12-Transformasi Genetik Dengan Agrobacterium

62 Media Bina Ilmiah
ISSN No. 1978-3787
Saran
Bercermin dari simpulan di atas, maka
sarannya sebagai berikut:
1. Tenaga kerja pariwisata kita harus
mengantongi sertifikat uji kompetensi yang
berkualitas berstandar ASEAN, untuk
mengantisipasi masuknya naker Filipina yang
berjumlah ratusan ribu itu.
2. Dengan mengantongi selembar sertifikat uji
kompetensi dari Lembaga Sertifikasi Profesi
Pariwisata, dapat dijadikan bukti autentik
(Syah) sebagai naker yang sudah memiliki
kemampuan memadai menguasi knowledge
(pengetahuan) dan skill (ketrampilan) di
bidangnya yang berstandar ASEAN.
3. Oleh karena itu para naker pribumi yang
belum mengantongi sertifikat uji kompetensi
pariwisata dari LSP Pariwisata Indonesia,
mesti buruan memperolehnya supaya tidak
kehabisan kursi di negeri sendiri, lalu jadi
penonton di negeri sendiri. Ayo bangkit,
bangkit, bangkit!
Pembangunan
Pariwisata
Berkelanjutan, Program Magister
Kepariwisataan (hand out). Denpasar
Universitas Udayana.
b.
DAFTAR PUSTAKA
Agusmidah.
2011.
Dilematika
Hukum
Ketenagakerjaan Tinjauan Politik.
Medan Penerbit PT. Sofmedia.
Ardika I Wayan. (2003). Pariwisata Budaya
Berkelanjutan, Denpasar : Program
Studi Magister Kajian Pariwisata.
Bahder
Ohan
Nasution.
2004.
Hukum
Ketenagakerjaan
Kebebasan
Berserikat Bagi Pekerja. Bandung
Penerbit Bandar Maju.
Black, J and Conroy, M. 1997. Accessibility
Measures and The Social Evaluation
of Urban Structure Enviroment and
Planning A. 9. PP 1013-1031
Bungin, Burhan. 2007. Penelitian Kualitatif.
Jakarta : Prenada Media Group.
Erawan,
I.
Nyoman.
2008.
Guy Standing. 1999. Global Labour Flexibility.
Harris, Rob. Et al. (2002). Sustainable Tourism A
Global Perspective. Oxford. Ltd.
Khakim Abdul. 2004. Hukum Ketenagakerjaan
Indonesia
Berdasarkan
UndangUndang No. 13 Tahun 2013. Bandung
: PT. Citra Aditya Bhakti.
Kusmayadi Sugiarto, Endar. 2000. Methodology
dalam Bidang Kepariwisataan.Jakarta
PT Gramedia Pustaka Utama.
Leiper,
Neil. 2004. Tourism Management.
Australia
National Library of
Australia Catalogin in Publication
Data.
Mascardo, Gianna. 2003. Interpretation and
Sustainable
Tourism:
Function
Examples and Principles (Journal of
Tourism Studies, Vol 14. No. 1 May
2003).
Scheyvens,
Regina. 2004. Tourism For
Development
Empowering
Comunities, Harlow, England. Person
Education.
Sjahputra, Tungga Imam. 2009. Pokok-pokok
Hukum
Ketenagakerjaan.
Jakarta:Harvarindo.
Suryawan, A.A. 2008. Manajemen Pembangunan
Pariwisata Berkelanjutan, Program
Magister Kajian Pariwisata (handout)
Denpasar. Universitas Udayana.
Wiratraman; R. Herlambang. 2006. Hak Buruh,
Revisi UU 13/2006 dan Imperialisme
Global. Surabaya Post, 1 Mei 2006
diakses 10 Maret 2007.
Manajemen
_____________________________________________
Volume 9, No. 1, Februari 2015
http://www.lpsdimataram.com
ISSN No. 1978-3787
Media Bina Ilmiah63
TRANSFORMASI GENETIK DENGAN Agrobacterium rhizogenes
PADA EKSPLAN AKAR TOMAT (Lycopersicum esculentum, Mill)
UNTUK INDUKSI PEMBENTUKAN AKAR RAMBUT
Oleh :
Novita Hidayatun Nufus, Wahyu Widoretno, Arifin Noor Sugiharto
Dosen pada Universitas 45 Mataram
Abstrak: Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengetahui keberhasilan transformasi genetik dengan
A.rhizogenes dalam menginduksi akar rambut eksplan tomat, mengetahui pengaruh lama waktu inokulasi
serta OD bakteri terhadap pembentukan dan pertumbuhan akar rambut, mengetahui pertumbuhan akar
rambut hasil transformasi di dalam media seleksi kanamisin, mengetahui integrasi T-DNA A.rhizogenes
di dalam DNA akar transforman melalui deteksi dengan teknik PCR. Penelitian dirancang menggunakan
Rancangan Acak Lengkap factorial dengan 2 faktor yaitu kerapatan bakteri (yang ditunjukkan dengan
nilai Optical Density/OD) dan lama inokulasi. Eksplan akar diinfeksi dengan A. rhizogenes (OD 0.5, OD
1.0 dan) masing-masing selama 15 menit, 30 menit 45 menit dan 60 menit. Hasil penelitian menunjukkan
bahwa transformasi dengan A. rhizogenes dapat menginduksi akar rambut dari eksplan akar kecambah
tomat. Persentase eksplan yang membentuk akar rambut, total jumlah akar yang terbentuk dan total berat
basah akar dipengaruhi oleh OD bakteri A.rhizogenes tetapi tidak dipengaruhi oleh lama inokulasi.
Walaupun lama inokulasi secara independen tidak berpengaruh, terdapat interaksi antara penggunaan
lama inokulasi dengan OD bakteri terhadap pembentukan dan pertumbuhan akar rambut eksplan tomat.
Penggunaan OD tinggi (OD 1) dengan lama inokulasi yang singkat (15 menit) memberikan hasil terbaik
yaitu 82% yang menghasilkan 33 akar dengan berat total 316mg. Ekplan yang ditransformasi mampu
tumbuh dan menghasilkan akar pada medium selektif kanamisin yang mengindikasikan bahwa akar
rambut yang terbentuk pada eksplan tertransformasi ialah akar rambut transforman. Sebaliknya, hampir
seluruh eksplan kontrol tidak dapat tumbuh dan mati di dalam medium selektif kanamisin. Hasil analisis
PCR tidak menunjukkan adanya pembentukan pita DNA pada seluruh sampel DNA transforman dan
DNA plasmid A.rhizogenes. Ketidakcocokan antara primer dan DNA target yang kemungkinan besar
disebabkan oleh mutasi pada sekuen DNA di daerah penempelan primer (primer binding site)
A.rhizogenes menyebabkan primer gagal mengenali dan mengamplifikasi segmen target T-DNA yang
telah terintegrasi di dalam DNA akar rambut tomat.
Kata kunci: Lycopersicum esculentum, Agrobacterium rhizogenes, akar rambut, lama inokulasi,
densitas bakteri
PENDAHULUAN
Tanaman tomat(Lycopersicum esculentum,
Mill) adalah salah satu tanaman yang dikenal luas
penggunaannya sebagai bahan makanan yang
banyak mengandung zat gizi tinggi bagi kesehatan.
Selain kaya akan vitamin, mineral dan serat, tomat
juga mengandung berbagai jenis senyawa antioksidan yang bermanfaat bagi manusia. Antioksidan yang diproduksi tomat merupakan produk
dari metabolisme sekunder yang dilakukannya
(Dalimartha, 1999; Tugiyono, 2006; Andayani et
al, 2008). Salah satu metabolit sekunder yang
diproduksi oleh tanaman tomat adalah likopen.
Likopen memiliki potensi yang tinggi sebagai anti
kanker karena kemampuannya dalam menghambat
radikal bebas berbahaya bagi tubuh manusia
(Tugiyono, 2006) sehingga produksi likopen dalam
jumlah besar perlu untuk dilakukan.
Produksi likopen dalam skala besar dapat
dilakukan dengan dari kultur akar rambut tomat
melalui transformasi genetik menggunakan
Agrobacterium rhizogenes. Akar rambut terbentuk
sebagai hasil transformasi genetik A.rhizogenes ke
dalam genom tanaman. A. rhizogenes memiliki
plasmid yang disebut dengan root inducing
plasmid (Ri-plasmid), dengan daerah DNA yang
dapat ditransfer, disebut sebagai T-DNA (White
dan Nester, 1980., Ambros, et al, 1986., Akasaka
et al, 1997., Doran, 2002., Zhang et al, 2007).
Integrasi T-DNA yang dilanjutkan dengan ekspresi
gen-gen pada T-DNA dapat menginduksi
_____________________________________
http://www.lpsdimataram.com
Volume 9, No. 1, Februari 2015
64 Media Bina Ilmiah
proliferasi multibranchial di tempat akar yang
terinfeksi sehingga disebut dengan akar rambut
(Rahimi et al, 2008).
Tahap awal yang sangat menentukan
keberhasilan transformasi dengan A.rhizogenes
ialah inokulasi. Beberapa faktor dalam inokulasi
yang dapat dimanipulasi untuk optimalisasi
terjadinya transformasi ialah kepadatan bakteri
yang ditunjukkan dengan nilai optical density
(OD) dan lama waktu inokulasi yang digunakan.
Optimalisasi kedua faktor tersebut dapat
meningkatkan kontak yang kemudian memicu
perlekatan bakteri pada dinding sel tanaman,
sehingga mampu meningkatkan keberhasilan
transormasi tomat dengan A.rhizogenes. Dengan
demikian penentuan kombinasi lama waktu
inokulasi dan kerapatan bakteri yang terbaik bagi
eksplan akar tanaman tomat diperlukan sehingga
diharapkan proses transformasi dapat berlangsung
dengan optimal.
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui
keberhasilan
transformasi
genetik
dengan
A.rhizogenes dalam menginduksi pembentukan
akar rambut pada eksplan akar tomat.Mengetahui
pengaruh lama waktu inokulasi serta OD bakteri
terhadap pembentukan dan pertumbuhan akar
rambut
eksplan
akar
tomat.Mengetahui
kemampuan pertumbuhan akar rambut eksplan
tomat hasil transformasi dengan A.rhizogenes di
dalam media selektif kanamisin.Mengetahui
adanya integrasi T-DNA A.rhizogenes di dalam
DNA akar rambut transforman melalui deteksi
dengan teknik PCR.
ISSN No. 1978-3787
Setelah 24 jam eksplan dicuci dengan antibiotik
cefotaxime 500 ppm selama 10 menit dan dikultur
pada medium MS padat tanpa ZPT yang telah
dicampur cefotaxim 500 ppm (Negara, 2009).
Inkubasi eksplan pada medium eliminasi
dilakukan selama 10 hari untuk mematikan A.
rhizogenes. Eksplan dari setiap kombinasi
perlakuan OD dan lama inokulasi dikultur
sebanyak 5 eksplan pada tiap botol dan diulang
sebanyak 3 kali. Kemudian eksplan dipindah ke
medium MS+kanamisin 100 ppm selama 30 hari,
setelah 30 hari dilakukan pengukuran presentase
jumlah eksplan yang hidup, jumlah akar yang
terbentuk dan berat basah akar.
Deteksi integrasi T-DNA dengan teknik PCR
dilakukan menggunakan 4 macam primer yang
masing-masing didesain untuk sekuen pada gen
rolB, sekuen pada TR-DNA, serta sekuen pada TLDNA. Sebagai kontrol positif digunakan DNA
plasmid A. rhizogenes ATCC-15834 dan sebagai
kontrol negatif digunakan DNA akar kecambah
tomat in vitro. Isolasi DNA akar dilakukan dengan
menggunakan metode CTAB, sedangkan isolasi
DNA plasmid A. rhizogenes ATCC-15834
dilakukan
dengan
menggunakan
metode
minipreparation.
Proses
PCR
dilakukan
menggunakan kombinasi dari 3 jenis PCR mix
(taq green polymerase, Intron, dan FastartROCHE), variasi beberapa komposisi PCR dan
berbagai suhu reaksi. Hasil PCR difraksinasi
dengan elektroforesis gel agarose 1% kemudian
visualisasi dengan sinar UV.
HASIL DAN PEMBAHASAN
METODE PENELITIAN
Eksplan yang digunakan dalam penelitian ini
adalah akar yang berasal dari kecambah tomat
umur 10 hari. Kecambah tersebut dipotong bagian
akar dan hipokotilnya masing-masing dengan
ukuran ± 1 cm, kemudian eksplan ditusuk-tusuk
dengan lanset steril sebelum diinfeksi dengan A.
rhizogenes. Induksi pembentukan akar rambut
dilakukan dengan cara merendam potongan
eksplan hipokotil dan akar ke dalam suspensi
bakteri dengan perlakuan OD 0, 0.5 dan 1.0,
kemudian eksplan dan suspensi bakteri tersebut
masing-masing dishaker pada kecepatan 100rpm
dengan perlakuan lama inokulasi 15 menit, 30
menit, 45 menit dan 60 menit.
Eksplan yang telah diinfeksi dalam suspensi
bakteri OD 0, 0.5 dan 1.0 selama 15 menit, 30
menit, 45 menit dan 60 menit diletakkan di atas
kertas saring steril, selanjutnya dilakukan kokultivasi dengan cara memindahkan masingmasing eksplan tersebut ke dalam medium MS
tanpa ZPT selama 24 jam dalam kondisi gelap.
_____________________________________________
Volume 9, No. 1, Februari 2015
Respon
awal
eksplan
yang
telah
ditransformasi
memperlihatkan
adanya
pembengkakan yang terjadi pada daerah bekas
perlukaan tempat berlangsungnya inokulasi.
Pembengkakan diamati terjadi rata-rata 2 hari
setelah inokulasi dilakukan. Pembengkakan
tersebut merupakan respon sel tanaman terhadap
integrasi T-DNA A.rhizogenes di dalam DNA
tanaman. T-DNA memuat gen-gen penyandi
protein tertentu yang berperan dalam proses
biosintesis zat pengatur tumbuh yaitu auksin dan
sitokinin di dalam sel tanaman. Ekspresi dari gengen tersebut mempengaruhi produksi hormon
endogen di dalam sel tanaman yang kemudian
menyebabkan
terjadinya
pembengkakan
(pembentukan kalus) pada jaringan eksplan akar
tomat (Gelvin, 2003). Berbeda dengan eksplan
tertransformasi, pengamatan yang dilakukan pada
eksplan
yang
tidak
diinokulasi
dengan
A.rhizogenes (selanjutnya disebut eksplan kontrol)
tidak menunjukkan adanya pembengkakan pada
permukaan eksplan.
http://www.lpsdimataram.com
ISSN No. 1978-3787
Pembengkakan pada daerah perlukaan eksplan
yang tertransformasi merupakan tahapan inisiasi
awal terbentuknya akar rambut (Mathius et al,
2004). Pengamatan yang dilakukan pada eksplan
tertransformasi menunjukkan bahwa akar rambut
terbentuk pada daerah pembengkakan bekas
perlukaan eksplan. Terbentuknya akar rambut ratarata terjadi pada hari ke-3 setelah berada dalam
media eliminasi bakteri yaitu 5 hari setelah
inokulasi dilakukan. Pada hari ke-7 sampai hari
ke-10 setelah inokulasi dilakukan, sebagian besar
eksplan telah membentuk akar. Hasil pengamatan
pada eksplan kontrol menunjukkan bahwa
terbentuknya akar terjadi dalam waktu yang relatif
lebih
cepat
dibanding
dengan
eksplan
tertransformasi. Secara umum, akar terbentuk 3
hari setelah inokulasi.
Penundaan waktu inisiasi akar pada eksplan
terinokulasi kemungkinan besar disebabkan karena
transformasi yang terjadi pada sel tanaman
memiliki implikasi terhadap jaringan tanaman,
baik yang mengalami transformasi (jaringan
transforman) maupun yang tidak (jaringan non
transforman). Pertumbuhan jaringan transforman
biasanya kalah oleh pertumbuhan jaringan non
transforman. Hal ini disebabkan karena jaringan
transforman mengandung gen sisipan yang
mengganggu proses metabolisme tanaman.
Terganggunya proses metabolisme pada jaringan
transforman
selanjutnya
menyebabkan
terganggunya proses pembelahan sel, sehingga
pertumbuhannya menjadi lebih lambat, yang
berakibat pada tertundanya proses pembentukan
akar pada eksplan tertransformasi. Selain itu,
seperti yang dikemukakan oleh Akasaka et al
(1998) yang menyebutkan bahwa penundaan
inisiasi akar pada eksplan terinokulasi disebabkan
oleh substansi-substansi kimia yang disekresikan
oleh bakteri.
Selain perbedaan waktu inisiasi akar,
morfologi akar yang terbentuk pada eksplan yang
ditransformasi
dengan
eksplan
kontrol
menunjukkan adanya perbedaan. Akar yang
terbentuk pada eksplan tertransformasi umumnya
relatif lebih tipis, percabangan yang relatif sangat
banyak, serta memiliki banyak rambut akar
sehingga tampak halus seperti rambut. Sebaliknya,
akar yang terbentuk pada eksplan kontrol tampak
relatif lebih tebal, tumbuh lurus ke bawah, dan
kelihatan kaku, serta memiliki rambut akar relatif
lebih sedikit dibanding dengan eksplan
terinokulasi.
Akar
yang terbentuk pada eksplan
tertransformasi memiliki karakteristik akar rambut
transforman seperti yang disebutkan oleh Giri dan
Narasu (2000), serta Rahimi et al (2008) yang
Media Bina Ilmiah65
menyatakan bahwa akar rambut dikarakterisasikan
dengan tingkat percabangan yang tinggi,
kelimpahan rambut akar dan bersifat plagiotropik.
Sebaliknya, eksplan kontrol tidak menunjukkan
karakter-karakter tersebut, yang menandakan
bahwa akar yang terbentuk pada eksplan kontrol
terjadi sebagai akibat aktivitas pertumbuhan
jaringan eksplan yang pada dasarnya berasal dari
akar.
Setelah 30 hari berada dalam media selektif,
tiap-tiap eksplan menunjukkan respon yang
berbeda-beda. Pengamatan yang dilakukan pada
eksplan yang diinokulasikan dengan A.rhizogenes
memperlihatkan akar-akar yang tumbuh pada saat
berada dalam media selektif ada yang mati dan ada
pula yang dapat bertahan hidup. Pada hari ke-20
setelah berada dalam media seleksi, akar-akar baru
mulai tumbuh di permukaan eksplan. Hasil yang
berbeda ditunjukkan oleh eksplan kontrol dimana
hampir seluruh akar yang tumbuh di dalam media
eliminasi mati dan tercatat tidak ada akar-akar baru
yang tumbuh setelah berada di dalam media
eliminasi. Hasil serupa didapatkan oleh Koronfel
(1998) yang menyebutkan bahwa pertumbuhan
akar-akar non transforman dalam media yang
mengandung 10 ppm kanamisin terhambat,
kemudian mati dalam jangka waktu 7 hari.
Pertumbuhan akar rambut dari eksplan yang
ditransformasi dalam media seleksi merupakan
hasil ekspresi gen resistensi kanamisin pada TDNA yang telah terintegrasi ke dalam DNA akar
rambut tomat. Hasil ini juga diperkuat oleh
pernyataan White dan Nester (1986) bahwa
Agrobacterium rhizogenes galur ATCC 15834
memiliki gen penanda resistensi terhadap
antibiotik kanamisin pada T-DNA plasmidnya,
yaitu pada plasmid pRi 15834c. Kanamisin ialah
antibiotik yang dapat berikatan pada sub unit 30S
dalam ribosom sehingga mencegah inisiasi
translasi yang mengakibatkan kegagalan sintesis
protein (Koronfel, 1998). Gen resistensi terhadap
kanamisin (yang terdapat pada T-DNA) mengkode
aminoglycoside
phospotransferase
yang
memfosforilasi kanamisin (Karcher, 1995).
Keberadaan gen penyandi resistensi terhadap
kanamisin berperan dalam seleksi akar hasil
transformasi. Akar hasil transformasi yang telah
terintegrasi oleh T-DNA bakteri dapat hidup dan
tumbuh dalam media selektif yang mengandung
kanamisin.
_____________________________________
http://www.lpsdimataram.com
Volume 9, No. 1, Februari 2015
66 Media Bina Ilmiah
ISSN No. 1978-3787
35
Total jumlah akar
yang terbentuk
30
25
c
20
15
b
b
10
5
0
a
aa
a
0
0.5
Kepadatan bakteri (OD)
Keterangan: a) OD = 0, 15 menit; b) OD = 0, t =
60 menit; c) OD = 0.5, t=15 menit; d) OD = 0.5,
t=30 menit; f) OD = 0.5, t=60 menit; g) OD = 1,
t=15 menit; h) OD = 1, t=45 menit
Hasil analisis statistik terhadap pengaruh
lama inokulasi dan OD bakteri terhadap persentase
transformasi, jumlah seluruh akar pada masingmasing perlakuan, serta berat basah akar pada yang
dihasilkan menunjukkan bahwa terdapat interaksi
antara perlakuan peningkatan OD dengan lama
inokulasi yang digunakan. Walaupun lama
inokulasi sebagai secara independen tidak
berpengaruh terhadap persentase pembentukan
akar, jumlah akar, serta berat basah akar yang
dihasilkan eksplan tomat, interaksi antara lama
inokulasi dan kepadatan bakteri berpengaruh
secara nyata terhadap peningkatan nilai dari ketiga
parameter tersebut. Penggunaan OD tinggi dengan
lama inokulasi yang singkat dan penggunaan OD
rendah dengan lama inokulasi yang relatif lama
dapat meningkatkan persentase pembentukan akar,
jumlah akar, serta berat basah akar secara
signifikan.
Persentase pembentukan
akar (%)
100
c
80
c
c
b
60
b
b
40
20
a
0
5.557
0
0.5
Kepadatan bakteri (OD)
1
_____________________________________________
Volume 9, No. 1, Februari 2015
Total berat basah akar
(mg)
350
Gambar 1. Perkembangan dan pembentukan akar
pada eksplan masing-masing perlakuan
setelah 28 hari berada di dalam media
seleksi
c
c
b
b
c
c
300
250
200
1
c
c
b
b
c
b
b
150
100
50
0
aaa
a
0
0.5
Kepadatan bakteri (OD)
Gambar 2
1
Pengaruh kepadatan bakteri (OD) dan
lama inokulasi A.rhizogenes pada
pembentukan dan pertumbuhan akar
selama 30 hari pada medium selektif
kanamisin. a)persentase pembentukan
akar, b) total akar yang terbentuk, c)
total berat basah akar. Rataan yang
diikuti dengan huruf yang sama
menunjukkan tidak berbeda nyata
berdasaran uji BNT dengan selang
kepercayaan 95%
Persentase transformasi, yang ditunjukkan
dengan persentase jumlah eksplan yang
membentuk akar, secara signifikan meningkat
selaras dengan peningkatan OD yang digunakan.
Interaksi yang signifikan di antara perlakuan
dengan lama inokulasi dengan peningkatan OD
yang
digunakan
menghasilkan
kombinasi
perlakuan yang mengoptimalkan pembentukan
akar pada eksplan tomat. Interaksi ini
menghasilkan persentase transformasi tertinggi
pada kombinasi perlakuan OD 1 dengan inokulasi
selama 15 menit yaitu 82.2%
Perhitungan dan pengamatan terhadap jumlah
akar yang dihasilkan oleh ekplan tomat
menunjukkan bahwa OD bakteri yang digunakan
berpengaruh
secara
signifikan
terhadap
peningkatan jumlah akar yang dihasilkan. Dari
grafik di atas, tampak jelas peningkatan jumlah
total akar yang terbentuk pada OD 0, 0.5, dan 1.
Interaksi antara OD dan lama inokulasi
memberikan pola yang khas, dimana penggunaan
OD tinggi dengan lama inoklasi singkat serta OD
http://www.lpsdimataram.com
ISSN No. 1978-3787
rendah dengan inokulasi yang lebih lama mampu
memaksimalkan jumlah akar yang terbentuk pada
eksplan tomat. Interaksi antara lama inokulasi dan
OD menghasilkan jumlah akar tertinggi pada OD 1
dengan lama inokulasi 15 menit yaitu sebanyak
31.33 akar. Sedangkan penggunaan OD 0.5 dengan
lama inokulasi singkat (13-30 menit) menghasilkan
jumlah akar paling sedikit, yaitu berturut-turut
17.33 dan 18.33.
Peningkatan total berat basah akar
menunjukkan pola yang serupa dengan kedua
parameter
sebelumnya.
Berdasarkan
pola
peningkatan berat basah yang tergambar pada
grafik serta hasil perhitungan didapatkan nilai total
berat basah tertinggi yang dihasilkan pada
penggunaan OD 1 dengan lama inokulasi 15 menit
yaitu 316 mg. Total berat basah akar terendah
diberikan oleh perlakuan dengan OD rendah (0.5)
dengan lama inokulasi singkat (15menit), dimana
berat basah akar yang dihasilkan ialah 214mg.
Berdasarkan hasil pengamatan dan uji statistik,
diketahui bahwa kepadatan bakteri (OD) yang
digunakan memegang peranan penting di dalam
proses transformasi dan produksi akar transforman
dari tanaman tomat. Konsentrasi bakteri yang
terlalu rendah
berakibat pada rendahnya
kemampuan bakteri untuk menginokulasi jaringan
tanaman, sedang konsentrasi terlalu tinggi juga
dapat menyebabkan rusaknya sel-sel tanaman
karena kondisi hipertonis larutan yang pada
akhirnya berakibat pada rendahnya persentase
transformasi. Pada penelitian ini, perlakuan dengan
kombinasi penggunaan OD rendah (0.5) dengan
lama inokulasi yang singkat (15-30menit)
mengakibatkan perlekatan bakteri yang terjadi
relatif lebih rendah dibanding dengan OD tinggi
(1), yang ditunjukkan dari frekuensi transformasi
yang terjadi lebih rendah dibanding dengan OD 1.
Kesimpulan yang diperoleh tersebut diperkuat
oleh pernyataan Manan et al (2009) serta
Sivanesan dan Jeong (2009). Menurut Manan et al
(2009), kepadatan bakteri dalam suspensi yang
digunakan mempengaruhi jumlah sel bakteri di
dalam tanaman, yang merupakan faktor penting
keberhasilan transformasi dengan Agrobacterium.
Jumlah bakteri yang berlebihan di dalam sel
tanaman dapat membuat tanaman menjadi stress
sehingga mempengaruhi potensi regenerasinya.
Sivanesan dan Jeong (2009) juga menyatakan
bahwa pertumbuhan bakteri yang terlalu tinggi di
dalam
sel
tanaman
dapat
menurunkan
pembentukan akar dan menyebabkan kerusakan
(browning) pada jaringan tanaman. Sebaliknya,
jumlah sel bakteri yang sedikit dapat mengurangi
potensi transformasi tanaman.
Media Bina Ilmiah67
Peningkatan persentase pembentukan akar,
jumlah seluruh akar, dan berat basah yang
dihasilkan tiap eksplan yang ditransformasi dengan
A. rhizogenes merupakan akibat dari ekspresi
onkogen dari T-DNA A.rhizogenes. Onkogen yang
termuat pada TL-DNA yaitu root locus (rol) gen,
berperan penting pada proses pembentukan akar
rambut tanaman. Ekspresi gen-gen ini baik secara
independen maupun sinergis mampu menginduksi
pembentukan akar rambut pada tanaman tomat.
Sebagai contoh integrasi dan ekspresi gen rolB
mampu mempengaruhi pertumbuhan instrinsik
sehingga akar rambut tomat dapat tumbuh di dalam
medium tanpa penambahan zpt.
Selain TL-DNA, TR-DNA juga memiliki juga
berperan pada pembentukan akar rambut pada
eksplan tomat. TR-DNA yang terintegrasi ke
dalam genom tanaman memuat gen-gen yang
homolog terhadap iaam dan iaah
pada
A.tumifaciens. Gen iaam mengkode tryptophan
monooxygenase yang mengubah triptofan menjadi
indol asetamide, sedangkan iaah mengkode indole
asetamide hydrolase yang mampu mengubah
indole asetamide menjadi indole asetic acid (IAA).
Kedua gen yang homolog terhadap iaam dan iaah
tersebut adalah aux1 dan aux2 pada A.rhizogenes
(Hashem, 2009). Ekspresi kedua gen tersebut
bersama dengan gen-gen rol menyebabkan
terjadinya perubahan level hormone endogen
tanaman. Perubahan level hormon endogen ini
kemudian memicu perimbangan baru dalam
tanaman yang pada akhirnya akan menginisiasi
pembentukan akar rambut pada eksplan tomat.
Integrasi T-DNA ke dalam genom tanaman
tomat tidak hanya mempengaruhi produksi
fitohormon endogen (auksin dan sitokinin) dalam
tanaman. Ekspresi gen-gen pada onkogen, dalam
hal ini root loci (rol gen) pada TL-DNA, juga
membuat tanaman lebih peka terhadap perubahan
level fitohormon endogen tersebut. Ekspresi gengen ini berperan pada peningkatan sensitivitas
auksin dan penurunan sensitivitas tanaman
terhadap sitokinin.
Deteksi integrasi T-DNA A. rhizogeneske
dalam genom tanaman dapat diketahui dengan
mengaplikasikan
beberapa
teknik
biologi
molekuler, salah satunya adalah deteksi integrasi
T-DNA dengan teknik PCR (Polymerase Chain
Reaction). Teknik PCR diaplikasikan dengan
menggunakan 3 primer spesifik yang masingmasing mengamplifikasi segmen pada gen rolB (2
macam primer) dan segmen pada TR-DNA.
Sebelum PCR, dilakukan pengujian pada hasil
isolasi DNA tanaman dan DNA plasmid
A.rhizogenes. Hasil uji kualitatif dan kuantitatif
_____________________________________
http://www.lpsdimataram.com
Volume 9, No. 1, Februari 2015
68 Media Bina Ilmiah
ISSN No. 1978-3787
DNA masing-masing sampel ditampilkan pada
gambar dan tabel berikut:
Tabel 1. Analisis kuantitatif sampel DNA bakteri,
DNA akar kontrol, dan DNA akar
transforman
dari
masing-masing
perlakuan
Gambar 4 Hasil elektroforesis DNA
A.rhizogenes ATCC 15834
plasmid
Keterangan:
M)marka DNA ladder 1 kb, 1) DNA plasmid
bakteri (volume suspensi 1.5ml), 2)DNA plasmid
bakteri (volume suspensi 2x1.5ml)
Gambar 3. Visualisasi hasil elektroforesis DNA
total pada masing-masing sampel.
Analisis PCR yang kemudian dilanjutkan
dengan elektroforesis pada sampel DNA akar
rambut hasil transformasi dengan A.rhizogenes,
DNA akar kontrol, serta DNA plasmid
A.rhizogenes dengan 3 primer yang digunakan
tidak menunjukkan terbentuknya amplikon yang
ditandai dengan tidak terlihatnya pita DNA pada
seluruh sampel DNA yang digunakan.
Keterangan:
1)DNA akar kontrol, 2) DNA akar hasil perlakuan
0.5-15, 3) DNA akar hasil perlakuan 0.5-30, 3)
DNA akar hasil perlakuan 0.5-45, 4) DNA akar
hasil perlakuan 0.5-60, 5) DNA akar hasil
perlakuan 1-15, 6) DNA akar hasil perlakuan 1-30,
7) DNA akar hasil perlakuan 1-30, 8) DNA akar
hasil perlakuan 1-45, 9) DNA akar hasil perlakuan
1-60, 10) DNA bakteri (volume suspensi 1.5ml),
11)DNA bakteri (volume suspensi 2x1.5ml)
Berdasarkan hasil spektrofotometri dan
elektroforesis DNA total diketahui bahwa
konsentrasi, kemurnian, dan profil DNA hasil
isolasi dari masing-masing sampel rata-rata relatif
baik. Selain itu, gambar 5.2.2 juga menunjukkan
bahwa DNA bakteri yang terisolasi merupakan
DNA total (whole genome), bukan DNA plasmid
yang ditandai dengan pita DNA yang terbentuk
berada pada bagian atas dan tidak adanya
fraksinasi seperti layaknya profil DNA plasmid
pada umumnya. Untuk itu, dilakukan isolasi ulang
DNA plasmid bakteri. Hasil isolasi plasmid bakteri
A.rhizogenes (gambar 5.3.3) menunjukkan adanya
fraksinasi DNA dari berat molekul besar ke DNA
dengan berat molekul yang lebih kecil, yang
merupakan salah satu ciri profil DNA plasmid.
_____________________________________________
Volume 9, No. 1, Februari 2015
Gambar 5 Hasil elektroforesis proses PCR dengan
plasmid rolB: M) Marka 1 kb DNA
ladder, 1)DNA akar kontrol, 2) DNA
plasmid bakteri, 3)DNA akar hasil
perlakuan 0.5-15, 4)DNA akar hasil
perlakuan 0.5-45, 5)DNA akar hasil
perlakuan 0.5-60, 6)DNA akar hasil
perlakuan 1-15, 7)DNA akar hasil
perlakuan 1-30
http://www.lpsdimataram.com
ISSN No. 1978-3787
Hasil PCR sampel DNA akar tanaman dari
seluruh perlakuan dan sampel DNA plasmid
bakteri
menggunakan
primer
yang
mengamplifikasi TL-DNA (hasil desain) tidak
menunjukkan terbentuknya amplikon, terlihat dari
tidak adanya pita DNA pada visualisasi dengan gel
agarose (1%) setelah dilakukan elektroforesis.
Telah dilakukan juga beberapa optimasi untuk
mendapatkan hasil PCR, antara lain optimasi suhu
annealing yang digunakan, yaitu 55 °C, 57°C,
59°C dan 60°C, serta aplikasi PCR langsung dari
koloni bakteri tanpa dilakukan isolasi DNA
terlebih dahulu. Namun demikian, hasil yang
diberikan oleh seluruh program yang dijalankan
tidak menghasilkan amplikon yang ditandai
dengan tidak terbentuknya pita DNA pada gel
elektroforesis.
Tidak terbentuknya amplikon pada seluruh
sampel DNA yang digunakan terjadi karena
ketidaksesuaian antara primer yang digunakan
dengan DNA target, sehingga proses annealing
(penempelan primer pada sekuen DNA target)
tidak berlangsung. Salah satu kemungkinan yang
menyebabkan ketidaksesuaian antara sekuen DNA
target dengan primer spesifik yang digunakan ialah
terjadinya mutasi yang mengubah susunan sekuen
DNA pada daerah penempelan primer (primer
binding site). Mutasi pada primer binding site yang
menyebabkan gagalnya amplifikasi sekuen DNA
target oleh primer, telah dilaporkan oleh beberapa
peneliti sebelumnya. Hass et al (1995)
menyebutkan bahwa kehilangan satu primer
binding site pada sekuen operon antara virB dan
virG pada Ti plasmid tipe nopalin menyebabkan
primer yang didesain untuk mengamplifikasi TDNA A.rhizogenes hanya dapat mendeteksi
sebagian kecil daerah gen target.
PENUTUP
Pada penelitian ini telah didapatkan metode
inokulasi yang mampu memberikan persentase
transformasi terbaik dengan berat basah akar
tertinggi pada eksplan tomat. Untuk itu pada
penelitian selanjutnya, perlu dilakukan kultur akar
pada media cair guna mendapatkan biomassa akar
yang banyak untuk produksi metabolit sekunder
likopen. Proses PCR pada penelitian ini tidak dapat
mendeteksi integrasi T-DNA A.rhizogenes pada
DNA akar transforman yang disebabkan oleh
primer yang tidak kompatibel dengan DNA target.
Kemungkinan terjadinya mutasi pada daerah
penempelan primer (primer binding site)
A.rhizogenes ATCC 15834 menyebabkan tidak
didapatkannya desain primer yang tepat untuk
deteksi integrasi T-DNA. Untuk itu, pada
penelitian selanjutnya perlu dilakukan sekuensing
DNA bakteri A.rhizogenes ATCC 15834 yang
Media Bina Ilmiah69
akan digunakan guna mengetahui sekuen DNA
yang tepat sebagai dasar untuk menesain primer
yang sesuai.
DAFTAR PUSTAKA
Akasaka
Y., M. Mii., H. Daimon. 1998.
Morphological alteration and root
nodul formation in Agrobacerium
rhizogenes-mediated transgenic hairy
root of peanut (Arachis hypogaea L),
Anals of Bothany81: 355-362
Alpizar, E., e. Dechamp., L. Lapetre-Montes., C.
Guilhaumon., B.Bertrand., C. Jordan.,
P. Lashermes., H. Ethienne.2008.
Agrobacterium
rhizogenestransformed root of coffee (Coffea
arabica): condition for long-term
proliferation, morphological, and
molecular characterization, Journal
of Bothany. 101: 929-940
Andayani, R., Lisawati, Y., and Maemunah. 2008.
Penentuan kadar anti oksidan, fenolat,
dan likopen pada buah tomat
(Lycopersicon esculentum). Jurnal
Sains dan Teknologi. 13:1-1
Dalimartha, S. 1999. Atlas tumbuhan obat
Indonesia, jilid 3. Penerbit puspa
Swara, Anggota IKAPI. Jakarta
Doran, P.M. 2002. Properties and application of
hairy root cultures di dalam K. M. O.
Caldentey., W.H Barz (ed), Plant
biotechnology and transgenic plants.
Marcell Dekker Icn. New York.p.126157
Escobar,
M.A. and
A.M.Dandekar. 2003.
Agrobacterium tumifaciens as an
agent of disease.TRENDS in Plant
science8 (8): 380-386
Gelvin, S.B. 2003. Agrobacterium mediated plant
transformation: the biology behind the
‘gene jockeying tool’. Microbiology
and Molecular Biology reviews67 (1):
16-37
Giri, A and A.L. Narasu. 2000. Transgenic hairy
roots: recent trends and applications.
Biotechnology Advances18: 1-22
Hashem, E.A. 2009. Estimation of the endegenous
auxin and cytokinin in hairy roots
incited on Solanum Dulcamara plants
by Ri plasmid Agrobacterium
rhizogenes. Australian Journal of
_____________________________________
http://www.lpsdimataram.com
Volume 9, No. 1, Februari 2015
70 Media Bina Ilmiah
Basic and Applied Sciences3 (1): 142147
Hillier, L and P.Green. 2010. OSP: a computer
program for choosing PCR and DNA
sequencing primer. Cold Spring
Harbour Laboratory Press. Missouri.
Pp
124-128.
Diakses
dari
genome.cship.org
Karcer, S.J. 1995. Molecular Biology, a project
approach: antibiotic information. San
Diedo: Academic Press, Inc. pp 239246
Kartikeyan, A., S. Palanivel., S.Parvathy., R.B.
Rhaj. Hairy root induction of
hypocotil segments of groundnut
(Arachis hypogaea L.). African
Biotechnology, Academic Journal
ISSN.6 (15): 1817-1820
Mathius, N.T., Reflini, N.Haris., J.Santoso., dan
Roswiem.
2004.Kultur
akar
rambutCinchona ledgeriana danC.
succirubra
dalam
kultur
in
vitro.Menara Perkebunan. 72(2): 7287
ISSN No. 1978-3787
Tim Penulis PS. 2009. Budidaya tomat secara
komersil.
Penebar
Swadaya:
Depok.pp 105-113
Twyman, R.M., P. Christou., E. Stroger. 2002.
Genetic transformation of plants and
the their cells di dalam K. M. O.
Caldentey., W.H Barz (ed), Plant
biotechnology and transgenic plants,
Marcell
Dekker
Icn.
New
York.pp.126-157
White, F.F and E.W. Nester. 1980. Plasmid
encodes
virulence
traits
in
Agrobacterium rhizogenes. Journal of
bacteriology141 (3): 1134-1141
Zhang, G.H., Y.R. Liang., J. Jin., J.L Lu., D.
Borthakur., J.J Dong., X.Q. Zheng.
2007. Induction of hairy root
byAgrobacterium
rhizogenes
in
relation to L-theanin production in
Camellia sinensis. Journal of
Horticultural
Science
and
Botechnology82 (4): 636-64
Mannan,A., N.Shaheen., W.Arshad., R.A.Qureshi.,
M.Zia., B.Mirza. 2008. Hairy root
induction and artemisinin analysis in
Artemisia dubia and Artemisia indica.
African Journal of Biotechnology7
(18): 3288-3292
Mannan, A., T.N.Syed., B.Mirza. 2009. Factors
affecting Agrobacterium tumifaciens
mediated transformation of Artemisia
absinthium L. Pak.J.Bot41(6): 32393246
Negara, S.M.P.K. 2009. Induksi akar rambut pada
hipokotil
tomat
(Lycopersicum
esculentum,
Mill.)
melalui
transformasi
genetik
dengan
Agrobacterium
rhizogenes
dan
penambahan auksin. Skripsi. Fakultas
Matematika dan Ilmu Pengetahuan
Alam, Universitas brawijaya. Malang.
Rahimi, K., K. Haghbeen., J. Marevatjo., F.R
Jazii., R. Sheikhani. 2008. Succesful
production of hairy root of Valeriana
sysimbriifolium by Agrobacterium
rhizogenes.
Journal
of
Biotechnology7 (2): 200-204
Tugiyono, H, 2006, Bertanam tomat. Penebar
Swadaya, Jakarta
_____________________________________________
Volume 9, No. 1, Februari 2015
http://www.lpsdimataram.com