ISOLASI DAN UJI RESISTENSI ANTIBIOTIK BAKTERI RESISTENSI
advertisement
ISOLASI DAN UJI RESISTENSI ANTIBIOTIK BAKTERI RESISTENSI MERKURI (Hg) DARI KAWASAN PANTAI LOSARI MAKASSAR Ririn Dwi Ayu S, S.Si Jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Hasanuddin, Makassar ABSTRAK Dilingkungan ditemukan beberapa bakteri yang resisten terhadap logam berat merkuri juga dapat resisten terhadap beberapa antibiotik. Penelitian ini bertujuan untuk mengisolasi bakteri dari perairan laut Pantai Losari, Makassar yang memiliki daya resistensi bakteri terhadap logam berat merkuri (Hg) dan resisten terhadap beberapa jenis antibiotik yang digunakan masyarakat pada umumnya. Pengisolasian bakteri dilakukan dari sampel air laut Pantai Losari menggunakan media Nutrien Agar Air Laut Sintetik (NA ALS) yang ditambahkan HgCl dengan tingkat konsentrasi 0,0002mg/ml (0,02µg/ml). Selanjutnya isolat bakteri dilakukan uji resisten antibiotik menggunakan paper disk antibiotik (Oxoid) meliputi Ampicillin 10µg, Novobiocyn 30µg, Chloramphenicol 30µg, Cefoperazone 75µg dan Ofloxacin 5µg. Ada tiga jenis isolat yang resisten merkuri (Hg) dan antibiotic yang diperoleh yaitu: isolat RmI yang juga resisten terhadap Ofloxacin 5µg, isolat RmII yang resisten terhadap Ampicillin 10µg dan isolat RmIII yang resisten terhadap semua jenis antibiotik. Kata kunci : Merkuri, Bakteri resisten Hg, Bakteri resisten antibiotik, Pantai Losari. ABSTRACT In the environment discovered some bacteria who resistant to heavy metal mercury and resistant to some antibiotic too. This studied aims to isolation the bacteria from sea water of losari beach in Makassar who had the bacteria resistant power to heavy metal mercury (Hg) and resistant to some types of antibiotics that used by public. Isolation of bacteria carried from seawater samples in losari beach by used medium Nutrient Agar for Synthetic Sea Water added with 0.0002 mg/ml (0.02 ug/ml) HgCl concentration. Furthermore, isolates were tasting to antibiotic used paper disc antibiotics (Oxoid) include 10μg Ampicillin, 30μg Novobiocyn, 30μg Chloramphenicol, 75μg Cefoperazone and 5μg Ofloxacin. There are three types isolates who resistant to mercury (Hg) and antibiotics be obtained, that is : RmI isolate also resistant to 5μg Ofloxacin too, RmII isolate also resistant to 10μg Ampicillin and RmIII isolate resistant to all types antibiotic. Keywords: Mercury, Hg-resistant bacteria, Antibiotic-resistant bacteria, Losari Beach. mikroorganisme PENDAHULUAN Perkembangan industri di daerah mempertahankan yang dirinya mampu dari pencemaran Makassar dan sekitarnya saat ini cukup pesat. merkuri (Hg) di perairan laut pantai losari, Peningkatan jumlah sangatlah memberikan dampak positif bagi industri ini akan selalu diikuti oleh pertambahan jumlah limbah, baik kekayaan alam di sekitarnya. berupa limbah padat, cair maupun gas. Salah satu dari limbah tersebut adalah logam berat. Merkuri (Hg) atau air raksa adalah Masyarakat Makassar saat ini banyak memanfaatkan perairan laut menjadikannya obyek wisata untuk dan logam yang ada secara alami, merupakan satu- memanfaatkan hasil sumber daya alam laut satunya logam yang pada suhu kamar berwujud untuk cair. Logam murninya berwarna keperakan, kemungkinan terjadi proses secara langsung cairan Bila yaitu dengan tertelannya air laut juga proses dipanaskan sampai suhu 3570C, Hg akan tidak langsung masuknya bakteri resisten menguap (Danahouses, 2009). merkuri kedalam tubuh manusia. Hal ini tak berbau dan mengkilap. Limbah merkuri dari para pengrajin dikonsumsi, kesehatan merupakan pengobatan sumber meningkatnya tidak menutup merupakan sesuatu yang membahayakan bagi emas di kawasan pantai losari Makassar sebagai dan manusia, dengan maka dilakukanlah pemberian beberapa pencemaran merkuri. Limbah air merkuri antibiotik. Namun, apabila mikroorganisme tersebut langsung dibuang melalui gorong- juga memiliki suatu senyawa yang resisten gorong dan mengalir ke pantai losari sehingga terhadap antibiotik maka organisme yang kadar merkuri bercampur dengan air laut. terinfeksi dari keberadaan pencemaran merkuri Jejeran berlokasi (Hg) di laut yang merupakan konsumsi sehari- bersebelahan dengan pantai losari. Pencemaran hari bagi masyarakat memiliki dampak yang di pantai losari saat ini sudah memasuki tahap negatif bagi kesehatan manusia itu sendiri, yang mengkhawatirkan. Dikatakan oleh Silver yaitu akan terjadi gangguan kesehatan dari dan manusia itu sendiri dikarenakan kegagalan toko emas saat ini Phung (1998) Salah satu usaha untuk detoksifikasi menggunakan merkuri dapat mikroorgansime dilakukan resisten pengobatan akibat keberadaan bakteri resisten merkuri (Hg) yang juga resisten antibiotik. merkuri. Bakteri resisten merkuri merupakan Bahaya resistensi antibiotika merupakan bakteri yang mempunyai gen resisten merkuri salah satu masalah yang dapat mengancam mer operon untuk bertahan pada lingkungan kesehatan yang bakteri saat ini menjadi lebih kuat dan kurang mengandung merkuri. Keberadaan masyarakat. Hampir semua jenis responsif terhadap pengobatan antibiotika biarkan cairan mengalir ke atas permukaan sehingga akan mengancam masyarakat dengan media Nutrien Agar (NA) yang mengandung hadirnya jenis penyakit infeksi baru yang lebih HgCl, sulit untuk diobati dan lebih mahal juga biaya menggunakan hockey stick. Media yang telah pengobatannya (Medicastore, 2010). terisi sampel diinkubasi dalam inkubator 72 kemudian diratakan dengan penelitian jam dengan suhu ruang (30oC) hingga terjadi mengenai bakteri yang tahan atau resisten pertumbuhan. Koloni bakteri yang tumbuh terhadap merupakan Untuk itu dilakukan kandungan merkuri (Hg) yang mikroorganisme diisolasi dari kawasan pantai losari Makassar, mereduksi merkuri (Hg). kemudian di ujikan kepada beberapa jenis 3. Uji Resistensi Antibiotik yang mampu antibiotik untuk mengetahui keberadaan bakteri Uji resisten antibiotik dilakukan dengan pereduksi merkuri (Hg) yang resisten juga menginokulasi bakteri resisten merkuri pada terhadap antibiotik yang merupakan bahan obat media seleksi padat Nutrien Agar (NA). Kertas yang disk antibiotik dengan konsentrasi standar dikonsumsi oleh masyarakat pada umumnya. antibiotik diletakkan menggunakan pinset steril Tujuan dari penelitian ini adalah isolasi pada permukaan media Nutrien Agar (NA) dan karakterisasi bakteri pereduksi merkuri yang sudah diinokulasikan bakteri, kertas disk yang resisten antibiotik dari kawasan pantai antibiotik diatur jaraknya agar tidak terlalu losari Makassar. rapat lalu diinkubasi selama 24 jam dalam inkubator, setelah itu diamati perubahan yang METODE terjadi dan diukur zona beningnya dengan 1. Pengambilan Sampel menggunakan jangka sorong. Pengambilan sampel air laut dilakukan 4. Karakterisasi Bakteri pada permukaan air laut sekitar pantai losari Pemeriksaan makroskopis koloni dinilai Makassar. Sampel air laut ini dimasukkan dari bentuk (punctiform, irregular, filamentous, kedalam botol yang telah disterilkan, kemudian atau rhizoid), elevasi (flat, raised, atau convex), disimpan pada suhu 4oC atau suhu lemari es. karakteristik optis (warna, opak, translusen, 2. Isolasi Bakteri atau transparan) dan permukaan (halus atau Bakteri diisolasi melalui teknik pengenceran bertingkat dan penanaman dengan kasar). Pewarnaan gram, isolat bakteri resisten metode tabur. Kultur hasil pengenceran diambil merkuri dioles pada kaca slide dan dengan memipet sebanyak 0,1 ml cairan dan ditambahkan 1 tetes kristal violet, 1 tetes Gram’s iodine mordant (Emerck), etil alkohol Sitrat 95% sampai kristal violet tidak larut lagi dan Dihidrogen Phosphat sebagai sumber nitrogen , safranin kemudian dikeringkan dan diperiksa dan indikator Brom Thymol Blue. Kemudian dengan mikroskop. diinkubasi dan tes positif ditandai dengan Tes pembentukan indol dilakukan dengan menginokulasi bakteri resisten ke sebagai sumber karbon, Amonium terbentuknya warna biru. Tes urease dilakukan dengan water pepton pada temperatur 300C menginokulasi bakteri resisten ke media padat selanjutnya ditambah 0,5 mL Kovac’s reagent urea Christensen, tes positif ditandai dengan (Emerck). terbentuknya warna merah. media Tes positif ditandai dengan terbentuknya warna merah. Tes Hasil tes H2S dapat juga digunakan substrat fermentasi glukosa karbohidrat dilakukan dengan dengan untuk tes motilitas. Tes ini dapat diamati menginokulasi bakteri resisten ke 50 mL media dengan kasat mata, yaitu bakteri motil ditandai pepton water (Kia Difco) yang mengandung 0,5 dengan bentuk koloni yang lebih besar dan mL bromthymol blue 0,4% dan glukosa 1%, keruh jika dibandingkan dengan koloni tidak diinkubasi 24-48 jam pada temperatur 300C. motil. Tes positif ditandai dengan terbentuk warna Tes produksi H2S dilakukan dengan kuning dan tes negatif ditandai dengan warna menginokulasi bakteri resisten ke media SIM biru. Hal yang sama dilakukan juga untuk tes (pepton 30 g/L, beef extract 3 g/L, fero fermentasi karbohidrat dengan substrat laktosa, amonium sulfat 0,2 g/L dan natrium tiosulfat maltosa dan sakarosa. Konsentrasi substrat 0,025 g/L, agar 3 g/L). Tes positif ditandai yang digunakan adalah laktosa 0,5%, maltosa dengan terbentuknya endapan hitam. 1%, dan sakarosa 2%. Pengujian katalase, diambil sedikit biakan bakteri dengan menggunakan jarum ose. HASIL DAN PEMBAHASAN Disuspensikan biakan tersebut pada setetes 1. Isolasi Bakteri Resisten Merkuri larutan H2O2 3% pada gelas objek. Diamati Media seleksi yang digunakan dalam segera apakah timbul gelembung-gelembung penelitian ini merupakan media Nutrient Agar gas sampai jangka waktu 5 menit setelah (NA) dengan menggunakan Air Laut Sintetik pencampuran dengan H2O2 3%. (ALS) sebagai pelarutnya. Tes penggunaan sitrat dilakukan dengan menginokulasi bakteri resisten ke media Simmon’s citrate agar yang berisi Natrium Pengisolasian bakteri ini dengan menggunakan metode tabur dari pengenceran bertingkat 10-1 sampai 10-3. Kemudian menumbuhkan bakteri tersebut kedalam Berdasarkan pada gambar 1, hasil beberapa Nutrien Agar Air Laut Sintetik (NA inokulasi menunjukkan pada isolat Rm II ALS) menggunakan konsentrasi merkuri (Hg) terjadi pertumbuhan yang lebih cepat daripada yang ; isolat Rm I, dan isolat Rm I pertumbuhannya 0,0008mg/ml; 0,0006mg/ml; 0,0004mg/ml; dan lebih cepat daripada isolat Rm III. Hal ini 0,0002mg/ml hal ini bertujuan untuk melihat menunjukkan bahwa bakteri pada isolat Rm II konsetrasi kemampuan bakteri dapat tumbuh. yang tumbuh pada media seleksi diduga adalah berbeda-beda, yaitu 0,001mg/ml Dari proses penginokulasian ini, bakteri bakteri resisten merkuri dengan tingkat laut hanya dapat tumbuh pada Nutrien Agar ketahanan merkuri yang tinggi. Selanjutnya Air Laut Sintetik (NA ALS) yang ditambahkan Smith et al (1998) menambahkan bahwa 0,0002mg/ml (0,02µg/ml) atau setara dengan perbedaan resistensi ini berhubungan dengan 0,02mg/100ml. kemudian Bakteri dimurnikan yang tumbuh, mekanisme respon populasi bakteri terhadap kembali kedalam merkuri. Ada tiga mekanisme respon terhadap beberapa media Nutrien Agar Air Laut Sintetik stres merkuri. Pertama, (NA ALS) dengan konsentrasi Hg yang sama. menghambat Dari hasil inokulasi maka diperolehlah tiga pertumbuhan sel lambat atau sel mati. Kedua, jenis isolat bakteri resisten merkuri (RmI, menginduksi sistem operon resisten merkuri RmII, dan RmIII) yang diambil dari kawasan untuk bekerja sehingga sel tetap hidup dalam pantai losari Makassar yang terlihat pada kondisi stres. Ketiga, adanya plasmid yang Gambar 1. mengandung gen resisten merkuri yang masuk metabolisme dengan sel cara sehingga ke dalam sel. Kultur bakteri pada isolat Rm I dan isolat Rm III menunjukkan resistensi merkuri yang lebih rendah dibandingkan dengan Rm II. Kemungkinan kultur pada isolat Rm I dan isolat Rm III memiliki respon dengan cara pertama yaitu menghambat metabolisme sel sehingga terjadi pertumbuhan yang lambat, sedangkan isolat Rm II diduga mengandung gen resisten merkuri spektrum sempit dimana mer penentu resisten hanya terjadi pada garam Gambar 1. Isolat bakteri resisten merkuri. A : Isolat Rm I , B: Isolat Rm II ,C : Isolat Rm III merkuri organik saja dan berbeda dengan mer penentu resisten merkuri spectrum luas yang sebagian besar bakteri gram positif dan gram resisten negatif aerob (Dexa Medica,2009) . terhadap methylmercury organomercurials dan seperti phenylmercury, serta garam merkuri anorganik (Misra, 1992; Silver dan Phung, 1998; Bogdanova et al, 1998). 2. Uji Resistensi Antibiotik Bakteri resisten merkuri yang telah tumbuh kemudian disuspensikan menggunakan natrium klorida 0,9%, kemudian dengan menggunakan swab steril melalui metode gores dipindahkan ke Nutrien Agar Air Laut Sintetik (NA ALS) yang baru dan diletakkanlah paper disk antibiotik kedokteran yang (Oxoid) telah menurut ditetapkan, standar yaitu Ampicillin 10µg yang aktif melawan bakteri gram positif dan gram Gambar 2. Hasil uji daya hambat bakteri resisten merkuri. A : Isolat Rm I , B: Isolat Rm II ,C : Isolat Rm III Tabel 1. Hasil Uji Resistensi Antibiotik Bakteri Resisten Merkuri (Hg) negatif (Hexpharmjaya,2012), Novobiocyn 30µg yang ISOLAT aktif melawan bakteri gram positif (Pojok-Vet, RmI RmII RmIII 2011), Chloramphenicol 30µg yang merupakan antibiotik spektrum luas untuk gram negatif dan gram positif (British National Formulary, 2009), Cefoperazone 75µg terhadap gram Ket : Ofl 5µg + + RESISTENSI Chl Nov Cef 30µg 30µg 75µg + + + Am 10µg + + Ofl : ofloxacin, Chl : chloramphenicol, Nov : novobiocyn, Cef : cefoperazone, Amp : ampicillin, (+) : resisten terhadap antibiotik, (-) : sensitif terhadap antibiotik. negatif dan β-laktamase yang lebih kuat (Blog Kesehatan, 2012) dan Ofloxacin 5µg yang aktif melawan sebagian besar bakteri gram positif dan gram negatif aerob (Dexa Medica, 2009). Berdasarkan pada hasil uji resisten antibiotik yang ditunjukkan dalam Gambar 2 dan Tabel 1, pengujian menunjukkan bahwa pada isolat Rm I memiliki sifat resistensinya terhadap Ofloxacin 5µg yang aktif melawan Pada isolat Rm II menunjukkan sifat resistennya terhadap Amphicillin 10µg yang aktif melawan bakteri gram negatif karena lebih hidrofilik sehingga mampu menembus pori dinding bakteri dan aktif pula melawan bakteri gram positif yang tidak menghasilkan βlaktamase (Farmasiku, 2012). Sedangkan pada isolat Rm III, koloni memiliki sifat atau kemampuan untuk menahan efek antibiotika. Hal ini menunjukkan bahwa bakteri dapat merubah diri sedemikian rupa sehingga dapat Maka didapatkan hasil pengamatan pewarnaan mengurangi efektifitas dari suatu obat, bahan gram yang terlihat pada Tabel 3. kimia ataupun zat lain. Akibatnya bakteri Menurut Kathiresan dan Bingham tersebut tetap dapat bertahan hidup dan (2001) menyatakan bahwa hampir semua bereproduksi sehingga makin membahayakan. bakteri laut bersifat gram negatif dan ukurannya lebih kecil dibanding dengan bakteri 3. Karakterisasi Bakteri Pemeriksaan dengan sifat kasar atau non laut. Bakteri gram positif hanya sekitar makroskopis adalah pemeriksaan yang dapat 10% dari total populasi bakteri laut dan diketahui secara jelas melalui panca indera, proporsi terbesar terdiri atas bakteri gram baik dengan penglihatan, negatif berbentuk batang, yang umumnya penciuman dan sebagainya secara langsung tanpa aktivitas gerakan dilakukan dengan bantuan flagel. Bakteri bentuk kokus umumnya Tabel 2. Hasil Pemeriksaan Makroskopis RmI Bulat Putih kehitaman Tidak Cembung Licin Cembung Bentuk Warna Elevasi Permukaan Tepi RmII Tidak beraturan Kuning Cembung Licin Berlekuk RmIII Bulat Putih Cembung Kasar Cembung Tabel 3. Pewarnaan Gram Isolat RmI RmII RmIII Hasil Basil, Gram positif ( + ) Cocobacillus, Gram negatif ( - ) Basil, Gram positif ( + ) menggunakan alat bantu. Dari pengisolasian lebih bakteri tersebut didapatkan data seperti yang Keberadaan bakteri laut gram positif terbanyak terlihat pada Tabel 2. ditemukan pada sedimen. Sedangkan pemeriksaan struktural atau mikroskopis dibanding bentuk batang. Dari hasil pewarnaan dan pengambilan yang sampel, isolat RmI merupakan gram positf dilakukan dengan menggunakan alat bantu, dimana koloni yang nampak berbentuk batang dalam dengan ukuran yang kecil, pada isolat RmII hal merupakan pemeriksaan sedikit ini dilakukan pengamatan menggunakan mikroskop dengan perbesaran koloni nampak bulat tapi tidak bulat 100x menggunakan bantuan minyak emersi. sepenuhnya oleh sebab itu dikatakan sebagai cocobacillus dan merupakan gram negatif, Tabel 4. Uji Fisiologis RmI + + + - Katalase H2S Sitrat Urea Motilitas Indol Sukrosa Glukosa Maltosa Laktosa sedangkan pada isolat RmIII koloni merupakan gram positif RmII + + + + + - RmIII + + - c. Uji Sitrat nampak Uji Sitrat ini bertujuan untuk berbentuk batang dengan ukuran yang mengetahui kemampuan bakteri dalam lebih tebal dan besar dibandingkan menguraikan sitrat. Dari ketiga dengan isolat RmI. yang diuji, semuanya menunjukkan hasil a. Uji Katalase negatif dimana tidak terjadi perubahan Hasil uji katalase yang dilakukan pada semua isolat yang ditumbuhkan isolat warna media dari hijau menjadi biru. d. Uji Urease pada media Nutrien Agar menunjukkan Uji urease bertujuan untuk semua isolat memiliki hasil yang positif, mengetahui kemampuan mikroorganisme dimana terdapat pembentukan gelembung dalam gas. menghasilkan Hal ini menunjukkan bakteri mendegradasi enzim urea atau urease. Enzim memiliki enzim Katalase yang berfungsi urease merupakan enzim hidrolisis yang menguraikan H2O2 yang ditambahkan ke memecah ikatan nitrogen dan karbon koloni bakteri menjadi H2O dan O2. pada komponen amida seperti urea dan b. Uji H2S membentuk amonia yang menciptakaan Pada uji H2S dengan suasana basa (Cappuccino dan Sherman menggunakan media TSIA ( Triple Sugar 1983). Dari ke tiga isolat yan diuji, isolat Iron Agar), didapatkan hasil negatif pada I (Rm I, Rma I) dan isolat III (Rm III, semua isolat dimana tidak terbentuk Rma III) yang menunjukkan reaksi endapan berwarna hitam pada dasar (butt) terhadap urease. Kesamaan dari isolat ini dari media. yaitu berbentuk basil. e. Uji Motilitas Kebanyakan Hasil pengujian pada ketiga isolat, memperoleh mikroorganisme energi melalui reaksi isolat RmI dan isolat RmII menunjukkan enzimatis yang memacu bioksidasi dari hasil substrat, yang positif menunjukkan yaitu pertumbuhan bakteri terutama karbohidrat menyebar (Cappuccino dan Sherman 1983). Dari baik disekitar tempat penusukan. Koloni ketiga isolat yang diuji, isolat RmI dan yang terbentuk pada media agar datar isolat RmIII yang menunjukkan reaksi adalah yang sama yaitu respon negatif, tidak berwarna putih keruh dan menyebar sampai ke permukaan media. dapat Sedangkan isolat RmIII menunjukkan maltosa, glukosa dan laktosa. Pada isolat hasil tidak RmII menunjukkan respon yang sama yang dengan isolat RmI dan RmIII yaitu menyebar dan hanya bertumbuh lurus di respon negatif hanya terhadap laktosa daerah penusukan. sedangkan terhadap sukrosa, maltosa dan f. Uji Indol glukosa negatif dimana menunjukkan bakteri pertumbuhan memfermentasikan menunjukkan respon sukrosa, positif Hasil yang didapatkan pada uji ditandai dengan terbentuknya perubahan indol menunjukkan bahwa semua isolat warna dari merah menjadi kuning pada memberikan hasil yang negatif, yaitu media uji. tidak terbentuk cincin berwarna merah di permukaan media setelah diberikan 5 KESIMPULAN tetes reagen kovac’s dan dibiarkan selama Diperoleh tiga isolat bakteri 10 menit. Hal ini menunjukkan bahwa (RmI, RmII dan RmIII) yang memiliki bakteri tidak triptofanase yang mengandung enzim dua sifat keunggulan yaitu tahan terhadap merupakan katalis logam berat merkuri (Hg) dengan pengurai gugus indol yang terkandung konsentrasi 0,002mg/100ml dan juga dalam asam amino triptofan. tahan terhadap beberapa jenis antibiotik g. Uji Fermentasi Karbohidrat dari kawasan pantai losari, Makassar, Uji fermentasi karbohidrat digunakan untuk mengetahui kemampuan mikroorganisme dalam mendegradasi dan memfermentasi karbohidrat dengan memproduksi asam atau asam dan gas. Sulawesi Selatan. DAFTAR PUSTAKA Bogdanova et al, 1998. Horisontal Spread of Mer Operons Among Gram-Positive Bacteria in Natural Environments. Microbiology 144: 609 – 620 Danahouses, 2009. Bahaya Logam Berat Bagi Kesehatan, http://danahouses.blogspot.com, Diakses pada tanggal 28 Januari 2012. Farmasiku, 2012, Antibiotika, http://www.farmasiku.com, Diakses pada tanggal 26 September 2012 Medicastore, 2010. Bahaya Resistensi Antibiotika, http://www.medicastore.com, Diakses pada tanggal 28 Januari 2012. Misra, T.K., 1992. Bacterial Resistances to Inorganic Mercury Salt and Organomercurial. Plasmid 25: 4 - 16. Silver and Phung 1998. Bacterial Heavy Metal Resistance: New Suprises. Rev Microbiol. Smit, E., Wolters, A. and Elsas, J.D.V. 1998. Self-Transmissible Mercury Resistance Plamids With Gene Mobilizing Capacity in Soil Bacterial Populations: Influence Of Wheat Roots And Mercury Addition. Appl. Environ. Microbiol. 64: 1210 1219.
