa).
Mahkota dewa merupakan tanaman
asli Indonesia yang dapat digunakan sebagai
obat, misalnya untuk mengobati asam urat,
diabetes melitus, hipertensi, dan penyakit
ginjal (Winarto, 2003). Selain berperan dalam
penyakit metabolik, tanaman ini juga bersifat
sitotoksik dan mampu menghambat proliferasi
sel kanker payudara (Purwantini dkk., 2002;
Bakhriansyah., 2006). Meskipun khasiat
Mahkota Dewa telah diungkap, belum ada
penelitian
yang
mengkaji
mekanisme
antipenuaan mahkota dewa (P.macrocarpa)
akibat reaksi glikosilasi. Oleh karena itu, pada
penelitian ini akan dikaji mekanisma mahkota
dewa (P. macrocarpa) sebagai penghambat
reaksi glikosilasi penyebab penuaan.
METODOLOGI
1. Bahan Penelitian
Bahan yang digunakan dalam penelitian
ini terdiri atas tanaman Mahkota Dewa (P.
macrocarpa) yang diperoleh dari UPT Balai
Benih
Dinas
Pertanian
Banjarbaru,
Kalimantan Selatan. Selain itu, bahan yang
digunakan terdiri atas aquadest, buffer fosfat
pH 7,4, serum darah manusia, asam asetat
20%, FeCl3, EDTA 0,2 mL, H2O2 0 mmol/L,
asam askorbat, urea, 2,4-dinitrofenilhidrazin
(DNPH), TCA 20%, HCl 2,5 M, etanol-etil
asetat 2 mL, FeCl2, o-fenantrolin, dan larutan
glukosa 500 mg/dL.
2. Alat Penelitian
Alat yang digunakan dalam penelitian
ini meliputi alat gelas (PYREX®), pH meter
(CYBERSCAN®),
sentrifuse
(CENTURION®), stopwatch, vortex (VM300®),
oven
(HETO®),
mikropipet
(TRANSFERPETTE®), dan spektrofotometer
(BIOSYSTEMS® BTS-305).
3. Jalannya penelitian
Pembuatan Jus mahkota dewa : Jus mahkota
dewa dibuat dengan cara sebagai berikut, dua
puluh lima gram daun mahkota dewa yang
telah dihaluskan dilarutkan ke dalam 100 mL
air. Campuran tersebut diblender kemudian
disaring dengan kertas saring. Filtrat yang
terbentuk mempunyai konsentrasi 25%.
Pengukuran Aktivitas Antioksidan Total : Pada
tahap ini digunakan dua larutan, yaitu larutan
kontrol dan larutan uji. Larutan kontrol adalah
larutan tanpa jus mahkota dewa (A0),
sedangkan larutan uji adalah larutan dengan
jus mahkota dewa (A1). Absorbansi diukur
pada panjang gelombang 390 nm dengan
spektrofotometer.
Pengujian
aktivitas
antioksidan total digunakan metode DNPH
seperti yang dilakukan Koracevic dkk, (2001)
dan dimodifikasi Sadikin (2001). Aktivitas
antioksidan dihitung dengan menggunakan
rumus berikut:
Aktivitas antioksidan total (%) =
( Ao − A1)
x100%
Ao
Pengukuran Aktivitas chelating logam :
Aktivitas chelating logam diuji dengan
Metode Dinis (Gulcin dkk., 2004). Pertama
dibuat larutan kontrol (Ao). Dicampurkan 0,05
mL FeCl2 mM yang ditambah dengan 0,2 mL
o-fenantrolin hingga homogen. Larutan yang
telah terbentuk kemudian dibiarkan selama 10
menit, setelah itu absorbansinya diukur
dengan spektrofotometer pada λ=562 nm.
Kemudian dibuat larutan uji (A1). Caranya
sama dengan pembuatan larutan kontrol, tetapi
ditambahkan jus mahkota dewa pada awal
pembuatan larutan.
Aktivitas chelating logam (%) =
( Ao − A1)
x100%
Ao
Pengukuran Aktivitas scavenging hidrogen
peroksida : Aktivitas chelating logam diuji
dengan Metode Ruch (Gulcin dkk., 2004).
Pertama dibuat larutan kontrol (Ao).
Ditambahkan 0,6 mL H2O2 40 mM dalam
buffer fosfat pH 7,4 sedangkan pada larutan
uji disertai dengan penambahan jus mahkota
dewa. Absorbansi pada larutan kontrol (Ao)
dan larutan uji (A1) diukur dengan
menggunakan spektrofotometer pada λ=230
nm.
Aktivitas scavenging hidrogen peroksida (%)
=
( Ao − A1)
x100%
Ao
Pengukuran
Potensi
Antiglikosilasi
:
Glikosilasi dibuat dengan model reaksi antara
protein serum dengan glukosa. Reaksi ini akan
menghasilkan senyawa karbonil yang dapat
diukur dengan spektrofotometer pada λ=390
nm. Pengukuran senyawa karbonil digunakan
metode DNPH yang dimodifikasi (Uchida
dkk., 1998; Sadikin., 2001). Pada tahap ini
digunakan dua larutan, yaitu larutan kontrol
dan larutan uji. Larutan kontrol adalah larutan
tanpa jus mahkota dewa (Ao), sedangkan
larutan uji adalah larutan dengan jus mahkota
dewa (A1).
Potensi antiglikosilasi (%) =
( Ao − A1)
x100%
Ao
HASIL DAN PEMBAHASAN
Modifikasi protein akibat reaksi
glikosilasi dapat diukur secara kimia, yang
ditandai oleh pembentukan senyawa karbonil.
Senyawa karbonil dapat diukur dengan
menggunakan DNPH. DNPH bereaksi dengan
gugus
karbonil
untuk
membentuk
dinitrofenilhidrazon yang jumlahnya dapat
diketahui secara spektrofotometris dengan
karakteristik penyerapan maksimal pada 360390 nm. Banyak sedikitnya jumlah karbonil
ini menggambarkan banyak atau sedikitnya
modifikasi protein (Suhartono dkk., 2006).
Pada penelitian ini, pengukuran produk
kimiawi tersebut berguna sebagai penanda
berlangsungnya penuaan dan merupakan
model glikosilasi protein plasma (Nagaraj
dkk., 1996). Potensi mahkota dewa dalam
menghambat reaksi glikosilasi adalah sebesar
91,434%. Aktivitas ini diduga disebabkan oleh
bahan aktifnya yang bersifat antioksidatif.
Mekanisme antioksidatif mahkota dewa
dinyatakan sebagai aktivitas chelating logam,
aktivitas scavenging H2O2, antioksidan total
dan antiglikosilasi, seperti tersaji pada Gambar
1.
Aktivitas antioksidatif mahkota dewa sebagai
scavenging dan chelating logam adalah
sebesar 33,752% dan 15,929%. Selain itu,
aktivitas antioksidan total mahkota dewa
adalah sebesar 24,761%. Menurut reaksi pada
Gambar 2 dan 3, potensi antioksidatif mahkota
dewa diduga mampu menghambat reaksi
glikosilasi
melalui
penghambatan
pembentukan senyawa karbonil. Diduga,
penghambatan reaksi glikosilasi tersebut
terjadai pada beberapa titik tangkap reaksi,
yakni:
1. Perubahan produk amadori menjadi
produk akhir melalui jalur oksidatif
melalui keterlibatan oksidan dan logam.
Pada jalur ini, perubahan 2-3 enediol
menjadi Nε-(carboxymethyl)lisine (CML)
melibatkan aktivitas H2O2 dan logam
(Mn+). Mahkota Dewa bekerja sebagai
antioksidan terhadap H2O2, dan sebagai
pengikat logam (Mn+).
(%)
120
100
80
60
40
20
0
91.434
33.752
15.9294
CL
S-H2O2
24.761
AT
AG
Gambar 1. Rerata potensi antioksidan mahkota dewa sebagai antipenuaan. Keterangan: CL = chelating logam; SH2O2 = scavenging H2O2; AT = antioksidan total; AG = potensi antiglikosilasi
Gambar 2. Pembentukan Nε-(carboxymethyl)lisine (CML) yang melibatkan jalur oksidatif reaksi glikosilasi
(Voziyan dkk, 2003).
Gambar 3. Skema pembentukan AGEs dan jalur pintas pembentukan senyawa dikarbonil (Booth dkk., 1997)
Peredaman terhadap reaktivitas oksigen
melalui jalur pintas yang berperan dalam
pembentukan senyawa dikarbonil. Pada
titik tangkap ini, Mahkota Dewa akan
menghambat pada 3 jalur, yakni gugus
aldehid-amino-dikarbonil, basa Schiffdikarbonil, dan produk amadori-dikarbonil
seperti disajikan pada gambar 3.
Kemampuan antipenuaan jus mahkota
dewa diduga disebabkan oleh kandungan
polifenolnya, yakni flavonoid. Flavonoid
adalah senyawa organik polifenol yang
mampu mereduki oksidan. Flavonoid bekerja
sebagai antioksidan dengan beberapa cara,
yakni a) pengelatan ion logam; dan b)
peredaman radikal bebas. Ada dua gugus
fungsi utama pada flavonoid yang menentukan
potensi peredaman oksidan, yakni a) gugus
katekol pada cincin B; dan b) ikatan rangkap
yang berkonjugasi dengan 4-okso pada cincin
C (Middleton dkk, 2000). Penelitian ini
didukung oleh penelitian Sengupta dkk,
(2006) yang dibuktikan bahwa flavonoid
mampu menghambat reaksi glikosilasi.
Mekanismenya diduga melalui aktivasi gugus
hidroksil pada flavonoid yang berikatan
dengan tapak karbonil reaktif dari glukosa
sehingga memblokade ikatan antara glukosa
dengan protein serum. Akibatnya, reaksi
glikosilasi dapat dihambat.
KESIMPULAN
Aktivitas antioksidatif jus daun mahkota
dewa (P.macrocarpa) berpotensi sebagai
antimodifikasi protein plasma akibat reaksi
glikosilasi penyebab penuaan.
DAFTAR PUSTAKA
Bakhriansyah, M., 2006, Aktivitas antiproliferasi
ekstrak etanol biji mahkota dewa (Phaleria
macrocarpa (Scheff)Boerl) pada sel
kanker payudara T47D. J Kedokt YARSI.,
14(2),134-40.
Booth, AA., Khalifah, RG., Todd, P., Hudson, BG.,
1997, In Vitro kinetic studies of formation
of antigenic Advanced Glycation End
Products (AGEs), J. Biol. Chem.,
272,5430-5437.
Coleman, MD., 2000, Use of
methaemoglobin generation
in vitro
to study
antioxidant status in the diabetic
erythrocyte,
Biochem
Pharmacol.,
60(15),1409-16.
Gulcin, I., Kufrevioglu, I., Oktay, M.,
Buyukokuroglu, ME., 2004, Antioxidant,
antimicrobial, antiulcer and analgesic
activities of nettle (Urtica dioica L.), J
Ethnopharmacol., 90,205-15.
Koracevic, D., Koracevic, G., Djrjevic., 2001,
Method for the measurement of
antioxidant activity in human fluids, J
Clin Pathol., 54,356-61.
Lapolla, A., Traldi, P., Fedele, D., 2005,
Importance of measuring products of nonenzymatic glycation proteins, Clin
Biochem., 38,103-15.
Mary, J., Vougier, S., Picott, CR., Perichon, M.,
Petropoulos, I., Friguet, B., 2004,
Enzymatic reactions involved in the repair
of oxidized proteins. Exp. Gerontol.,
39,1117-23.
Middleton, E., Kandaswani, L., Theoharis, S.,
2000, The effect of plant flavonoid on
mammalian
cells:
implication
for
inflamation, heart disease, and cancer.
Pharmacol, Rev, 52,673-751.
Nagaraj, RH., Otin, MP., Monnier, VM., 1996,
Ether crosslinks as a basis for protein
crosslinking by the advanced maillard
reaction in aging and diabetes, Arch.
Biochem. Biophys., 325(2),152-158
Purwantini, I., Setyowati, EP., Hertiani, P., 2002,
Uji aktivitas ekstrak etanol buah, biji,
daun Mahkota dewa (Phaleria macrocarpa
(Scheff)Boerl) terhadap Artemia salina
Leach dan profil kromatografi lapis tipis
ekstrak aktif. Maj Farmasia Indon.,
13(2),1010-6.
Ramalho, J., Marques, C., Pereira, P., Mota, MC.,
1996, Crystallin composition oh human
cataractous lens may be modulated by
protein glycation, Graefe’s Arch Clin Exp
Ophtalmol., 234,232-8.
Sadikin, M., Adhiyanto, C., 2001, Pengukuran
konsentrasi
senyawa
dikarbonil.
Disampaikan pada Pelatihan Radikal
Bebas dan Antioksidan Dalam Kesehatan.
Jakarta, 16-21 April
Sengupta, B., Uematsu, T., Jacobson, P., Swenson,
J., 2003, Exploring the antioxidant
property of bioflavonoid quercetin in
preventing DNA glycation: a calorimatric
and spectroscopic study. Biochem.
Biophys. Res. Commun, 339,355-61.
Suhartono, E., Setiawan, B., Edyson, Mashuri.,
2004, Modifikasi protein akibat reaksi
Maillard dan pengaruhnya terhadap kadar
tirosin, Jurnal Profesi Medika., 4(2),20-8.
Suhartono, E., Setiawan, B., 2006, Kapita selekta
biokimia: radikal bebas, antioksidan, dan
penyakit, Banjarmasin, Penerbit Pustaka
Banua.
Uchida, K., Kanematsu, M., Sakai, K., Matsuda,
T., Hattori, D., Mizuno, Y., 1998, Protein
bound acrolein: potential marker for
oxidative stress. Proc. Natl. Acad. Sci.
USA., 95,4882-7.
Voziyan, PA., Khalifah, RG., Thibaudeau, C.,
Yildiz, A., Jacob, J., Serianni, AS., 2003,
Modification of proteins in vitro by
physiological levels of glucose. J. Biol.
Chem., 278,46616-24.
Winarto, WP., 2003, Mahkota Dewa, budidaya dan
pemanfaatan untuk obat. Jakarta: Penebar
Swadana.