STUDI HOMOLOGI DAERAH TERMINAL

STUDI HOMOLOGI DAERAH TERMINAL-C. HASIL
TRANSLASI INSCRIPTO BEBERAPA GEN DNA
POLIMERASE I
TESIS
Oleh
MULYONO
BIDANG KHUSUS BIOKIMIA
PROGRAM STUDI KIMIA
PROGRAM PASCASARJANA
INSTITUT TEKNOLOGI BANDUNG
2000
ABSTRAK
DNA polimerase merupakan enzim yang berperan dalam proses
rephkasi DNA. Tiga aktivitas yang umumnya dimiliki oleh enzim ini
yaitu polimerase 5'--3', eksonuklease 5'-43' dan eksonuklease 3'-~5',
masmg-masmg terletak pada domain yang berbeda. Secara berurut
aktMtas polimerase terletak pada domain terminal-C, disusul aktivitas
3'-5' pada domain tengah dan aktivitas 5'-i3' pada domain
terminal-N. Informasi mengenai komposisi (unrtan) asam amino pada
daerah terminal-C penting untuk studi struktur-fungsi yang berkaitan
dengan aktivitas polimerisasi. Untuk mempelajari urutan asam amino di
daeah terminal-C telah dilakukan studi homologi daerah tersebut dari
berbagai macam enzim DNA polimerase. Berdasarkan informasi urutan
asam amino dari "GenBank" terdapat 2 buah daerah unitan lestari,
DPNLQNIP dan QVHDELL, yang berjarak ± 200 asam amino pada
daerah terminal-C enzim ini. Sepasang primer telah dirancang dan
disintesis untuk mengamplifikasi fragmen DNA pada daerah di atas.
Dua betas dari 14 sampel DNA mikroba telah berhasil diamplifikasi
oleh = pasangan primer FP1-PURI menghasilkan fragmen 0,6 kb.
Fragmen ini telah diklon pada vektor pGEM-T dengan set inang
Escherichia coli JM 109. Analisis restriksi plasmid rekombinan dari
berbagai hansforman menyarankan bahwa plasmid PGEM-T telah
mengandung sisipan fragmen DNA. Analisis lebih lanjut dengan cara
penentuan urutan nukleotida telah diperoleh semua urutan DNA yang
terampffikasi dengan panjang antara 639 hingga 645 pasang basa dan
in frame dengan unman DNA polimerase terpublikasi. Analisis
inscripto translation dan komparasi unitan asam amino menyarankan
bahwa unman asam amino antara dua daerah lestan dan kedua betas
sampel rehitif berbeda dan beberapa di antaranya terdapat persamaan.
Satu dan 3 asam amino bermuatan negatif yang diduga berperan pentng
dalam reaksi polimerisasi dan jugs ditemukan lestari pada daerah
te minal-C dari 12 sampel mikroba dalam penelitian ini. Pembandingan
dengan data terpublikasi pada daerah yang sama dari organisme lain
menyarankan bahwa untuk genus organisme yang sama memiliki pola
unman asam amino yang rninp.
vii
DAFTAR ISI
Judul .....................................................................................
Lembar Pengesahan ...............................................................
Pedoman Penggunaan Tesis ...................................................
Kata Pengantar ......................................................................
Abstrak ..................................................................................
Abstract ..................................................................................
Daftar Isi ...............................................................................
Daftar Ganibar .......................................................................
Daftar Tabel ..........................................................................
Daftar Lampiran ....................................................................
Daftar Snigkataii ....................................................................
Halanian
i
iii
iv
v
vii
Viii
ix
xi
xii
xiv
Sv
BABIPENDAHULUAN
I
BAB II TINJAUAN PUSTAKA
2.1 DNA Polinierase........................................................
2.2 Hubungan Struktur-Fungsi DNA Polimerase ............
2.3 Aktivitas DNA Polimerase.........................................
2.3.1 Aktivitas Eksonuklease 5'-3'........................
2.3.2 Aktivitas Eksonuklease 3'-5 ..........................
2.3.3 Aktivitas Polimerase ......................................
2.4 "Polyierase Chain Reaction (PCR)" .........................
2.4.1 Primer PCR.....................................................
2.4.2 Primer "Degenerated" untuk Aniplifikasi DNA
3
3
6
9
10
12
15
16
16
1S
BAB III METODE PENELITIAN
3.1 Peralatan dan Balian .................................................
3.1.1 Peralatan ........................................................
3.1.2 Balian ............................................................
3.1.2.1 Bakteri Termofilik ............................
3.1.2.2 Bakteri Mesofilik ..............................
3.1.2.3 Plasinid .............................................
3.1.2.4 DNA Primer .....................................
3.1.2.5 Zat Kiiiiia .........................................
3.2 Cara Keija ...............................................................
3.2.1 Isolasi DNA Kromosom .................................
20
20
20
22
22
22
23
23
24
25
25
ix
3.2.1.1 Metode Wan 1))2
3.2.1.2 Metode Kfjn et al. (1991) .................
3.2.1.3 Metode Lisis Cepat ...........................
3.2.2 Elektroforesis Gel Agarosa .............................
3.2.3 "Polymerase Chain Reaction" (PCR) ..............
3.2.4 Pemurnian DNA dari Gel Agarosa dengan Kolom
GFX ................................................................
3.2.5 Ligasi DNA deugan vektor pGEM R -T ............
3.2.6 Transformasi E. coli dengan DNA Plasmid ....
3.2.7 Isolasi DNA Plasmid Skala Kecil ...................
3.2.8 Isolasi Plasmid deugan Metode "QIA Miniprep Kit"
........................................................................
3.2.9 Peuiotongan Plasmid deugan Enzlnl Restriksi
3.2.10 Penentuan Urutan Nukleotida Menggunakan "Dye
Terminator" ...................................................
3.3 Pencarian data DNA ke GENBANK .........................
3.4 Pengolahan,Data Nukleotida deugan Program DNAStar
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Fragmeu 0,6 kb Gen DNA polimerase ......................
-4.1.1 Konstntksi Primer...........................................
4.1.1.1 Daerah-daerali asam amino "Cousen~ed"
Enzim DNA Polimerase.....................
4.1.1.2 Primer "Degenerated.........................
4.1.1.3 Primer "Undegenerated"...................
4.1.2 DNA Kromosom dari Beberapa Mikroorganisme
........................................................................
4.1.2.1 DNA Kromosom Hasil Isolasi deugan
Metode Wang (1992)........................
4.1.2.2 DNA KrOLUOSOm Hasil Isolasi deugan
Metode Klijn et al. (1992) ................
4.1.2.3 DNA Kromosom Hasil Isolasi deugan
MetodeLisis Cepat............................
4.1.3 Fragmen -DNA Hasil Amplifikasi ..................
4.1.4
26
27
28
29
29
30
31
31
32
33
34
34
36
36
37
37
38
38
39
42
43
46
47
47
49
Plasmid Rekombinan Hasil Kloning Fragmeu
0,6 kb ...........................................................
54
4.2 Karakteristik Fragmen 0,6 kb ...................................
55
x
DAFTAR GAMBAR
Halaman
Gambar 2.1
Gambar 2.2
Gambar 2.3
Gambar 2.4
Gambar 2.5
Gambar 3.1
Gambar 4.1
Gambar 4.2
Gambar 4.3
Gambar 4.4
Gambar 4.5
Gambar 4.6
Gambar 4.7
"Alignment" unrtan daerah lestari utama
faiiiili polimerase .............................................
Usulan keadaan mekanisme transisi dua ion
logaui untuk reaksi eksonuklease 3'-5' ............
Domain-domain Enzim DNA polimerase I
Escherichia coli ................................................
Substrat pemotongan eksonuklease 5'-3'
DNA polimerase ...............................................
Mekanisiue interuiediet (keadaan transisi) ion
logam divalen pachi reaksi polimerase.................
Peta restriksi vektor pGEM-T ............................
Peta daerali lestari enzim DNA polimerase 1. 39
Hasil isolasi DNA kromosom ............................
Foto elektroforesis gel agarosa fragmen DNA
liasil PCR ..........................................................
Hasil isolasi plasiuid rekombinan secara "uiiniprep
Hasil analisis restriksi 12 plasmid rekombinan
dengm.enzim Pst I ............................................
Polion filogenetik fragmen DNA polimerase
dari 12 saiupel nukroorgaiusme..........................
Polion filogenetik fragmen DNA polimerase
dari 35 s~unpel hula-oorgaiusme..........................
xii
7
10
11
14
17
24
48
51
56
58
63
65
BAB I
PENDAHULUAN
Enzim DNA polimerase merupakan enzim yang secara alami
berperan dalam proses replikasi DNA. Proses replikasi ini dapat
dilakukan secara in vitro uienggiuiakan enzim tersebut pada teknik
DNA rekontbinan. Metode "polytuerase chain reaction" (PCR) dan
penentuan unttan nukleotida merupakan dua uietode yang uienggunakan aplikasi dari proses replikasi DNA.
Pada beberapa mikroorganisme enzim DNA polimerase diketallui
memiliki tiga aktivitas, yaitu aktivitas polimerisasi 5'-3', aktivitas
eksonuklease 3'-5', dan aktivitas eksonuklease 5'-3'. Letak domain
ketiga aktivitas enzim tersebut secara berunttan adalah eksonuklease
5'-3', eksonuklease 3'-+5' dan polimerase 5'-3'.
Keberadaan ketiga aktivitas enzim tersebut pada beberapa enzim
DNA polimerase bervariasi, tergantung jenis organisme. Ada yang
inentpunyai aktivitas eksonuklease 3'-5', tetapi tidak mentpun)-ai
aktivitas 5'-3', ataupun sebaliknya ada yang memiliki aktivitas 5'-3'
tetapi tidak memiliki aktivitas 3'-5' (NeNNTon dan Graham, 1994;
Mathews dan Van Holde, 1996). Aktivitas polimerase untttmnya
dimiliki olelt semtta enzim DNA polimerase. Nanuui demikian
kemampuan (laju) polinterisasi dari uiasing-teasing enzim juga berbeda.
Perbedaan kentampuan ini mttngkin disebabkan oleh perbedaan
kouiposisi asatn amino pada domain polimerase.
Hasil studi daerah terminal-C fragmen Klenow, memberi
informasi bahwa pada daerah: di atas terdapat motif-motif asam amino
yang berperan penting dalam aktivitas polimerase (Joyce dan Steitz,
1 99A ). Adanya data urutan dan komposisi asam amino pada berbagai
enzim DNA polimerase lainnya diharapkan dapat membcrikan
sumbangan informasi pada studi struktur-fungsi gen DNA polimcrasc,
baik yang berkaitan dengan akfvitas polimerase enzim tersebut, ataupun
untuk rekayasa gen DNA polimerase lebih lanjut agar memiliki sifat
yang lebih diinginkan.
Untuk mengetahui urutan dan komposisi asam amino pada daerah
term . nal-C telah dilakukan kloning dan penentuar. urutan nukleotida
DNA polimerase dari beberapa mikroorganisme. Pendekatan klonina
dilakukan dengan menggunakan informassi tentang adanya dua daerah
urutan asam amino "conserved" yak u 8 urutan asa«, amino
(DPNLQNLP) dan 7 urutan asam amino (QVHDELL) yang berjarak +
200 asam amino, yang terletak pada daerah C-terminal enzim DN?A
polimerase. Pada kedua urutan asam amino di atas telah dirancang
primer yang diharapkan mampu mengamplifikasi bagian gen yang
representatif dari urutan + 200 asam amino. Melalui urutan basa yang
teramplifikasi telah dilakukan homologi terhadap daerah terminal-C
DNA polimerase.