ISOLASI DNA flo - Blog UB

KUMPULAN LAPORAN
PRAKTIKUM BIOTEKNOLOGI
Disusun Oleh:
Nama
: Anatasia
NIM
: 125040200111140
Kelompok : Selasa 09.15-11.00
Asisten
: Nimas Ayu
UNIVERSITAS BRAWIJAYA
FAKULTAS PERTANIAN
PROGRAM STUDI AGROEKOTEKNOLOGI
MALANG
2013
LAPORAN PRAKTIKUM BIOTEKNOLOGI
“ ISOLASI DNA ”
Disusun Oleh:
Nama
: Anatasia
NIM
: 125040200111140
Kelompok : Selasa 09.15-11.00
Asisten
: Nimas Ayu
UNIVERSITAS BRAWIJAYA
FAKULTAS PERTANIAN
PROGRAM STUDI AGROEKOTEKNOLOGI
MALANG
2013
BAB I
PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
DNA dapat diisolasi dari berbagai sel atau
jaringan
baik
hewan,
tumbuhan
maupun
manusia.Isolasi DNA merupakan teknik awal dalam
pemanfaatan
DNA
untuk
berbagai
tujuan.Sebenarnya telah ada metode standar dalam
mengisolasi DNA, misalnya teknik atau metode
yang dikemukakan oleh Sambrook (1989).Isolasi
DNA dari sel maupun jaringan eukariotik, misalnya
dari jaringan tumbuhan maupun hewan dilakukan
melalui
tahap
penghancuran
sel
(lisis),
penghilangan RNA dan protein serta pemurnian
DNA. isolasi DNA ini membutuhkan alat-alat
canggih dan bahan-bahan yang cukup mahal,
misalnya EDTA ( Etilendiamin tetra asetat ) yang
berfungsi sebagai merusak sel dengan cara
mengikat
ion
Magnesium
yang
berfungsi
mempertahankan integritas sel, SDS ( Sodium
dodesil sulfat ) yang dapat melarutkan membrane
sel, mendenaturasi protein, enzim proteinase K
yang mendegradasi protein, RNAse mendegradasi
RNA serta NaCl dan chloroform untuk memurnikan
DNA.
Modifikasi teknik isolasi DNA telah dilakukan
pada beberapa laboratorium, misalnya pada takaran
bahan-bahan yang digunakan atau penguraian/
penggantian jenis bahan yang digunakan sesuai
denga sel/ jaringan sumber DNA.Teknik/ metode
isolasi DNA yang sangat sederhana adalah
metode Kitchen Preparation. Metode isolasi ini
memanfaatkan
bahan-bahan
yang
biasanya
digunakan ibu rumah tangga yaitu sabun cuci (cair,
bubuk atau krim) untuk menggantikan bahan utama
yang berfungsi untuk melisis sel, ekstrak buah
nanas sebagai sumber enzim protease serta garam
dapur.
1.2 Tujuan
1. Untuk mengetahui definisi isolasi DNA
2. Untuk mengetahui macam metode isolasi DNA
3. Untuk mengetahui tahap isolasi DNA
4. Untuk mengetahui manfaat isolasi DNA
1.3 Manfaat
1. Mengetahui definisi isolasi DNA
2. Mengetahui macam metode isolasi DNA
3. Mengetahui tahap isolasi DNA
4. Mengetahui manfaat isolasi DNA
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Definisi Isolasi DNA
 Isolasi DNA merupakan tahap pertama dari
berbagai teknologi analisis DNA yang bertujuan
untuk mendapatkan DNA murni yang dapat
digunakan untuk keperluan pemeriksaan atau
diagnosa. (Aditia, 2010)
 Isolasi DNA merupakan langkah mempelajari
DNA. Salah satu prinsip isolasi DNA yaitu
dengan sentrifugasi. Sentrifugasi merupakan
teknik untuk memisahkan campuran berdasarkan
berat molekul komponennya. Molekul yang
mempunyai berat molekul besarakan berada di
bagian bawah tabung dan molekul ringan akan
berada pada bagian atas tabung.(Jusuf, M, 2001)
 DNA isolation is a routine procedure to collect
DNA for subsequent molecular or forensic
analysis.
(Isolasi DNA adalah prosedur rutin untuk
mengumpulkan DNA untuk analisis molekuler
atau forensik berikutnya)(Doyle, 1987)
2.2 Macam Metode Isolasi DNA
Isolasi DNA menggunakan metode isolasi
Karsinah et al.(2002) yang telah dimodifikasi dengan
langkah kerja sebagai berikut :
1. Tabung eppendorf diisi dengan 1 ml buffer
ekstraksi CTAB (CTAB 3%, NaCl 1,4 M, EDTA
0,002M dan Tris-HCl 0,1M) dan 5 μl
mercaptoethanol.
2. Daun Bawang merah disterilisasi dengan alkohol
dan ditimbang 0,5 gram.
3. 0,5 gram daun bawang merah digerus dalam
mortar dengan bantuan nitrogen cair dan
ditambah PVP 10 mg, kemudian dimasukkan
kedalam eppendorf yang sudah berisi 1 ml buffer
ekstraksi CTAB dan 5 μl mercaptoethanol.
Setelah itu ekstrak daun divortex hingga
homogen.
4. Ekstrak daun diinkubasi dalam suhu 65ºC
selama 30 menit sambil dibolak-balik tiap 10
menit. Kemudian ditambahkan 700 μl Chloroform
: Isoamylalcohol/CHISAM (24:1). Setelah itu
ekstrak daun divortex hingga homogen.
5. Ekstrak daun kemudian disentrifugasi selama 10
menit dengan kecepatan 6000 rpm. Supernatan
dimasukkan tabung baru dan ditambahkan 700 μl
CHISAM.
6. Larutan supernatan dan CHISAM disentrifugasi
selama 10 menit dengan kecepatan 6000 rpm.
Fase atas dimasukkan tabung baru ditambah
isopropanol dingin. Larutan tersebut dibolak-balik
perlahan hingga tampak benang-benang putih
dalam larutan. Larutan diinkubasi dalam freezer
selama 30 menit.
7. Setelah diinkubasi, larutan disentrifugasi selama
10 menit dengan kecepatan 6000 rpm setelah itu
supernatan dibuang dengan hati-hati agar
endapan DNA pellet tidak ikut terbuang.
8. Endapan DNA pellet dicuci dengan buffer
pencuci dengan cara menambahkan 200 μl
buffer pencuci ke dalam tube, kemudian cairan di
buang. Pencucian ini dilakukan 2 kali. Setelah itu
endapan DNA pellet dikering anginkan.
9. Endapan DNA kemudian diresuspensi dengan
500 μl buffer TE lalu ditambah 1 μl RNAse.
10. Larutan DNA yang sudah ditambah RNAse
diinkubasi selama 30 menit pada Suhu 37ºC.
11. Setelah larutan DNA diinkubasi, ditambahkan 1
ml ethanol absolute dingin dan dibolak-balik
perlahan.
12. Larutan DNA lalu diinkubasi pada freezer selama
30 menit.
13. Setelah inkubasi selesai kemudian disentrifugasi
selama 10 menit pada kecepatan 6000 rpm.
Pelet kemudian dikering anginkan.
14. Pelet diresuspensi dengan 100 μl buffer TE dan
disimpan dalam lemari es. (Puspita, 2010)
2.3 Tahap Isolasi DNA
a. Perusakan dinding sel
Penggunaan nitrogen cair
b. Lisis membran sel
Penggunaan detergen kationik (CTAB)
c. Pemurnian
Beberapa kontaminan seperti senyawa sekunder
(fenol) polisakarida, RNA,dan protein
d. Presipitasi
Penggumpalan DNA menggunakan isopropanol
dingin (Puspita, 2010)
2.4 Manfaat Isolasi DNA
 Visualisasi DNA dengan elektroforesis gel.




Peninjauan pola fragmen DNA hasil pemotongan
secara enzimatik melalui teknik Hibridisasi
Southern
Isolasi DNA genomik dalam rangka pembuatan
pustaka genomik.
Isolasi plasmid atau DNA fage dalam prosedur
rutin peminakan DNA
Isolasi DNA yang diperlukan sebagai cetakan
(template) dalam prosedur perbanyakan DNA
secara in vitro melalui teknik PCR (Puspita,
2010).
BAB III
METODOLOGI
3.1 Alat dan Bahan (beserta fungsi)
Alat
1. Sarung latex : untuk melindungi tangan saat
praktikum
2. Timbangan
: untuk menimbang bahan
3. Mangkuk
: wadah tempat meletakan
bahan
4. Mortar
: wadah menghaluskan bahan
5. Pestle
: alat untuk menghaluskan
bahan
6. Tube 1,5ml
:
wadah/tabung
unutk
pengamatan
7. Pipet Pasteur : untuk mengambil bahan cair
8. Mikropipet
: untuk mengambil bahan cair
9. Vortex
: untuk menghomogenkan
campuran
10. Inkubator(freezer) :
untuk
menginkubasi
bahan pengamatan
11. Sentrifuge
: untuk menghomogenkan
larutan
Bahan
1. Daun sawi hijau, daun belimbing , dan dun
bayam : sebagai bahan praktikum
2. Nitrogen cair :
membantu
proses
penggerusan
3. PVP
: memisahkan fase organic &
fenol
4. CTAB
: melisis membran sel
5. CHISAM (chloroform isoamil alcohol) : untuk
mengurangi kontaminasi protein
6. Betha-Mertacaptoethanol : menghilangkan
kontaminan polisakarida
7. Isopropanol dingin: untuk presipitasi
8. Buffer pencuci : untuk mencuci DNA
9. TE buffer
: sebagai penyangga
10. Enzim RNAse : mengurangi kontaminan
RNA
3.2 Langkah Kerja
+buffer ekstrasi
CTAB 1ml
+N2 cair & PVP 0,1
-1980 C
Timbang daun 0,1gr
CT
Klorofor : isoamialkohol
24
:
1
β-mercoptoetanol5µl
inkubasi 650 C, 30’
500µl chisam
Sentrifuge 6-8x103 RPm 10’
Ambil super natan
Sentrifuge 6-8x103 RPm 10’+chisam 0,5
Ambil super natan
+Isopropanol 1x volume (diputar pelan-pelan)
Inkubasi frezer 15’
Sentrifuge (13000 rpm)
Buffer pencuci 2x(500 µl)
Resuspensi TE buffer 200 µl
RNAse 1 µl
Inkubasi 650C 10’
+ etanol dingin
Simpan di frezer
3.3 Analisa Perlakuan
Pertama – tama, yang merupakan langkah awal
praktikum adalah menimbang daun 0,1 gr, kemudian
gerus tambahkan nitrogen cair dan PVP untuk
memudahkan penggerusan. Kemudian tambahkan
buffer CTAB 1 ml, fungsinya untuk melisis membran
sel. Setelah itu tambahkan 500 µl CHISAM untuk
mengurangi kontaminan protein. Tambahkan Bethamercaptoetanol 5 µl, fungsinya untuk menghilangkan
kontaminasi polisakarida. Inkubasi 650C selama 10’.
Kemudian sentrifuge 13.000 rpm selama 5 menit.
Ambil supernatan, tambah 0,5 ml CHISAM. Kemudian
sentrifuge 13.000 rpm, 5 menit. Ambil supernatannya
tambahkan isopropanol dingin 1*volume, inkubasi
freezer 10 menit. Sentrifuse 10000 rpm, 5 menit.
Ambil pellet dan buang supernatan. Tambah 500 µl
buffer pencuci 2x (500 ml) kering anginkan dan balik
ditas tissue. Resuspensi 50-100 µl buffer TE.
Kemudian tambah 1 µl RNAse, inkubasi 65oC, 10
menit. Tambahkan etanol dingin. Simpan dalam
frezeer.
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Hasil
DNA
HASIL
Sawi hijau
belimbing
bayam
4.2 Pembahasan
Zubaidah (2004) menyatakan bahwa isolasi DNA
dapat dilakukan dengan berbagai cara, akan tetapi
pada setiap jenis maupun bagian tanaman dapat
menimbulkan masalah berbeda, antara lain karena
adanya senyawa polifenol dan polisakarida dalam
konsentrasi tinggi yang dapat menghambat
pemurnian DNA dan juga mempengaruhi enzimenzim seperti polimerase, ligase, endonuklease
restriksi, atau enzim untuk kegiatan molekuler lain
yang dapat menyebabkan DNA tidak dapat
digunakan untuk aplikasi penelitian. Proses
ekstraksi DNA dari sel adalah langkah pertama
dalam prosedur pemisahan DNA dari substansi lain
yang tidak dionginkan dengansangat hati-hati
sehingga tidak menyebabkan kerusakan DNA.
Dan menurut (Subandiyah 2006) ekstraksi DNA
menggunakan nitrogen cair untuk melisis dinding sel
dapat mengeluarkan semua isi sel yang kemudian
ditampung dalam larutan penyangga yang berisi Tris
HCl dan EDTA. Dinding sel juga dapat dipecahkan
dengan penggerusan menggunakan bufer ekstraksi
diikuti dengan penghangatan pada suhu 65°C.
Detergen seperti sodium dodecil sulfat (SDS),
sarkosil, dan CTAB dapat digunakan untuk proses
lisis.
BAB V
PENUTUP
5.1 Kesimpulan
Proses panjang yang dilakukan adalah untuk
memisahkan DNA murni dari segala macam seperti
protein dan senyawa lainnya. Dan pada pratikum
kali ini hanya terlihat sedikit DNA murni nya pada
percobaan kami, hasil ini dipengaruhi oleh berbagai
hal seperti bahan-bahan yang kurang steril,
bahannya hanya mengandung sedikit DNA murni
,atau dalam proses pengerjaan yang kurang teliti
namun dari pratikum kali ini dapat dimengerti
bagaimana cara untuk mendapatkan DNA murni.
5.2 Saran
5.2.1 Kritik dan saran untuk praktikum tahun
depan
sebaiknya praktikum bioteknologi pertanian
lebih di perhatikan lagi, di buatkan jadwaljadwal yang sekiranya cukup untuk melakukan
praktikum untuk semua materi, tidak praktikum
cuman 2 kali, tapi langsung UAP.
Untuk asisten
Terimakasih untuk bimbingannya, mohon
maaf apabila kami kurang mengikuti arahan
dengan baik semoga dapat bermanfaat
terimakasih.
DAFTAR PUSTAKA
Aditia.2010.IsolasiDNA.http://sharkestaditia.blogspot.co
m
/2010/03/isolasiDNA.html
Diakses
01
Desember 2012
Doyle, J.J. and J.L. Doyle. 1987. A rapid DNA isolation
procedure
for small quantities of fresh leaf tissue.
Phytochem. Bull. 19: 11-15.
Jamilah. 2005. Pengaruh Berbagai Macam Detergen,
Penambahan Enzim, dan Ekstrak Nanas
(Ananas comusus (L) Merr) Terhadap Hasil
Isolasi DNA Berbagai Macam Buah Sebagai
Topik Praktikum Matakuliah Genetika. Skripsi
tidak diterbitkan. Malang: Universitas Negeri
Malang.
Jusuf M. 2001. Genetika 1 Struktur dan ekspresi
Gen. Bogor : Sagung Seto.
Puspita, 2010. Tahapan Isolasi DNA. http://puspitt
.multiply.com
/journal/item/14/ISOLASI-DNA?
&show_interstitia l=1 &u=%2Fjournal%2Fitem.
Diakses tanggal 01 Desemb- er 2012
Subandiyah, S. 2006. Polymerase Chain Reaction untuk
Deteksi atau Identifikasi Patogen Tumbuhan.
Beberapa Metode Ekstraksi DNA. Pelatihan dan
Workshop Identifikasi DNA dengan Aplikasi PCR.
Malang. hlm. 43-50
Zubaidah, 2004.Isolasi dan karakterisasi Gen Perbaikan
DNA
Baru
pada
Bakteri
Radioresisten
Deinococcus radiodurans.Prosiding Seminar
Nasional Sains dan Teknik Nuklir, Bandung, Juni
2004.