gibson assembly, piranti enzimatis terbaru dalam - Biotrends

BioTrends Vol.6 No.2 Tahun 2015
GIBSON ASSEMBLY, PIRANTI ENZIMATIS TERBARU DALAM
TEKNOLOGI REKOMBINASI DNA
Sri Kartika Wijaya
Pusat Penelitian Bioteknologi- LIPI
Jl.Raya Bogor KM.46 Cibinong Science Center, Bogor 16911.
Telepon: 021-8754587. Email : [email protected],
[email protected]
S
elama hampir setengah
abad, tak terhitung jumlah
peneliti yang telah
melakukan rekombinasi DNA.
Rekombinasi DNA didefinisikan
sebagai teknik perakitan DNA baik
secara natural atau artifisialyang
prosesnya melibatkan pertukaran
materi genetik dari kromosom
yang berbeda atau dari region
berbeda dari satu kromosom
makhluk hidup yang sama
(Clancy, S 2008), rekombinasi ini
secara umum diperlukan untuk
duplikasi kromosom pada saat
meiosis yang merupakan momen
kritikal perkembangbiakan
makhluk hidup. Selain itu,
Gambar 1. menjelaskan tentang teknik Gibson Assembly dilakukan diawal masa percobaan yang secara
umum dituturkan bertujuan untuk menginsersi sebuah fragmen DNA ke dalam vektor pUC19.
Bagian [1A] memperlihatkan sisi penggabungan vektor dan insert. Perbanyakan vektor pUC19
yang memiliki sisi overlap dengan beberapa bagian dari –N dan –C fragmen insert dilakukan
dengan teknik PCRdengan primer yang didesain unik pada sisi reverse dan forward.Bagian [1B]
merupakan gambaran umum dari prosesGA. Sisi DNA vektor dan insert yang saling tumpang
tindih dilambangkan dengan garis hitam. T4 DNA Polimerasi akan memakan beberapa puluh
basa yang bersinggungan pada sisi 3’ dari DNA, yang akibatnya akan membentuk overhang
pada dua sisi DNA yang bersinggungan. Taq Polimerase dan Taq ligase akan mengisi celah
DNA sekaligus melekatkan dua untai DNA asing menjadi satu untai DNA yang tersambung
rapat tanpa celah.
14
BioTrends Vol.6 No.2 Tahun 2015
rekombinasi DNA juga berperan
dalam proses perbaikan dan
replikasi DNA yang terjadi secara
alami (Clancy, S 2008).
ligase DNA(Gellert 1967)yang
esensial untuk pelekatan untai
DNA (Lehnman 1974)dan enzim
restriksi(Smith & Welcox 1970)
yang berfungsi sebagai enzim
Secara umum, rekombinasi DNA
yang bisa membelah DNA pada
dikelompokkan menjadi
sekuens yang spesifik(Loenen et
rekombinasi yang sifatnya natural al. 2013). Dua enzim yang
dan non-natural. Salah satu tipe
fenomenal tersebut memiliki peran
rekombinasi yang sering dilakukan utama dalam proses rekombinasi
diantaranya adalah rekombinasi
DNA karena keberadaannya yang
yang bersifat non-natural, karena
memungkinkan peneliti untuk
terkadang rekombinasi non-natural memotong DNA dengan ukuran
ini diperlukan saat seorang peneliti tertentu dan kemudian meletakkan
ingin menyusun elemen genetik
atau menyambungkan DNA asing
atau pada saat mensintesa genom tersebut ke dalam genom makhluk
suatu makhluk hidup secara utuh. yang lain. Hingga kini, berbagai
Sejak itulah metoda rekombinasi
adaptasi dan penyempurnaan
DNA mengalami banyak perbaikan metode rekombinasi terus
dari segi teknik dan kemudahan
dilakukan demi hasil yang lebih
penggunaan, dan pada akhirnya
cepat danakurat.
pengembangan metoda
tersebutmenjadi sangat beragam. Penelitian mengenai teknologi
Tak dapat dipungkiri bahwa
rekombinasi DNA sudah dimulai
perkembangan metoda
sejak tahun 1967, yaitu ketika
rekombinasi DNA menjadi sangat
kelompok penelitian Zimmerman
pesat sejak ditemukannya enzim
melakukan eksperimen ekstrem
Gambar2.
yang bertujuan untuk menyatukan
dua untai DNA
bakteriofagedengan reaksi
enzimatis(Zimmerman et al. 1967).
Kelompok penelitian mereka
menggunakan enzim yang berasal
dari ekstrak Escherichiacoli untuk
menggabungkan dua untai DNA.
Beberapa tahun kemudian, A.D
Kaiser dan Peter Lobban berhasil
mengembangkan teknik untuk
menggabungkan dua molekul
DNA, yang dikemudian hari
menjadi teori dan teknik acuan
dibuatnya DNA dimer sirkuler dari
Polyomavirus simian virus 40
(SV40)(Jackson, Symons & Berg
1972). Polyomavirus simian virus
40 (SV40) adalah DNA virus yang
berperan kuat sebagai salah satu
penyebab penyakit kanker
(Vilchez & Butel 2004), dan pada
saat itu ditemukan bahwa pada
infeksi tingkat akhir, mayoritas
virus SV40 ditemukan dalam
bentuk sirkuler DNA yang
ditengarai terbentuk dengan cara
Memperlihatkan pembaharuan teknik Gibson Assembly dengan menggunakan
enzimeksonuklease III dan T5 eksonuklease. Kedua enzim ini hanya dibedakan di sisi aktif
pemotongan ujung DNA. Secara umum, T5 eksonuklease lebih ringkas karena hanya
memerlukan satu kali pengaturan suhu pada 50ºC.
15
BioTrends Vol.6 No.2 Tahun 2015
rekombinasi DNA (Goff & Berg
1977). Karena proses rekombinasi
inilah SV40 digunakan sebagai
subjek untuk mengamati proses
rekombinasi yang terjadi secara
natural.
Gibson Assembly
Gibson Assembly (Borgi &
Gargouri) adalah teknologi
rekombinasi DNA terbaru yang
diperkenalkan oleh Gibson grup.
Teknik rekombinasi ini pertama
kali dipublikasikan pada tahun
2009. Dalam sebuah tulisan
komunikasi singkat, Daniel Gibson
dengan gamblang memaparkan
proses enzimatis perakitan
molekul DNA yang berhasil
menggabungkan molekul DNA
hingga ribuan kilobasa dalam satu
Lompatan besar di bidang
rekombinasi DNA terjadi ketika
para peneliti bisa
mengembangkan teknik
penggabungkan dua molekul
DNAyang tadinya hanya berupa
fragmen linearhingga akhirnya
berhasil membuat DNA sirkuler
yang memiliki
Gibson Assembly (Borgi &
struktur berupa
lingkaran tertutup.
Gargouri) adalah teknologi
DNA sirkuler ini
menarik perhatian
rekombinasi DNA terbaru yang
dunia ilmiah
dikarenakan
diperkenalkan oleh Gibson
berperan pada
grup. Teknik rekombinasi ini
replikasi bakteri,
seringkali
pertama kali dipublikasikan
merupakan penanda
infeksi (seperti
pada tahun 2009. Dalam
misalnya pada
sebuah tulisan komunikasi
kasus infeksi SV40),
dan terlebih lagi
singkat, Daniel Gibson dengan
sirkular DNA ini
berpotensi untuk
gamblang memaparkan proses
dikembangkan lebih
jauh untuk berbagai
enzimatis perakitan molekul
kepentingan di
DNA yang berhasil
bidang biologi
molekuler. Riset
menggabungkan molekul DNA
intensif tentang
rekombinasi DNA ini
hingga ribuan kilobasa dalam
rupa-rupanya
satu kali reaksi isothermal
menjadi inspirasi
bagi kelompok riset
yang lain untuk
kali reaksi isothermal, teknik GA
memoles teknik rekombinasi
membutuhkan satu syarat penting,
tersebut menjadi lebih mudah.
yaitu rangkaian DNA yang dibuat
Beberapa teknik pun melalui
overlap/ tumpang tindih satu sama
proses uji coba, selain
lain, yang memiliki basa nukleotida
denganenzim restriksi dan PCR,
saling berpasangan satu sama
teknologienzim ligase independen lain.
(Li & Elledge 2007)pun diadopsi
sebagai salah satu strategi
Jauh sebelum teknik ini berhasil
kloning. Hanya saja, kesemua
dikembangkan, kisah sukses
teknologi rekombinasi diatas
strategi rekombinasi DNA dengan
memiliki kekurangan berupa
teknik yang dikembangkan oleh
rentang waktu pengerjaan yang
kelompok penelitian Gibson
lebih lama, biaya yang lebih tinggi, bukanlah proses singkat. Pada
dan terkadang tidak
tahapan awal penelitian
memungkinkan untuk melakukan
pengembangan teknologi GA ini;
modifikasi yang diperlukan pada
khususnya sebelum mereka
sekuen DNA.
berhasil mengembangkannya
menjadi satu tahap reaksi; Gibson
16
grup melakukan rekombinasi DNA
melalui dua tahap
reaksi.Kelompok penelitian
tersebut melakukan rekombinasi
yang bertujuan untuk menyisipkan
sebuah fragmen DNA pada vektor
PUC19(Gibson 2011).
Proses rekombinasi dimulai
dengan perbanyakan vektor
E.colidengan kultur bakteri. Stok
DNA yang sudah dipurifikasi dari
vektor tersebut diperbanyak
dengan teknik Polymerase Chain
Reaction(PCR), yang merupakan
satu teknik terbaik untuk
penggandaan untai DNA.Teknik
PCR ini memungkinkan kita untuk
menggandakan DNA vektor dan
insert sekaligus dengan
penambahan bagian overlap
sepanjang 40bp di sisi –N dan –C
dari vektor (gambar 1A).Dua-tahap
rekombinasi in-vitro bisa
terlaksana dengan menggunakan
enzim T4 DNA polymerase dan
kombinasi dari enzim Taq DNA
polimerase dan Taq DNA ligase.
Dalam reaksi ini, Taq DNA
polimerase bekerja sama seperti
DNA polimerase manusia pada
proses replikasi alami, hanya saja,
jika DNA polimerase manusia
akan rusak sesaat setelah berada
dalam temperatur tinggi, maka
Taq DNA polimerase masih bisa
bertahan hingga 94ºC. Hal ini
menjadi keuntungan tersendiri jika
mengingat siklus PCR yang
berulang-ulang hingga 20 atau 35
siklus menggunakan suhu 94-95ºC
untuk setiap siklusnya, menjadikan
Taq DNA polimerase enzim yang
ideal bagi proses ini penggandaan
DNA ini.
Proses dua-tahap rekombinasi
DNA yang pertama kali
diperkenalkan oleh grup Gibson ini
dikerjakan dengan cara sebagai
berikut(Gibson 2011):

Pada reaksi pertama; ujung 3’
dari fragmen DNA akan
terpotong sepanjang
beberapa basa hingga
membentuk overhangpada
ujung 3’ tersebut. Proses
pemotongan sebagian DNA
fragmen ini dilakukan oleh
enzim T4 DNA polimerase
BioTrends Vol.6 No.2 Tahun 2015
pada suhu 37ºC, yang
bertujuan untuk
mengekspose bagian DNA
yang overlap, baik pada insert
DNA fragmen ataupun pada
DNA vektor. Proses
pemotongan tersebuthanya
mungkin terjadi jika tanpa
penambahan dNTPs,
sedangkan dNTPs
dibutuhkan
sebagaisumberdaya basa
tunggal A (Adenin), T
(Tirosin), G (Guanin) dan C
(Sitosin) yang penting pada
saat merakit untaian DNA
baru.Mengingat hal itu,
pemberian dNTPs ditunda
pada reaksi tahap pertama
dan baru akan ditambahkan
pada reaksi kedua.
Setelah proses pemotongan
ujung DNA dengan T4
Polimerase, enzim tersebut
akan di inaktifasi pada suhu
75ºC, yang kemudian disertai
dengan proses pendinginan
secara lambat dan bertahap,
proses pendinginan ini
diharapkan bisa menginisiasi
proses annealing(pelekatan)
dari sisi yang saling overlap
(tumpang tindih).

Reaksi kedua adalah dengan
melibatkan enzim Taq
polymerase dan Taq ligase,
dua enzim ini akan aktif pada
suhu 45ºC dengan
penambahan dNTPs.Taq
Polimerase menggunakan
sumber daya dNTPs untuk
merekontruksi untai DNA baru,
proses rekonstruksi ini
dibarengi dengan proses
repairing oleh Taq ligase untuk
mengisi celah-celah diantara
dua DNA asing yang masih
mungkin belum sempurna.
Dengan demikian, kolaborasi
antara enzim Taq polymerase
dan Taq ligase tersebut
diharapkan bisa menghasilkan
sambungan DNA yang tanpa
celah.Aktivitas ini juga
meminimalisir adanya
kemungkinan kesalahan pada
saat mengisi celah DNA yang
tidak komplemen. (Gambar
1B).
Seperti yang telah dijabarkan
diatas, bahwa reaksi dua-tahap
rekombinasi DNA tersebut
memiliki satu hal yang mungkin
menjadikannya kurang efisien,
fakta bahwa reaksi pertama dan
kedua tidak bisa dikerjakan dalam
satu reaksi adalah dikarenakan
keberadaan dNTPs akan
menghambat kerja enzim T4 DNA
polymerase. Disisi lain, dNTPs
adalah substansi yang diperlukan
untuk mengisi celah di untai DNA
yang kosong.Terlebih lagi,
perbedaan suhu untuk reaksi
pertama dan kedua sedikit
ekstrim, yaitu 75ºC dan 45ºC.
Maka dari itu penyempurnaan
proses rekombinasi DNA ini
kemudian dilakukan dengan
penggunaan enzim eksonulease
III. Enzim inibisa melakukan fungsi
yang sama seperti enzim T4 DNA
polymerase, yaitu mengeliminasi
sebagian basa pada ujung 3’,
namun kelebihannya, enzim T4
DNA polymerasetersebut tidak
akan terhambat dengan
keberadaan dNTPs pada larutan.
Pada akhirnya, dengan cara ini
rekombinasi DNA bisa dilakukan
dengan satu tahap reaksi dengan
menggunakan
thermocycler.Hanya saja teknik
rekombinasi DNA menggunakan
eksonuklease III tetap
memerlukan dua temperature
yaitu pada suhu 37ºC dan 50ºC
(Gambar 2).
Pada perkembangan selanjutnya
enzim T5 eksonuklease pun
digunakan menggantikan enzim
eksonuklease III, pada dasarnya
dua enzim ini memiliki fungsi
sama, hanya saja T5
eksonuklease akan memotong
basa di ujung 5’ bukan di ujung 3’
seperti yang dilakukan oleh
eksonuklease III. Kelebihan lain
dari enzim T5 eksonuklease ini
adalah kemudahan dalam proses
pengaturan suhu selama reaksi
berlangsung, dalam proses
rekombinasinya enzim T5
eksonuklease hanya memerlukan
satu kali pengaturan suhu pada
50ºC.
17
Nah bagaimanakah detail proses
rekombinasi dengan enzim
eksonuklease dan T4 DNA
polimerase ini? Mari simak
langkahnya (Gambar 2):

Enzim T5 eksonuklease
Enzim T5 eksonuklease
adalah enzim yang pertama
kali bertugas dalam proses
perakitan DNA dengan teknik
GA. Enzim ini bekerja dengan
sedikit ‘memakan’ bagian
ujung 5’ dari DNA, yang
tujuannya adalah untuk
memberi ruang bagi enzim
lain bekerja menyatukan dua
DNA yang asing satu sama
lain.

Enzim Phusion dan Taq
Ligase.
Dua enzim ini mulai aktif
bekerja saat suhu
thermocycler mencapai 50ºC.
Berbeda dengan enzim T5
eksonuklease yang aktif sejak
saat ditambahkan ke dalam
campuran DNA dan menjadi
inaktif ketika suhu mencapai
50ºC. Saat T5 eksonuklease
‘memakan’ beberapa basa di
ujung 5’ dan meninggalkan
jejak berupa ujung DNA yang
menggantung, maka enzim
Phusion akan ‘mengisi’ ruang
kosong antara DNA yang
overlap. Pekerjaan enzim
Phusion ini akan
disempurnakan oleh Taq
Ligase yang akan menutup
celah-celah kecil antara dua
DNA yang digabungkan dan
sebagai hasil akhir, akan
diperoleh satu DNA yang
tersambung rapat tanpa
celah.
Aplikasi Teknik Gilson Assembly
Dalam artikel yang ditulis oleh
Daniel Gibson dan Salvatore
Rusello yang dipublikasikan oleh
NEB, mereka memaparkan bahwa
jika dibandingkan dengan kloning
tradisional yang membutuhkan
situs pemotongan enzim restriksi,
dilanjutkan dengan ligasi dan
konfirmasi dengan teknik PCR,
metode kloning dengan Gibson
Assembly terbilang lebih efisien,
cepat dan mudah.
BioTrends Vol.6 No.2 Tahun 2015
Karenakeseluruhan proses
penggandaan untai DNA vektor
dan insert, penggunaan enzim
restriksi dan enzim ligase,
dilanjutkan dengan kloning dan
transformasi bisa dikerjakan dalam
waktu beberapa jam saja. Produk
Gibson Assembly bisa langsung
digunakan untuk transformasi ke
dalam sel inang tanpa harus
melewati proses purifikasi yang
bisa berdampak mengurangi
konsentrasi sampel DNA. Poin
penting yang mungkin sedikit
harus mendapatkan perhatian
khusus adalah pada saat
mendesain primer yang akan
digunakan untuk proses assembly,
karena setiap primer yang dibuat
harus memiliki sisi overlap pada
dua untai DNA yang berbeda.
Namun saat ini, beberapa
software bioinformatika berbayar
mampu memberikan kemudahan
dalam proses perakitan primer ini.
Hal lain adalah ketepatan
konsentrasi DNA vektor dan
fragmen yang akan diinsersikan
juga harus akurat. Dalam buku
panduan teknik Gibson Assembly,
dijelaskan bahwa konsentrasi
yang dibutuhkan akan sangat
dipengaruhi oleh banyaknya
fragment DNA dan panjangnya
fragment DNA yang akan di
rekombinasi, yang secara umum
juga akan menentukan efisiensi
dari proses assembly DNA yang
dilakukan.
kedepannya, akan mempengaruhi
kecepatan proses perakitan DNA,
dan utamanya akan sangat
mempengaruhi proses sintesa
genom, secara tidak langsung
juga akan mempercepat proses
riset di bidang-bidang terkait.
Li, MZ & Elledge, SJ 2007,
'Harnessing homologous
recombination in vitro to
generate recombinant DNA
via SLIC', Nat Methods, vol.
4, no. 3, pp. 251-6.
Loenen, WAM, Dryden, DTF,
Raleigh, EA, Wilson, GG &
Murray, NE 2013,
'Highlights of the DNA
cutters: a short history of the
restriction enzymes', Nucleic
Acids Research.
Daftar Pustaka
Borgi, I & Gargouri, A 2008, 'A
spontaneous direct repeat
deletion in the pGEX fusion
vector decreases the
expression level of
recombinant proteins in
Roop, RM, 2nd, Bellaire, BH,
Escherichia coli', Protein
Valderas, MW & Cardelli, JA
Expr Purif, vol. 60, no. 1, pp.
2004, 'Adaptation of the
15-9.
Brucellae to their
intracellular niche', Mol
Microbiol, vol. 52, no. 3, pp.
Gellert, M 1967, 'Formation of
covalent circles of lambda
621-30.
DNA by E. coli extracts',
Proceedings of the National Smith, HO & Welcox, KW 1970, 'A
Academy of Sciences of the
Restriction enzyme from
United States of America,
Hemophilus influenzae: I.
vol. 57, no. 1, pp. 148-55.
Purification and general
properties', Journal of
Molecular Biology, vol. 51,
Gibson, DG 2011, 'Enzymatic
assembly of overlapping
no. 2, pp. 379-91.
DNA fragments', Methods
Enzymol, vol. 498, pp. 349- Vilchez, RA & Butel, JS 2004,
61.
'Emergent Human Pathogen
Simian Virus 40 and Its Role
in Cancer', Clinical
Goff, SP & Berg, P 1977,
Microbiology Reviews, vol.
'Structure and formation of
circular dimers of simian
17, no. 3, pp. 495-508.
virus 40 DNA', Journal of
Virology, vol. 24, no. 1, pp.
Zimmerman, SB, Little, JW,
295-302.
Oshinsky, CK & Gellert, M
Dalam kesempatan yang lebih
1967, 'Enzymatic joining of
luas, teknik Gibson Assembly juga Jackson, DA, Symons, RH & Berg,
DNA strands: a novel
memungkinkan untuk
P 1972, 'Biochemical
reaction of
diaplikasikan untuk beberapa hal
Method for Inserting New
diphosphopyridine
nucleotide', Proceedings of
lain, diantaranya untuk
Genetic Information into
the National Academy of
merekonstruksi DNA yang
DNA of Simian Virus 40:
berukuran besar, Site-directed
Sciences of the United
Circular SV40 DNA
mutagenesis, membuat fragment
States of America, vol. 57,
Molecules Containing
DNA rantai ganda, dan juga pada
Lambda Phage Genes and
no. 6, pp. 1841-8.
proses kombinasi-sintesis fragmen
the Galactose Operon of
DNA (Gibson and Russello).
Escherichia coli',
Proceedings of the National
Dalam perkembangannya, teknik
Academy of Sciences of the
Gibson assembly telah
United States of America,
diperkenalkan secara luas dalam
bentuk produk jadi di bawah brand
vol. 69, no. 10, pp. 2904-9.
NEB. Semua enzim yang
dibutuhkan untuk proses Gibson
Lehnman, IR 1974, 'DNA Ligase:
Assembly dikonsentrasikan
Structure, Mechanism, and
didalam satu tube tunggal untuk
Function', Science, vol. 186,
proses satu reaksi isothermal yang
no. 4166, pp. 790-7.
mudah. Dengan teknik baru ini,
18