STUDI HOMOLOGI DAERAH TERMINAL
advertisement
STUDI HOMOLOGI DAERAH TERMINAL-C. HASIL TRANSLASI INSCRIPTO BEBERAPA GEN DNA POLIMERASE I TESIS Oleh MULYONO BIDANG KHUSUS BIOKIMIA PROGRAM STUDI KIMIA PROGRAM PASCASARJANA INSTITUT TEKNOLOGI BANDUNG 2000 ABSTRAK DNA polimerase merupakan enzim yang berperan dalam proses rephkasi DNA. Tiga aktivitas yang umumnya dimiliki oleh enzim ini yaitu polimerase 5'--3', eksonuklease 5'-43' dan eksonuklease 3'-~5', masmg-masmg terletak pada domain yang berbeda. Secara berurut aktMtas polimerase terletak pada domain terminal-C, disusul aktivitas 3'-5' pada domain tengah dan aktivitas 5'-i3' pada domain terminal-N. Informasi mengenai komposisi (unrtan) asam amino pada daerah terminal-C penting untuk studi struktur-fungsi yang berkaitan dengan aktivitas polimerisasi. Untuk mempelajari urutan asam amino di daeah terminal-C telah dilakukan studi homologi daerah tersebut dari berbagai macam enzim DNA polimerase. Berdasarkan informasi urutan asam amino dari "GenBank" terdapat 2 buah daerah unitan lestari, DPNLQNIP dan QVHDELL, yang berjarak ± 200 asam amino pada daerah terminal-C enzim ini. Sepasang primer telah dirancang dan disintesis untuk mengamplifikasi fragmen DNA pada daerah di atas. Dua betas dari 14 sampel DNA mikroba telah berhasil diamplifikasi oleh = pasangan primer FP1-PURI menghasilkan fragmen 0,6 kb. Fragmen ini telah diklon pada vektor pGEM-T dengan set inang Escherichia coli JM 109. Analisis restriksi plasmid rekombinan dari berbagai hansforman menyarankan bahwa plasmid PGEM-T telah mengandung sisipan fragmen DNA. Analisis lebih lanjut dengan cara penentuan urutan nukleotida telah diperoleh semua urutan DNA yang terampffikasi dengan panjang antara 639 hingga 645 pasang basa dan in frame dengan unman DNA polimerase terpublikasi. Analisis inscripto translation dan komparasi unitan asam amino menyarankan bahwa unman asam amino antara dua daerah lestan dan kedua betas sampel rehitif berbeda dan beberapa di antaranya terdapat persamaan. Satu dan 3 asam amino bermuatan negatif yang diduga berperan pentng dalam reaksi polimerisasi dan jugs ditemukan lestari pada daerah te minal-C dari 12 sampel mikroba dalam penelitian ini. Pembandingan dengan data terpublikasi pada daerah yang sama dari organisme lain menyarankan bahwa untuk genus organisme yang sama memiliki pola unman asam amino yang rninp. vii DAFTAR ISI Judul ..................................................................................... Lembar Pengesahan ............................................................... Pedoman Penggunaan Tesis ................................................... Kata Pengantar ...................................................................... Abstrak .................................................................................. Abstract .................................................................................. Daftar Isi ............................................................................... Daftar Ganibar ....................................................................... Daftar Tabel .......................................................................... Daftar Lampiran .................................................................... Daftar Snigkataii .................................................................... Halanian i iii iv v vii Viii ix xi xii xiv Sv BABIPENDAHULUAN I BAB II TINJAUAN PUSTAKA 2.1 DNA Polinierase........................................................ 2.2 Hubungan Struktur-Fungsi DNA Polimerase ............ 2.3 Aktivitas DNA Polimerase......................................... 2.3.1 Aktivitas Eksonuklease 5'-3'........................ 2.3.2 Aktivitas Eksonuklease 3'-5 .......................... 2.3.3 Aktivitas Polimerase ...................................... 2.4 "Polyierase Chain Reaction (PCR)" ......................... 2.4.1 Primer PCR..................................................... 2.4.2 Primer "Degenerated" untuk Aniplifikasi DNA 3 3 6 9 10 12 15 16 16 1S BAB III METODE PENELITIAN 3.1 Peralatan dan Balian ................................................. 3.1.1 Peralatan ........................................................ 3.1.2 Balian ............................................................ 3.1.2.1 Bakteri Termofilik ............................ 3.1.2.2 Bakteri Mesofilik .............................. 3.1.2.3 Plasinid ............................................. 3.1.2.4 DNA Primer ..................................... 3.1.2.5 Zat Kiiiiia ......................................... 3.2 Cara Keija ............................................................... 3.2.1 Isolasi DNA Kromosom ................................. 20 20 20 22 22 22 23 23 24 25 25 ix 3.2.1.1 Metode Wan 1))2 3.2.1.2 Metode Kfjn et al. (1991) ................. 3.2.1.3 Metode Lisis Cepat ........................... 3.2.2 Elektroforesis Gel Agarosa ............................. 3.2.3 "Polymerase Chain Reaction" (PCR) .............. 3.2.4 Pemurnian DNA dari Gel Agarosa dengan Kolom GFX ................................................................ 3.2.5 Ligasi DNA deugan vektor pGEM R -T ............ 3.2.6 Transformasi E. coli dengan DNA Plasmid .... 3.2.7 Isolasi DNA Plasmid Skala Kecil ................... 3.2.8 Isolasi Plasmid deugan Metode "QIA Miniprep Kit" ........................................................................ 3.2.9 Peuiotongan Plasmid deugan Enzlnl Restriksi 3.2.10 Penentuan Urutan Nukleotida Menggunakan "Dye Terminator" ................................................... 3.3 Pencarian data DNA ke GENBANK ......................... 3.4 Pengolahan,Data Nukleotida deugan Program DNAStar BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN 4.1 Fragmeu 0,6 kb Gen DNA polimerase ...................... -4.1.1 Konstntksi Primer........................................... 4.1.1.1 Daerah-daerali asam amino "Cousen~ed" Enzim DNA Polimerase..................... 4.1.1.2 Primer "Degenerated......................... 4.1.1.3 Primer "Undegenerated"................... 4.1.2 DNA Kromosom dari Beberapa Mikroorganisme ........................................................................ 4.1.2.1 DNA Kromosom Hasil Isolasi deugan Metode Wang (1992)........................ 4.1.2.2 DNA KrOLUOSOm Hasil Isolasi deugan Metode Klijn et al. (1992) ................ 4.1.2.3 DNA Kromosom Hasil Isolasi deugan MetodeLisis Cepat............................ 4.1.3 Fragmen -DNA Hasil Amplifikasi .................. 4.1.4 26 27 28 29 29 30 31 31 32 33 34 34 36 36 37 37 38 38 39 42 43 46 47 47 49 Plasmid Rekombinan Hasil Kloning Fragmeu 0,6 kb ........................................................... 54 4.2 Karakteristik Fragmen 0,6 kb ................................... 55 x DAFTAR GAMBAR Halaman Gambar 2.1 Gambar 2.2 Gambar 2.3 Gambar 2.4 Gambar 2.5 Gambar 3.1 Gambar 4.1 Gambar 4.2 Gambar 4.3 Gambar 4.4 Gambar 4.5 Gambar 4.6 Gambar 4.7 "Alignment" unrtan daerah lestari utama faiiiili polimerase ............................................. Usulan keadaan mekanisme transisi dua ion logaui untuk reaksi eksonuklease 3'-5' ............ Domain-domain Enzim DNA polimerase I Escherichia coli ................................................ Substrat pemotongan eksonuklease 5'-3' DNA polimerase ............................................... Mekanisiue interuiediet (keadaan transisi) ion logam divalen pachi reaksi polimerase................. Peta restriksi vektor pGEM-T ............................ Peta daerali lestari enzim DNA polimerase 1. 39 Hasil isolasi DNA kromosom ............................ Foto elektroforesis gel agarosa fragmen DNA liasil PCR .......................................................... Hasil isolasi plasiuid rekombinan secara "uiiniprep Hasil analisis restriksi 12 plasmid rekombinan dengm.enzim Pst I ............................................ Polion filogenetik fragmen DNA polimerase dari 12 saiupel nukroorgaiusme.......................... Polion filogenetik fragmen DNA polimerase dari 35 s~unpel hula-oorgaiusme.......................... xii 7 10 11 14 17 24 48 51 56 58 63 65 BAB I PENDAHULUAN Enzim DNA polimerase merupakan enzim yang secara alami berperan dalam proses replikasi DNA. Proses replikasi ini dapat dilakukan secara in vitro uienggiuiakan enzim tersebut pada teknik DNA rekontbinan. Metode "polytuerase chain reaction" (PCR) dan penentuan unttan nukleotida merupakan dua uietode yang uienggunakan aplikasi dari proses replikasi DNA. Pada beberapa mikroorganisme enzim DNA polimerase diketallui memiliki tiga aktivitas, yaitu aktivitas polimerisasi 5'-3', aktivitas eksonuklease 3'-5', dan aktivitas eksonuklease 5'-3'. Letak domain ketiga aktivitas enzim tersebut secara berunttan adalah eksonuklease 5'-3', eksonuklease 3'-+5' dan polimerase 5'-3'. Keberadaan ketiga aktivitas enzim tersebut pada beberapa enzim DNA polimerase bervariasi, tergantung jenis organisme. Ada yang inentpunyai aktivitas eksonuklease 3'-5', tetapi tidak mentpun)-ai aktivitas 5'-3', ataupun sebaliknya ada yang memiliki aktivitas 5'-3' tetapi tidak memiliki aktivitas 3'-5' (NeNNTon dan Graham, 1994; Mathews dan Van Holde, 1996). Aktivitas polimerase untttmnya dimiliki olelt semtta enzim DNA polimerase. Nanuui demikian kemampuan (laju) polinterisasi dari uiasing-teasing enzim juga berbeda. Perbedaan kentampuan ini mttngkin disebabkan oleh perbedaan kouiposisi asatn amino pada domain polimerase. Hasil studi daerah terminal-C fragmen Klenow, memberi informasi bahwa pada daerah: di atas terdapat motif-motif asam amino yang berperan penting dalam aktivitas polimerase (Joyce dan Steitz, 1 99A ). Adanya data urutan dan komposisi asam amino pada berbagai enzim DNA polimerase lainnya diharapkan dapat membcrikan sumbangan informasi pada studi struktur-fungsi gen DNA polimcrasc, baik yang berkaitan dengan akfvitas polimerase enzim tersebut, ataupun untuk rekayasa gen DNA polimerase lebih lanjut agar memiliki sifat yang lebih diinginkan. Untuk mengetahui urutan dan komposisi asam amino pada daerah term . nal-C telah dilakukan kloning dan penentuar. urutan nukleotida DNA polimerase dari beberapa mikroorganisme. Pendekatan klonina dilakukan dengan menggunakan informassi tentang adanya dua daerah urutan asam amino "conserved" yak u 8 urutan asa«, amino (DPNLQNLP) dan 7 urutan asam amino (QVHDELL) yang berjarak + 200 asam amino, yang terletak pada daerah C-terminal enzim DN?A polimerase. Pada kedua urutan asam amino di atas telah dirancang primer yang diharapkan mampu mengamplifikasi bagian gen yang representatif dari urutan + 200 asam amino. Melalui urutan basa yang teramplifikasi telah dilakukan homologi terhadap daerah terminal-C DNA polimerase.
