REGULASI EKSPRESI GEN PADA BAKTERIOFAGE DAN VIRUS

REGULASI EKSPRESI GEN PADA
BAKTERIOFAGE DAN VIRUS
• Fage/virus Æ memanfaatkan perangkat sel inang untuk
sintesis DNA/protein
• Strategi memanfaatkan sel inang Æ mensintesis 4
makromolekul:
1. RNA polimerase baru Æ khusus mentranskripsi
kromosom virus
2. Subunit RNA pol baru Æ berasosiasi dengan polimerase
sel inang, hanya mentranskripsi kromosom virus
3. Protein represor Æ menghambat fungsi sel inang
4. Protein aktivator Æ mengatur ekspresi gen virus
Suharsono.2005. BTK505. IPB
Regulasi pada fage T7
2 kategori gen:
ƒGen awal (early genes): Klas
I Æ diekspresikan pertama
ƒGen lambat (late genes):
Klas II dan Klas III Æ
diekspresikan bila produk
gen awal tersedia
Suharsono.2005. BTK505. IPB
Regulasi pada fage T7
3 kelompok gen
1.Produk gen awal Æ
menghambat sintesis RNA
inang
2.Produk gen metabolisme
DNA (enzim untuk replikasi
kromosom virus & nuklease
untuk degradasi kromosom
sel inang Æ nt bebas)
3.Produk gen akhir (mantel,
ekor & protein pembungkus
kromosom virus). Produk
terakhir: lisozim Æ lisis sel
inang Æ + 250 fage
Suharsono.2005. BTK505. IPB
Ekspresi T7
1. Gen-gen klas I diekspresikan oleh RNA pol sel inang Æ
transkrip panjang Æ dipotong oleh RNaseIII dari sel
inang Æ 5 mol mRNA Æ translasi oleh ribosom dari sel
inang
Produk:
• antirestriksi (0.3) Æ melindungi kromosom virus dari
degradasi oleh enzim restriksi sel inang
• protein kinase (0.7) Æ modifikasi RNA pol sel inang,
membatasi ekspresi gen klas I dan menjamin ekspresi
gen klas II dan III
• RNA polimerase T7 (1) Æ transkripsi klas II dan III (80%
genom virus T7)
• Ligase (1.3) Æ menyambung fragmen DNA
2. Gen-gen klas II diekspresikan oleh RNA pol T7
-replikasi DNA virus
3. Gen-gen klas III
-morfogenesis fage, pengemasan DNA, lisis sel inang
Suharsono.2005. BTK505. IPB
Siklus fage T7
Suharsono.2005. BTK505. IPB
Regulasi pada SPO1
• SPO1: virus besar, menginfeksi Bacillus subtilis
• 3 kelompok gen: early, middle, late
1. Gen awal Æ RNA pol sel inang (menghasilkan produk
gen 28)
2. Gen tengah Æ RNA pol sel Inang yang mengandung
produk gen 28 pada posisi faktor σ
–Faktor σ mengenali –35: TTGACA dan -10: TATAAT
pada gen awal SPO1
–Produk gen 28 mengenali –35: AGGAGA dan -10:
TTTTTT pada gen tengah SPO1
–Menghasilkan produk gen 33 dan 34
3. Gen akhir Æ RNA pol sel inang yang mengandung
produk gen 33 dan 34
Suharsono.2005. BTK505. IPB
Regulasi pada SPO1 (lanjutan)
Transisi ekspresi gen awal ke gen tengah dan dari gen
tengah ke gen akhir melibatkan modifikasi RNA
polimerase (melalui penggantian salah satu subunitnya,
yaitu posisi faktor σ)
Suharsono.2005. BTK505. IPB
Regulasi pada λ
Setelah menginfeksi E.coli, λ menempuh:
1. Siklus litik Æ sel inang lisis Æ 100 fage
2. Siklus lisogenik Æ kromosom fage menyisip kedalam
kromosom E.coli
Suharsono.2005. BTK505. IPB
Siklus litik atau lisogenik?
Protein-protein regulator
yang disandi λ
Suharsono.2005. BTK505. IPB
Regulasi selama siklus litik λ
Fase litik meliputi 3 fase:
• Fase Immediate-early
• Fase Delayed-early
• Fase Late
Fase Immediate-early
Kromosom λ masuk, transkripsi
oleh RNA pol sel inang. Inisiasi
transkripsi dimulai dari PR
(transkripsi ke kanan) Æ gen cro
dan PL (transkripsi ke kiri) Æ gen
N. Protein N diperlukan untuk
transisi dari immediate-early ke
delayed early (seperti produk
gen 28 pada SPO1)
Suharsono.2005. BTK505. IPB
Regulasi selama siklus litik λ
Fase Delayed-early
Dimulai saat protein N
menstimulasi transkripsi gen-gen
delayed- early, mengekspresikan
gen cII dan cIII (relevan untuk
siklus lisogenik), gen O, P (untuk
replikasi kromosom λ) dan Q
(untuk transisi dari delayed-early
ke late, seperti produk gen 33
dan 34 dari SPO1)
Fase Late
Dimulai saat protein Q
menstimulasi transkripsi gen-gen
late spt gen penyandi kepala,
ekor dan faktor-faktor litik
Suharsono.2005. BTK505. IPB
Transkripsi gen-gen immediate-early
RNA polimerase sel inang:
ƒKanan: PR Æ cro
ƒKiri: PL Æ N
Suharsono.2005. BTK505. IPB
Transkripsi delayed-early
RNA polimerase sel inang (faktor δ diganti protein N)
ƒKanan: PR Æ cII, O, P, Q
ƒKiri: PL Æ CIII
Suharsono.2005. BTK505. IPB
Keadaan lisogeni
• Siklus lisogeni memerlukan:
1. Protein represor λ Æ menghambat ekspresi gen-gen
untuk siklus lisis
– Disandi oleh gen cI di bawah kontrol PRE
(promoter for repressor establishment)
2. Protein Int λ Æ integrasi ke kromosom E. coli
– Disandi oleh gen Int di bawah promoter PINT
3. PRE dan PINT: sekuensi mirip, memerlukan protein cII
dan cIII supaya RNA polimerase mengenalinya Æ cII
dan cIII diperlukan untuk siklus lisogeni
Suharsono.2005. BTK505. IPB
Keadaan lisogeni
Suharsono.2005. BTK505. IPB
Protein cII dan cIII
• Protein cII Æ protein regulator (aktivator) seperti CAP
Æ mengikat daerah –35 dari PRE dan PINT Æ
menstimulasi RNA pol menempel pada promoter
sehingga kedua operon ditranskripsikan
• Protein cIII Æ menonaktifkan protease yang dapat
mendegradasi protein cII (Æ menjaga stabilitas cII)
• CII dan cIII memerlukan protein N
Suharsono.2005. BTK505. IPB
Mekanisme Lisogeni
• Represor λ Æ mengikat operator (OL dan OR),
mencegah transkripsi gen-gen yang dikontrol PR dan PL
yaitu: gen N dan cro
• N dan CRO tidak stabil Æ konsentrasi di dalam sel turun
(rendah)
• N rendah Æ menghambat transkripsi gen-gen delayedearly yang tergantung N, yaitu: O, P, Q
• Q rendah/tidak ada Æ mencegah ekspresi gen-gen dan
late Æ tidak terjadi siklus lisis
• Protein Int Æ perantara rekombinasi situs spesifik
antara attP dan attB sehingga kromosom λ terintegrasi
kedalam kromosom E. coli
Suharsono.2005. BTK505. IPB
Strategi λ dalam memilih siklus
1. Menghasilkan protein-protein N dan Q, yang
berinteraksi dengan RNA pol dan mempengaruhi
pembacaan terminator Æ lisis
2. Menghasilkan protein aktivator cII yang mengikat
daerah promoter dan memudahkan RNA pol menempel
pada promoter Æ lisogeni
3. Menghasilkan represor Æ mengikat operator Æ
lisogeni
Suharsono.2005. BTK505. IPB
Interaksi represor-operator
• Mutasi gen cI Æ plak jernih (WTÆ plak keruh: lisis &
lisogeni)
• Mutasi cII- dan cIII- Æ plak jernih
• Represor: stabil, 26 kDa, berinteraksi dengan operator
sebagai dimer
• Mutan operator (OL- dan OR-) Æ virulen (represor normal
tapi tidak dapat mengikat operator Æ tidak dapat
menempuh siklus lisogeni Æ plak jernih (~lacOc)
Suharsono.2005. BTK505. IPB
Operator
• Operator mempunyai 3 situs penempelan (OL1, 2, 3;
OR1, 2, 3)
• Operator tumpang tindih dengan promoter
• Setiap situs penempelan = 17 nt, dipisahkan dengan
yang lain oleh daerah kaya AT
• Setiap mutasi pada situs penempelan Æ virulen
= mutasi Æ virulen
Suharsono.2005. BTK505. IPB
Lisis-Lisogeni
• Lisis/lisogeni ditentukan oleh 6 protein regulator yang
berkompetisi, yaitu: N, Q, cII, cIII, cI, dan cro
• Protein cro (control of repressor and other things)
– paling menentukan terjadinya siklus lisis atau
lisogeni
– diekspresikan segera setelah infeksi λ
– tidak memerlukan protein N
– ada sebelum produk cI (represor), cII dan cIII ada
di dalam sel
– represor, dapat mengikat OR dan OL seperti represor
cI (tapi kurang efisien dan kurang stabil) Æ tidak
dapat menghambat secara penuh ekspresi gen-gen
N dan cIII (dibawah PL) dan cro, cII, O, P, dan Q (di
bawah PR)
Suharsono.2005. BTK505. IPB
Mekanisme Lisis-Lisogeni
• Lisogeni memerlukan ekspresi gen cI Æ perlu cII dan
cIII untuk mengaktifkan PRE
• Lisis memerlukan ekspresi seluruh gen Æ perlu
antiterminator N dan Q
• Transkripsi cI lebih sensitif terhadap penurunan cII/cIII
daripada transkripsi untuk gen-gen yang terlibat dalam
siklus lisis terhadap penurunan N dan Q
Æ jika cro banyak Æ menempel pada OR dan OL Æ cII
dan cIII rendah Æ cI tidak diekspresikan Æ ekspresi
seluruh gen λ Æ siklus lisis
Æ jika cro sedikit Æ tidak kuat menempel pada OR dan
OL Æ ekspresi cII dan cIII normal Æ cI
diekspresikan Æ siklus lisogeni
– tingkat produksi cro Æ temperatur, keadaan
metabolit sel inang, genotipe sel inang, genotipe
fage
Suharsono.2005. BTK505. IPB
Keadaan E. coli lisogeni
• Bakteri lisogenik untuk λ (E. coli (λ)) kebal terhadap
superinfeksi (+λ)
• E. coli (λ) + λ Æ DNA λ masuk tapi tidak terjadi lisis
pada bakteri
• Profage mensintesis represor cI pada tingkat rendah Æ
menempel pada PROR dan PLOL pada profage (menjaga
kondisi lisogeni) dan PROR dan PLOL pada λ yang masuk
(mencegah replikasi dan integrasi kedalam kromosom E.
coli krn situs attB sudah ditempati) Æ kromosom λ
berada di sitosol Æ jumlahnya berkurang (hilang) bila E.
coli mengalami pembelahan sel
Suharsono.2005. BTK505. IPB
• Transkripsi represor pada tingkat rendah di E. coli (λ)
dikontrol oleh PRM (promoter for repressor maintenance)
yang tidak memerlukan cII dan cIII (beda dengan PRE)
• Transkripsi dari PRM dikontrol oleh protein cI:
Jika represor cI rendah Æ PRM dirangsang Æ transkripsi
cI
Jika represor cI tinggi Æ transkripsi dari PRM dihambat
oleh represor cI (Æ regulasi autogenous)
Suharsono.2005. BTK505. IPB
Induksi lisis dari keadaan profage
• Lisis terjadi karena protein represor cI tidak dapat
menghambat ekspresi operon dari profage λ
• Kehilangan secara spontan profage λ dari kromosom
E. coli jarang terjadi
Suharsono.2005. BTK505. IPB
1. Induksi zigotik
• Sel donor lisogenik Hfr x
sel resipien non lisogenik
– Jika kromosom yang
mengandung profage
masuk ke sel resipien Æ
tidak menemui protein
represor Æ transkripsi
dari PROR dan PLOL Æ
siklus lisis
– Tidak terjadi lisis jika sel
resipien adalah E. coli
(λ)
Suharsono.2005. BTK505. IPB
2. Mutasi pada cI
• Mutan cI857 Æ sintesis protein represor thermolabil
(stabil pada 30oC, tidak aktif pada 42oC)
• E. coli (cI857) Æ dipanaskan Æ E. coli lisis
Suharsono.2005. BTK505. IPB
3. Perlakuan bakteri lisogenik yang dapat
merusak DNA (dengan irradiasi UV, mitomisin,
sinar X)
• Mekanisme: perbaikan DNA dengan sistem SOS
• Bila DNA rusak dan tidak dapat diperbaiki dengan
replikasi, E. coli mensintesis protein RecA Æ
memudahkan sintesis enzim SOS termasuk untuk
replikasi tanpa DNA cetakan. RecA adalah protease
yang dapat merusak represor LexA (menekan enzim
sistem perbaikan kesalahan), dan represor λ dalam E.
coli (λ).
• Jika DNA rusak Æ sinyal untuk mensintesis protein
RecA Æ merusak represor λ Æ profage terinduksi
untuk mengalami lisis
Suharsono.2005. BTK505. IPB
Regulasi SV40
Produk gen early
• Antigen t (15kD)
• Antigen T (96 kD)
Æ Transkrip sama, beda
splicing
Produk gen late
• Protein kapsid (VP1, VP2,
VP3) Æ beda splicing
– mRNA late Æ splicing:
• 16S mRNA Æ VP1
• 19S mRNA:
• VP2
• VP3
Arah transkripsi gen-gen early
Æ Krn 2 kodon AUG
berbeda dengan gen-gen late
Suharsono.2005. BTK505. IPB
Regulasi sintesis protein SV40
• Infeksi (8-10 jam) Æ gen early (gen A penyandi
antigen T) ditranskripsikan oleh RNA pol dan
ditranslasikan oleh ribosom sel inang
• Mutan tsA (antigen T thermolabile) Æ tidak dapat
memulai replikasi kromosom virus & tidak dapat
memulai transkripsi gen-gen late untuk protein
kapsid virus
Antigen T Æ protein pengatur early yang esensial
(~ protein N pada λ)
Suharsono.2005. BTK505. IPB
Mekanisme
Promoter early (EI dan EII) dekat
dengan ORI dan gen early A
Situs penempelan antigen T (I, II,
III) bebas Æ transkripsi oleh
RNA pol dari EI
Melekatnya antigen T (tetramer)
pada situs I Æ Inisiasi transkripsi
dari situs EII
Penempelan antigen T pada situs
II Æ transkripsi gen A berhenti Æ
ekspresi gen-gen late
Suharsono.2005. BTK505. IPB
Regulasi SV40
Kromosom SV40 menginfeksi sel inang:
• RNA pol memilih promoter EI untuk memulai transkripsi
genA Æ sintesis antigen T
• Akumulasi antigen T (tetramer) Æ mengikat situs I Æ
inisiasi transkripsi dari EI dihambat, sehingga RNA pol
menempel pada promoter EII untuk melakukan transkripsi
antigen T Æ jumlah antigen T banyak Æ mengikat semua
situs I, dan II Æ transkripsi gen early berhenti, dan
replikasi DNA SV40 dan transkripsi gen-gen late dimulai
Suharsono.2005. BTK505. IPB
Kenapa terjadi early/late?
• Promoter EI dan EII jauh lebih kuat daripada promoter
pada gen-gen late sehingga transkripsi oleh RNA pol
pada gen A sangat intensif Æ produk antigen T banyak
• Antigen T menghambat ekspresi gen-gen early,
sehingga RNA pol memulai ekspresi gen-gen late
‰Sintesis antigen T Æ regulasi autogenous (~ represor λ
~ trp)
‰Mutan tsA Æ antigen T thermolabile didegradasi (situs I
dan II bebas) Æ stimulasi 15x transkripsi gen early Æ
overproduksi protein mutan T
Suharsono.2005. BTK505. IPB