PERSISTENSI VAKSIN DNA PENYANDI GLIKOPROTEIN 25

PERSISTENSI VAKSIN DNA PENYANDI GLIKOPROTEIN 25
YANG DIBERIKAN MELALUI PAKAN BUATAN
PADA IKAN MAS Cyprinus carpio
YULIYANTI
DEPARTEMEN BUDIDAYA PERAIRAN
FAKULTAS PERIKANAN DAN ILMU KELAUTAN
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2011
PERSISTENSI VAKSIN DNA PENYANDI GLIKOPROTEIN 25
YANG DIBERIKAN MELALUI PAKAN BUATAN
PADA IKAN MAS Cyprinus carpio
YULIYANTI
SKRIPSI
Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Perikanan pada
Program Studi Teknologi & Manajemen Perikanan Budidaya
Departemen Budidaya Perairan,
Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan,
Institut Pertanian Bogor
DEPARTEMEN BUDIDAYA PERAIRAN
FAKULTAS PERIKANAN DAN ILMU KELAUTAN
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2011
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI
DAN SUMBER INFORMASI
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi yang berjudul:
PERSISTENSI VAKSIN DNA PENYANDI GLIKOPROTEIN 25 YANG
DIBERIKAN MELALUI PAKAN BUATAN PADA IKAN MAS Cyprinus
carpio
adalah benar merupakan hasil karya yang belum diajukan dalam bentuk apa pun
kepada perguruan tinggi mana pun. Semua sumber data dan informasi yang
berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun yang tidak diterbitkan
dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar
Pustaka di bagian akhir skripsi ini.
Bogor, Januari 2011
YULIYANTI
C14061431
SKRIPSI
Judul
: Persistensi vaksin DNA penyandi glikoprotein 25 yang diberikan
melalui pakan buatan pada ikan mas Cyprinus carpio
Nama
: Yuliyanti
NRP
: C14061431
Menyetujui,
Pembimbing I
Pembimbing II
Dr. Alimuddin
NIP. 19700103 199512 1 001
Dr. Sri Nuryati, S.Pi, M.Si
NIP. 19710606 199512 2 001
Mengetahui,
Ketua Departemen Budidaya Perarian
Dr. Ir. Odang Carman, M. Sc.
NIP. 19591222 198601 1 001
Tanggal Lulus :
KATA PENGANTAR
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas segala rahmat
dan ridho-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Tema yang dipilih
dalam penelitian yang dilaksanakan sejak bulan Juli 2010 s.d. November 2010
adalah vaksin DNA, dengan judul “Presistensi vaksin DNA penyandi glikoprotein
25 yang diberikan melalui pakan buatan pada ikan mas Cyprinus carpio”.
Penulis menyadari bahwa karya ilmiah ini tidak lepas dari bantuan berbagai
pihak yang telah mendorong dan membimbing penulis, baik ide, pemikiran,
tenaga, moril maupun materil. Oleh karena itu penulis mengucapkan terima kasih
yang sebesar-besarnya kepada :
1. Dr. Alimuddin, selaku dosen pembimbing I
2. Dr. Sri Nuryati, selaku dosen pembimbing II
3. Dr. Widanarni, selaku dosen penguji
4. Dr. Eddy Supriyono, selaku dosen pembimbing akademik
5. Ayah, Ibu, M. Zaenuri, Inah Carinah, Muhammad Abidin dan Susy Restiani
atas doa, kasih sayang, dukungan moril, maupun materil selama ini.
6. Anna Octavera, S.Pi., yang banyak membantu dalam penelitian dan
penyusunan serta penulisan skripsi ini.
7. Dosen dan staf BDP yang tidak dapat penulis sebutkan satu per satu, yang telah
banyak membantu penulis dalam menyelesaikan pendidikan di IPB.
8. Sdri. Lina, Fuad, Gilang, Thami, Andhini, Jasmadi, Darmawan, Sekar, Ikbal,
Sulistia, Zam Zam, Puguh, Sypeh, Nadia, Anna, Meirina, Ena, Widya dan
Sofyan yang sabar membantu dan memberikan saran dalam penyusunan skripsi
ini serta rekan-rekan BDP angkatan 43, 44, dan 45 yang memotivasi dan
memberi semangat saat penelitian dan penyusunan karya ilmiah ini.
Bogor, Januari 2011
Yuliyanti
RIWAYAT HIDUP
Penulis bernama lengkap Yuliyanti, dilahirkan di Indramayu pada tanggal
20 Juli 1988 dan merupakan anak pertama dari dua bersaudara dari pasangan
Bapak Zaenal dan Ibu Carsih.
Penulis memulai jenjang pendidikan dasar di SD Negeri Lagoa 11 Pagi
Percontohan dan lulus pada tahun 2000. Pendidikan lanjutan menengah ditempuh
di SMP Negeri 30 Jakarta dan lulus pada tahun 2003. Pendidikan menengah atas
ditempuh penulis di SMA Negeri 13 Jakarta dan lulus pada tahun 2006.
Penulis diterima sebagai mahasiswa Institut Pertanian Bogor melalui jalur
Seleksi Penerimaan Mahasiswa Baru (SMPB) pada tahun 2006 dan penulis
memasuki Departemen Budidaya Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan,
Institut Pertanian Bogor pada tahun 2007. Selama kuliah penulis aktif dalam
organisasi HIMAKUA sebagai anggota pada periode 2007/2008 dan sebagai staf
Olahraga dan Kesenian periode 2008/2009. Penulis juga menjadi asisten untuk
program Sarjana IPB mata kuliah Dasar-Dasar Akuakultur selama tiga periode
tahun 2008-2010, asisten mata kuliah Nutrisi Ikan 2010, asisten mata kuliah
Dasar-Dasar Genetika Ikan 2010, asisten mata kuliah Fisiologi Reproduksi
Organisme Akuatik 2010, serta menjadi asisten untuk program Diploma IPB
sebagai asisten mata kuliah Teknik Pemberian dan Pembuatan Pakan Ikan 2010,
asisten mata kuliah Nutrisi Ikan 2010. Selain itu, penulis menerima beasiswa dari
Yayasan ORBIT dari 2006-2007.
Penulis pernah magang di BBAP Jepara selama 10 hari tahun 2008 serta
pada bulan Juli-Agustus 2009, penulis pernah melaksanakan praktek kerja lapang
dengan judul “Pembenihan Kerapu Tikus Cromilepthes altivelis di Balai
Budidaya Laut Lombok”. Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
sarjana pada Departemen Budidaya Perairan, FPIK IPB, penulis melakukan
penelitian yang berjudul ”Persistensi vaksin DNA penyandi glikoprotein 25
yang diberikan melalui pakan buatan pada ikan mas Cyprinus carpio”.
ABSTRAK
YULIYANTI. Persistensi vaksin DNA penyandi glikoprotein 25 yang diberikan
melalui pakan buatan pada ikan mas Cyprinus carpio. Dibimbing oleh Alimuddin
dan Sri Nuryati.
Koi Herpes Virus (KHV) adalah patogen virus utama yang menginfeksi ikan mas
dan koi. Serangan penyakit KHV mewabah di hampir seluruh sentra budidaya
ikan mas di Indonesia dan dapat menyebabkan kematian massal. Metode
vaksinasi DNA merupakan salah satu cara yang dapat dilakukan untuk
menanggulangi serangan KHV. Pemberian vaksin umumnya dilakukan dengan
cara injeksi. Pada penelitian ini dilakukan uji persistensi vaksin DNA (pMBaGP25) yang diberikan melalui pakan buatan dan persistensinya pada beberapa
jaringan ikan dianalisis menggunakan metode PCR dengan primer spesifik gen
GP25. Bakteri Escherichia coli DH5α yang mengandung vaksin DNA pMBaGP25 dikultur pada empat media perlakuan yaitu 2xYT, LB polipepton, LB
tripton dan TSB. Kepadatan bakteri hasil kultur dihitung menggunakan
spektrofotometer dengan panjang gelombang 580 nm. Hasil penelitian
menunjukkan bahwa media kultur cair yang efisien untuk pertumbuhan bakteri
adalah media LB tripton. Selanjutnya, DNA GP25 dapat terdeteksi di ginjal dan
limpa ikan yang diberi pakan buatan mengandung vaksin DNA GP25. Pemberian
pakan bervaksin 2 kali seminggu menunjukkan persistensi DNA di ginjal dan
limfa adalah tertinggi. Dosis vaksin DNA yang dapat terdeteksi adalah 7,56 ng
(dengan jumlah copy DNA yaitu 1,598 x 1010).
Kata kunci: ikan mas, KHV, vaksin DNA, GP25
ABSTRACT
YULIYANTI. Persistence of DNA vaccine encoding glycoprotein 25 by oral
feeding on common carp Cyprinus carpio. Supervised by Alimuddin and Sri
Nuryati.
Koi Herpes Virus (KHV) is a major viral pathogen that infects common carp and
koi. KHV disease outbreak in almost all centre of common carp culture in
Indonesia and caused mass mortality. DNA vaccination method is one of ways to
cope with KHV infection. Vaccines were commonly given by injection. In this
research, persistence test of DNA vaccine (pMBa-GP25) were carried out by oral
feeding on common carp. DNA vaccine persistence test were done using PCR
method with the specific primer for GP25 gene. Escherichia coli DH5α bacteria
containing pMBa-GP25 DNA vaccine were cultured in four treatment mediums
namely 2xYT, LB polypeptone, LB triptone and TSB. Bacteria densities were
counted with spectrophotometer using 580 nm wave lengths. The results showed
that an efficient culture media for E. coli was LB tripton. Furthermore, GP25
DNA was detected in kidney and spleen of vaccinated fish. Level of DNA vaccine
that could be detected was 7,56 ng (amount of DNA copy 1,598 x 1010 copies).
Keywords: common carp, KHV, DNA vaccine, GP25
DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR TABEL ...................................................................................
ii
DAFTAR GAMBAR ...............................................................................
iii
DAFTAR LAMPIRAN ...........................................................................
iv
I.
PENDAHULUAN ............................................................................
1
II. BAHAN DAN METODE ................................................................
2.1 Kultur cari bakteri terkonstruksi glikoprotein 25 (GP25) ...........
2.2 Perhitungan jumlah kepadatan bakteri ........................................
2.3 Pelleting bakteri terkonstruksi ....................................................
2.4 Pembuatan dan pemberian pakan bervaksin ...............................
2.5 Pemeriksaan dan perhitungan jumlah copy plasmid pada pakan
2.6 Analisis persistensi vaksin DNA ................................................
2.7 Analisis data ................................................................................
3
3
3
3
3
4
5
7
III. HASIL DAN PEMBAHASAN........................................................
3.1 Hasil ............................................................................................
3.2 Pembahasan ................................................................................
8
8
10
IV. KESIMPULAN ................................................................................
4.1 Kesimpulan .................................................................................
4.2 Saran ...........................................................................................
14
14
14
DAFTAR PUSTAKA ..............................................................................
15
LAMPIRAN .............................................................................................
16
DAFTAR TABEL
Halaman
1. Jumlah kepadatan bakteri pada media cair TSB, 2xYT, LB-P dan
LB-T ....................................................................................................
1
2. Hasil digitasi pakan bervaksin GP25 dari pengambilan 3 titik sampel
1
ii
DAFTAR GAMBAR
Halaman
1. Deteksi gen MBa-GP25 pada pakan perlakuan ....................................
8
2. Deteksi gen GP25 dan kontrol internal β-aktin pada organ target .......
9
iii
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
1. Perendaman dan pengambilan 3 titik sampel pakan perlakuan ............
16
2. Komposisi media kultur agar cair (20 ml) ...........................................
17
3. Hasil digitasi standar pMBa-GP25 .......................................................
18
4. Persamaan standarisasi pMBa-GP25 ...................................................
19
5. Perhitungan ketebalan pita DNA hasil amplifikasi pada pakan
Perlakuan ..............................................................................................
20
6. Perhitungan copy plasmid pada pakan perlakuan ................................
21
7. Harga bahan penyusun media perlakuan (2xYT, LB polipepton,
LB tripton, TSB) ..................................................................................
22
iv
I. PENDAHULUAN
Ikan mas Cyprinus carpio adalah spesies ikan air tawar yang memiliki
nilai ekonomis penting. Spesies inisudah tersebar luas di Indonesia dan menjadi
salah satu dari 10 komoditas andalan perikanan budidaya di Indonesia. Namun,
perkembangan budidaya ikan mas menghadapi kendala setelah serangan penyakit
KHV (Koi Herpes Virus) mewabah di hampir seluruh sentra budidaya ikan mas di
Indonesia.
Koi Herpes virus (KHV) yang menyerang ikan mas dan koi pertama kali
ditemukan di Israel tahun 1998 (Hedrick et al., 1999). Selanjutnya, penyakit KHV
dilaporkan berjangkit di beberapa negara antara lain negara-negara Eropa dan
Amerika Serikat serta Taiwan dan Jepang pada tahun 2003 (Haenen, 2003). Sejak
terjangkit pertama kali di Blitar, penyakit ini telah menyebar ke hampir semua
daerah di Indonesia. Virus ini mengakibatkan kematian massal yaitu kematian
mencapai 80-95% populasi sehingga berdampak pada kerugian ekonomi dan
sosial (Sunarto et al., 2004).
Menurut Hedrick et al.(2000), penyakit KHV menyebabkan kematian
yang besar dan bersifat sporadis pada ikan mas dan koi. Serangan penyakit ini
menunjukkan kematian yang sangat cepat, ikan akan terlihat sakit dan akhirnya
mati dalam 24-48 jam. Alternatif yang dilakukan oleh masyarakat dalam
menanggulangi wabah ini adalah dengan mengunakan bahan kimia, fitofarmaka,
dan penerapan biosekuriti. Namun hasil yang diperoleh tidak maksimal untuk
mencegah wabah KHV. Mengingat sifat virus herpes yang berasosiasi kuat
dengan sel dan sulit untuk ditanggulangi, maka langkah pencegahan perlu
dilakukan. Metode yang ada untuk mendeteksi virus secara akurat masih terbatas
dan virus dapat hadir dalam tubuhinang tanpa menunjukkan gejala klinis. Salah
satu langkah pencegahan yang bisa dilakukan adalah dengan vaksinasi. Vaksin
yang dapat diberikan berupa vaksin konvensional dan vaksin rekombinan.
Solusi terhadap serangan KHV pada ikan mas di Indonesia dapat diatasi
dengan pemberian vaksin DNA. Kelebihan dari vaksin DNA (Lorenzen &
LaPatra, 2005) adalah bersifat generik dan sederhana, aman dan tidak
menimbulkan risiko terinfeksi penyakit, dapat mencapai tujuan vaksinasi ketika
vaksinasi konvensional gagal, mengaktifkan sistem kekebalan humoral dan seluler,
memberikan proteksi yang baik apabila diberikan pada stadia awal, proteksi tidak
dipengaruhi oleh suhu, dan penyediaan vaksin baru dapat dilakukan dalam waktu
cepat dengan biaya yang relatif murah. Vaksin DNA dapat melindungi organisme
melawan penyakit dengan cara menginjeksikan DNA murni (naked DNA) untuk
meningkatkan respons kekebalan. Vaksin konvensional atau vaksin yang
dilemahkan memiliki keterbatasan yang dapat disempurnakan oleh vaksin DNA.
Nuryatiet al.(2010) mengatakan bahwa konstruksi vaksin DNA yang
mengandung sisipan gen glikoprotein 25 (GP25) untuk KHV berhasil
dikembangkan menggunakan gen virus isolat asal Indonesia sebagai sumber DNA
yang disisipkan ke plasmid. Perbedaan strain virus mengandung konsekuensi
adanya perbedaan sekuen gen penyandi protein imunogenik seperti yang
ditunjukkan pada glikoprotein ORF 25 (yang merupakan bagian virus yang
bersifat imunogenik) dari KHV asal Indonesia memiliki perbedaan susunan asam
amino dengan KHV asal Jepang, Amerika Serikat dan Israel. Dengan demikian
vaksin DNA yang dibuat menggunakan isolat Indonesia diduga lebih efektif
dibandingkan dengan isolat dari luar.
Metode vaksinasi dengan pemberian vaksin DNA melalui pakan buatan
pada stadia benih ikan mas diharapkan menjadi salah satu alternatif pengobatan
secara massal yang dapat menangani permasalahan penyakit pada ikan yang
disebabkan oleh virus. Karena menurut Lorenzen & LaPatra (2005) salah satu
kekurangan vaksin DNA yaitu masih diperlukannya suatu strategi baru untuk
vaksinasi secara massal. Hal ini juga diungkapkan oleh Lorenzen & LaPatra
(2005) sebagai salah satu kelebihan dari vaksin DNA yaitu proteksi vaksin DNA
akan lebih baik apabila diberikan pada stadia awal.
Tujuan dari penelitian ini adalah untuk menguji dosis dan frekuensi
pemberian vaksin DNA, persistensi DNA asing pada organ target ikan mas
Cyprinus carpio serta menguji penggunaan media agar cair yang efisien untuk
pertumbuhan bakteri terkonstruksi gen pMBa-GP25.
2
II. BAHAN DAN METODE
2.1. Kultur cair bakteri terkonstruski glikoprotein 25 (GP25)
Bakteri Escherichia coli yang mengandung konstruksi vaksin pMBa-GP25
yang disimpan dalam gliserol pada suhu –80oC diambil menggunakan tusuk gigi
steril dan digoreskan kuadran pada media padat LB polipepton + ampisilin untuk
mendapatkan koloni tunggal. Sel bakteri diinkubasi pada suhu 37oC selama 16
jam, lalu disimpan pada suhu 4oC hingga akan digunakan. Untuk perbanyakan
plasmid, bakteri dikultur di media cair menggunakan shaker incubator dengan
kecepatan 240 rpm selama 16 - 18 jam.
2.2. Perhitungan jumlah kepadatan bakteri
Bakteri E. coli terkonstruksiplasmid GP25 dikultur pada 4 jenis media cair,
yaitu 2xYT, LB polipepton, LB tripton, dan TSB dengan penambahan ampisilin
1:1000. Inkubasi bakteri dilakukan menggunakan shaker dengan kecepatan 240
rpm pada suhu 37oC selama 16 jam. Sebanyak 2 ml media cair yang telah
ditumbuhi oleh bakteri dimasukkan ke dalam kuvet untuk menghitung kepadatan
bakteri menggunakan alat spektrofotometer pada panjang gelombang 580 nm.
2.3.Pelletingbakteri terkonstruksi
Pelleting bakteri bertujuan untuk memisahkan sel bakteri dengan media
kultur. Sebanyak 20 ml bakteri hasil kultur dituangkan secara parsial ke dalam
masing-masing microtube bervolume 1,5 ml, lalu disentrifugasi pada kecepatan
12000 rpm dan suhu 4oC selama 30 detik. Hasil pelleting bakteri dicuci dengan 1
ml PBS sebanyak 3 kali. Setelah dicuci dengan PBS, bakteri dimatikan dengan
perlakuan panaspada suhu 80oC selama 5 menit selanjutnya disentrifugasi dan
diresuspensi kembali dengan PBS sebanyak 1 ml.
2.4.Pembuatandan Pemberian Pakan Bervaksin
Bakteri mengandung vaksin DNA dicampurkan terlebih dahulu dengan
kuning telur sebanyak 1-2% volume bakteri sebelum dicampurkan ke pakan.
Kuning telur berfungsi sebagai binder. Pakan yang mengandung vaksin DNA
kemudian didiamkan pada suhu ruang sampai kering. Pencampuran pakan buatan
dengan vaksin DNA dilakukan sesaat sebelum pemberian pakan perlakuan. Ikan
diberi pakan bervaksin dengan frekuensi pemberian 1 minggu sekali dan 1
minggu 2 kali yang diberikan secara at satiation.
2.5.Pemeriksaan dan perhitungan jumlah copy plasmid pada pakan
Pemeriks
aan dan perhitungan jumlah copy plasmid bakteri pada pakan bertujuan untuk
mengetahui distribusi dan kemampuan pakan buatan sebagai pembawa vaksin
DNA melalui perendaman.Pemeriksaan pakan perlakuan yang mengandung
bakteri terkonstruksi dilakukan dengan melarutkan 3 butir pakan perlakuan yang
berasal dari 3 titik sampel yang berbeda ke dalam masing-masing microtube 1,5
ml berisi 300 μl alkohol 70% selama 1 jam. Pakan diambil dari dalam microtube
lalu larutan disentrifugasi pada suhu 4oC dengan kecepatan 12000 rpm selama 10
menit. Supernatan dibuang dan pellet dikering udarakan. Setelah benar-benar
kering, pellet bakteri langsung digunakan dalam analisis PCR (Polymerase Chain
Reaction).
PCR dilakukan menggunakan primer spesifik glikoprotein KHV yaitu
FGP
5'-TTGTCGACATGACGGGTTGTGGGGTTTG-„3
dan
RGP
5'-
TCAGCAAGGCGGCCTTCACGG-„3. Reaksi PCR yang digunakan, yaitu
dengan volume 10 μL yang mengandung 1 μL LA Buffer; 1 μL dNTPs mix; 1 μL
MgCl2; 1 μL (1 pmol) masing-masing primer; 0,05 μL LATaq polymerase (Takara
Bio, Shiga, Japan), 1 μL DNAdan sisanya akuabides.Amplifikasi PCR dilakukan
dengan program: pre-denaturasi pada suhu 95oC selama 7 menit; 45 siklus pada
suhu 95oC selama 30 detik, 64oC selama 30 detik dan 72oC selama 30 detik; serta
pada suhu 72oC selama 7 menit. Pengecekan hasil amplifikasi PCR dilakukan
dengan elektroforesis menggunakan gel agarosa 0,7%.
Perbedaan ketebalan pita-pita DNA hasil elektroforesis diukur dengan
menggunakan software UN-SCAN-IT gel. 6.0. Pita DNA yang memiliki
ketebalan berbeda mencirikan perbedaan kandungan bakteri bervaksin dalam
pakan.
Untuk mengetahui jumlah copy plasmid pada pakan perlakuan, hasil
digitasi standar pMBa-GP25 digunakan sebagai acuan untuk menentukan kisaran
4
konsentrasi DNA pada pakan perlakuan. Kemudian konsentrasi DNA dikonversi
menggunakan rumus persamaan berikut ini.
CP = (A) / {(1,1 x 10-15)* x 430 bp**}
Keterangan:
CP : Jumlah copy plasmid yang terkandung pada pakan (copy/µg)
A : Hasil pengukuran ketebalan pita (software UN-SCAN-IT gel 6.0)
*
: Konversi base pairs (1bp = 1,1 x 10-15 µg)
** : Ukuran pita DNA untuk situs pengenalan GP25 (430 bp)
2.6.Analisis persistensi vaksin DNA
Deteksi vaksin DNA pada masing-masing organ ikan mas ini dilakukan
dengan tahapan ekstraksi DNA organ, amplifikasi dengan PCR dan elektroforesis.
DNA diekstraksi dari jaringan ginjal dan limpa ikan mas pada hari ke-1, hari ke-3,
danhari ke-7 setelah pemberian pakan perlakuan. Sebanyak 20 – 25 mg sampel
jaringan hasil perlakuan dimasukkan ke dalam setiap microtube bervolume 1,5 ml.
Langkah pertama adalah melisiskan jaringan melalui penambahan200 µlCell Lysis
Solution (Gentra, Minneapolis, USA) dan 1,5 µl proteinase K (20 mg/ml) dengan
menggunakan micropipette ke dalam sampel jaringan kemudian dihomogenasi
menggunakan vortex dan diinkubasi menggunakan Dry Thermo Unitpada suhu
55OC dan dibiarkan semalaman (overnight, 12-16 jam).Setelah melewati proses
inkubasi, langkah selanjutnya adalah digesti RNA untuk penghilangan RNA.
Sampel diangkat dari inkubator dan dibiarkan pada suhu ruang selama 10 menit.
Sebanyak 1,5 µl RNAse (4 mg/ml) ditambahkan ke dalam larutan dan diaduk
dengan membolak-balik microtube secara perlahan sebanyak 25 kali, kemudian
diinkubasi pada suhu 37oC selama 60 menit. Setelah itu, didiamkan dalam suhu
ruang selama ±10 menit. Sebanyak 100 µl Protein Precipitation Solution
ditambahkan ke dalam tube kemudian divorteks dengan kecepatan 12.000 rpm
selama 30 detik kemudian sampel disimpan dalam es (on ice) selama 10 - 15
menit. Setelah itu sampel disentrifugasi selama 10 menit pada suhu 4OC, 12.000
rpm. Langkah keempat adalah pengendapan DNA. Supernatan hasil sentrifugasi
dimasukkan ke dalam microtube bervolume 1,5 ml yang sebelumnya telah diisi
5
dengan 300 µl isopropanol. Selanjutnya diaduk dengan hati-hati sebanyak 50x dan
disentrifuse pada suhu 4OC dengan kecepatan 12.000 rpm selama 10 menit.
Supernatan dari sampel dibuang dan ditambahkan etanol 70% (dingin) pada pellet
genom serta disentrifuse kembali dengan kecepatan 12.000 rpm selama 10 menit
pada suhu 4 ºC. Langkah terakhir, etanol dibuang dan dikering udarakan. Setelah
kering, pellet DNA dilarutkan pada ion exchange water sebanyak 30 µl dan
disimpan dalam freezer (-20 ºC) untuk digunakan pada proses selanjutnya (PCR
dan elektroforesis).
Amplifikasi DNA hasil isolasi dilakukan dengan menggunakan mesin
PCR. Tahap PCR diawali dengan pembuatan premix, yaitu campuran bahan
pereaksi yang akan digunakan dalam proses PCR. Primer yang digunakan adalah
primer spesifik glikoprotein KHV. Reaksi PCR yang digunakan, yaitu dengan
volume 10 µL yang mengandung 1 µL LA Buffer; 1 µL dNTPs mix; 1 µL MgCl2;
1 µL (1 pmol) masing-masing primer; 0,05 µL LATaq polymerase (Takara Bio,
Shiga, Japan); 1 µL DNA genom dan sisanya akuabides. Amplifikasi PCR dengan
situs pengenalan KHV : pre-denaturasi pada suhu 95oC selama 7 menit; 45 siklus
pada suhu 95oC selama 30 detik, 64oC selama 30 detik dan 72oC selama 30 detik;
serta 1 siklus pada suhu 72oC selama 7 menit. Selain itu amplifikasi β-aktin ikan
mas dilakukan sebagai kontrol internalloading DNA. Primer yang digunakan
adalah F ccAt: 5‟-ATGGTTATGGGACAGAAGGAC-3‟ dan R ccAT: 5‟CTGTGTCATCTTTTCCCTGTTGGC-3‟.
Program
yang
digunakan:
pre-
denaturasi pada suhu 94oC selama 3 menit; 35 siklus pada suhu 95oC selama 20
detik, 59oC selama 20 detik dan 72oC selama 30 detik; serta pada suhu 72oC
selama 3 menit.
Separasi
hasil
amplifikasi
PCR
dilakukan
dengan
elektroforesis
menggunakan gel agarosa0,7%. Sample DNA hasil PCR sebanyak 3 μl
dicampurkan dengan 0,5 μl loadingbuffer, lalu dimasukkan ke dalam sumur yang
terdapat dalam gel dengan menggunakan micropipette. Setelah itu 3 μl marker
DNA dimasukkan ke dalam sumur di dekat sumur sampel. Bak elektroforesis
ditutup dan listrik dialirkan dengan tegangan 200 Volt dan kuat arus 70 mA.
Fragmen
DNA akan bermigrasi dari kutub negatif ke positif. Setelah
bromophenol blue bermigrasi sampai 3/4 bagian dari panjang gel, aliran listrik
6
dihentikan. Lalu gel diangkat dan dilepaskan dari cetakannya. Gel tersebut
diletakkan di atas ultraviolet illuminator untuk visualisasi DNA. Pengambilan
gambar menggunakan kamera digital Canon® PowerShot A640 yang terpasang
pada kotak ultraviolet illuminaor. Kamera tersebut terhubung ke komputer dan
pemotretan dilakukan secara otomatis menggunakan bantuan software (image
capture).
2.7 Analisis data
Parameter yang diamati adalah jumlah DNA yang masuk pakan buatan,
jenis media yang dapat mendukung pertumbuhan bakteri serta distribusi gen mBaGP25 pada organ target dari visualisasi hasil PCR. Data yang diperoleh dianalisis
secara deskriptif dan ditampilkan mengunakan tabel, grafik, dan gambar.
7
III. HASIL DAN PEMBAHASAN
3.1 Hasil
Kepadatan bakteri yang mengandung pmBA-GP25 yang dikultur pada 4
jenis media cair menunjukkan hasil yang berbeda. Kepadatan bakteri tertinggi
diperoleh dengan menggunakan media LB tripton (LB-T) dengan biaya
pembuatan bahan sebesar Rp 30,30/ml (Tabel 1).
Tabel 1. Jumlah kepadatan bakteri pada media cair TSB, 2xYT, LB-Pdan LB-T
Media
Kepadatan (106/ml)
1.
TSB
14,09 ± 0,49
2.
2xYT
9,63 ± 0,11
3.
LB-P
11,96 ± 1,10
4.
LB-T
18,30± 2,64
Keterangan: LB-P: LB polipepton; LB-T: LB tripton
No.
Biaya bahan/ ml
Rp 48,00
Rp 45,87
Rp 32,86
Rp 30,30
Jumlah bakteri yang terkandung pada pakan buatan ditunjukkan oleh
ketebalan pita DNA dan jumlah copy plasmid pada pakan perlakuan. Deteksi gen
GP25 pada pakan perlakuan membuktikan keberhasilan distribusi vaksin DNA ke
dalam pakan buatan pada pengujian 3 titik sampel (Gambar 1) dan kuantifikasi
hasil digitasi pakan bervaksin MBa-GP25 (Tabel 2).
Gambar 1. Deteksi gen GP25 pada pakan perlakuantitik pengambilan ke-1 (T1),
titik pengambilan ke-2 (T2) dan titik pengambilan ke-3 (T3).
Tabel 2. Hasil digitasi pakan bervaksin GP25 dari pengambilan 3 titik sampel
Sampel
Konsentrasi DNA GP25 pada
pakan (ng/μl)
1
2
3
38,76
48,21
31,51
Jumlah
Rata-rata
Ketebalan pita DNA hasil
amplifikasi (ng)
4,417
5,967
3,228
13,612
4,537
Berdasarkan penelitian yang telah dilakukan diperoleh bahwa vaksin DNA
GP25 dapat masuk ke dalam organ target(Gambar 2).Secara umum,DNA vaksin
dapat terdeteksi di setiap perlakuan. Produk visualisasi PCR yang dihasilkan
dengan menggunakan primer GP25 berukuran 430 bp. Gen GP25 masih terdeteksi
pada hari ke-1 dan hari ke-3 pada ginjal dan limpa setelah pemberian pakan
perlakuan. Selanjutnya gen GP25 tidak terdeteksi sampai hari ke-7 setelah
pemberian pakan perlakuan.
GP25
β- actin
(a)
GP25
β- actin
(b)
GP25
β- actin
(c)
Gambar 2.Deteksi gen GP25 dan kontrol internal β-aktin pada ginjal (G) dan
limpa (L) pada hari ke-1 (a) dan hari ke-3 (b) setelah pemberian
pakan perlakuan. Gen GP25 tidak terdeteksi pada semua jaringan
setelah pelakuan hari ke-7 (c).
9
3.2 Pembahasan
Virus KHV menyerang semua stadia ikan mas, sehingga diperlukan
penerapan berbagai metode untuk menanggulangi penyakit KHV seperti
penggunaan vaksin DNA.
Lorenzen dan LaPatra (2005) menyatakan bahwa
vaksin DNA mengandung satu atau lebih gen yang memberi kode sebagian sifat
antigenik suatu virus core protein atau envelope protein. Ekspresi antigen yang
terjadi di dalam sel inang yang telah divaksinasi merangsang pengaktifan sistem
kekebalan tubuh inang. Pada penelitian ini digunakan vaksin DNA yang
mengandung gen imunogenik GP25 yang sudah diuji aktivitasnya (Nuryati, 2010).
Pada penelitian sebelumnya uji aktivitas vaksin menggunakan metode
injeksi. Tahapan isolasi plasmid mengambil porsi biaya yang paling mahal
dibandingkan tahap kultur bakteri (Nuryati, 2010), sehingga harus ada alternatif
metode transfer vaksin dengan memangkas tahapan isolasi plasmid yang
memungkinkan pemberian vaksin dalam bentuk bakteri terkonstruksi. Pada
penelitian ini dikembangkan metode pemberian vaksin melalui pakan buatan.
Melalui metode PCR, persistensi vaksin DNA GP25 dapat terdeteksi pada organ
target yaitu ginjal dan limpa. Hal ini menunjukkan bahwa pemberian vaksin DNA
GP25 melalui pakan buatan berpeluang sebagai alternatif metode transfer vaksin
untuk mencegah virus KHV pada ikan mas.
Berdasarkan hasil penelitian pendahuluan terkait dengan penentuan dosis
bakteri E. coliDH5α sebagai vektor pembawa gen MBa-GP25 diperoleh dosis
optimum sebesar 106 cfu/ml. Hal ini diperkuat oleh produk visualisasi PCR yang
menunjukkan deteksi gen MBa-GP25 berukuran 430 bp pada organ target yaitu
ginjal dengan frekuensi pemberian pakan sebanyak 1 minggu 2 kali pemberian.
Munculnya pita DNA pada organ target diduga dapat menginduksi sistem imun.
Untuk meyakinkan hal ini, perlu dilakukan uji tantang dengan virus KHV.
Media kultur mempengaruhi kemampuan mikroorganisme untuk tumbuh
dan tetap hidup. Selanjutnya, hasil kultur menggunakan 4 jenis media berbeda
menghasilkan konsentrasi bakteri yang berbeda. Berdasarkan hasil perhitungan
jumlah kepadatan bakteri menggunakan spektrofotometer dengan panjang
gelombang 580 nm, media LB tripton merupakan media yang menghasilkan
bakteri paling banyak, yaitu(18,3±2,64)x106 cfu/mldan ekonomis, diikuti oleh
10
media TSB, LB polipepton dan 2xYT (Tabel 1). Dengan demikian disarankan
untuk menggunakan media LB tripton untuk memproduksi bakteri E. coli
mengandung vaksin DNA.
Perhitungan jumlah copy plasmid bakteri pada pakan bertujuan untuk
mengetahui kemampuan pakan buatan sebagai pembawa vaksin DNA melalui
pencampuran secara manual. Berdasarkan hasil visualisasi produk PCR, maka
distribusi plasmid GP25 pada pakan tidak merata. Jumlah copy DNA asing yang
terdapat dalam pakan buatan mencapai nilai tertinggi yaitu pada titik sampel ke2dalam 3 butir pakan buatan.Dosis vaksin DNA dalam pakan buatan adalah
7,56ng (dengan jumlah copy DNA yaitu 1,598 x 1010). Variasi kandungan bakteri
dalam pakan diduga menjadi salah satu penyebabvariasi keberadaan DNA vaksin
di organ ginjal dan limpa. Variasi jumlah pakan yang dimakan juga diduga
menyebabkan perbedaan ketebalan pita DNA produk PCR antar individu ikan mas.
Dosis vaksin DNA secara oral melalui pakan buatan sebesar 7,56 ng
(dengan jumlah copy DNA yaitu 1,598 x 1010)relatif lebih rendah dibandingkan
denganpenelitian Nuryati (2010). Dosis vaksin DNA terbaik melaui injeksi yang
digunakan pada uji tantang terhadap sintasan ikan mas yang diinfeksi koi herpes
virus (KHV) adalah 7,5 µg(dengan jumlah copy DNA yaitu 7,8 x 1012)dan 12,5
µg (dengan jumlah copy DNA yaitu 13 x 1012) (Nuryati, 2010). Dosis yang
ditemukan juga lebih rendah dibandingkan dengan yang dilaporkan oleh Zheng et
al. (2006), yaitu 15 µg. Penggunaan bakteri sebagai vektor pembawa gen GP25
yang dicampurkan ke pakan buatan dapat menurunkan dosis vaksin DNA dengan
metode injeksi dari 1012 menjadi 106. Namun dengan penurunan dosis tersebut,
ekspresi gen GP25 belum bisa dideteksi dengan RT-PCR. Dengan demikian
penelitian menggunakan dosis lebih tinggi masih perlu dilakukan. Terkait dengan
tingginya biaya pembuatan vaksin DNA menggunakan metode injeksi, maka
diharapkan pemberian vaksin DNA secara oral dapat menekan biaya vaksinasi.
Ginjal adalah organ yang memiliki kemampuan sebagai penyaring zat-zat
sisa metabolisme tubuh, memproduksi hormon erythropoietin yang membantu
pembuatan
sel
darah
merah
dan
menyaring
darah.
Limpa
berfungsi
mengakumulasi limfosit dan makrofaga, degradasi eritrosit, tempat cadangan
darah, dan sebagai organ pertahanan terhadap infeksi partikel asingyang masuk ke
11
dalam darah. Oleh karena itu, ginjal dan limpa merupakan organ target yang
diisolasi untuk mendeteksi gen MBa-GP25 setelah H+1, H+3 dan H+7 pemberian
pakan perlakuan. Gray et al. (2002) menyatakan bahwa virus DNA lebih banyak
ditemukan
pada
ginjal,
jaringan
usus
dari
ikan
yang
terinfeksi,
tetapijugaterdeteksidalamjaringanhatidanginjalpada jumlah yanglebih rendah.
Selanjutnya,
Gilad
et
al.
(2004)
melaporkan
bahwa
insang,
ginjal,
danlimpaadalahorganyangpalingbanyakterinfeksi KHV.
Hasil analisis PCR menunjukkan bahwa DNA GP25 dapat terdeteksi
setelah hari ke-1(Gambar 2a) dan hari ke-3 (Gambar 2b) setelah pemberian pakan
perlakuan. Padaginjal setelah H+1 dan H+3 dengan frekuensi 1 minggu sekali
pemberian, dihasilkan pita DNA yang lebih tipis dibandingkan frekuensi
pemberian 1 minggu 2 kali pemberian. Selanjutnya, pada hari ke-7 setelah
pemberian pakan perlakuan (Gambar 2c), gen GP25 tidak terdeteksi pada semua
organ target. Hal ini mungkin disebabkan karena semua atau hampir semua
plasmid DNA telah terpotong-potong oleh enzim restriksi endogenus. Dengan
demikian, pemberian pakan bervaksin 2 kali seminggu diduga dapat menginduksi
sistem imun ikan mas. Hal ini diperkuat oleh pendapat Gillund et al. (2008) yang
menyatakan bahwa vaksin DNA yang diberikan ke ikan akan mengalami beberapa
kemungkinan antara lain: a) DNA akan masuk (uptake) ke dalam sel yang ada di
lokasi injeksi; b) DNA akan tertinggal di bagian luar sel (ekstraseluler); c) DNA
akan didegradasi oleh enzim endonuklease di jaringan tempat injeksi, dan d) DNA
terdistribusi melalui darah ke jarungan lain. Target yang diharapkan dari
pemberian vaksin DNA ini adalah munculnya respons imun pada ikan yang diberi
vaksin. Nuryati (2010) menyatakan bahwa vaksin DNA yang terdistribusi ke
jaringan lain dan terekspresi maka vaksin DNA tersebut akan mentranslasikan
glikoprotein virus KHV. Glikoprotein virus harus dipastikan tidak menginfeksi
inangnya sendiri (ikan).
Bila gen glikoprotein ditranslasi dan selanjutnya protein GP dikenali oleh
sistem imun sehingga terbentuk antibodi dan menginduksi memori, maka
vaksinasi DNA melalui pakan buatan dapat menjadi alternatif pengendalian
infeksi KHV pada ikan mas dan ikan koi. Pemberian vaksin DNA GP25 melalui
pakan buatan dapat terdeteksi pada ikan mas stadia benih. Hal ini sesuai dengan
12
Kordi (2004), menyatakan bahwa vaksin DNA kurang efektif diberikan pada ikan
yang digunakan berumur kurang dari 2 minggu dan berat badannya kurang dari 1
g. Hal ini karena organ tubuh yang merespons kekebalan belum sempurna
memproduksi antibodi. Organ tubuh ikan yang berfungsi merespons kekebalan,
akan tercapai sempurna setelah 2 minggu.
13
IV. KESIMPULAN DAN SARAN
4.1 Kesimpulan
Media kultur cair yang efisien untuk pertumbuhan bakteri adalah media
LB tripton. DNA GP25 dapat terdeteksi di ginjal dan limpa ikan yang diberi
pakan buatan mengandung vaksin DNA GP25. Pemberian pakan bervaksin 2 kali
seminggu menunjukkan persistensi DNA di ginjal dan limpa adalah tertinggi.
Dosis vaksin DNA yang dapat terdeteksi pada pakan adalah 7,56ng (dengan
jumlah copy DNA yaitu 1,598 x 1010).
4.2 Saran
Perlakuan uji tantang pada ikan mas yang telah diberikan pakan buatan
bervaksin DNA GP25 dengan frekuensi 1 minggu 2 kali pemberian. Penelitian
menggunakan dosis vaksin lebih tinggi juga perlu dilakukan.
DAFTAR PUSTAKA
Gilad, O., Yun, S., Zagmutt-Vergara, F.J., Leutenegger, C.M., Bercovier, H.,
Hedrick, R.P., 2004. Concertrations of a koi herpesvirus (KHV) in tissue
of experimentally infected Cyprinus carpio koias assessed by real-time
TaqMan PCR. Diseases of Aquatic Organisms 60, 179-187.
Gillund, F., Dalmo, R., Tonheim, T.C., Seternes, T., Myhr, A.I., 2008. DNA
vaccination in aquaculture-Expert jugments of impacts on enviroment and
fish health. Aquaculture 284, 25-34.
Haenen, O.L., Way, M.K., Bergmann, S.M., Ariel, E., 2004. The emergence of
koi herpesvirusand its significance to European aquaculture.Bulletin of the
European Association of Fish Pathologists 24, 293–307.
Hedrick, R.P., Marty, G.D., Nordhausen, R.W., Kebus, M., Bercovier, H., Eldar,
A., 1999. An herpesvirus associated with mass mortality of juvenil and
adult koi Cyprinus carpio. Fish Health Newsl. Am. Fish. Soc., 27:7.
Hedrick, R.P., Gilad, O., Yun, O., Spangenberg, J., Marty, R., Nordhausen, M.,
Kebus, M., Bercovier, H., Eldar, A., 2000. A herpesvirus associated with
mass mortality of juvenil and adult koi, a strain of common carp. J. Aquant.
Anim. Health 12, 44-55.
Kordi, M.G.H., 2004. Patologi Ikan Teleostei. Gadjah Mada University Press,
Yogyakarta.
Lorenzen, N., LaPatra, S.E., 2005. DNA vaccines for aquaculture fish. Rev. Sci.
Tech. Off. Int. Epiz. 24(1), 201-213.
Nuryati, S., Alimuddin., Sukenda., Soejoedono R.S., Santika, A., Pasaribu, F.H.,
Sumantadinata, K., 2010. Constraction of a DNA vaccine using
glycoprotein gene and its expression towards increasing survival rate of
KHV-infected Common carp Cyprinus carpio. Natur Indonesia 13, 47-52.
Nuryati, S. 2010. Pengembangan vaksin DNA penyandi glikoprotein virus KHV
(Koi Herpes Virus) menggunakan isolat lokal. [Disertasi]. Program
Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor. Bogor.
Sunarto, A., Taukhid, Koeshayani, I., Supriadi, H., Gardenia, L., 2004. Strategi
Pengendalian Koi Herpesvirus pada Ikan Mas dan Koi. Makalah pada
workshop Strategi dan Pengendalian Penyakit Koi Herpesvirus pada Ikan
Mas dan Koi.
Zheng, F.R., Sun, X.Q., Liu,H.Z., Zhang, J.X., 2006. Study on the distribution and
expression of DNA vaccine agains lymphocytis disease virus in Japanese
flounder Paralichthys olivaceus. Aquaculture 261, 1128-1134.
Lampiran1. Pencampuran dan pengambilan 3titik sampel pakan perlakuan
T1
T2
T3
16
Lampiran 2. Komposisi media kultur agar cair (20 ml)
No.
1.
Jenis Media
2XYT
Komposisi
NaCl 0,5%
Yeast Ekstrak 1%
Polypepton 1,6%
Mili Q water
0,1 g
0,2 g
0,32 g
20 ml
Jumlah
2.
LB Polipepton
NaCl 1%
Yeast Ekstrak 0,5%
Polypepton 1%
Mili Q water
0,2 g
0,1 g
0,2 g
20 ml
3.
LB Tripton
NaCl 1%
Yeast Ekstrak 0,5%
Tripton 1%
Mili Q water
0,2 g
0,1 g
0,2 g
20 ml
4.
TSB
Pancreatic Digest of Casein
Papaic Digest of Soyabean Meal
Sodium Chloride
Dipotassium Hydrogen Phosphate
Dextrose (Glucose)
0,8 g
17
Lampiran 3. Hasil digitasi standar pMBa-GP25
Sample
1
2
3
4
Konsentrasi DNA
GP25 awal (ng/μl)
63,663
35,731
9,477
5,988
Ketebalan pita DNA
hasil amplifikasi (ng)
10,00
1,00
0,10
0,01
18
Lampiran 4. Persamaan standarisasi pMBa-GP25
Konsentrasi DNA Gp25 awal (ng/µl)
12
10
8
y = 0.164x - 1.939
R² = 0.829
6
4
2
0
0
-2
10
20
30
40
50
60
70
Ketebalan pita hasil amplifikasi (ng)
19
Lampiran 5. Perhitungan ketebalan pita DNA hasil amplifikasi pada pakan
perlakuan
Persamaan dalam perhitungan standarisasi pMBa-GP25:
y = 0,164x – 1,939
Ketebalan Pita DNA pada Pengujian Titik Sampel ke-1 :
y = 0,164x – 1,939
y = 0,164 (38,75582) – 1,939
y = 4,4169ng
20
Lampiran 6. Perhitungan copyplasmid pada pakan perlakuan
Persamaan dalam perhitungan jumlah copy plasmid:
CP = (A) / {(1,1 x 10-15)* x 430 bp**}
Keterangan:
CP : Jumlah copy plasmid yang terkandung pada pakan (copy/ng)
A : Hasil pengukuran ketebalan pita (software UN-SCAN-IT gel 6.0)
*
: Konversi base pairs (1bp = 1,1 x 10-15 µg atau 1 bp =1,1 x 10-12 ng)
** : Ukuran pita DNA untuk situs pengenalan GP25 (430 bp)
Diketahui :
Kebutuhan pakan untuk 10 ekor ikan mas = 1,2045 g
Jumlah pakan untuk 1 ekor ikan mas
= 0,12045 g = 15 butir
Plasmid DNA yang terkandung pada 1 butir pakan = 0,504151 ng
Plasmid DNA yang terkandung pada 15 butir pakan = 15 x 0,504151 ng
= 7,56 ng
Jumlah copy plasmid pada pakan perlakuan :
CP = (A) / {(1,1 x 10-12) x 430 bp}
= 7,56ng / {(1,1 x 10-12)* x 430 bp}
= 1,598 x 1010
21
Lampiran 7. Harga bahan penyusun media perlakuan (2xYT, LB polipepton, LB tripton, TSB)
Media
2xYT
LB
polipepton
LB tripton
TSB
Komposisi Bahan
Bobot Bahan
1 Botol (g)
Jumlah Bahan yang
Digunakan
Harga Bahan
Total (Rp)
Harga Bahan (Rp)
%/100 ml
g/100 ml
500 g
Polipepton
500
1,6
1,6
888000
100 ml
2841,6
1 ml
28,42
1 ml
Ekstrak ragi
500
1,0
1,0
660000
1320,0
13,20
425,0
4,25
45,87
1776,0
17,76
NaCl
500
0,5
0,5
Polipepton
500
1,0
1,0
425000
888000
Ekstrak ragi
500
0,5
0,5
660000
660,0
6,60
NaCl
500
1,0
1,0
425000
850,0
8,50
Tripton
500
1,0
1,0
760000
1520,0
15,20
660,0
6,60
8,50
Ekstrak ragi
500
0,5
0,5
660000
NaCl
Pancreatic Digest of
Casein
Papaic Digest of Soyabean
Meal
500
1,0
1,0
425000
850,0
500
4,0
4,0
600000
4800,0
Sodium Chloride
Dipotassium Hydrogen
Phosphate
48,00
32,86
30,30
48
Dextrose (Glucose)
22