Preparasi, Biodistribusi Dan Clearance Senyawa Pengkontras Mri

SEMINAR NASIONAL VI
SDM TEKNOLOGI NUKLIR
YOGYAKARTA, 18 NOVEMBER 2010
ISSN 1978-0176
PREPARASI, BIODISTRIBUSI DAN CLEARANCE
SENYAWA PENGKONTRAS MRI Gd-DTPA-PAMAM
G4-NIMOTUZUMAB MELALUI SIMULASI MENGGUNAKAN
153Gd-DTPA-PAMAM G4-NIMOTUZUMAB
Adang H.G., Rista S.*, A. Mutalib, Yono S., Ratna Dini H., Karyadi, Sri Aguswarini,
* RS Hasan Sadikin Bandung
E-mail: [email protected]
Abstrak
PREPARASI, BIODISTRIBUSI DAN CLEARANCE SENYAWA PENGKONTRAS MRI GdDTPA-PAMAM G4-NIMOTUZUMAB MELALUI SIMULASI MENGGUNAKAN
153Gd-DTPAPAMAM G4-NIMOTUZUMAB. Salah satu tantangan besar dalam pengobatan adalah bagaimana cara
mengirimkan bahan aktif obat ke sasaran secara efektif, tidak menyebar ke organ atau jaringan lain, karena
penyebaran ke organ atau jaringan lain akan mengakibatkan efek samping pada organ atau jaringan
tersebut. Dendrimer yang mampu berinteraksi dengan jaringan tumor kanker, merupakan pilihan yang
sangat baik untuk membawa obat/senyawa ke organ/jaringan tumor atau kanker. Keunggulan dendrimer
adalah pada bentuknya yang bercabang-cabang dengan permukaan yang sangat banyak, memungkinkan
untuk dapat menyisipkan zat untuk diagnosa, terapi atau molekul biologi aktif lainnya. Penelitian ini
bertujuan untuk mengetahui karakteristik dan potensi Gd-DTPA-PAMAM G4-Anti EGFR Nimotuzumab
sebagai senyawa pengkontras untuk mendeteksi tumor otak glioma. Penelitian dimulai dengan
mengkonjugasikan CHX-A”-DTPA dengan PAMAM (poliamidoamin) G4 yang kemudian diikuti dengan
mereaksikan DTPA-PAMAM G4 dengan anti EGFR Nimotuzumab. Senyawa komplek DTPA-PAMAM G4Nimotuzumab kemudian direaksikan dengan logam paramagnetik Gadolinium (Gd) untuk menghasilkan
senyawa pengkontras Gd-DTPA-PAMAM G4-Nimotuzumab yang lebih spesifik terhadap kanker glioma.
Oleh karena Gd-DTPA-PAMAM G4-Nimotuzumab merupakan
senyawa radioaktif, maka untuk
memudahkan karakterisasinya pada penelitian ini, proses preparasinya menggunakan senyawa bertanda
153Gd-DTPA-PAMAM G4-Nimotuzumab. Efisiensi penandaan/pembentukan DTPA-PAMAM G4Nimotuzumab yang yang ditentukan dengan metode KLT (Kromatografi Lapis Tipis) dan KCKT
(Kromatografi Cair Tekanan Tinggi) setelah proses pemurnian menggunakan penyaring protein (Vivaspin)
>90 %. Profil biodistribusi 153Gd-DTPA-PAMAM G4-Nimotuzumab memperlihatkan bahwa konsentrasi
radioaktif pada hati dan limfa maíz cukup tinggi 48 jam setelah injeksi. Profil clearance komplek 153GdDTPA-PAMAM G4-Nimotuzumab menunjukkan bahwa 19,4 % dan 3,2 % komplek diekskresikan berturutturut melalui urin dan feces sampai dengan 120 jam setelah injeksi. Pencitraan menggunakan senyawa
pengkontras 153GD-DTPA-PAMAM G4-Nimotuzumab yang dilakukan pada tikus model (tikus putih yang
pada otaknya telah diimplantkan sel-sel glioma) dengan alat MRI memberikan nilai densitas citra berturutturut 677, 730,740 dan 667 pada 1,2, 3 dan 4 jam setelah penyuntikan.
Kata Kunci : dendrimer, glioma, PAMAM G4, Nimotuzumab,senyawa pengontras.
Abstract
PREPARATION, BIODISTRIBUTION AND CLEARANCE OF MRI CONTRAST AGENT GdDTPA-PAMAM G4-NIMOTUZUMAB SIMULATED BY USING 153Gd-DTPA-PAMAM G4NIMOTUZUMAB. One of the major challenges in medicine is how to deliver the active ingredient of drug
to target effectively where it do not spread to other organs or tissues, because it will cause adverse effects in
the organ or tissue. A conjugated dendrimer is able to interact with the tumor tissue of cancer; therefore it is
Adang H G
711
STTN-BATAN & Fak. Saintek UIN SUKA
SEMINAR NASIONAL VI
SDM TEKNOLOGI NUKLIR
YOGYAKARTA, 18 NOVEMBER 2010
ISSN 1978-0176
a very good choice for delivery of drugs / compounds to the organ / tissue tumors or cancer. The form of
dendrimer branching with a vast surface, allowing the substance to be inserted for the diagnosis, therapy or
other active biological molecules. This study was aimed to determine the characteristics and potential of GdDTPA-PAMAM G4-Anti EGFR Nimotuzumab as a contrast agent for detection of brain glioma tumor. The
study was began by conjugating a CHX-A"-DTPA to PAMAM (polyamidoamine) G4 which was then
followed by reacting the resulted PAMAM G4-DTPA with anti EGFR Nimotuzumab. Finally the DTPAPAMAM G4 formed was then reacted with paramagnetic metal, Gd, to form Gd-DTPA-PAMAM G4Nimotuzumab. As Gd-DTPA-PAMAM G4-Nimotuzumab is not a radioactive compound, and in order for its
formation and characterization processes were easily monitored, these processes were simulated using a
153Gd-DTPA-PAMAM G4-Nimotuzumab. The 153Gd-DTPA-PAMAM G4-Nimotuzumab with labeling
efficiency of > 95% which was measured by TLC and HPLC methods, was obtained successfully.
Biodistribution profile of 153Gd-DTPA-PAMAM G4-Nimotuzumab showed that radioactive concentrations
were still relatively high in liver and spleen 48 hours post injection. Clearance profile showed that 19.4 %
and 3.2 % of 153Gd-DTPA-PAMAM G4-Nimotuzumab were removed through urine and feces 96 hours post
injection. The MRI imaging of Gd-DTPA-PAMAM G4-Nimotuzumab on white rat model (glioma implanted
rat) gave the image density of 677, 730, 740 and 667; 1 hour, 2 ,3 and 4 hours post injection respectively.
Keywords : dendrimer, glioma, PAMAM G4, Nimotuzumab, contrast agent
PENDAHULUAN
Kanker adalah sel-sel yang kehilangan pengendalian
dan mekanisme normalnya, sehingga mengalami
pertumbuhan yang tidak teratur. Kanker dapat
terjadi pada berbagai jaringan dalam organ.
Menghindari faktor penyebab kanker adalah yang
terbaik, tetapi hal ini sangat sulit karena penyebab
kanker belum diketahui dengan pasti, oleh karena itu
penanggulangan lebih ditekankan pada upaya
deteksi dini yang diikuti dengan pengobatan [1].
Meskipun kemajuan yang pesat telah dicapai
dalam pemahaman tentang biologi molekuler,
penemuan biomarker kanker, radioterapi dan
kemoterapi, tetapi semua itu sampai saat ini masih
belum mampu memperbaiki survival rate penderita
kanker secara keseluruhan. Saat ini klasifikasi
diagnostik
dan
prognostik
tidak
dapat
mencerminkan seluruh heterogenitas klinis dari
penyakit kanker sehingga sulit untuk memprediksi
keberhasilannya.
Sebagian
besar
senyawa
antikanker yang ada saat ini, tidak secara jelas dapat
membedakan antara kanker dan sel normal,
sehingga dapat menimbulkan toksisitas dan efek
samping yang membahayakan pada sel disekitarnya
[1, 2]
. Pengembangan perangkat deteksi dini penyakit
kanker yang diperlukan pada saat ini adalah yang
spesifik ke target dan seminimal mungkin masuk ke
organ/jaringan yang bukan target, sehingga tidak
bias dalam diagnosanya yang pada akhirnya akan
memudahkan dalam pengobatan.
Dalam bidang kesehatan , konyugat dendrimer
banyak digunakan sebagai sistem pengiriman obat
(drug delivery system) yaitu dengan membawa
bahan aktif secara selektif langsung ke sasaran
sehingga tidak menyebar ke bagian tubuh yang
STTN-BATAN & Fak. Saintek UIN SUKA
712
tidak diinginkan. Keunggulan dendrimer sebagai
sistem pengiriman obat adalah pada struktur
molekulnya
yang bercabang-cabang dengan
permukaan yang sangat banyak, sehingga
memungkinkan untuk dapat menyisipkan zat untuk
diagnosa, terapi atau molekul biologi aktif lainnya
pada molekul dendrimer tersebut. Satu molekul
dendrimer dapat membawa molekul yang
mengandung sel kanker , zat terapi pembunuh sel
kanker, molekul pemberi sinyal untuk sel kanker.
Pengkonyugasian dendrimer dapat dilakukan
dengan molekul pembawa yang spesifik ke target
(targeted specific) seperti asam folat, peptida,
monoklonal antibody. Jika konyugat dendrimer ini
kemudian digabungkan dengan logam paramagnetik
dengan menggunakan suatu ligand yang sesuai
(seperti DTPA atau DOTA) maka akan terbentuk
senyawa pengkontras untuk MRI yang dipakai
untuk keperluan diagnosa suatu penyakit tertentu
sesuai dengan kespesifikan molekul yang diikatkan
pada dendrimer tersebut [3, 4, 5, 6, 7, 8].
Nimotuzumab merupakan antibodi monoklonal
yang digunakan sebagai obat anti kanker.
Nimotuzumab ini termasuk dalam kelompok
inhibitor epidermal growth factor receptor (EGFR).
Senyawa ini menghambat protein reseptor
epidermal growth factor(EGF) yang banyak
terdapat pada pemukaan sel kanker. EGF secara
normal menstimulasi sel untuk tumbuh dan
berdiferensiasi. Dengan menghambat reseptor ini,
nimotuzumab mencegah sel kanker menerima pesan
yang diperlukan sel untuk tumbuh, berkembang dan
menyebar. Nimotuzumab menghambat aktivasi
protein tirosin kinase dan berikatan dengan afinitas
yang optimal serta spesifisitas tinggi pada daerah
ekstraseluler dari EGFR, sehingga dapat
Adang H G
SEMINAR NASIONAL VI
SDM TEKNOLOGI NUKLIR
YOGYAKARTA, 18 NOVEMBER 2010
ISSN 1978-0176
menghambat ikatan ligan dan aktivasi reseptor.
Nimotuzumab terbuat dari rangkaian asam amino
yang 95% rangkaiannya sama dengan rangkaian
asam amino antibodi manusia. EGFR merupakan
target kunci dalam pengembangan terapi kanker.
Obat-obatan dengan target EGFR terbukti dapat
meningkatkan efek
terapi bila digunakan
bersamaan dengan pengobatan tradisional seperti
terapi radiasi dan kemoterapi [9, 10, 11, 12, 13].
Kromatografi adalah teknik pemisahan
campuran didasarkan atas perbedaan distribusi dari
komponen-komponen tersebut diantara 2 fasa yaitu
fasa diam dan fasagerak. Teknik pemisahan ini
memanfaatkan interaksi komponen dengan fasa
diam dan fasa gerak serta sifat fisik dan sifat kimia
komponen. Salah satu jenis teknik kromatografi
yang umum adalah kromatografi lapis tipis yaitu
merupakan salah satu analisis kualitatif dari suatu
sampel dengan memisahkan komponen-komponen
sampel berdasarkan perbedaan kepolaran. Teknik
ini biasanya menggunakan fasa diam dalam bentuk
pelat silika/alumina dan fasa geraknya dengan jenis
sampel yang akan dipisahkan. Teknik kromatografi
lainnya yang banyak digunakan saat ini adalah
KCKT (kromatografi cair kinerja tinggi) merupakan
salah satu teknik kromatografi untuk zat cair yang
biasanya disertai dengan tekanan tinggi. Seperti
teknik kromatografi pada umumnya, KCKT
memisahkan molekul berdasarkan perbedaan
afinitasnya terhadap zat padat tertentu. Cairan yang
akan dipisahkan merupakan fasa cair dan zat
padatnya merupakan fasa diam (stasioner). Teknik
ini sangat berguna untuk memisahkan beberapa
senyawa sekaligus karena setiap senyawa
mempunyai afinitas selektif antara fasa diam
tertentu dan fasa gerak tertentu. Dengan bantuan
detektor serta integrator kita akan mendapatkan
kromatogram. Kromatorgram memuat waktu retensi
serta tinggi puncak suatu senyawa. Dalam
penelitian ini metode KLT dan KCKT digunakan
untuk menentukan kemurnian radiokimia senyawa
153
Gd-DTPA-PAMAM G4-Nimotuzumab sebagai
model dari senyawa pengkontras Gd-DTPAPAMAM G4-Nimotuzumab.
Dalam penelitian ini telah dilakukan pembuatan
senyawa pengkontras MRI spesifik target berbasis
dendrimer (PAMAM G4), Gd-DTPA-PAMAM G4Anti EGFR antibodi monoklonal (Gd-DTPAPAMAM G4-anti EGFR Nimotuzumab). Penyiapan
dilakukan dengan mengkonyugasikan PAMAM G4
pada Nimotuzumab. PAMAM G4-Nimotuzumab
yang terbentuk kemudian direaksikan dengan logam
paramagnetik Gd dengan menggunakan bifuctional
chelating agent DTPA. Penelitian ini bertujuan
untuk mengetahui karakteristik dan potensi GdDTPA-PAMAM
G4-Nimotuzumab
sebagai
senyawa pengkontras untuk mendeteksi tumor otak
Adang H G
713
glioma. Oleh karena senyawa Gd-DTPA-PAMAM
G4-Nimotuzumab bukanlah senyawa radioaktif,
maka untuk memudahkan karakterisasinya pada
penelitian ini, proses preparasi sediaan Gd-DTPAPAMAM G4-Nimotuzumab disimulasikan dengan
Gd-DTPA-PAMAM G4-Nimotuzumab bertanda
153
Gd (153Gd-DTPA-PAMAM G4-Nimotuzumab)
yang lebih mudah dideteksi dengan menggunakan
alat pencacah radioaktif [14]. Pada penelitian ini
penentuan kemurnian radiokimia komplek 153GdDTPA-PAMAM
G4-Nimotuzumab
dilakukan
dengan metode kromatografi lapis tipis dan KCKT.
Karakterisasi senyawa 153Gd-DTPA-PAMAM G4Nimotuzumab dilakukan dengan melihat profil
biodistribusi, profil clearance dan pencitraan
dengan alat MRI menggunakan hewan uji yang
telah ditumbuhi dengan sel kanker glioma pada
otaknya.
METODE
1.
Bahan dan Peralatan
Penelitian ini dilakukan di Pusat Radioisotop dan
Radiofarmaka BATAN. Bahan yang digunakan
dalam penelitian ini adalah senyawa CHX-A”-DTPA
[(R)-2-Amino-3-(4-isothiocyanatophenyl)prophyltrans-(S,S)-cyclohexane-1,2-diaminepentaacetic
acid] yang diperoleh dari Macrocyclic. Dendrimer
yang digunakan adalah polyamidoamin (PAMAM)
G4 dengan gugus amin dalam bentuk larutan 10 %
dalam metanol dari pemasok Aldrich. Nimotuzumab
diperoleh dalam bentuk larutan injeksi TheraCim
dari Innogen. Tikus yang telah diinfeksi tumor otak
diperoleh dari bagian Farmakologi RSHS Bandung.
Larutan 153Gd sitrat 1 mM dibuat dengan melarutkan
10 µmol GdCl3 (Stream) yang telah diirradiasi
dalam 9 ml akuades dan 100 µmol Na sitrat,
kemudian pH dinetralkan dan volume ditambah
sampai 10 ml. Larutan salin, air suling diperoleh
dari IPHA dan gas N2 dari IGI. Kolom PD-10
(Sephadex G25) diperoleh dari Pharmacia Hewan
yang digunakan dalam penelitian ini adalah mencit
dan tikus putih. Single channel analyzer
(BIOSCAN) dan Gammatec II digunakan sebagai
pencacah radioaktivitas pada penentuan kemurnian
radiokimia. Pelat silika gel F254 (Merck) digunakan
sebagai fasa diam pada kromatografi lapis tipis
(KLT). Alat kromtografi cair kinerja tinggi KCKT
(Shimadzu) dengan detektor UV dan radioaktif
(NaI-Tl) digunakan untuk menentukan kemurnian
radiokimia.
Kolom yang digunakan untuk
penentuan kemurnian radiokimia dengan KCKT
adalah Size Exclusion Column 250 (SEC, 300 x 7,8
mm dia) didapat dari pemasok Biorad.
2.
Konyugasi
CHX-A”-DTPA
dengan
STTN-BATAN & Fak. Saintek UIN SUKA
SEMINAR NASIONAL VI
SDM TEKNOLOGI NUKLIR
YOGYAKARTA, 18 NOVEMBER 2010
ISSN 1978-0176
PAMAM G4
6.
Dendrimer PAMAM G4 dalam metanol 10% b/v ,
dimasukkan dalam vial 10 ml, kemudian dialiri gas
nitrogen sampai kering. Isi vial (PAMAM G4)
dilarutkan kembali dalam 200 µL dapar fosfat pH 7.
Kedalam larutan PAMAM G4, ditambahkan CHXA”-DTPA dalam dapar bikarbonat pH 8,5. Larutan
kemudian distirer selama 48 jam pada suhu kamar.
Pemurnian konjugat DTPA-PAMAM G4 dilakukan
dengan ultrafiltrasi menggunakan filter protein
(Vivaspin MWCO 10 KD). Volume akhir larutan
dibuat 500 µL dalam air .
Kemurnian radiokimia komplek 153Gd-DTPAPAMAM G4-Nimotuzumab ditentukan dengan
menggunakan
metode KCKT. Kolom yang
digunakan dalam penentuan kemurnian radiokimia
ini adalah SEC 250 (BioRad) dengan eluen PBS 0,1
M pH 7,2 yang lajualirnya 1 ml/menit. Pengamatan
dilakukan dengan menggunakan dua detektor yaitu
detektor UV (280 nm) dan detektor radioaktif NaITl.
7.
3.
Pembuatan CHO-Nimotuzumab
Pada larutan Nimotuzumab ditambahkan dapar
asetat pH 5 dan kemudian didinginkan pada suhu 28 oC sebelum penambahan larutan NaIO4 dalam
dapar asetat pH 5.5 ( 0.3 ml). Campuran disimpan
selama 2 jam pada suhu 2-8 oC sebelum
ditambahkan 6 µL etilen glikol. Campuran reaksi
kemudian diinkubasi selama 30 menit pada suhu 2-8
o
C yang diikuti dengan proses pemurnian dengan
ultrafiltrasi menggunkan protein filter (Vivaspin
MWCO 10 KD). Hasil ultrafiltrasi kemudian
diencerkan dengan PBS 0,1 M pH 7 sampai
diperoleh volume 0,6 ml. Konsentrasi CHONimotuzumab yang diperoleh kemudian ditentukan
dengan spektrofotometer Uv/Vis.
4.
Konyugasi DTPA-dendrimer dengan CHONimotuzumab
Kedalam larutan DTPA-dendrimer yang telah diatur
pHnya menjadi 8,5 dengan dapar bikarbonat 50 mM
ditambahkan CHO-nimotuzumab. Campuran reaksi
kemudian di stirer selama 20-24 jam pada suhu 2-8
o
C dan terlindung cahaya. DTPA-dendrimerNimotuzumab yang terbentuk kemudian dimurnikan
dengan ultrafiltrasi menggunakan protein filter
(Vivaspin MWCO 10 KD).
5.
Pembuatan
Gd-DTPA-DendrimerNimotuzumab atau 153Gd-DTPA-PAMAM
G4-Nimotuzumab
Kedalam larutan DTPA-dendrimer-Nimotuzumab
ditambahkan larutan Gd sitrat 0.3 M, kemudian atau
153
Gd-sitrat 0,3 M yang kemudian di stirer selama
24 jam pada suhu 2 – 8 oC dan terlidung dari
cahaya. 153Gd-DTPA-PAMAM G4-Nimotuzumab
yang terbentuk kemudian dimurnikan dengan
ultrafiltrasi menggunakan protein filter (Vivaspin
MWCO 10 KD). Konsentrasi Nimotuzumab pada
sediaan 153Gd-DTPA-PAMAM G4-Nimotuzumab
ditentukan dengan spektrofotometer Uv/Vis.
STTN-BATAN & Fak. Saintek UIN SUKA
714
Penentuan Kemurnian Radiokimia 153GdDTPA-PAMAM G4-Nimotuzumab
Uji biodistribusi sediaan 153Gd-DTPAPAMAM G4-Nimotuzumab
Sebanyak 0,1 mL sediaan 153Gd-DTPA-PAMAM
G4-Nimotuzumab dengan aktivitas 100 Ci
disuntikkan melalui vena ekor mencit (berat 25-35
g). Mencit kemudian dibunuh dibedah setelah 1, 3,
4, 24 dan 48 jam paska injeksi. Organ-organ seperti
darah, ginjal , limpa, jantung, paru, lambung,
kandung kemih, hati dan otak kemudian dicuplik
yang kemudian dicacah dengan alat pencacah sinar
gamma. Peresentase cacahan pada tiap gram organ
atau tiap organ kemudian dihitung.
8.
Urin dan feces clearance sediaan 153GdDTPA-PAMAM G4-Nimotuzumab
Besarnya perubahan aktivitas komplek dalam urin
dan feces per satuan waktu merupakan laju urin dan
feces clearance. Penentuan uji pencucian
153
radiofarmaka
Gd-DTPA-PAMAM
G4Nimotuzumab dari ginjal dilakukan dengan
menyuntikkan 0,2 mL dengan aktivitas sekitar 200
Ci sediaan kepada tikus secara intra vena melalui
vena ekor. Tifus tersebut kemudian dimasukkan
kedalam metabolic cage. Urin tifus ditampung dan
pada selang waktu tertentu paska injeksi (1, 3, 4, 24
dan 48 jam) diambil dan diukur aktifitasnya dengan
alat pencacah gamma (Gammatec II). Persentase
aktifitas yang dikeluarkan melalui urin dan feces
setelah selang waktu tertentu dihitung dengan cara
membandingkan cacah urin dan feces dengan
standar yang telah diketahui cacahannya.
9.
Pencitraan
Glioma
dengan
MRI
menggunakan senyawa pengontras GdDTPA-PAMAM G4-Nimotuzumab.
Pencitraan kanker otak (glioma) menggunakan
senyawa pengontras Gd-DTPA-PAMAM G4Nimotuzumab yang dilakukan menggunakan tikus
model (tikus yang pada otaknya telah diimplantkan
sel-sel glioma). Tikus model disuntik dengan GdDTPA-PAMAM G4-Nimotuzumab yang kemudian
dicitra dengan menggunakan alat MRI 1, 2, 3 dan 4
Adang H G
SEMINAR NASIONAL VI
SDM TEKNOLOGI NUKLIR
YOGYAKARTA, 18 NOVEMBER 2010
ISSN 1978-0176
[mV]
Gd-153 DTPA DENDRIMER NIMOTUZUMAB
1
Gd-153 DTPA DENDRIMER NIMO- 364 ( 2009) - Detector uv
Gd-153 DTPA DENDRIMER NIMO- 364 ( 2009) - Detector NaITl
6.70 0
jam setelah penyuntikan. Dari hasil pencitraan akan
diperoleh densitas citra pada masing-masing waktu.
80
kolom sec 2000
HASIL DAN PEMBAHASAN
Eluen bufer phosphat pH7
Gd-153 DTPA Dendrimer
Gambar 1. Struktur Senyawa Pengontras MRI
Gd-DTPA-PAMAM G4-Nimotuzumab
Hasil penentuan efisiensi penandaan komplek 153GdDTPA-PAMAM G4-nimotuzumab yang dilakukan
dengan KCKT menggunakan
kolom SEC
250dengan eluen PBS 0,1 M pH 7 yang kecepatan
alirnya 1 ml/menit dapat dilihat pada Gambar 2.
Dari Gambar 2 dapat dilihat puncak Gd-DTPAPAMAM-G4-nimotuzumab pada 6,297 menit
(kromatogram warna hijau) yang dideteksi dengan
detektor UV (280 nM) Sementara itu puncak 153GdDTPA-PAMAM G4-nimotuzumab dapat dilihat
pada 6,7 menit (radiokromatogram warna kuning)
yang dideteksi dengan detektor radioaktif (NaI-Tl).
Dari dua kromatogram ini dapat dilihat dengan jelas
153
terbentuknya
Gd-DTPA-PAMAM
G4nimotuzumab. Efisiensi pembentukan/penandaan
153
Gd-DTPA-PAMAM G4-nimotuzumab
yang
dihitung berdasarkan kromatogram adalah > 90 %.
Dari kromatogram ini juga dapat dilihat maíz
adanya pengotor lain yaitu komplek 153Gd-DTPAPAMAM G4 pada 9,393 menit.
Adang H G
715
1
9 .5 3 3
panja ng gelombang 280 nm
6 .2 9 7
V o l ta g e
40
Flow 1
A
9 .3 9 8
2
20
B
0
0
10
20
30
40
[min.]
Time
Gambar 2. Kromatogram HPLC
Gd-DTPA-PAMAM G4-Nimotuzumab
( A = detektor radioaktif dan B= detektor UV).
153
Profil biodistribusi kompleks 153Gd-DTPA-PAMAM
G4-nimotuzumab (% dosis per gram organ) dapat
dilihat pada Gambar 3. Pengujian biodistribusi
kompleks 153Gd-DTPA-PAMAM G4-nimotuzumab
dilakukan dengan menggunakan mencit putih
dengan berat antara 25-35 g. Organ dan jaringan
yang diambil adalah darah, kandung kemih, ginjal,
paru, limpa, lambung, hati, jantung, otot dan otak.
Dari profil biodistribusi ini dapat dilihat
radioaktifitas pada ginjal sampai dengan 48 jam
setelah injeksi masih lebih tinggi dibandingkan
dengan organ lainnya. Dari data dapat diartikan
bahwa komplek cenderung bersifat hidrofil dengan
rute ekskresinya melalui ginjal. Keradioaktifan
yang cukup signifikan juga terdapat pada organorgan hati dan limfa, hal ini disebabkan karena
ukuran dari komplek Gd-DTPA-PAMAM G4nimotuzumab yang relatif besar (~ 170 kD) yang
akan tertahan di hati dan limfa (Gambar 3) [5, 8, 9].
12
8
% radioaktivitas
Pembuatan senyawa pengontras MRI Gd-DTPAPAMAM G4-nimotuzumab dilakukan dalam 4 tahap
reaksi yaitu pembuatan CHO-nimotuzumab,
konyugasi DTPA dengan dendrimer PAMAM G4,
reaksi CHO-nimotuzumab dengan DTPA-PAMAM
G4 dan reaksi DTPA-PAMAM G4-nimotuzumab
dengan gadolinium (Gd). Karena senyawa GdDTPA-PAMAM G4-nimotuzumab (Gambar 1)
bukan
senyawa yang radioaktif, maka untuk
memudahkan karakterisasinya, proses preparasi
cedían pada penelitian ini disimulasikan dengan GdDTPA-PAMAM G4-nimotuzumab bertanda 153Gd
(153Gd-DTPA-PAMAM G4-nimotuzumab)
2
60
1 Jam
3 Jam
4 jam
24 jam
48 jam
4
0
Darah
K.ke mih
Ginjal
Lambung
Hati
Jantung
Paru
Limpa
Otak
Otot
Nama Organ
Gambar 3. Biodistribusi 153Gd-DTPA-PAMAM
G4-Nimotuzumab
Hasil penentuan urin dan feces clearance yang
diamati selama 96 jam setelah injeksi secara
berturut-turut dapat dilihat pada Gambar 4 dan
Gambar 5. Hasil ekskresi melalui urin menunjukkan
bahwa sekitar 19,4 % radioaktifitas sedíaan 153Gd-
STTN-BATAN & Fak. Saintek UIN SUKA
SEMINAR NASIONAL VI
SDM TEKNOLOGI NUKLIR
YOGYAKARTA, 18 NOVEMBER 2010
ISSN 1978-0176
DTPA-PAMAM G4-Nimotuzumab diekskresikan
setelah 96 jam pengamatan. Sedangkaqn presentase
tertinggi dalam urin clearance terjadi pada 24 jam
setelah injeksi (~ 18,3 %).
Gambar 5. Citra MRI Gd-DTPA-PAMAM
G4-Nimotuzumab
Hasil uji T1 pencitraan otak tikus putih yang telah
diinplant dengan sel kanker otak menggunakan
cedían pengkontras Gd-DTPA dan Gd-DTPAPAMAM G4-Nimotuzumab dengan alat MRI
menunjukkan bahwa T1 Gd-DTPA > Gd-DTPAPAMAM G4-Nimotuzumab (1/T1 Gd-DTPA < 1/T1
Gd-DTPA-PAMAM G4-Nimotuzumab). Hasil ini
memperlihatkan bahwa penyangatan citra GdDTPA-PAMAM G4-Nimotuzumab lebih tinggi
dibanding dengan Gd-DTPA.
Gambar 4. Urin Clearance 153Gd-DTPAPAMAM G4-Nimotuzumab
Sementara itu hasil uji feces clearance (Gambar 5)
menunjukkan bahwa radioaktifitas sedíaan 153GdDTPA-PAMAM
G4-Nimotuzumab
yang
diekskresikan melalui feces hanya ~ 3,32 % selama
96 jam pengamatan setelah injeksi.
1.8
1.5
% radioaktivitas
1.2
0.9
0.6
0.3
0
4J
24 J
72 J
96 J
120 J
Waktu, jam
Gambar 4. Feces Clearance 153Gd-DTPAPAMAM G4-Nimotuzumab
Hasil pencitraan kanker otak (glioma) menggunakan
senyawa pengkontras Gd-DTPA-PAMAM G4nimotuzumab yang dilakukan pada tikus model
(tikus yang pada otaknya telah diimplantkan sel-sel
glioma) dengan alat MRI dapat dilihat pada Gambar
5. Hasil densitas citra yang diamati 1,2, 3 dan 4 jam
setelah injeksi berturut-turut adalah 677, 730,740
dan 667 [14]. Dari hasil ini dapat dilihat bahwa
densitas citra maksimum diperoleh 3 jam setelah
injeksi sedangkan 4 jam setelah injeksi citra densitas
sudah mulai menurun.
STTN-BATAN & Fak. Saintek UIN SUKA
716
KESIMPULAN
Dari hasil preparasi dan karakterisasi (biodistribusi
dan uji clearance) senyawa 153Gd-DTPA-PAMAM
G4-Nimotuzumab
sebagai
simulasi
untuk
pembuatan senyawa pengontras MRI Gd-DTPAPAMAM G4-Nimotuzumab yang secara umum
digunakan untuk sistem pengiriman obat ke target
(Drug Delivery System) dapat disimpulkan bahwa :
a. Penggunaan perunut radioaktif 153Gd
memudahkan pengamatan dalam proses
preparasi
dan
karakterisasi sedíaan
153
pengkontras
Gd-DTPA-PAMAM
G4Nimotuzumab.
b. Hasil uji biodistribusi menunjukkan bahwa
konsentrasi komplek Gd-DTPA-PAMAM G4Nimotuzumab pada hati dan limpa maíz cukup
tinggi 48 jam setelah injeksi yang diperkirakan
disebabkan oleh ukuran molekul komplek GdDTPA-PAMAM G4-Nimotuzumab yang relatif
cukup besar (~ 170 kD).
c. Pencitraan otak menggunakan cedían
pengkontras
Gd-DTPA-PAMAM
G4Nimotuzumab dengan alat MRI, sebaiknya
dilakukan antara 2 sampai 3 jam setelah injeksi
karena kondisi tersebut memberikan densitas
citra yang maksimum.
Untuk melengkapi data biodistribusi dan clearance
yang sudah ada,
perlu dilakukan beberapa
pengujian lainnya seperti lipofilisitas, stabilitas,
pembersihan dari darah (blood clearance) dan juga
uji immunologi.
Adang H G
SEMINAR NASIONAL VI
SDM TEKNOLOGI NUKLIR
YOGYAKARTA, 18 NOVEMBER 2010
ISSN 1978-0176
UCAPAN TERIMAKASIH
Terimakasih yang sebesar-besarnya disampaikan
kepada dr. Rose dan juga Bagian Farmakologi
UNPAD yang telah membantu sampai selesainya
penelitian ini.
DAFTAR PUSTAKA
1.
Rong Tong, Jianjun Cheng, Anticancer
Polymeric Nanomedicine, Polymer Review
(2007) 47 :345-351
2. Benjamin P. Sopczynski, A New Anti-Tumor
Drug Delivery System : Dendrimers, MMG
445 Basic Biotechnology eJournal 2008, 2, 8792. Diunduh tg l09-04-2008 dari :
http://ejournal.vudat.msu.edu
3. Sonke Svenson, Donald A. Tomalia,
Dendrimers in biomedical applications –
reflections on the field, Advanced Drug
Delvery Reviews 57 (2005), 2215-1137.
Diunduh tgl 18-03-2007 dari :
http://www.sciencedirect.com.
4. Dhruba J.B., Marianne K., Mujgan G., Tessa
M.S., Shaker A.M., Nanoparticles and cancer
therapy : A consice review with emphasis on
dendrimers, International Journal of
Nanomedicine 2009 : 4, 1-7.
5. Thommey P. Thomas, Anil K. Patri, Andrzej
Myc, Mon Thiri Myaing,Jing Yong Ye,
Theodore B. Norris, James R. Baker Jr., In
Vitro Targeting of Synthesized Antibody
Conjugated
Dendrimer
Nanoparticle,
Biomacromolecules 2004,5, 2269-2274.
6. Luzzi
D.E.,
Smith
B.W.,
Nanoradiopharmaceuticals and Methods of
Use, US Patent No. 20070031327.
7. Donald A. Tomalia, L.A Reyna, S. Svenson,
Dendrimers as multi-purpose devices for
oncology drug delivery and diagnostic
imaging, Biochemical Society Transactions
(2007) Vol.35, part 1. pp.61-67.
8. Kobayashi, Hisataka , Choyke, Peter L.,
Methods for tumor treatment using dendrimer
conjugates, United States Patent 20060204443
(2006).
9. Martin W. Brechbiel, Robert A. Star, Hisataka
Kobayashi, Methods for Functional kidney
imaging using small dendrimer contrast agents,
United States Patent. 229316 (2002).
10. Ruth Duncan, Lorella Izzo, Dendrimer
Biocampatibility and Toxicity, Advanced Drug
Delvery Reviews 57 (2005), 2116-2129.
Diunduh tgl 16-05-2008 dari :
http://www.sciencedirect.com.
Adang H G
717
11. Kalevi Kairemo, Paola Erba, Kim Bergstrom,
Ernest K.J. Pauwels, Nanoparticle in Cancer,
Current Radiopharmaceuticals, 2008, 1, 30-36.
12. Spencer H.L., Sum YU Kwok, Pratap Singh,
Steven E.Diamond., Immobization of specific
binding assay reagents. Diunduh tgl. 24-032008 dari :
http://www.freepatentsonline.com/EP0637385
B1.html.
13. Thomas T.P., Patri A.K., Andrzej Myc, Mon
Thiri Myaing, Jing Yong Ye,
Norris T.B., James R.B. Jr., In vitro targeting
of synhesizes antibody-conjugated dendrimer
nanoparticles, Biomacromolecules 2004, 22692274.
14. Ristaniah D.S., Penyangatan citra resonansi
magnetik tumor otak glioma tikus dengan
menggunakan senyawa pengontras Gd-DTPAdendrimer- antibodi anti- EGFR, Ringkasan
Desertasi Promosi Doktor, Program Pasca
Sarjana Universitas Padjadjaran Bandung,
2009
STTN-BATAN & Fak. Saintek UIN SUKA
SEMINAR NASIONAL VI
SDM TEKNOLOGI NUKLIR
YOGYAKARTA, 18 NOVEMBER 2010
ISSN 1978-0176
STTN-BATAN & Fak. Saintek UIN SUKA
718
Adang H G