MOLECULAR IDENTIFICATION BY USING POLYMERASE CHAIN

MOLECULAR IDENTIFICATION BY USING POLYMERASE CHAIN
REACTION (PCR) AND DNA SEQUENCING OF DIARRHEA BACTERIA
PATHOGENS
IDENTIFIKASI MOLEKULAR DENGAN TEKNIK POLYMERASE CHAIN
REACTION (PCR) DAN SEKUENSING DNA TERHADAP BAKTERI
PATOGEN PENYEBAB DIARE
Ety Supriyaningsih, Priyo Wahyudi, Supandi
Fakultas Farmasi dan Sains Universitas Muhammadiyah Prof. Dr. Hamka
Abstract
Diarrhea caused by bacterial infections. Identification of pathogenic bacteria can be
done by using molecular techniques. This research aims at detecting bacterial
pathogens that cause diarrhea by the method of polymerase chain reaction (PCR),
using 16S rRNA gene sequence analysis. Samples were extracted using the GeneJET
Genomic DNA Purification Kit, then amplified by PCR using primers 63F and 1387r.
Positive PCR results are indicated by the presence of DNA fragments in the
electrophoresis gel in the area about 2500 base pairs. This result was followed by
sequencing and alignment of data on Basic Local Alignment Search Tool (BLAST).
BLAST alignment results Siloam Karawaci Hospitals with samples were known to
have 99 % similarity with Escherichia coli O157 H:7. E. coli is a bacterium that is
commonly found in patients with diarrhea.
Keyword: PCR, DNA sequencing, 16S rRNA gene
Abstrak
Diare dapat disebabkan oleh infeksi bakteri. Identifikasi bakteri patogen dapat
dilakukan dengan menggunakan teknik molekuler. Penelitian ini dilakukan untuk
mendeteksi bakteri patogen penyebab diare dengan metode polymerase chain
reaction (PCR), menggunakan analisa sekuens gen 16S rRNA. Sampel diekstraksi
menggunakan GeneJET Genomic DNA Purification Kit, kemudian diamplifikasi
dengan PCR menggunakan primer 63f dan 1387r. Hasil PCR positif ditunjukkan
dengan adanya fragmen DNA pada gel elektroforesis pada daerah sekitar 2500
pasang basa. Hasil ini dilanjutkan dengan sekuensing dan penyejajaran data pada
Basic Local Alignment Search Tool (BLAST). Penyejajaran menggunakan BLAST
dari sampel yang diperoleh dari Rumah Sakit Siloam Karawaci Tanggerang-Banten
diketahui memiliki 99% kemiripan dengan Escherichia coli O157 H:7. Bakteri E. coli
merupakan bakteri yang sering terdapat pada penderita diare.
Kata kunci: PCR, sekuensing DNA, Gen 16S rRNA
1
PENDAHULUAN
Diare merupakan penyakit disebabkan oleh infeksi bakteri. Bakteri-bakteri
penyebab diare merupakan jenis bakteri Gram negatif diantaranya Campylobacter
jejuni, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Clostridium perfringen, Escherichia
coli, Clostridium difficile, dan Vibrio cholera (Guerrant et al. 2001).
Polymerase Chain Reaction (PCR) adalah salah satu teknik yang dapat
melipatgandakan DNA secara in vitro dalam waktu singkat (Yuwono 2006). Proses
PCR menggunakan sepasang primer, yang merupakan oligonukleotida yang berperan
sebagai amplifikasi molekul DNA, kemudian dielektroforesis dan diidentifikasi
menggunakan suatu gen penanda yaitu gen 16S rRNA (Aris 2013).
Gen 16S rRNA merupakan gen yang bersifat spesifik terhadap spesies
prokariot sehingga gen 16S rRNA dapat digunakan untuk mempelajari hubungan
filogenetik dari suatu spesies bakteri (Claridge 2004). Analisa sekuen akan
menemukan secara jelas bahwa bakteri patogen tersebut bersifat spesifik terhadap
bakteri-bakteri yang menyebabkan penyakit diare (Radji 2010).
Analisis sekuen merupakan suatu teknik yang dianggap paling baik untuk
melihat keanekaragaman hayati suatu kelompok organisme. Sekuensing DNA adalah
suatu proses penentuan urutan basa suatu DNA. Proses ini menggunakan prinsip
reaksi polimerisasi DNA secara enzimatis dengan penambahan suatu ddNTP.
Penyakit infeksi diare menjadi perhatian di Rumah Sakit Siloam Karawaci
Tangerang, karena banyaknya jumlah pasien infeksi diare yang disebabkan oleh
bakteri. Pada penelitian ini dilakukan identifikasi molekuler terhadap isolat bakteri
patogen diare yang diperoleh dari pasien infeksi diare. Isolat bakteri yang didapat dari
Rumah Sakit Siloam Karawaci Tanggerang Banten akan diamplifikasi dengan teknik
PCR, selanjutnya dilakukan sekuensing terhadap gen 16S rRNA. Sekuens yang
didapat akan dilakukan penyejajaran menggunakan situs online NCBI atau EMBL.
METODOLOGI
Alat Penelitian
Alat-alat yang digunakan adalah tabung reaksi, micropipet, tube sentrifius 2
ml, jarum ose, batang pengaduk, inkubator, autoklaf, laminar air flow, waterbath,
microsentrifuge refrigenerator (Bio-Lion XC-HR 20), peltier thermo cycler (Tanach
RAY MG48), elektroforesis (Mupid EXU), UV transiluminator (Extra Gene). .
Bahan Penelitian
1. Bahan Isolasi DNA Genom
Isolat bakteri diperoleh dari RS Siloam Tanggerang, ethanol 50%, 70%, 96%
dan GeneJET Genomic DNA Purification Kit (Thermo Scientific), yang terdiri dari:
lysis solution, digestion solution, proteinase K, RNAse solution, wash buffer I, wash
bufer II, dan Elution bufer.
2. Bahan Kimia untuk PCR
Forward primer (Genetika Science) 63f (5’-CAG GCC TAA CAC ATG CAA
GTC-3’) dan reverse primer (Genetika Science) 1387r (5’-GGG CGG WGT GTA
CAA GGC-3) (Marchesi et al. 1998). Deionized demineralized water (Thermo
2
Scientific), PCR Master Mix 2x (Thermo Scientific), yang terdiri dari: Taq
polimerase, PCR bufer, dATP, dGTP, dTTP, dCTP, dan Mg2+.
3. Bahan Kimia untuk Elektroforesis
Gel agarosa, loading dye (Thermo Scientific), etidium bromida, bufer Tris
Borat EDTA (TBE) 1x, dan DNA Ladder 1 kb (Thermo Scientific).
4. Bahan untuk Pengkayaan
Medium nutrient broth (NB) (Merck).
Prosedur Kerja
1. Isolasi DNA Genom dengan GeneJET Kit
Tahap awal yang dilakukan dalam penelitian meliputi persiapan alat dan
bahan yang digunakan dalam penelitian. Alat-alat seperti tip dan tube sentrifius
disterilkan terlebih dahulu dengan autoklaf suhu 121ºC selama 15 menit. Medium NB
yang digunakan disterilisasi dengan autoklaf suhu 121ºC selama 15 menit, sedangkan
sterilisasi dengan ethanol 70% digunakan untuk sterilisasi laminar air flow dan
lingkungan di sekitar perlakuan, sterilisasi dengan pemanasan menggunakan Bunsen
digunakan untuk jarum ose.Isolat bakteri yang akan digunakan untuk proses isolasi,
terlebih dahulu dikultur dalam medium nutrient broth dan diinkubasi 18-36 jam pada
suhu 37oC. Proses isolasi dilakukan berdasarkan protokol yang terdapat pada
GeneJET Genomic DNA Purification Kit.
Sebanyak 1,5-2,0 ml kultur bakteri dipindahkan ke dalam tabung
mikrosentrifus steril, kemudian disentrifugasi pada kecepatan 5000 x g selama 10
menit. Supernatan yang terbentuk dibuang dan jangan sampai ada sisa medium
dalam tabung. Endapan sel bakteri kemudian ditambahkan dengan 20 μl Proteinase K
dan 180 μl digestion solution dihomogenkan, lalu diinkubasi 30 menit pada suhu
56oC sambil sesekali dihomogenkan. Tahap selanjutnya ditambahkan 20 μl RNAse
solution lalu dihomogenkan dan diinkubasi suhu ruang selama 10 menit agar sel lisis
dengan sempurna. Ditambahkan 200 μl lysis solution, dihomogenkan selama 15 detik
lalu ditambahkan dengan 400 μl ethanol 50%, dihomogenkan kembali.
Campuran tersebut dipindahkan ke kolom GeneJET Genomic DNA
Purification yang dilengkapi dengan collection tube. Kolom disentrifugasi pada
kecepatan 6000 x g selama 1 menit. Kemudian kolom GeneJET Genomic DNA
Purification dipindahkan ke collection tube 2 ml baru. Pada kolom ditambahkan 500
μl wash bufer I yang telah ditambah dengan ethanol 96%, kemudian disentrifugasi
pada kecepatan 8000 x g selama 1 menit. Collection tube dibuang lalu diganti dengan
yang baru.
Ditambahkan 500 μl wash bufer II yang sudah ditambahkan ethanol 96%, lalu
disentrifugasi dengan kecepatan 12000 x g selama 3 menit. Jika terlihat larutan belum
homogen, maka larutan dihomogenkan kembali selama 1 menit dengan kecepatan
maksimum. Diambil larutan bagian bawah tube lalu pindahkan ke kolom GeneJET
Genomic DNA Purification 1,5 ml steril. Terakhir, ditambahkan 200 μl elution bufer
untuk melarutkan DNA genom. Kemudian diinkubasi selama 2 menit pada suhu
ruang, dan disentrifugasi pada kecepatan 8000 x g selama 1 menit. Didapat DNA
murni, lalu disimpan pada suhu _20oC.
3
Selanjutnya adalah analisis DNA genom bakteri dengan menggunakan
Elektroforesis. Untuk membuat agarosa dengan konsentrasi 1,6%, yaitu ditimbang
agarosa sebanyak 0,80 g dalam 50 ml air suling steril, dan dididihkan hingga larut.
Setelah agak dingin, larutan tersebut dituang pada cetakan gel, sisir dipasang,
dan didiamkan hingga gel mengeras. Sisir diangkat dan nampan dipindahkan ke
wadah elektroforesis.
Wadah tersebut terlebih dahulu diberi bufer TBE 1x hingga menggenangi
permukaan gel agarosa. Sebanyak 0,5 μl Loading dye ditambahkan pada 2,5 μl
sampel DNA dan dihomogenkan. Campuran tersebut dimasukkan ke dalam cetakan
sisir yang tersedia secara hati-hati. Elektroforesis dinyalakan dan tegangan diatur
sebesar 100 volt. Kemudian, ditunggu hingga xylene cyanol mencapai 1 cm dari tepi
bawah gel. Selanjutnya gel agarosa diambil dan dimasukkan ke dalam wadah yang
sudah mengandung etidium bromida selama lima menit dalam ruangan gelap. Hasil
diamati pada UV transiluminator pada panjang gelombang 500 nm dan fragmen
DNA yang akan muncul didokumentasikan. Hasil positif ditandai dengan adanya
fragmen DNA yang muncul pada gel agarosa.
2. Amplifikasi DNA Target dengan PCR
Proses amplifikasi genom bakteri terhadap gen 16S rRNA menggunakan
primer 63f (5’-CAG GCC TAA CAC ATG CAA GTC-3’) dan pimer 1387r (5’GGG CGG WGT GTA CAA GGC-3’) (Marchesi et al. 1998). Proses amplifikasi
dilakukan berdasarkan protokol pada PCR Master Mix 2x. Dimasukkan sebanyak 25
μl PCR master mix 2x ke dalam microtube 0,5 ml, kemudian ditambahkan 15 μl
deionized demineralized water (ddH2O) dan dihomogenkan. Primer 63f dan 1387r
ditambahkan masing-masing sebanyak 2 μl, lalu dihomogenkan. Larutan tersebut
dibagi menjadi dua bagian dengan dipipet sebanyak 22 μl dan dimasukkan ke dalam
microtube 0,5 ml steril. Sebanyak 3 μl cetakan DNA ditambahkan ke dalam masingmasing microtube untuk memperoleh volume total 25 μl lalu dihomogenkan. Larutan
tersebut di spindown dan dimasukkan ke dalam mesin PCR. Kondisi PCR diatur :
Denaturasi awal pada suhu 94oC selama 3 menit sebanyak 1 siklus, denaturasi pada
suhu 94oC selama 1 menit sebanyak 30 siklus, annealing pada suhu 55oC selama 1
menit sebanyak 30 siklus, ekstensi pada suhu 72oC selama 5 menit sebanyak 30 siklus
dan ekstensi akhir pada suhu 72oC selama 10 menit sebanyak 1 siklus (Prabu et al.
2010).
Hasil amplifikasi dianalisis menggunakan elektroforesis gel agarosa 1,6 %.
3. Sekuensing Gen 16S rRNA
Amplikon dimasukkan ke dalam microtube 0,5 ml kering dan steril, kemudian
diberi label dan disegel dengan parafilm untuk mencegah kebocoran dan perembesan.
Sampel dikirim ke 1st BASE Laboratories, Malaysia untuk selanjutnya dipurifikasi
dan disekuensing.
4. Penyejajaran Hasil Sekuen dengan Menggunakan Program Online NCBI
dan EMBL
Sekuen DNA yang diperoleh dibandingkan dengan sekuen database pada
situs http://www.ebi.ac.uk EMBL dan http://www.ncbi.nlm.gov NCBI. Lalu
dilakukan penyejajaran terhadap persen kemiripannya dengan bakteri lain pada
database. Hasilnya dapat dibuat untuk membuat pohon filogenetik.
4
Teknik Analisis Data
Analisis data hasil deteksi PCR dengan dielektroforesis dan dianalisis
berdasarkan ada tidaknya potongan pita DNA yang terbentuk, dan data disajikan
secara deskriptif dalam bentuk tabel dan gambar.
HASIL DAN PEMBAHASAN
A. Isolasi DNA Bakteri
Proses isolasi DNA merupakan tahapan awal dari seluruh rangkaian
penelitian. Tahap pendahuluan bakteri dikultur dalam medium Nutrient Agar (NA)
untuk melihat bentuk koloni bakteri yang terdapat dalam isolat murni. Koloni-koloni
yang telah tumbuh selanjutnya dipindahkan dalam medium Nutrient Broth (NB)
karena penggunaan medium cair akan memudahkan pada saat proses isolasi. Medium
diinkubasi selama 18-48 jam, menurut Sambrook and Russell (2001) pertumbuhan
bakteri mencapai fase log akhir setelah diinkubasi semalam. Fase log akhir
merupakan saat yang optimal untuk memanen bakteri, sehingga kuantitas DNA yang
diperoleh maksimal.
x
Gambar 3. Bentuk koloni bulat bakteri Escherichia coli dari pasien
Diare RS Siloam Tangerang dalam medium NA. Tanda x
(koloni bulat).
Setelah proses perbanyakan bakteri. Bakteri-bakteri dilakukan isolasi dan
pemurnian DNA dengan menggunakan GeneJET Kit. Kegiatan isolasi DNA ini
dilakukan untuk mendapatkan cetakan DNA yang murni dari masing-masing isolat.
Proses isolasi DNA dilakukan sesuai dengan protokol yang terdapat pada GeneJET
Genomic DNA Purification Kit.
5
EO1
M
x
Gambar 4. Elektroforegram total genom DNA bakteri EO1 dari
pasien diare RS Siloam Karawaci Tangerang Banten.
Lajur M (marker), EO1 (DNA bakteri) dan x (pita DNA
M EO3
x
Gambar 5. Elektroforegram total genom DNA bakteri EO3 dari
pasien diare RS Siloam Karawaci Tangerang Banten.
Lajur M (marker), EO3 (DNA bakteri) dan x (pita DNA).
Dari kesepuluh isolat yang diperoleh dari rumah sakit, setelah dilakukan
isolasi hanya didapatkan dua isolat murni DNA bakteri. Yaitu sampel EO1 dan EO3.
Hal ini disebabkan pada saat memvisualisasikan dengan UV Transiluminator, Bentuk
DNA yang diperoleh memiliki tingkat kemurnian yang baik pada sampel tersebut
dengan ditandai munculnya bentuk pita tunggal atau pita DNA yang tidak berekor.
Menurut Herison dkk. (2003) kualitas DNA yang baik yaitu tidak terdapat pola DNA
yang terdegradasi pada saat visualisasi gel agarosa, sehingga DNA ini dapat
dilanjutkan untuk amplifikasi dengan PCR.
B. Amplifikasi Gen 16S rRNA Bakteri
Amplifikasi DNA dilakukan menggunakan metode PCR dengan primer 63f
(5’-CAG GCC TAA CAC ATG CAA GTC-3’) dan primer 1387r (5’-GGG CGG
WGT GTA CAA GGC-3) (Marchesi et al. 1998).
6
M
EO3
x
Gambar 6. Elektroforegram amplikon Gen 16S rRNA bakteri Escherichia
coli EO3 dari pasien diare RS Siloam Karawaci Tangerang
Banten. Lajur M (marker), EO3 (DNA bakteri) dan x (pita DNA).
M
EO1
x
Gambar 7. Elektroforegram amplikon Gen 16S rRNA bakteri Escherichia
coli EO1 dari pasien diare RS Siloam Karawaci Tangerang
Banten. Lajur M (marker), EO1 (DNA bakteri) dan x (pita DNA).
Proses amplifikasi dimulai dengan denaturasi awal pada suhu 94oC selama
tiga menit, yang bertujuan untuk mempersiapkan untai DNA yang akan didenaturasi.
Denaturasi pada suhu 94oC selama satu menit bertujuan untuk memisahkan untai
ganda DNA. Annealing pada suhu 55oC selama satu menit untuk memberi waktu
pada primer untuk menempel pada daerah tertentu dari target DNA. Proses ekstensi
pada suhu 72oC selama lima menit dilakukan dengan tujuan untuk memperpanjang
gen 16S rRNA. Ekstensi akhir pada suhu 72oC yang bertujuan untuk
menyempurnakan proses penggabungan untai DNA. Proses denaturasi, annealing,
dan ekstensi dilakukan sebanyak 30 siklus bertujuan untuk melipatgandakan
amplikon, agar saat dilakukan sekuensing jumlah DNA dapat terbaca pada mesin
DNA sequencer.
7
Visualisasi gambar 7 (EO1) memiliki bentuk smear yang panjang dan terlihat
sangat jelas. Hal ini menunjukkan, DNA yang teramplifikasi menunjukkan kualitas
DNA kurang baik. Kualitas ini dapat dipengaruhi oleh konsentrasi primer, dNTP dan
MgCl2 yang digunakan. Menurut Henegariu et al. (1997) konsentrasi primer yang
kurang baik dapat menyebabkan primer menempel pada sekuen yang tidak diinginkan
dan dapat menyebabkan proses PCR tidak berjalan efisien, sehingga menghasilkan
produk yang kurang baik.
Pada EO3 muncul pita tunggal, sehingga didapat produk DNA target dengan
kualitas baik, sehingga EO3 dapat dilakukan sekuensing DNA dengan mesin DNA
sequencer.
C. Analisis Hasil Sekuensing
Analisis bioinformatika merupakan suatu analisis dengan meng-input data
hasil sekuens (query) pada program resmi di GenBank. Analisis dilakukan dengan
menggunakan dua program online yaitu pada situs http://www.ncbi.nlm.gov dan
http://www.ebi.ac.uk. Sebelum dianalisis dengan program tersebut sebaiknya data
hasil sekuens dilakukan analisa untuk melihat bentuk puncak atau elektroforegram
yang didapat.
Gambar 8. Elektroforegram sekuens Gen 16S rRNA dari bakteri
Escherichia coli pasien diare RS Siloam Karawaci Tangerang
Banten menggunakan primer 1387r
Gambar 9. Elektroforegram sekuens Gen 16S rRNA dari bakteri
Escherichia coli pasien diare RS Siloam Karawaci Tangerang
Banten menggunakan primer 63f
8
Berdasarkan gambar 8 didapat lambang N pada proses pembacaan awal
dengan mesin sequencer. Lambang N merupakaan suatu bentuk analisis yang tidak
cukup jelas untuk menujukkan keberadaan basa A, C, G, atau T, sehingga harus
dihilangkan terlebih dahulu dengan menggunakan program BioEdit. Data yang
diperoleh dari program BioEdit berupa data hasil consensus antara primer forward
dan primer reverse. Consensus merupakan suatu program yang terdapat pada BioEdit
yang digunakan untuk mengontruksi kembali rangkaian urutan DNA yang saling
tumpang tindih menjadi bentuk yang tunggal, sehingga dapat dilakukan ke tahap
selanjutnya yaitu analisis di GenBank pada program Basic Local Alignment Search
Tool (BLAST).
Gambar 10. Hasil BLASTN dari sekuens Gen 16S rRNA bakteri pasien
diare RS Siloam Karawaci Tangerang Banten.
Dari hasil BLAST dengan NCBI didapatkan data berupa garis-garis bewarna
merah (gambar 10). Hasil ini menunjukkan suatu skala pada tingkat kesamaan
sekuens-sekuens yang telah disejajarkan. Hasilnya menunjukkan garis-garis bewarna
merah yang berarti kedua sekuens forward maupun reverse pada 16S rRNA memiliki
tingkat kemiripan yang sangat mirip yaitu lebih dari 200 nukleotida. Warna merah
pada hasil menunjukkan bahwa data hasil BLAST valid, karena jika datanya kurang
bagus akan ditunjukkan dengan warna biru sampai hitam.
9
Gambar 11. Hasil BLASTN dari sekuens Gen 16S rRNA bakteri pasien
diare RS Siloam Karawaci Tangerang Banten.
Gambar 11 merupakan kelanjutan dari hasil BLASTN, dari data tersebut
didapatkan bahwa sampel isolat memiliki persen kemiripan 99% pada jenis bakteri
Escherichia coli O157:H7 Str Sakai. Nilai E-value yang dihasilkan adalah nol, nilai
nol ini menunjukkan sekuens homolog dengan sekuens yang terdapat di GenBank.
Hasil ini sesuai dengan penelitian yang dilakukan oleh (Sugianto 2007) yang
dilakukan secara mikrobiologi bahwa bakteri utama yang terdapat pada penderita
diare adalah jenis bakteri Escherichia coli. Hasil penelitian yang dilakuan secara
molekuler maupun penelitian secara mikrobiologi telah didapatkan hasil yang sama,
tetapi penelitian secara molekuler memiliki hasil yang lebih jelas karena terlihat
sampai pada tingkatan strain bakteri tersebut, sedangkan tidak didapatkan pada
penelitian yang dilakukan secara mikrobiologi
10
Gambar 12. Hasil BLASTN dari sekuens Gen 16S rRNA bakteri pasien
diare RS Siloam Karawaci Tangerang Banten.
Dari gambar 12 didapat bahwa terdapat garis-garis penghubung antara
sekuens yang di atas dengan sekuens yang di bawah. Garis ini menunjukkan terdapat
kesesuaian antara sekuens forward 16S dengan sekuens reverse 16S. Sekuens
tersebut memiliki kesamaan 99% dengan bakteri Escherichia coli serta ada bagianbagian yang tak terhubung pada garis, menunjukkan adanya perbedaan dari kedua
sekuens tersebut pada saat proses penyejajaran.
Data sekuens gen 16S rRNA dari sampel isolat kemudian dibandingkan
dengan beberapa data sekuen gen 16S rRNA dari beberapa spesies E.coli lainnya.
Hasil perbandingan sekuen ini kemudian divisualisasikan dalam bentuk pohon
filogenetik yang dapat menunjukkan hubungan kekerabatan antara satu galur E.coli
dengan galur yang lainnya. Pohon filogenetik membuat percabangan yang berupa
akar dan cabang. Akar pohon merupakan titik yang bertindak sebagai nenek moyang,
sedangkan cabang merupakan titik yang menjelaskan tentang spesies-spesies yang
saling memiliki hubungan kekerabatan. Makin dekat cabang, maka hubungan antar
spesies itu semakin dekat (Baldauf 2003).
11
Shigella sonnei Ss046 16 S ribosomal RNA, complete
sequence
Escherichia coli O157:H7 str Sakai 16S ribosomal RNA, complete
sequence
EO3
Escherichia coli str K-12 MG 1655 16S ribosomal RNA, complete
sequence
Shigella dysentriae Sd197 16S ribosomal RNA, complete sequence
Shigella dysentriae strain ATCC 13313 16S ribosomal RNA,
complete sequence
Gambar 13. Cladogram bakteri Escherichia coli O105 H:7 str sakai pasien
diare RS Siloam Karawaci Tangerang Banten. Tanda panah:
sampel EO3
Pohon filogenetik selain menunjukkan kekerabatan antar spesies yang
diperbandingkan, juga menggambarkan perubahan yang terjadi pada gen penanda
untuk masing-masing spesies. Semakin panjang suatu cabang artinya semakin banyak
perubahan yang terjadi pada gen penanda selama proses evolusi, akibatnya spesies
yang berada pada cabang tersebut dapat dikatakan lebih maju. Cladogram merupakan
cara yang dipakai untuk mempresentasikan pohon filogenetik (Baldauf 2003). Dari
cladogram diketahui sampel EO3 memiliki hubungan yang dekat dengan spesies
Escherichia coli str K-12 MG 1655.
Dari hasil penyejajaran dengan menggunakan BLAST pada situs NCBI
didapat bahwa sampel adalah bakteri jenis Escherichia coli O157: H7. Diketahui
bakteri ini yang sering terdapat pada penderita diare. Escherichia coli O157: H7
adalah strain enterohemorrhagic (penyebab diare dan kolitis/pendarahan pada
dinding kolon). (Obrig 2010).
SIMPULAN
Identifikasi bakteri patogen penyebab diare berhasil dilakukan dengan
menggunakan teknik PCR. Tahap awal isolasi dengan menggunakan GeneJET
Genomic DNA Purification Kit dihasilkan suatu produk DNA yang murni dengan
ditunjukkan munculnya pita tunggal pada elektroforesis gel agarosa. Hasil amplifikasi
dengan PCR didapatkan ukuran DNA sekitar 2500 pasang basa. Hasil sekuensing dan
penyejajaran Gen 16S rRNA yang dilakukan dengan program online NCBI dan
EMBL menyatakan bahwa sampel memiliki kemiripan 99% dengan bakteri
Escherichia coli O157 H:7. Bakteri tersebut diketahui menjadi penyebab utama
penyakit diare.
12
DAFTAR PUSTAKA
Aris M, Sukenda, Harris E, Sukadi MF, Yuhana M. 2013. Identifikasi Molekuler
Bakteri Patogen dan Desain Primer PCR. Jurnal Budidaya Perairan. Vol 1
No 3 Halm. 43-50
Baldauf SL. 2003. Phylogeny for the faint of heart:a tutorial. Journal of Biology.
No.6 Halm. 345-361
Clarridge JE. 2004. Impact of 16S rRNA Gene Sequence Analysis for Identification
of
Bacteria on Clinical Microbiology and Infectious Diseases. Journal Clinical
Microbiology Reviews. Vol 17 Halm. 840-862
Guerrant RL, Van Gilder T, Steiner TS, Thielman NM, Slutsker L, Tauxe RV,
Hennessy T, Griffin PM, Dupont H , Sack RB, Tarr P, Neill M , Nachamkin
I , Reller LB, Osterholm MT, Bennish ML, Pickering LK. 2001. Practice
Guidlines for the Management of Infectious Diarrhea. Journal Clinical
Infectious Deseases. Vol 32 Halm. 331-351
Henegariu O, Heerema NA, Dlouhy SR, Vance GH, Vogh PH. 1997. Multiplex PCR:
Critical Parameters and Step-By-Step Protocol. Biomolecular Techniques.
Halm 504-511
Herison C, Rustikawati, Eliyanti. 2003. Penentuan Protokol yang Tepat untuk
Menyiapkan DNA Genom Cabai (Capsicum sp). Jurnal Akta Agrosia. Vol 6.
Halm 38-42
Marchesi JR, Takuichi S, Weightman AJ, Martin TA, Fry JC, Hiom SJ, Wade WG.
1998. Design and Evaluation of Useful Bacterium-Specific PCR Primers That
Amplify Genes Coding for Bacterial 16S rRNA. Journal Applied and
Environmental Microbiology.Vol 64 Halm. 795-799.
Prabhu V, Isloor S, Balu M, Suryanarayana VVS, Rathnamma D. 2010. Genotyping
by ERIC-PCR of Escherichia coli Isolated from Bovine Mastitis Cases.
Journal of Biotechnology. Vol 9 Halm. 298-301
Radji M, Puspaningrum A, Sumiati A. 2010. Deteksi Cepat Bakteri Escherichia coli
dalam Sampel Air dengan Metode Polymerase Chain Reaction Menggunakan
Primer 16E1 Dan 16E2. Makara Vol 14 Halm. 39-43
Sambrook J, Russell DW. 2001. Molecular cloning a laboratory Manual. Cold
Spring Harbor Laboratory Press. New York.
Sugianto E. 2006. Etiologi Diare Akut Infektif Di Puskesmas Mranggen dan
Karangawen Kabupaten Demak. Bagian penyakit Dalam fakultas kedokteran
UNDIP RSUP Dr. Kariadi Semarang.
Obrig TG. 2010. Escherichia coli Shiga Toxin Mechanisms of Action in Renal
Disease.
Journal Toxins Department of Microbiology and Immunology. Halm 27702792
Yuwono T. 2006. Teori Dan Aplikasi Polymerase Chain Reaction. Andy Publisher,
Yogyakarta. Halm 23-278.
13